Methodenartikel

Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

DOI:

10.3791/63155

⸱

13 oktober 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cardiovascular & Metabolic Sciences, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic, 2University Hospitals Cleveland Medical Center, 3Case Western Reserve University, 4Center for Microbiome & Human Health, Cleveland Clinic, 5Electron Microscopy Core, Lerner Research Institute, Cleveland Clinic

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diverse bacteriesoorten scheiden ~ 20-300 nm extracellulaire blaasjes (EV's) af, bestaande uit lipiden, eiwitten, nucleïnezuren, glycanen en andere moleculen afgeleid van de ouderlijke cellen. EV's functioneren als intra- en inter-species communicatievectoren en dragen tegelijkertijd bij aan de interactie tussen bacteriën en gastheerorganismen in de context van infectie en kolonisatie. Gezien de veelheid aan functies die aan EV's worden toegeschreven in gezondheid en ziekte, is er een groeiende interesse in het isoleren van EV's voor in vitro en in vivo studies. Er werd verondersteld dat de scheiding van EV's op basis van fysieke eigenschappen, namelijk grootte, de isolatie van blaasjes uit verschillende bacterieculturen zou vergemakkelijken.

De isolatieworkflow bestaat uit centrifugatie, filtratie, ultrafiltratie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) voor de isolatie van EV's uit bacterieculturen. Een pompgestuurde tangentiële flowfiltratie (TFF) stap werd opgenomen om de schaalbaarheid te verbeteren, waardoor materiaal uit liters startcelcultuur kon worden geïsoleerd. Escherichia coli werd gebruikt als een modelsysteem dat EV-geassocieerde nanoluciferase en niet-EV-geassocieerde mCherry tot expressie brengt als reportereiwitten. De nanoluciferase was gericht op de EV's door zijn N-terminus te fuseren met cytolysine A. Vroege chromatografiefracties met 20-100 nm EV's met geassocieerd cytolysine A - nanoLuc verschilden van de latere fracties die de vrije eiwitten bevatten. De aanwezigheid van EV-geassocieerd nanoluciferase werd bevestigd door immunogold labeling en transmissie-elektronenmicroscopie. Deze EV-isolatieworkflow is van toepassing op andere menselijke darmgerelateerde gramnegatieve en grampositieve bacteriesoorten. Kortom, de combinatie van centrifugatie, filtratie, ultrafiltratie / TFF en SEC maakt schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriesoorten mogelijk. Het gebruik van een gestandaardiseerde isolatieworkflow zal vergelijkende studies van microbiële EV's tussen soorten vergemakkelijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn nanometergrote, liposoomachtige structuren die bestaan uit lipiden, eiwitten, glycanen en nucleïnezuren, uitgescheiden door zowel prokaryote als eukaryote cellen1. Sinds de vroege studies die de afgifte van EV's van gramnegatieve bacteriën2 visualiseren, is het aantal biologische functies dat wordt toegeschreven aan bacteriële EV's (20-300 nm in diameter) de afgelopen decennia voortdurend gegroeid. Hun functies omvatten het overbrengen van antibioticaresistentie3, biofilmvorming4, quorumdetectie5 en toxineafgifte<....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Zorg ervoor dat al het werk met bacteriën en recombinant DNA de beste praktijken voor bioveiligheidsinsluiting volgt die geschikt zijn voor het bioveiligheidsrisiconiveau van elke stam. Het werk moet worden gedaan in overeenstemming met lokale, nationale en internationale bioveiligheidsvoorschriften.

1. Bacteriestammen en kweekomstandigheden

OPMERKING: Bacteriestammen die in deze studie werden gebruikt, waren Escherichia coli MP1 13, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve en Bifidobacter....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om te beoordelen welke SEC-chromatografiefracties werden verrijkt voor EV's, werd de SEC-kolom geladen met 2 ml E. coli MP1-geconditioneerd kweekmedium dat 1.000 keer door TFF was geconcentreerd en werden sequentiële fracties verzameld. Met behulp van MRPS bleek dat fracties 1-6 de meeste EV's bevatten (figuur 2A). Latere fracties bevatten zeer weinig EV's, bestaande uit in plaats van EV-vrije eiwitten (figuur 2B). EV's hadden voornamelijk een diameter .......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In het bovenstaande protocol wordt een methode beschreven die schaalbaar is en ev's betrouwbaar isoleert van verschillende gramnegatieve / positieve en aerobe / anaërobe bacteriën. Het heeft verschillende potentiële stoppunten tijdens de procedure, hoewel het beter is om te voorkomen dat het langer dan 48 uur duurt om EV's te isoleren van geconditioneerde bacteriële kweekmedia.

Ten eerste bestaat het uit het kweken van bacteriën om geconditioneerd bacteriekweekmedium te genereren. Het bleek da.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het hierboven beschreven onderzoek werd ondersteund door NIH TL1 TR002549-03 trainingsbeurs. We bedanken Drs. John C. Tilton en Zachary Troyer (Case Western Reserve University) voor het vergemakkelijken van de toegang tot het deeltjesgrootte-analyse-instrument; Lew Brown (Spectradyne) voor technische assistentie bij de analyse van de deeltjesgrootteverdelingsgegevens; Dr. David Putnam aan de Cornell University voor het verstrekken van pClyA-GFPplasmide 14; en Dr. Mark Goulian aan de Universiteit van Pennsylvania voor het verstrekken van de E. coli MP113.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubesThermo Scientific3430het is belangrijk om dunne PCR-buizen te gebruiken om nauwkeurige metingen met Qubit te verkrijgen
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) waterige oplossingElectron microscopy sciences15700
250 mL Fiberlite polypropyleen centrifuge flessenThermoFisher010-1495
500 mL Fiberlite polypropyleen centrifuge flessenThermoFisher010-1493
65 mm Polypropyleen Ronde Bodem/Conische Fles AdapterBeckman Coulter392077Laat Vivacell passen in rotor
Akkermansia mucinophilaATCCBAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)MilliporeSigmaUFC910024
Avanti J-20 XPI centrifugeBeckman CoulterNiet meer verkocht door Beckman. Avanti J-26XP is het meest vergelijkbare moderne model.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482ATCC29148
Bifidobacterium breveNCIMBB8807
Bifidobacterium dentiumATCC27678
Brain Heart infusie (BHI) bouillonHimediaM2101Na het autoclaven werden zowel BHI bouillon als agar in de anaërobe kamer geïntroduceerd, aangevuld met Menadione (1 µg/L), hematine (1,2 µg/L) en L-Cysteïne Hydrochloride (0,05%). Ze werden vervolgens minimaal 24 uur onder anaërobe omstandigheden geïncubeerd voordat ze werden geïnoculeerd met de anaërobe bacteriestammen.
C-300 microfluidics cartridgeSpectradyne
ChloramfenicolMP BiomedicalsICN19032105
ElektronenmicroscoopFEI companyTecnai G2 SpiritBT
Escherichia coli HST08 (Steller competente cellen)Takara636763
Escherichia coli MP1Dr. Mark Goulian (geschenk)commensale bacteriën afkomstig van muizendarm
Fiberlite 500 mL naar 250 mL adapterThermoFisher010-0151-05gebruikt met Fiberlite rotor om 250 mL flessen te kunnen gebruiken voor kleinere hoeveelheden van de startbacteriecultuur
Fiberlite vaste hoek centrifugerotorThermoFisherF12-6x500-LEXpast op 6 x 500 mL flessen
Formvar Koolstof Film 400 Mesh, KoperElectron microscopy sciencesFCF-400-CU
Glutaraldehyde (EM-kwaliteit, 10% waterige oplossing)Electron microscopy sciences16100
HematineChemCruz207729BVoorraad oplossing werd gemaakt in 0,2 M L-histidine oplossing als  1,2 mg/mL
Infinite M Nano+ Microplate readerTecanDit apparaat werd gebruikt om de mCherry fluoresctie te meten
In-Fusion  HD Cloning PlusTakara638909Voor het klonen van de PCR fragmenten in de PCR-lineairiseerde vectoren
JS-5.3 AllSpin Swing-Bucket RotorBeckman Coulter368690
Lauria Bertani (LB) bouillon, MillerDifco244620
L-Cysteïne HydrochlorideJ.T. Baker2071-05Dit dient gewogen en direct aan de geautoclaveerde BHI media binnen de anaërobe kamer te worden toegevoegd
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer naar Slang Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PKcole-parmer - speciaalHV-30800-08verbindingsadapters voor filtratiebuiscircuit
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer naar Slang Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PKcole-parmer - speciaalHV-30800-24verbindingsadapters voor filtratiebuiscircuit
Masterflex L/S Analoge Variabele Snelheid Console Drive, 20 tot 600 rpmMasterflexHV-07555-00
Masterflex L/S Easy-Load Head voor Precision Buizen, 4-Roller, PARA Housing, SS RotorMasterflexEW-07514-10
Masterflex L/S Precision Pompbuizen, PharmaPure, L/S 16; 25 ftCole PalmerEW-06435-16lage binding/lage uitloging buizen
Menadione (Vitamine K3)MP102259Voorraad oplossing werd gemaakt in ethanol als 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PKRepligenD04-E100-05-NTFF apparaat dat we hebben gebruikt om maximaal 2 L van E. coli cultuur supernatant te filteren
Nano-Glo Luciferase Assay SysteemPromegaN1110Deze testkit werd gebruikt om de luminescentie van het nluc reporter eiwit te meten
NanoLuc (Nluc) Luciferase Antilichaam, clone 965808R&D SystemsMAB10026
nCS1 microfluidics resistieve puls detectie instrumentSpectradyne
nCS1 ViewerSpectradyneAnalysesoftware voor deeltjesgrootteverdeling
OneTaq 2x Master Mix met standaard bufferNEBM0482DNA polymerase master mix gebruikt voor routine PCR reacties voor koloniecontrole
Protein LoBind, 2,0 mL, PCR schone buizenEppendorf30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master MixNEBM0492DNA polymerase master mix gebruikt voor de PCR reacties die nodig zijn voor klonen
qEV original, 35 nmIzonmaximaal invulvolume van 0,5 mL
qEV rackIzonvoor gebruik met de qEV-original SEC kolommen
qEV-2, 35 nmIzonmaximaal invulvolume van 2 mL
Qubit fluorometerThermoFisherArtikel niet langer verkrijg

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Yanez-Mo, M., et al. Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27066(2015).
  2. Chatterjee, S. N., Das, J. Electron micro....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Extracellular VesiclesBacterial EVsEscherichia ColiEV IsolationSize Exclusion ChromatographyTangential Flow FiltrationTransmission Electron MicroscopyUltrafiltrationBacterial Cell CultureImmunogold Labeling

Gerelateerde artikelen