Schaalbare isolatie en zuivering van extracellulaire blaasjes van Escherichia coli en andere bacteriën

Samenvatting

Bacteriën scheiden nanometergrote extracellulaire blaasjes (EV's) af die bioactieve biologische moleculen dragen. EV-onderzoek richt zich op het begrijpen van hun biogenese, rol in microbe-microbe en gastheer-microbe interacties en ziekte, evenals hun potentiële therapeutische toepassingen. Een workflow voor schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriën wordt gepresenteerd om standaardisatie van EV-onderzoek te vergemakkelijken.

Samenvatting

Diverse bacteriesoorten scheiden ~ 20-300 nm extracellulaire blaasjes (EV's) af, bestaande uit lipiden, eiwitten, nucleïnezuren, glycanen en andere moleculen afgeleid van de ouderlijke cellen. EV's functioneren als intra- en inter-species communicatievectoren en dragen tegelijkertijd bij aan de interactie tussen bacteriën en gastheerorganismen in de context van infectie en kolonisatie. Gezien de veelheid aan functies die aan EV's worden toegeschreven in gezondheid en ziekte, is er een groeiende interesse in het isoleren van EV's voor in vitro en in vivo studies. Er werd verondersteld dat de scheiding van EV's op basis van fysieke eigenschappen, namelijk grootte, de isolatie van blaasjes uit verschillende bacterieculturen zou vergemakkelijken.

De isolatieworkflow bestaat uit centrifugatie, filtratie, ultrafiltratie en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) voor de isolatie van EV's uit bacterieculturen. Een pompgestuurde tangentiële flowfiltratie (TFF) stap werd opgenomen om de schaalbaarheid te verbeteren, waardoor materiaal uit liters startcelcultuur kon worden geïsoleerd. Escherichia coli werd gebruikt als een modelsysteem dat EV-geassocieerde nanoluciferase en niet-EV-geassocieerde mCherry tot expressie brengt als reportereiwitten. De nanoluciferase was gericht op de EV's door zijn N-terminus te fuseren met cytolysine A. Vroege chromatografiefracties met 20-100 nm EV's met geassocieerd cytolysine A - nanoLuc verschilden van de latere fracties die de vrije eiwitten bevatten. De aanwezigheid van EV-geassocieerd nanoluciferase werd bevestigd door immunogold labeling en transmissie-elektronenmicroscopie. Deze EV-isolatieworkflow is van toepassing op andere menselijke darmgerelateerde gramnegatieve en grampositieve bacteriesoorten. Kortom, de combinatie van centrifugatie, filtratie, ultrafiltratie / TFF en SEC maakt schaalbare isolatie van EV's van verschillende bacteriesoorten mogelijk. Het gebruik van een gestandaardiseerde isolatieworkflow zal vergelijkende studies van microbiële EV's tussen soorten vergemakkelijken.

Inleiding

Extracellulaire blaasjes (EV's) zijn nanometergrote, liposoomachtige structuren die bestaan uit lipiden, eiwitten, glycanen en nucleïnezuren, uitgescheiden door zowel prokaryote als eukaryote cellen¹. Sinds de vroege studies die de afgifte van EV's van gramnegatieve bacteriën² visualiseren, is het aantal biologische functies dat wordt toegeschreven aan bacteriële EV's (20-300 nm in diameter) de afgelopen decennia voortdurend gegroeid. Hun functies omvatten het overbrengen van antibioticaresistentie³, biofilmvorming⁴, quorumdetectie⁵ en toxineafgifte⁶. Er is ook een groeiende belangstelling voor het gebruik van bacteriële EV's als therapieën, vooral in vaccinologie⁷ en kankertherapie⁸.

Ondanks de groeiende belangstelling voor EV-onderzoek, zijn er nog steeds technische uitdagingen met betrekking tot isolatiemethoden. In het bijzonder is er behoefte aan isolatiemethoden die reproduceerbaar, schaalbaar en compatibel zijn met diverse EV-producerende organismen. Om een uniforme reeks principes te creëren voor het plannen en rapporteren van EV-isolatie en onderzoeksmethoden, publiceert en actualiseert de International Society for Extracellular Vesicles de MISEV-position paper⁹. Bovendien biedt het EV-TRACK-consortium een open platform voor het rapporteren van gedetailleerde methodologieën voor EV-isolatie die worden gebruikt in gepubliceerde manuscripten om de transparantie te vergroten¹⁰.

In dit protocol werden eerdere methodologieën die werden gebruikt voor de isolatie van EV's uit zoogdiercelkweek^{aangepast 11,12} om de isolatie van EV's uit bacteriële celkweek mogelijk te maken. We hebben geprobeerd methoden te gebruiken die EV-isolatie van een verscheidenheid aan microben mogelijk maken, die schaalbaar kunnen zijn en de zuiverheid en opbrengst van EV's in evenwicht brengen (zoals besproken in de MISEV-position paper⁹). Na het verwijderen van bacteriële cellen en puin door centrifugering en filtratie, wordt het kweekmedium geconcentreerd door ultrafiltratie van centrifugaalapparaten (voor een volume tot ~ 100 ml) of pompaangedreven TFF (voor grotere volumes). EV's worden vervolgens geïsoleerd door SEC met behulp van kolommen die zijn geoptimaliseerd voor de zuivering van kleine EV's.

Figuur 1: Bacterial EV isolatie workflow schematisch overzicht. Afkortingen: EV = extracellulair blaasje; TFF = tangentiële stromingsfiltratie; SEC = grootte-uitsluitingschromatografie; MWCO = afsnijding van het molecuulgewicht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een muis-commensale stam van Escherichia coli (d.w.z. E. coli MP1¹³) werd gebruikt als een modelorganisme en gemodificeerd om EV-geassocieerd nanoluciferase tot expressie te brengen door fusie tot cytolysine A, zoals eerder gemeld¹⁴. De methoden die hier worden gebruikt, kunnen ten minste enkele liters bacterieculturen verwerken en EV-geassocieerde van niet-EV-geassocieerde eiwitten effectief scheiden. Ten slotte kan deze methode ook worden gebruikt voor andere grampositieve en gramnegatieve bacteriesoorten. Alle relevante gegevens van de gerapporteerde experimenten werden ingediend bij de EV-TRACK-kennisbank (EV-TRACK ID: EV210211)¹⁰.

Protocol

OPMERKING: Zorg ervoor dat al het werk met bacteriën en recombinant DNA de beste praktijken voor bioveiligheidsinsluiting volgt die geschikt zijn voor het bioveiligheidsrisiconiveau van elke stam. Het werk moet worden gedaan in overeenstemming met lokale, nationale en internationale bioveiligheidsvoorschriften.

1. Bacteriestammen en kweekomstandigheden

OPMERKING: Bacteriestammen die in deze studie werden gebruikt, waren Escherichia coli ^{MP1 13}, Akkermansia mucinophila, Bacteroides thetaiotaomicron, Bifidobacterium breve en Bifidobacterium dentium.

1. Gebruik voor E. coli een steriele lus om afzonderlijke kolonies in te enten in 250 tot 1.000 ml Luria-Bertani (LB) bouillon en incubeer aeroob in een schuddende incubator bij 300 tpm en 37 °C gedurende 48 uur voordat u de cultuur verwerkt. Voor recombinante E. coli MP1-stam met p114-mCherry-Clyluc (aanvullende methode en aanvullende figuur S1), voegt u chlooramfenicol toe aan de LB-agar en bouillon in een eindconcentratie van 17 μg / ml.
2. Voor A. mucinophila, B. thetaiotaomicron, B. breve en B. dentium, streak op Brain heart infusion (BHI) agarplaten en incubeer anaëroob in een vinyl anaerobe kamer. Ent enkele kolonies in 100 ml vooraf gereduceerde BHI-bouillon en incubeer gedurende 48 uur anaeroob.

2. EV-isolatie

1. Verhelderen van bacteriekweekmedium door centrifugatie en filtratie
   1. Breng de bacteriële celculturen die in stap 1 zijn ingeënt over om 250 ml of 500 ml polypropyleencentrifugeflessen te reinigen door te gieten. Centrifugeer de flessen in een rotor met grote capaciteit met vaste hoek bij 4 °C en 5.000 × g gedurende 15 minuten. Breng het supernatant over in schone centrifugeflessen door voorzichtig te gieten en centrifugeer opnieuw op 10.000 × g gedurende 15 minuten.
      OPMERKING: Hergebruik de flessen na bioveiligheidsgeschikte reiniging en decontaminatie.
      1. Als er na de tweede centrifugatie grote pellets bacteriële cellen aanwezig zijn, herhaal dan de centrifugatie in een schone fles om cellen verder te verwijderen.
   2. Breng het supernatant over naar een 0,22 μm polyethersulfon vacuümaangedreven filterapparaat van de juiste grootte door te gieten. Filter door het filtratieapparaat aan te sluiten op een vacuümwandtoevoer. Als de filtratiesnelheid aanzienlijk daalt, verplaatst u eenvoudig al het ongefilterde materiaal naar een nieuw apparaat. Bewaar het gefilterde medium een nacht bij 4 °C en zet het protocol indien gewenst de volgende dag voort.
      OPMERKING: De bovenstaande centrifugaties maken meestal verwerking van ~ 2x het aangegeven volume celkweek door elk apparaat mogelijk. Een enkel filterapparaat van 500 ml kan bijvoorbeeld ~ 1.000 ml voorgecentrifugeerde cultuur filteren. Deze apparaten worden meestal niet hergebruikt. Het gebruik van spuitfilters bij deze stap wordt niet aanbevolen zonder optimalisatie, omdat aanzienlijke verliezen werden opgemerkt met de geteste modellen. Dit is een potentieel pleisterpunt.
   3. Controleer op de volledige verwijdering van de levensvatbare cellen op dit punt door een aliquot van het gefilterde supernatant op geschikte agarplaten te verspreiden en zorg ervoor dat er na incubatie geen kolonies zijn onder optimale omstandigheden voor de bacteriestam. Als bacteriën worden gedetecteerd, optimaliseer dan de bovenstaande procedure verder door extra centrifugaties en / of filtraties uit te voeren.
2. Concentratie van het gefilterde medium
   1. Als u werkt met volumes die aanzienlijk > 100 ml, gaat u verder met stap 2.2.2. Als u werkt met volumes van ~ 100 ml, laadt u 90 ml gefilterd kweekmedium op het reservoir van een respectievelijk capaciteit 100 kDa moleculair gewichtsafsnijdingsapparaat (MWCO) centrifugaal ultrafiltratieapparaat met behulp van serologische pipetten. Balanceer altijd met een bijpassend ultrafiltratieapparaat en centrifugeer in zwenkbakrotor bij 4 °C en 2.000 × g gedurende intervallen van 15-30 minuten, totdat het volume van het medium in het bovenste reservoir is geconcentreerd tot <0,5 ml.
      1. Vul het reservoir aan met eventueel achtergebleven gefilterd kweekmedium. Als u 'bijlaadt', verwijdert u de doorstroom in de onderkant van het apparaat en balanceert u alle apparaten opnieuw.
         OPMERKING: Er werd waargenomen dat het maximale volume van gefilterd kweekmedium dat met deze apparaten kan worden geconcentreerd, <2 keer het aanbevolen volume is.
      2. Als de viscositeit van het geconcentreerde medium in het reservoir zichtbaar is verhoogd (donker, viskeus materiaal), verdun dan met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en herconcentrateer door centrifugatie om niet-EV-eiwitten kleiner dan de MWCO van 100 kDa te verdunnen.
         OPMERKING: Dit is een potentieel stoppunt.
      3. Breng het geconcentreerde medium over in een eiwitarme buis, bewaar het een nacht bij 4 °C en zet het protocol indien gewenst de volgende dag voort.
   2. Als u met volumes werkt die aanzienlijk > 100 ml, selecteert u een TFF-apparaat van de juiste grootte (100 kDa MWCO) om het te verwerken volume te verwerken.
      OPMERKING: Filtratie-apparaten voor het verwerken van 100 ml tot > 1.000 ml zijn in de handel verkrijgbaar. Lokale beschikbaarheid, kosten en compatibiliteit met de pomp en slangen / verbindingen zullen bepalen welke specifieke modellen het nuttigst zullen zijn. Tot 2 L kweekmedium werd verwerkt met het apparaat dat is aangegeven in de tabel met materialen voordat het filter moest worden gereinigd (zie stap 2.3 hieronder voor het reinigingsprotocol).
      1. Monteer een filtratiecircuit met # 16 laag-bindende / lage uitlogingsbuizen, 1/8 inch slang-weerhaak naar Luer-adapters, het TFF-apparaat en een peristaltische pomp, zoals aangegeven in aanvullende figuur S2.
         OPMERKING: Voer TFF uit in een bioveiligheidskast om het risico op besmetting van het EV-preparaat met omgevingsbacteriën te minimaliseren.
      2. Begin bij kamertemperatuur met het circuleren van het gefilterde, geconditioneerde medium op ongeveer 200 ml / min (minimaal 100 ml / min). Bepaal het juiste toerental dat overeenkomt met het gewenste debiet door 200 ml PBS in een gegradueerd vat te pompen. Verzamel bij het circuleren van gefilterd, geconditioneerd medium de moleculen < 100 kDa die het ultrafiltratiemembraan passeren als afval in een apart vat.
         OPMERKING: Het onderstaande voorbeeld gaat uit van een beginvolume van 2 L cultuur.
      3. Blijf het geconditioneerde medium circuleren totdat het volume is verminderd tot ~ 100-200 ml. Ga indien nodig over op kleinere schepen. Verdun 2-voudig met PBS en blijf circuleren met de pomp, geconcentreerd tot 75-100 ml. Verdun 2-voudig met PBS en blijf circuleren tot een eindvolume van 25 ml. Verdun 2-voudig met PBS en blijf circuleren tot <10 ml.
      4. Til de voedingsslang uit het monsterreservoir en blijf pompen om het filter te zuiveren en de maximale hoeveelheid monster terug te winnen.
         OPMERKING: Dit is een potentieel stoppunt.
      5. Breng het geconcentreerde monster over in een conische buis en bewaar indien gewenst een nacht bij 4 °C. U kunt ook doorgaan met het protocol.
      6. Verplaats het geconcentreerde monster naar een 15 ml capaciteit 100 kDa MWCO centrifugaal ultrafiltratie-apparaat. Centrifugeer in een zwenkbakrotor bij 4 °C en 2.000 × g gedurende intervallen van 15-30 minuten totdat het volume van het medium in het bovenste reservoir is geconcentreerd tot <2 ml.
         OPMERKING: Dit is een potentieel stoppunt.
      7. Breng het geconcentreerde medium over in een eiwitarme buis en bewaar het bij 4 °C 's nachts, waarbij het protocol de volgende dag indien gewenst wordt voortgezet.
3. Het TFF-apparaat reinigen (optioneel)
   OPMERKING: De filtratiesnelheid neemt af naarmate het TFF-apparaat tijdens het proces begint te "verstoppen" (vervuiling). Indien nodig kan het filterapparaat worden gereinigd om de filtratie van extra monsters in dezelfde zuiveringsrun te vergemakkelijken. Hoewel theoretisch mogelijk, is een gereinigd TFF-filter niet gebruikt voor een andere zuiveringsrun om kruisbesmetting te voorkomen.
   1. Om schoon te maken, verwijdert u alle slangen en doppen van het TFF-apparaat en voert u eventuele resterende vloeistof af.
   2. Gebruik de peristaltische pomp en slang om zowel de binnen- als buitencompartimenten van het TFF-apparaat (d.w.z. via de parallelle en loodrechte poorten in het model in de materiaaltabel) te overspoelen met ~ 100 ml gedestilleerd water. Verwijder alle slangen/doppen en laat het TFF-apparaat leeglopen.
   3. Sluit de buitenste (loodrechte filtraat) poorten af en laat 250 ml 20% ethanol in gedestilleerd water circuleren op >200 ml/min gedurende 10 minuten door het binnenste compartiment. Draineren, overstromen met gedestilleerd water, en opnieuw aftappen zoals hierboven.
   4. Laat 250 ml 0,5 N verse NaOH-oplossing gedurende 30 minuten door het binnencompartiment circuleren en laat opnieuw uitlekken.
   5. Sluit alle slangen en doppen opnieuw aan op de inlaat-, uitlaat- en filtraatpoorten, zoals in aanvullende figuur S2, en laat 0,5 N NaOH-oplossing opnieuw circuleren totdat een volume NaOH->^{filteroppervlak} van 1 ml / cm 2 door het filtermembraan dringt en wordt verzameld als filtraat / afval.
   6. Spoel het TFF-apparaat af met gedestilleerd water zoals hierboven beschreven. Gebruik het TFF-apparaat onmiddellijk of overspoel het apparaat met ~ 100 ml 20% ethanol en bewaar het 's nachts bij 4 °C.
      OPMERKING: Als het in ethanol wordt bewaard, moet u 250 ml PBS door het apparaat afvoeren, spoelen met water, aftappen en door het apparaat laten circuleren totdat een volume van >1 ml / cm² filteroppervlak door het filtermembraan dringt en wordt verzameld als filtraat / afval om resterende ethanol te verwijderen voorafgaand aan monsterverwerking.
4. Grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)
   OPMERKING: SEC wordt gebruikt om de zuiverheid van EV's te verhogen en niet-vesiculaire eiwitten te verwijderen.
   1. Gebruik een kleine SEC-kolom (bedvolume van 10 ml) voor de isolatie van EV's van < 100 ml uitgangsmateriaal en een grotere kolom (bedvolume van 47 ml) voor de isolatie van EV's van >100 ml uitgangsmateriaal.
      OPMERKING: In het onderstaande voorbeeld worden volumes voor de grotere kolom weergegeven, met volumes voor de kleinere kolom tussen haakjes.
   2. Breng de SEC-kolom en PBS gedurende enkele uren op kamertemperatuur. Stabiliseer de SEC-kolom in een verticale positie met behulp van een standaard laboratoriumstandaard en houder. U kunt ook commerciële chromatografiekolomstandaards gebruiken.
   3. Voordat u verbinding maakt met de SEC-kolom, hydrateert u het monsterreservoir door 5 ml PBS door de frit en in een afvalcontainer te laten stromen. Schroef de inlaatdop van de SEC-kolom los, voeg 2 ml PBS toe aan het monsterreservoir en sluit het reservoir voorzichtig aan op de kolom terwijl de PBS door de frit naar buiten druipt (niet van toepassing op kleine SEC-kolommen).
      OPMERKING: Deze vorige stap voorkomt dat luchtbellen vast komen te zitten aan de bovenkant van de SEC-kolom. Als er lucht vastzit, verwijdert u het reservoir, tikt u op de kolom om de luchtbel eruit te halen en herhaalt u de verbindingsprocedure. Voor de kleinere kolom maakt u eenvoudig de bovenkant van de SEC-kolom los en bevestigt u de monstertrechter.
   4. Voeg 47 ml (10 ml) PBS toe aan het monsterreservoir en maak de bodem van de SEC-kolom los. Laat alle geladen monsterbuffer door de kolom stromen voor equilibratie. Gooi de doorstroom weg.
   5. Laad maximaal 2 ml (0,5 ml) monster op het monsterreservoir, gooi de doorstroom weg en laat het monster volledig in de kolom komen.
   6. Voeg onmiddellijk PBS toe aan het monsterreservoir of de trechter met een volume van 14,25 ml minus het monstervolume (3 ml minus het monstervolume, voor de kleine kolom). Laat de oplossing door de kolom stromen en gooi deze hoeveelheid weg die gelijk is aan het volume van de kolomleegstand.
      OPMERKING: Voor een typisch monster van 2 ml is de hoeveelheid PBS die aan het monsterreservoir of de trechter moet worden toegevoegd 12,25 ml.
   7. Plaats een 2 ml laagbindende microbuis direct onder de SEC-kolom. Voeg onmiddellijk 2 ml (0,5 ml) PBS toe aan het monsterreservoir en laat het in de kolom komen. Label deze eerste 2 ml (0,5 ml) doorstroom als fractie 1. Blijf 2 ml (0,5 ml) per keer toevoegen aan het monsterreservoir om elke volgende fractie te verzamelen.
      OPMERKING: De meeste bacteriële EV's elueren in de eerste 5 fracties. Tijdens de optimalisatie werden de eerste 12 fracties verzameld.
   8. Bewaar de fracties bij 4 °C voor kortdurende opslag (dagen) of -80 °C voor langdurige opslag.
   9. Reiniging en opslag van de herbruikbare SEC-kolommen
      OPMERKING: De SEC-kolommen die in dit protocol worden beschreven, kunnen volgens de fabrikant tot 5 keer opnieuw worden gebruikt. Als het debiet van de SEC-kolommen afneemt na gebruik <5, raadt de fabrikant aan de geconcentreerde monsters gedurende 10 minuten op 10.000 x g te centrifugeren om eventuele aggregaten vóór SEC te verwijderen. Laad vervolgens het supernatant van deze centrifugatie op de SEC-kolom voor EV-isolatie.
      1. Om de SEC-kolom na elk gebruik schoon te maken en op te slaan, voegt u 2 ml (0,5 ml) van 0,5 M NaOH toe en laat u deze volledig in de kolom komen. Laat 100 ml (20 ml) 20% ethanol door de kolom lopen en bewaar het bij 4 °C tot het volgende gebruik. Voor het volgende gebruik, breng de ethanol in evenwicht tot kamertemperatuur zoals hierboven, en wissel het uit met PBS-buffer door nog eens 150 ml (30 ml) PBS door de kolom te laten lopen.
      2. Om de SEC-kolom na elk gebruik schoon te maken en onmiddellijk opnieuw te gebruiken, voegt u 2 ml (0,5 ml) 0,5 M NaOH toe en laat u deze volledig in de kolom komen. Voer ongeveer 150 ml (30 ml) PBS-buffer uit om NaOH weg te spoelen. Wanneer de pH van eluaat gelijk is aan PBS (~7), kan een nieuw monster worden geladen.

3. Kwaliteitscontrole van ev-voorbereiding

1. Steriliteitstesten
   OPMERKING: Aangezien deze EV's afkomstig zijn uit bacterieculturen, is het van cruciaal belang om steriliteit te garanderen voordat ze stroomafwaarts worden gebruikt.
   1. Verkrijg 100 μL (20 μL) van de fracties die in assays moeten worden gebruikt en ent 3 ml van het medium dat wordt gebruikt om de bronbacteriën te laten groeien. Kweek onder de respectieve optimale omstandigheden gedurende ten minste 3 dagen en observeer op troebelheid. U kunt ook de fractiemonsters aanbrengen op agarplaten die het medium bevatten dat wordt gebruikt om de producerende bacteriën te laten groeien en op zoek gaan naar kolonievorming.
      OPMERKING: Als bacteriële besmetting wordt gedetecteerd, wordt het niet aanbevolen om het EV-preparaat te gebruiken voor experimenten. Herhaal in plaats daarvan de isolatie en zorg ervoor dat het risico op bacteriële besmetting wordt geminimaliseerd door (a) voldoende centrifugatie / filtratie van geconditioneerd bacteriecelkweekmedium uit te voeren, (b) schone flessen, slangen, filters en chromatografiekolommen te gebruiken en (c) geschikte aseptische technieken te gebruiken.
2. Eiwitkwantificering
   OPMERKING: Er werd een zeer gevoelige, op fluorescentie gebaseerde eiwitkwantificeringskit gebruikt (zie de tabel met materialen). De kit werkt met een bijpassende gepatenteerde fluorimeter bij excitatie/ emissiegolflengten van 485/590 nm.
   1. Breng alle reagentia, standaarden en monsters op kamertemperatuur.
   2. Bereid een hoofdmengsel van eiwitreagens en buffer door 1 μL van het reagens toe te voegen aan 199 μL buffer voor elk monster en de standaard die moet worden getest. Gebruik dunwandige 0,5 ml PCR-buizen en voeg 10 μL standaard + 190 μL mastermix toe aan elke standaardbuis.
      OPMERKING: Om binnen het bereik van de test te zijn, hangt de hoeveelheid van elke fractie die aan elke monsterbuis moet worden toegevoegd af van de verwachte eiwitopbrengst van de zuivering. Doorgaans werd 5 μL van elke fractie + 195 μL mastermix gebruikt. Het uiteindelijke volume monster + mastermix moet 200 μL zijn.
   3. Vortex de testbuizen en incubeer gedurende ten minste 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
   4. Meet de normen op de juiste gepatenteerde fluorimeter (zie de tabel met materialen) door de optie Eiwittest te selecteren met behulp van de pijlknoppen en op de GO-knop te drukken om te bevestigen. Volg de instructies op het scherm, plaats elke standaardbuis en druk op GO.
   5. Plaats de experimentele monsterbuis; druk op GO om te lezen; en noteer het weergegeven resultaat, namelijk de werkelijke eiwitconcentratie in het assaybuffer/monstermengsel. Als u de eiwitconcentratie in het monster wilt verkrijgen, gebruikt u de pijltoetsen om de optie Monsterconcentratie berekenen te selecteren, drukt u op GO en gebruikt u de pijltoetsen om het monstervolume te selecteren dat aan de testbuffer voor het gegeven monster is toegevoegd. Druk op GO en noteer de eiwitconcentratie van het monster. Herhaal deze stap voor elk te analyseren monster.
3. Deeltjes tellen en grootteverdeling
   OPMERKING: Microfluidics resistive pulse sensing (MRPS) werd gebruikt om de EV-concentratie en grootteverdeling te kwantificeren.
   1. Verdun de monsters in PBS aangevuld met 1% Tween-20 dat is gefilterd door een spuitfilter van 0,02 μm tot een eiwitconcentratie van ongeveer 0,1 μg / ml.
      OPMERKING: Het doel van verdunning is het bereiken van een verwachte deeltjesconcentratie in het bereik van 10¹⁰ deeltjes/ml in EV-bevattende fracties. De optimale verdunning moet mogelijk empirisch worden bepaald. Er worden weinig EV's verwacht voor latere fracties (voorbij Fractie 6). De deeltjesconcentratie zal dus waarschijnlijk < 10¹⁰ deeltjes / ml zijn, ondanks analyse bij lage verdunningen.
   2. Laad 3 μL van elk monster met een micropipette in de wegwerpmicrofluïdicacartridge, plaats de cartridge in het MRPS-instrument en druk op de metalen knop met een blauw verlichte rand.
   3. Klik op Go! op de acquisitiesoftware en wacht tot het monster door het instrument is geanalyseerd. Verkrijg 1.000 tot 10.000 deeltjesgebeurtenissen om de technische statistische analysefout te minimaliseren. Klik op dit punt op Stoppen en Uitvoeren beëindigen om de voorbeeldacquisitie te voltooien.
      OPMERKING: Samen met de onbewerkte gegevensbestanden voert het instrument een samenvattende spreadsheet uit met de deeltjesconcentratie in het monster. Corrigeer deze waarde volgens de gemaakte monsterverdunning.
   4. Gebruik analysesoftware om de onbewerkte gegevens te laden en aangepaste grafieken van grootteverdeling te genereren.

4. EV-opslag

1. Aliquot individuele of gepoolde fracties tot 25-50% van de individuele fractiegrootte (afhankelijk van de grootte van de gebruikte kolom) in eiwitarme buizen en bewaar bij -80 °C om vries-dooicycli te voorkomen.
   OPMERKING: Verschillende toepassingen kunnen kleinere of grotere aliquots vereisen, afhankelijk van de verwachte hoeveelheid die in elk experiment wordt gebruikt. Dit zal empirisch moeten worden bepaald. De niet-EV-bevattende fracties kunnen worden weggegooid als ze niet van toepassing zijn op de onderzoeksdoelstellingen.

5. Transmissie-elektronenmicroscopie

1. Negatieve kleuring
   1. Voeg 5 μL van het EV-monster toe aan het met koolstof gecoate koperen 400 mesh-rooster en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Was de monsterzijde met 5 druppels Tris-buffer van 5 mM (pH 7,1) en vervolgens met 5 druppels gedestilleerd water.
   2. Kleur de zijkant van het monster met 5 druppels 2% uranylacetaat. Dep elke extra hoeveelheid vlek weg met filterpapier en laat het rooster enkele uren of een nacht volledig drogen. Visualiseer de monsters met een elektronenmicroscoop op 80 kV.
2. Immunogold etikettering
   1. Breng 10 μL van de EV-suspensie aan op een formvar/koolstof 400 mesh-rooster en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was het rooster drie keer in PBS en breng vervolgens 4% paraformaldehyde aan gedurende 10 minuten om het monster te fixeren. Was de roosters vijf keer met PBS.
   2. Blokkeer het rooster met drie wasbeurten PBS met 0,1% runderserumalbumine (BSA). Breng vervolgens 10 μL van een primair antilichaam gedurende 40 minuten aan bij kamertemperatuur (hier 1 μg / ml nluc-antilichaam). Was drie keer opnieuw met PBS met 0,1% BSA.
   3. Voeg 10 μL secundair goudgelabeld antilichaam toe aan het rooster en incubeer gedurende 40 minuten bij kamertemperatuur. Was de roosters drie keer met PBS.
      OPMERKING: Hier werd een geiten-antimuisantilichaam geconjugeerd met 10 nm gouden nanodeeltjes gebruikt na verdunning 1:10 in blokkerende buffer. Als gouden etikettering EV-visualisatie verdoezelt, kunnen in plaats daarvan secundaire antilichamen met kleinere gouden nanodeeltjes (bijv. 5 nm) worden gebruikt.
   4. Bevestig het rooster na 10 μL 2,5% glutaaraldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Was drie keer in PBS. Voer negatieve kleuring uit met 2% uranylacetaat (10 μL) gedurende 15 minuten. Integreer de monsters in 10 μL van 0,5% uranylacetaat en 0,13% methylcellulose-oplossing gedurende 10 minuten.
   5. Laat de monsterroosters een nacht bij kamertemperatuur drogen voordat ze op de elektronenmicroscoop worden afgebeeld.
   6. Bepaal op de microscoop acquisitiesoftware de belichting empirisch om de optimale kwaliteit van het beeld te verkrijgen (bijv. 0,80851 s in deze specifieke opstelling) en pas deze aan door deze waarde in het optievak belichtingstijd te typen. Selecteer de optie 80 kV en klik op Acquisitie starten om de afbeelding vast te leggen.

Resultaten

Om te beoordelen welke SEC-chromatografiefracties werden verrijkt voor EV's, werd de SEC-kolom geladen met 2 ml E. coli MP1-geconditioneerd kweekmedium dat 1.000 keer door TFF was geconcentreerd en werden sequentiële fracties verzameld. Met behulp van MRPS bleek dat fracties 1-6 de meeste EV's bevatten (figuur 2A). Latere fracties bevatten zeer weinig EV's, bestaande uit in plaats van EV-vrije eiwitten (figuur 2B). EV's hadden voornamelijk een diameter ...

Discussie

In het bovenstaande protocol wordt een methode beschreven die schaalbaar is en ev's betrouwbaar isoleert van verschillende gramnegatieve / positieve en aerobe / anaërobe bacteriën. Het heeft verschillende potentiële stoppunten tijdens de procedure, hoewel het beter is om te voorkomen dat het langer dan 48 uur duurt om EV's te isoleren van geconditioneerde bacteriële kweekmedia.

Ten eerste bestaat het uit het kweken van bacteriën om geconditioneerd bacteriekweekmedium te genereren. Het bleek da...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.5 mL flat cap, thin-walled PCR tubes	Thermo Scientific	3430	het is belangrijk om dunne PCR-buizen te gebruiken om nauwkeurige metingen met Qubit te verkrijgen
16% Paraformaldehyde (formaldehyde) waterige oplossing	Electron microscopy sciences	15700
250 mL Fiberlite polypropyleen centrifuge flessen	ThermoFisher	010-1495
500 mL Fiberlite polypropyleen centrifuge flessen	ThermoFisher	010-1493
65 mm Polypropyleen Ronde Bodem/Conische Fles Adapter	Beckman Coulter	392077	Laat Vivacell passen in rotor
Akkermansia mucinophila	ATCC	BAA-835
Amicon-15 (100 kDa MWCO)	MilliporeSigma	UFC910024
Avanti J-20 XPI centrifuge	Beckman Coulter		Niet meer verkocht door Beckman. Avanti J-26XP is het meest vergelijkbare moderne model.
Bacteroides thetaiotaomicron VPI 5482	ATCC	29148
Bifidobacterium breve	NCIMB	B8807
Bifidobacterium dentium	ATCC	27678
Brain Heart infusie (BHI) bouillon	Himedia	M2101	Na het autoclaven werden zowel BHI bouillon als agar in de anaërobe kamer geïntroduceerd, aangevuld met Menadione (1 µg/L), hematine (1,2 µg/L) en L-Cysteïne Hydrochloride (0,05%). Ze werden vervolgens minimaal 24 uur onder anaërobe omstandigheden geïncubeerd voordat ze werden geïnoculeerd met de anaërobe bacteriestammen.
C-300 microfluidics cartridge	Spectradyne
Chloramfenicol	MP Biomedicals	ICN19032105
Elektronenmicroscoop	FEI company	Tecnai G2 SpiritBT
Escherichia coli HST08 (Steller competente cellen)	Takara	636763
Escherichia coli MP1	Dr. Mark Goulian (geschenk)		commensale bacteriën afkomstig van muizendarm
Fiberlite 500 mL naar 250 mL adapter	ThermoFisher	010-0151-05	gebruikt met Fiberlite rotor om 250 mL flessen te kunnen gebruiken voor kleinere hoeveelheden van de startbacteriecultuur
Fiberlite vaste hoek centrifugerotor	ThermoFisher	F12-6x500-LEX	past op 6 x 500 mL flessen
Formvar Koolstof Film 400 Mesh, Koper	Electron microscopy sciences	FCF-400-CU
Glutaraldehyde (EM-kwaliteit, 10% waterige oplossing)	Electron microscopy sciences	16100
Hematine	ChemCruz	207729B	Voorraad oplossing werd gemaakt in 0,2 M L-histidine oplossing als  1,2 mg/mL
Infinite M Nano+ Microplate reader	Tecan		Dit apparaat werd gebruikt om de mCherry fluoresctie te meten
In-Fusion  HD Cloning Plus	Takara	638909	Voor het klonen van de PCR fragmenten in de PCR-lineairiseerde vectoren
JS-5.3 AllSpin Swing-Bucket Rotor	Beckman Coulter	368690
Lauria Bertani (LB) bouillon, Miller	Difco	244620
L-Cysteïne Hydrochloride	J.T. Baker	2071-05	Dit dient gewogen en direct aan de geautoclaveerde BHI media binnen de anaërobe kamer te worden toegevoegd
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Female Luer naar Slang Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - speciaal	HV-30800-08	verbindingsadapters voor filtratiebuiscircuit
Masterflex Fitting, Polypropylene, Straight, Male Luer naar Slang Barb Adapter, 1/8" ID; 25/PK	cole-parmer - speciaal	HV-30800-24	verbindingsadapters voor filtratiebuiscircuit
Masterflex L/S Analoge Variabele Snelheid Console Drive, 20 tot 600 rpm	Masterflex	HV-07555-00
Masterflex L/S Easy-Load Head voor Precision Buizen, 4-Roller, PARA Housing, SS Rotor	Masterflex	EW-07514-10
Masterflex L/S Precision Pompbuizen, PharmaPure, L/S 16; 25 ft	Cole Palmer	EW-06435-16	lage binding/lage uitloging buizen
Menadione (Vitamine K3)	MP	102259	Voorraad oplossing werd gemaakt in ethanol als 1 mg/mL
MIDIKROS 41.5CM 100K MPES 0.5MM FLL X FLL 1/PK	Repligen	D04-E100-05-N	TFF apparaat dat we hebben gebruikt om maximaal 2 L van E. coli cultuur supernatant te filteren
Nano-Glo Luciferase Assay Systeem	Promega	N1110	Deze testkit werd gebruikt om de luminescentie van het nluc reporter eiwit te meten
NanoLuc (Nluc) Luciferase Antilichaam, clone 965808	R&D Systems	MAB10026
nCS1 microfluidics resistieve puls detectie instrument	Spectradyne
nCS1 Viewer	Spectradyne		Analysesoftware voor deeltjesgrootteverdeling
OneTaq 2x Master Mix met standaard buffer	NEB	M0482	DNA polymerase master mix gebruikt voor routine PCR reacties voor koloniecontrole
Protein LoBind, 2,0 mL, PCR schone buizen	Eppendorf	30108450
Q5 High-Fidelity 2x Master Mix	NEB	M0492	DNA polymerase master mix gebruikt voor de PCR reacties die nodig zijn voor klonen
qEV original, 35 nm	Izon		maximaal invulvolume van 0,5 mL
qEV rack	Izon		voor gebruik met de qEV-original SEC kolommen
qEV-2, 35 nm	Izon		maximaal invulvolume van 2 mL
Qubit fluorometer	ThermoFisher		Artikel niet langer verkrijg