Methodenartikel

High-Throughput optische controle en opname calciumsignaal in iPSC-afgeleide cardiomyocyten voor toxiciteitstests en fenotypische geneesmiddelenscreening

4.7K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63175

⸱

31 maart 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1LumiSTAR Biotechnology, Inc., 2NEXEL Co., Ltd., 3Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University, 4Manchester Heart Centre, Manchester Royal Infirmary, Manchester University NHS Foundation Trust, 5Division of Cardiovascular Sciences, Manchester Academic Health Sciences Centre, University of Manchester, 6Division of Cell Matrix Biology and Regenerative Medicine, University of Manchester

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft volledig optische controle en observatie van geactiveerde cellulaire activiteit in iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM's) voor high-throughput geneesmiddelenscreening en toxiciteitstests. Multiparametrische kwantificering van fenotypische patronen in tijd en ruimte worden getoond. Langetermijneffecten van geneesmiddelen gedurende uren, of opeenvolgende metingen gedurende dagen, worden aangetoond.

Samenvatting

Begrijpen hoe prikkelbare cellen werken in gezondheid en ziekte en hoe dat gedrag kan worden veranderd door kleine moleculen of genetische manipulatie is belangrijk. Genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's) met meerdere emissievensters kunnen worden gecombineerd (bijvoorbeeld voor gelijktijdige observatie van verschillende subcellulaire gebeurtenissen) of worden gebruikt in uitgebreide toepassingen met andere lichtafhankelijke actuatoren in prikkelbare cellen (bijvoorbeeld het combineren van genetisch gecodeerde optogenetische controle met spectraal compatibele calciumindicatoren). Dergelijke benaderingen zijn gebruikt in primaire of stamcel-afgeleide neuronen, cardiomyocyten en bètacellen van de pancreas. Het was echter een uitdaging om de doorvoer of de duur van observatie van dergelijke benaderingen te verhogen vanwege beperkingen van de instrumenten, analysesoftware, indicatorprestaties en genleveringsefficiëntie. Hier wordt een hoogwaardige groene GECI, mNeonGreen-GECO (mNG-GECO) en rood verschoven GECI, K-GECO, gecombineerd met optogenetische controle om volledig optische controle en visualisatie van cellulaire activiteit te bereiken in een beeldvormingsformaat met hoge doorvoer met behulp van een High-Content Imaging System. Toepassingen die cardiotoxiciteitstests en fenotypische geneesmiddelenscreening demonstreren met gezonde en van patiënten afgeleide iPSC-CM's worden getoond. Bovendien worden multiparametrische beoordelingen met combinaties van spectrale en calciumaffiniteitsindicatorvarianten (NIR-GECO, LAR-GECO en mtGCEPIA of Orai1-G-GECO) ook gedemonstreerd tot verschillende cellulaire compartimenten.

Inleiding

Op mensen gebaseerde geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide modellen worden beschouwd als een veelbelovende oplossing voor de 3V-doelstellingen (vervanging, reductie en verfijning) die zijn uiteengezet voor dierstudies 1,2. iPSC-afgeleide cardiomyocyten zijn gebruikt voor ziektemodellering en medicijnontdekking omdat ze essentiële aspecten van de menselijke biologie samenvatten3. Calciumbeeldvorming, meestal met chemische kleurstoffen, is gebruikt om cellulaire activiteit voor en na medicamenteuze behandeling te observeren 4,5. Chemische op kleurstoffen gebaseerde calciumdetectiesondes remmen echter direct de Na, K-ATPase en verstoren de cellulaire functie6. Het volgen van dezelfde cellen over uren of dagen is dus problematisch wanneer chemische kleurstoffen worden gebruikt. Hier wordt een reeks genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's)7,8,9,10 gebruikt over een breed excitatie/ emissie- en calciumaffiniteitsspectrum om een cardiaal toxiciteitstestplatform te vormen dat real-time multi-organelmetingen over langere perioden biedt 11.

Om het high-throughput calcium-gebaseerde screeningsconcept in het iPSC-CM-model verder te ontwikkelen dan de eerder aangetoonde academische context met behulp van genetisch gecodeerde hulpmiddelen voor optische controle en calciumbeeldvorming door co-expressie van een rood verschoven calciumindicator, R-GECO of K-GECO met een optogenetisch hulpmiddel, chR212,13, zijn kant-en-klare virale kits gegenereerd. Door beeldvorming over te zetten in een instrument met een hoog gehalte dat is uitgerust met een auto-microfluïdisch systeem, wordt eenkanaals pipetteren van samengestelde toevoeging bovenop live-cell imaging gelegd. Ten slotte worden beide cruciale aspecten van het experimentele traject, beeldverwerking en analyse, verbeterd en geautomatiseerd.

Protocol

Linkerventrikel niet-verdichting cardiomyopathie (LVNC) patiënt iPSC-afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM) werden verstrekt door het National Taiwan University Hospital. De verzameling van patiëntmonsters voor herprogrammering naar iPSC en de onderhoudsprotocollen14 voor onderzoeksdoeleinden volgden de WMA-verklaring van Helsinki (ethische principes voor medisch onderzoek met menselijke proefpersonen) en werden goedgekeurd door de Institutional Review Board: Research Ethics Committee Office bij NTUH (#201612099RINC). Andere iPSC-CM's werden verkregen van commerciële leveranciers. Het gebruik van iPSC-derivaten vereist geen specifieke toestemmingen in onze instelling.

1. iPSC afgeleide cardiomyocytenpreparaat

  1. Bereid de multi-well plaat voor voordat iPSC-CM uit de koude opslag wordt verwijderd voor ontdooien. Bestrijk elke put van de 96-wells microplaat met 100 μL van 50 μg/ml fibronectine/0,2% gelatine-oplossing (zie Materiaaltabel) om alle oppervlakken grondig te bedekken.
  2. Incubeer de plaat bij 37 °C gedurende 1 uur in een bevochtigde incubator.
  3. Verwarm het medium (zie Materiaaltabel) gedurende 30 minuten tot kamertemperatuur voordat de cel ontdooit.
    OPMERKING: Het huidige protocol beschrijft de kamertemperatuur als 25 °C.
  4. Breng de iPSC-CM over van de opslagtank voor vloeibare stikstof naar een waterbad van 37 °C.
    OPMERKING: iPS-CM's worden meestal op droogijs verzonden door academische of commerciële bronnen. Ze worden na ontvangst tot gebruik overgebracht naar de opslag van vloeibare stikstof.
  5. Verwijder de injectieflacon voordat het ijs volledig smelt en besproei de injectieflacon met 75% ethanol.
  6. Breng de injectieflacon naar een bioveiligheidskast van klasse II en breng de inhoud voorzichtig over naar een nieuwe conische buis van 15 ml met 9 ml medium op kamertemperatuur.
  7. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
  8. Gooi het supernatant weg met een pipet en resuspenseer de cellen voorzichtig in 1 ml medium met 10 μM ROCK-remmer (Y27632) (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Vermijd herhaaldelijk pipetteren van ontdooide cellen om maximaal celherstel te garanderen.
  9. Verwijder de coatingoplossing uit de put en voeg snel 50 μL medium met 10 μM ROCK-remmer toe.
  10. Bevestig het aantal levensvatbare cellen met behulp van de trypan blue exclusion methode met een hemocytometer15.
  11. Plaatcellen in gecoate 96-well plaat met een dichtheid van 100.000-150.000 cel / cm2, volgens de instructies van de fabrikant16.
  12. Zorg er na 24 uur voor dat de cellen die aan het oppervlak van de plaat zijn bevestigd, in contact komen met andere cellen.
    OPMERKING: Enkele cellen overleven slecht in langdurige kweek en gedragen zich meestal gevarieerder.
  13. Vervang het voorverwarmde onderhoudsmedium om de 2 dagen.
    OPMERKING: Voor langdurige medicamenteuze behandeling werd de LVNC iPSC-CM elke 2 dagen vervangen met halve middelgrote vervangingen met of zonder geneesmiddelen met kleine moleculen.

2. Expressie van genetisch gecodeerde calciumindicatoren

  1. Na het plateren van de cellen gedurende 72 uur, ontdooit u de GECIIs virale kits (zie Tabel van materialen) op ijs.
  2. Bereid een 2x virale kit stock oplossing met het onderhoudsmedium.
  3. Bereid de cellen voor op infectie door het gemiddelde volume aan te passen tot 100 μL per putje. Voeg 100 μL van de voorgemengde virale oplossing toe en incubeer gedurende 8-16 uur bij 37 °C.
  4. Vervang door 200 μL voorverwarmd medium na incubatie.
  5. Visualiseer de GECI-expressie 24 uur na transductie met behulp van een beeldvormingssysteem (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Het expressieniveau bereikt het maximum op 48-72 uur na transductie. Cellen kunnen worden afgebeeld vanaf het 24-uurs tijdspunt. De signalen van GECI's houden echter langer dan een maand stand.
  6. Bewaar cellen in de bevochtigde incubator voordat functionele testen worden uitgevoerd.
  7. Infecteer de iPSC-CMs (LVNC patiënt-afgeleide iPSC-CMs) met ChR2-K-GECO virale kit (zie Tabel van materialen) op dag 25 na differentiatie met behulp van het infectieprotocol (stap 2.1-2.6).

3. Calciumbeeldvorming op basis van kleurstof met Fluo-4

  1. Los Fluo-4 poeder (zie materiaaltabel) op in DMSO als een voorraadoplossing (5 mM).
  2. Verdun de stamoplossing tot een concentratie van 10 μM Fluo-4 in de buffer van Tyrode.
    OPMERKING: De buffer van Tyrode bestaat uit 1,0 g/l natriumbicarbonaat, 0,2 g/l calciumchloride, 0,1 g/l magnesiumchloride, 0,2 g/l kaliumchloride, 8,0 g/l natriumchloride, 0,05 g/l natriumfosfaat monobasisch en 1,0 g/l D-glucose.
  3. Vervang het halve medium door 10 μM Fluo-4-oplossing (wat een eindconcentratie van 5 μM oplevert).
  4. Incubeer de cellen bij 37 °C gedurende 30 min.
  5. Was de cellen met de voorverwarmde buffer van Tyrode en vervang ze door het medium voordat ze beeld verkrijgen.
  6. Begin met opnemen met het streamacquisitieprotocol.
    OPMERKING: Streamacquisitie is continu het verkrijgen van afbeeldingen zonder intervaltijd. De slagfrequentie van iPSC-CM is ongeveer 1 Hz en dit streamacquisitieprotocol wordt gebruikt voor het verzamelen van kloppende patronen.

4. Beeldacquisitie en functionele testen voor toxiciteitstests en fenotypische screening

  1. Schakel alle apparaten van het High-Content Imaging System in (zie Materiaaltabel).
  2. Controleer of de kamertemperatuur 37 °C bereikt, met 5% CO 2-suppletie. Houd het systeem gedurende 2 uur in evenwicht voordat het beeld wordt verkregen.
    OPMERKING: Thermische drift is een belangrijk probleem voor live-cell observaties op lange termijn, 1 ° C kan het brandpuntsvlak met ~ 1 μm veranderen, dus het is essentieel om de lens en het podium de doeltemperatuur te laten bereiken voordat het beeld wordt verkregen.
  3. Open de beeldbewerkingssoftware (zie Materiaaltabel) en kies de plaatinstelling voor een plaat met 96 putten.
  4. Plaats een onbedekte plaat met 96 putten in de kamer en laad met de afdichtring met levende cellen erop.
    OPMERKING: De live-cell afdichtingsring is een adapter voor het bereiken van een omgevingsevenwicht.
  5. Kies de 20x (figuur 1 en figuur 2), 60x (figuur 3 en figuur 4) en 20x (figuur 5) waterdompeling objectieflens op basis van de vereiste ruimtelijke resolutie.
  6. Pas de focus aan om duidelijke beelden te maken voordat de experimentele acquisitie plaatsvindt.
  7. Selecteer 3-5 regio's willekeurig per put voor het registreren van calciumactiviteit.
    OPMERKING: Elk gebied moet ten minste 20 cellen (n ≥ 20) bevatten.
  8. Kies de juiste filters voor verschillende indicatoren. FITC 475/536 voor mNG-GECO, mtGCEPIA3 en Oria1-G-GECO; Cy5 631/692 voor NIR-GECO2; ER 530/593 voor ER-LAR-GECO; Texas Red 560/624 voor K-GECO.
  9. Stel het juiste LED-vermogen (Light-Emitting Diode) in voor elk gebruikt beeldkanaal.
    OPMERKING: Bij het optimaliseren van het LED-vermogen voor beeldacquisitie door signaal (gedetecteerde intensiteit van het object) tot ruis (gedetecteerde intensiteit van de achtergrond), moet de S / N-verhouding hoger zijn dan 2. In dit protocol, 10% LED-voeding voor TRITC en FITC; 20% voor Cy5 was typisch.
  10. Stel de belichtingstijd van de camera in op maximaal 40 ms (25 Hz) en een opnameduur van 30 sfor stream acquisitie om calciumtransiënten te observeren die zijn gerapporteerd door mNG-GECO- en K-GECO-sondes, uitgedrukt in cardiomyocyten (figuur 1-3 en figuur 5). Verhoog het LED-vermogen als het signaal /de ruis <2 is bij hogere framesnelheden.
  11. Optimaliseer voor optogenetische stimulatie (figuur 2 en figuur 3C, D) het vermogen (meestal 5% -10%) en de frequentie van blauw licht bij 1 Hz.
    OPMERKING: Over het algemeen klopt de menselijke iPSC-CM spontaan rond ~ 1 Hz en de operator moet sneller tempo maken dan de spontane snelheid.
  12. Als opeenvolgende (figuur 3) of uitgebreide (figuur 4) metingen zijn gepland, vermijd dan ten koste van alles fototoxiciteit. Dit kan betekenen dat de intensiteit van het verlichtingsvermogen moet worden verminderd en dit moet worden gecompenseerd door de belichtingstijd van de camera te verhogen, bijvoorbeeld tot 100 ms met het time-lapse-protocol dat wordt gebruikt voor driekanaals real-time observatie van subcellulaire Ca2+ signalen (figuur 4).
  13. Gebruik het asynchrone dispense protocol voor 10 mM cafeïnetoevoeging via het auto microfluïdica systeem (zie Tabel van materialen) (Figuur 4).
    OPMERKING: Het asynchrone dispense-protocol maakt beeldacquisitie mogelijk terwijl medicijnen zoals cafeïne worden toegevoegd, zonder hiaten tussen afbeeldingen.
  14. Begin met acquisitie.

5. Bereiding van kleine moleculen

  1. Resuspendeer de E4031, dofetilide en verapamil in DMSO en verdun ze met de buffer van Tyrode. De uiteindelijke concentratie DMSO in het medium was 0,1% (v/v).
  2. Bereid de samengestelde oplossingen op de dubbele (d.w.z. 2x) de gewenste werkconcentratie en balanceer bij 37 °C vóór toevoeging.
    OPMERKING: Het minimaliseren van temperatuurschommelingen na toevoeging van het medium is van vitaal belang, omdat contractiliteit temperatuurafhankelijk is en het effect van het veranderen van temperatuur snel is.
  3. Rangschik verbindingen naar het overeenkomstige doel goed.
  4. Voeg 100 μL van de dubbele sterkte (2x) verbindingen via het auto microfluïdicasysteem (zie Materiaaltabel) toe aan de putten en begin met de acquisitie na de gewenste (meestal 15 min) incubatietijd.

6. Beeldvormingsverwerking en -analyse

  1. Isoleer het signaalgebied van de achtergrond door het kenmerk van de puls gedurende de tijdsomwenteling automatisch met de software te detecteren.
  2. Gebruik de calciumpiekanalysesoftware (zie tabel met materialen) om de kloppende frequentie (BPM), het pieksignaal (amplitude), de calciumtransiënte duur 50% (CTD50), de calciumtransiënte duur 90% (CTD90), de stijgingstijd en de vervaltijd (figuur 1C) te analyseren.
    OPMERKING: In deze instellingen was fotobleaching zichtbaar gedurende de eerste 10 s en de signalen zijn daarna gestabiliseerd. Zo werd de calciumpiek geanalyseerd van 11-30 s. In driekanaalsopnamen (figuur 4) wordt de celcontour handmatig begrensd voor het meten van intensiteitsverandering.

Resultaten

De waarneming van spontane calciumoscillatie in mNG-GECO10, uitgedrukt door van iPSC afgeleide cardiomyocyten (iPSC-CM's) met of zonder medicamenteuze behandelingen, wordt aangetoond in figuur 1 en animatievideo 1. Kinetische sporen verkregen met behulp van mNG-GECO tonen aan dat kleine moleculaire ionkanaalremmers, verapamil, dofetilide en E4031, calciumtransiënten beïnvloedden (figuur 1B) zoals verwacht. De typische calciumtransiënt in figuur 1C kan worden geanalyseerd door calciumpiekanalysesoftware om pieksignaal (amplitude), calciumtransiënte duur 50% (CTD50), calciumtransiënte duur 90% (CTD90), stijgingstijd en vervaltijd af te leiden. Verapamil, een L-type calciumblokker17, remt de calciuminstroom in de cellen volledig zoals verwacht (figuur 1B). Dofetilide en E4031 zijn hERG-kanaalremmers 18,19,20, vermeld als experimentele klasse III antiaritmica. De vervaltijd wordt verlengd met zowel Dofetilide (p < 0,05) als E4031-behandeling (p < 0,001) in vergelijking met de voertuiggroep. Verlenging van CTD50 (p < 0,01) en CTD90 (p < 0,001) met E4031-behandeling werd waargenomen in vergelijking met alleen het medium (tabel 1), deze resultaten zijn consistent met gerapporteerde effecten op het QT-interval, een klinisch relevante meting van repolarisatie bepaald op basis van het oppervlakte-elektrocardiogram uit een lange tijd tussen het begin van de Q-golf en het einde van de T-golf, in eerdere studies 12,21.

Een moeilijkheid van CTD-beoordeling bij spontaan kloppende cellen is de variabiliteit die de beatsnelheid oplegt aan de CTD. Dit is een bijzonder probleem voor het iPSC-CM-model, waar elke put van een 96-putplaat zijn eigen slagsnelheid kan hebben, ook al zijn alle cellen afkomstig van dezelfde ouderflacon. Het is mogelijk om een beat rate op te leggen door optische of elektrische pacing. Om de dosisrespons van E4031 onder gestandaardiseerde tempoomstandigheden te evalueren, werden ChR2 en K-GECO7 die iPSC-CM's tot expressie brengen optisch geregeld met behulp van 1 Hz 470 nm lichtpulsen en waargenomen met behulp van het rode K-GECO-signaal (figuur 2A en aanvullende figuur 1). Progressieve reducties van de piekamplitude (p < 0,01) en toename van de vervaltijd (p < 0,05) van de calciumtransiënten treden op bij toenemende concentraties van E4031 (figuur 2B1). Een dosisafhankelijk effect van E4031 was het meest duidelijk voor de verlagingen van de piekamplitude (figuur 2B1,B2).

Hoewel kortlopende studies die minuten duren meestal worden gebruikt voor cardiotoxiciteitsbeoordelingen, is er een blinde vlek voor chronische toxiciteitsbeoordelingen die parallel lopen met blootstelling van patiënten aan geneesmiddelen gedurende weken, maanden of jaren. Het zou voordelig zijn om ziekte- of toxiciteitseffecten te bestuderen gedurende de intervallen die de behandelingsduur weerspiegelen die relevant zijn voor de klinische praktijk. We gebruikten ons volledig optische controle- en detectiesysteem om de van iPSC afgeleide cardiomyocyten van een patiënt met linkerventrikel niet-verdichting (LVNC) te bestuderen. iPSC-CMs werden getransduceerd met een K-GECO viral kit (stap 2.2-2.6) na differentiatie Dag 25. Het K-GECO-signaal werd vervolgens elke 1-2 weken in dezelfde putjes gevolgd, met of zonder aanvullende medicamenteuze behandelingen. Zowel spontane calciumactiviteit (figuur 3A,3B) als calciumdynamica onder optische pacing (figuur 3C,D, stap 4.11) werden verkregen met behulp van het high-Content Imaging System (stap 4.1-4.12) en verwerkt door calciumpiekanalysesoftware (stap 6). Zoals aangetoond in figuur 3A,C, blijven heldere calciumtransiënten een maand na virale transductie zichtbaar, met of zonder het extra licht dat wordt gebruikt voor optische pacing. Dit werk identificeerde een geneesmiddel dat de slagsnelheid lijkt te verhogen, het contractie-interval regulariseert en de voorbijgaande calciumamplitude in het LVNC iPSC-CM-model verhoogt (figuur 3A, B). Er zijn twee belangrijke observaties te maken uit deze gegevens. Ten eerste, vanuit het therapeutische perspectief, lijkt het medicijneffect duurzaam op dag 63 en dag 70-tijdspunten. Ten tweede, en van belang voor een veld dat in het algemeen samengestelde effecten test tijdens korte vensters (<1 min) op eerdere tijdstippen (meestal <50 dagen); de ziekte fenotype modificerende effecten van de verbinding zijn pas duidelijk na dag 60, wat suggereert dat het gemakkelijk kan zijn om geneesmiddelen die langzame werkingsmechanismen hebben in standaard screeningprotocollen te verdisconteren.

De variabiliteit van de beatfrequentie en de daaropvolgende impact op de transiënte duur van calcium, is niet alleen een goed-tot-goed probleem op een bepaald tijdstip. Het verandert ook als iPSC-CM in cultuur worden gehandhaafd, wat binnen een put in de tijd varieert (figuur 3B). Om consistentie op te leggen binnen sequentiële experimenten, kan 1 Hz optische pacing worden toegepast met of zonder medicamenteuze behandeling (figuur 3C,D). Hier hoewel de dag 63-resultaten de bemoedigende trends in de calciumtransiënt laten zien met een significant hogere amplitude, kortere CTD90 en kortere vervaltijd; door het tijdstip van 70 dagen - en indicatief voor de noodzaak van chronische beoordelingen tijdens het screeningsproces van geneesmiddelen voor zeldzame ziekten - vroeg nadat depolarisaties (EAD) zijn gedetecteerd. De waarde van het toevoegen van een pacingprotocol aan ziektefenotypering, of evaluatie van kleine moleculen, kan kwalitatief worden beoordeeld door vergelijking van de resultaten in figuur 3B, D voor beat rate, calcium transient amplitude, CTD90 en vervaltijd.

Een voordeel van een GECI, in vergelijking met chemische kleurstof, gebaseerde methodologie om de calciumtransiënt te visualiseren, is het vermogen om de sonde te beperken tot een specifiek compartiment in een cel. Dit kan verder worden uitgebreid door meerdere kleur- en/of affiniteitsvarianten in enkele cellen te multiplexen. Vandaar dat verschillende GECI's, waaronder ER-LAR-GECO9, mtGCEPIA22,23 (of Oria1-G-GECO) en NIR-GECO2 8,24, zijn ontwikkeld voor expressie afzonderlijk of in combinatie, in celmodellen voor real-time calciumactiviteitsmeting die ontstaat in respectievelijk het endoplasmatisch reticulum / sarcoplasmatisch reticulum (ER / SR), mitochondriën (of CRAC-kanaal) en cytosol. Ze kunnen worden gecombineerd in het iPSC-CM-model (figuur 4A, C) om de interactie tussen verschillende intracellulaire calciumvoorraden te bestuderen. Een cafeïnebehandeling van 10 mM kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de SR-calciumopslag te legen. Hier liep een afname van het ER-LAR-GECO-signaal (indicatief voor verlies van calcium uit de SR) parallel met een afname van het NIR-GECO-signaal (indicatief voor een toename van de cytosolische calciumconcentratie) zoals verwacht. Hoe andere intracellulaire compartimenten door deze fluctuaties worden beïnvloed, is niet goed bestudeerd. Toch laat de opname van een groene mitochondriaal gerichte mtGCEPIA3 zien dat calciumopname optreedt in mitochondriën in deze omstandigheden (figuur 4A, B).

Evenzo kan het visualiseren van het samenspel tussen verschillende calciumstromen worden gezien door een sonde, Orai1-G-GECO25, op te nemen om het calciumafgifte-geactiveerde kanaal (CRAC) Ca2 + stroom te onthullen (figuur 4C, D). In het iPSC-CM-model neemt dit signaal toe met de spontane cytosolische calciumtransiënt (figuur 4D1,D2). In overeenstemming hiermee roept de behandeling met cafeïne een grote calciumtransiënt op in zowel het cytosol als uit het Orai1-kanaal.

Er wordt erkend dat de meeste calciumtransiënte beeldvorming in cardiomyocytenmodellen is bepaald met behulp van calciumkleurstoffen26. Een genetisch gecodeerde calciumindicator werd vergeleken met een chemische kleurstof in het van iPSC afgeleide cardiomyocytenmodel om een zij-aan-zij vergelijking van verschillende calciumbeeldvormingsbenaderingen mogelijk te maken. K-GECO expresserende iPSC-CMs werden afgebeeld naast Fluo-4 loaded cellen. K-GECO die cardiomyocyten tot expressie bracht, vertoonde consistent kloppend gedrag in de loop van de tijd (figuur 5A,C). Fluo-4-belasting had echter invloed op zowel de beatfrequentie als CTD in dit model (figuur 5B, C), wat suggereert dat Fluo-4 zelf de resultaten van dergelijke experimenten zou kunnen beïnvloeden. Dit zal vooral het geval zijn na langdurige blootstelling aan de beeldvormingsonde, die kan optreden in het meerwandige beeldvormingsformaat als well-by-well beeldvorming plaatsvindt met een minuut verblijftijd per put.

figure-results-1
Figuur 1: Ionkanaalremmers met kleine moleculen toegepast op van iPSC afgeleide cardiomyocyten. (A-B) Time-lapse beelden van iPSC-CM die mNG-GECO tot expressie brengen, genomen bij 25 Hz. Schaalbalk = 50 μm. (B) Representatieve Ca2+ oscillaties na toevoeging van de verbinding. Fluorescerende signalen verkregen uit mNG-GECO-expressiecellen worden gepresenteerd als een fluorescentieverhouding F / F0, waarbij F0 wordt gedefinieerd als basale intensiteit en F de intensiteit die op elk tijdstip wordt gedetecteerd. (C) Calciumpiekanalysesoftware kan parameters extraheren, waaronder halve maximale breedte (CTD50), 90% voorbijgaande duur (CTD 90), stijgtijding en vervaltijd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Voorbeeld van een dosisrespons met de hERG-remmer E4031 binnen een optisch pacingsysteem. (A) Sporen van optische stimulatie met 10% blauw licht in verschillende concentraties E4031. Time-lapse beelden van iPSC-afgeleide cardiomyocyten die K-GECO tot expressie brengen, genomen bij 25 Hz. (B1) Representatieve sporen van calciumtransiënten verkregen met verschillende samengestelde doses. Piekanalyse en dosis-respons van E4031 in amplitude (B2) en vervaltijd (B3). Blauwe balken geven 1 Hz 470 nm pulslichtstimulatie aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Volledig optisch platform toegepast voor langdurige fenotypische screening van geneesmiddelen in lvnc-patiënt-afgeleide cardiomyocyten. (A) Representatief spoor van spontane kloppende activiteit in van de patiënt afgeleide cardiomyocyten (postdifferentiatie Dag 70) met (rood) of zonder (blauw) 5 μM medicamenteuze behandeling. (B) Piekanalyse van spontane kloppende activiteit met of zonder 5 μM medicamenteuze behandeling. (C) Intensiteitssporen van geneesmiddelrespons in patiënt-afgeleide iPSC-CM onder 1 Hz optische stimulatie. (D) Piekanalyse van van de patiënt afgeleide cardiomyocyten met 1 Hz optische stimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Drie kanalen subcellulaire Ca2+ beeldvorming in het iPSC-CM model. (A-B) iPSC-CMs werden getransduceerd met subcellulaire calciumsondes voor het cytoplasma, NIR-GECO2 (rood), het endoplasmatisch reticulum ER-LAR-GECO (geel) en mtGCEPIA3 (cyaan), een mitochondriale Ca2+ indicator. (B) Driekanaals time-lapse calcium beeldvorming voor en na 10 mM cafeïnebehandeling. (C-D) iPSC-CMs getransduceerd met cytoplasmatische, NIR-GECO2 (rood), endoplasmatisch reticulum ER-LAR-GECO (geel) en CRAC-kanaalindicatoren Orai1-G-GECO (cyaan) werden gevisualiseerd. (D) Driekanaals time-lapse calcium beeldvorming werd vastgelegd. (D1) Spontane beat-to-beat activiteit werd waargenomen met NIR-GECO2 en Orai1-G-GECO. (D2) Calciumefflux van het ER (afname van het ER-LAR-GECO-signaal) ging gepaard met een toename van het cytosolische calciumsignaal bij cafeïnebehandeling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Vergelijking van de genetisch gecodeerde calciumindicator (K-GECO) met de chemische calciumgevoelige kleurstof (Fluo-4) in iPSC-CM's. (A-B ) Representatieve calciumsporen van K-GECO (A) en Fluo-4 (B) worden in de loop van de tijd gepresenteerd. (C) Calciumtransiënte analyse van K-GECO getransduceerd, of Fluo-4 geladen iPSC-CM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

BPMCTD50 (s)CTD90 (s)Amplitude (F/F0)StijgtijdVervaltijd(en)
Voertuig (0,1% DMSO)112.3657+/-10.950.25+/-0.040.41+/-0.011.99+/-0.020.07+/-0.010.28+/-0.01
Verapamil (1 miljoen euro)0-----
Dofetilide (5 nM)103.42+/-9.87**0.23+/-0.030.46+/-0.031.91+/-0.030.07+/-0.010.35+/-0.02*
E4031 (30 nM)75.73+/-12.08***0.37+/-0.04**0.58+/-0.08***1.55+/-0.02**0.11+/-0.04***0.35+/-0.07**

Tabel 1: Effecten van samengestelde toevoeging aan voorbijgaande calciumparameters in het iPSC-CM-model. Significantiewaarden worden aangegeven met *(p ≤ 0,05), **(p < 0,01) en ***(p < 0,001).

Geanimeerde video 1: Spontane calciumactiviteit werd waargenomen door mNG-GECO in iPSC-afgeleide cardiomyocyten met alleen vehikel. Er wordt een Pseudo-gekleurde film van een grijsschaalbeeld voorzien. Klik hier om deze video te downloaden.

Aanvullende figuur 1: Schematische weergave van de adenovirale vector. Dit omvat kanaal rhodopsine ChR2 als actuator, met een rode fluorescerende calciumindicator K-GECO als calciumverslaggever voor een volledig optische test. Het lichtgevoelige ionkanaal maakt het mogelijk om prikkelbare cellen te depolariseren door licht in het blauwgroene bereik van het zichtbare spectrum. Bij deze experimenten werd 470 nm licht gebruikt. Calciumtransiënten in prikkelbare cellen kunnen tegelijkertijd in beeld worden gebracht door K-GECO, dat groen excitatielicht vereist en rode emissies produceert. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Om met succes high-throughput screening uit te voeren, moeten signalen gelijkmatig over het kweekvat worden verdeeld, zodat willekeurig geselecteerde regio's van belang (ROI's) automatisch kunnen worden toegepast tijdens beeldvormingsacquisitie. Hoewel chemische calciumindicatoren gemakkelijk aan deze eis voldoen, hebben genetisch gecodeerde sondes historisch gezien patches geproduceerd, in plaats van vellen, van signaal die het gebruik ervan beperken. Het gebruik van een viraal transductiesysteem levert hoge 27,28 en equivalente expressieniveaus van meerdere indicatoren tussen de doelcellen in vergelijking met conventionele transfectiemethoden. Verschillende celtypen kunnen verschillende promotors vereisen en de keuze van het genafgiftesysteem moet mogelijk dienovereenkomstig veranderen 29,30,31. In heterogene celmodellen kunnen transductie en expressie-efficiëntie verschillen in specifieke celtypen. Aan de ene kant kan dit de toepassing beperken tot bepaalde cellen, maar het fenomeen kan worden gebruikt om bepaalde cellen in een co-kweeksysteem te onderscheiden32.

De belangrijkste impact van deze aanpak is de bevrijding van de één-op-één relatie tussen de experimentator en de steekproef door automatisering. In een standaard multi-well experiment, voor het verzamelen van gegevens op vier posities binnen een enkele put, schatten we dat het ongeveer 15 uur duurt bij de microscoop om 30 s video's te verzamelen van een 96 putplaat. In het geautomatiseerde systeem duurt dit ~4 uur. Bovendien duurt de handmatige analyse van de gegevens veel langer dan data-acquisitie. Het analysesysteem dat hier wordt gebruikt, is ongeveer 200 keer sneller dan het handmatige equivalent. Het netto resultaat is een verbeterde workflow en hoge kosten- en tijdsbesparingen.

In tegenstelling tot primaire cardiomyocyten geladen met calciumkleurstoffen die in de orde van uren overleven, kunnen GECI's uitgedrukt in iPSC-CM's via virale toedieningssystemen een signaal opleveren in een experimenteel model dat een paar maanden leeft. Deze modellen kunnen worden onderhouden in een multi-well formaat en tegelijkertijd worden gevolgd voor seriële analyse in high-content beeldvormingssystemen die zijn ontwikkeld voor screening van kleine moleculen. Dit produceert een eenvoudig menselijk experimenteel platform om medicijneffecten te testen over een duur die dichter bij die van patiënten ligt (weken of maanden) in plaats van de minuten die doorgaans worden gebruikt in toxicologische testen.

Het systeem kan worden uitgebreid om multiparametermetingen te leveren door GECI's op te nemen met verschillende emissie-eigenschappen van groen tot bijna infrarood. Dergelijke experimenten vereisen goed excitatielicht en filtersets in het experimentele ontwerp om signalen gescheiden te houden. Brede toepassing in een context van geneesmiddelenscreening vereist robuuste en efficiënte analyseplatforms naast het verstrekken van geneesmiddelen. Hoewel het hier beschreven model zich richt op het gebruik van meerdere dynamische calciumindicatoren, kan dit worden gewijzigd in structurele markers van celvorm of -functie. Deze zijn meestal gemakkelijker te visualiseren omdat ze weinig beat-to-beat variabiliteit vertonen in vergelijking met de honderdvoudige variatie in intracellulaire calciumconcentratie. Deze benadering kan met name waardevol zijn voor zeldzame ziekten waarbij het iPSC-tussenproduct dat is afgeleid van patiënten alle genetische drivers en modifiers van een bepaalde aandoening kan bevatten die kunnen worden bewaard in een schaalbaar celmodel, waardoor de ontdekking van geneesmiddelen bij verschillende ziekten op basis van cellulaire fenotypen wordt vergemakkelijkt die onafhankelijk van het onderliggende biologische mechanisme kunnen worden gevisualiseerd, wat een uitdaging kan zijn om op te helderen.

Openbaarmakingen

LumiSTAR heeft patentbescherming aangevraagd voor het gebruik van K-GECO, NIR-GECO en LAR-GECO.

Dankbetuigingen

We bedanken prof. Robert Campbell van de Universiteit van Tokio voor het delen van het materiaal en de waardevolle discussie; Dr. Chia-Lin Ho in Molecular Device voor technische ondersteuning.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
96-well platePerkin Elmer6055302
auto microfluidic systemMolecular DeviceEen apparaat heeft een pipet met een enkele kanaal die kan worden gebruikt om automatisch verbinding toe te voegen
CaffeïneSigma-AldrichC0750
Cardiosight-S l iPSC afgeleide cardiomyocytenNEXELC-002
Dimethyl sulfaatMillipore Sigma1096780100
DofetilideSigma-AldrichPZ0016
E4031Tocris1808
ER-LAR-GECO virale kitLumiSTARAA001aRod-verschoven GECI verpakt in adeno-virale vector
FibronectineSigma-AldrichF1141
Fluo-4 AMInvitrogenF14201Chemische calcium gevoelige kleurstof
GelatineSigma-AldrichG1890
ImageXpress Micro Confocal High-Content Imaging SystemMolecular Device
iPSC-CMs OnderhoudsmediumNEXELCMS-002iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium) + Cardiosight-S Supplement
iPSC-CMs Medium (Cardiosight-S medium)NEXELCMS-002
K-GECO virale kitLumiSTARAA005aRod-verschoven GECI verpakt in adeno-virale vector
LumiCAL softwareLumiSTARLUCS01aSoftware voor analyse van calciumpiek in cardiomyocyten
mNG-GECO virale kitLumiSTARAL008aHelderdere groene GECI verpakt in lenti-virale vector
mt-GCEPIA3 virale kitLumiSTARAL011aGECI gericht op mitochondriën verpakt in lenti-virale vector
NIR-GECO virale kitLumiSTARAV004aNaar infrarood GECI verpakt in virale vector
Orai1-GGECO virale kitLumiSTARAL010aGECI gericht op Orai1 verpakt in lenti-virale vector
Tyrode's zoutenSigma-AldrichT2145
Verapamil hydrochlorideSigma-AldrichV4629
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254

Referenties

  1. O'Connor, M. D. The 3R principle: Advancing clinical application of human pluripotent stem cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (2), 21(2013).
  2. Ebert, A. D., Liang, P., Wu, J. C. Induced pluripotent stem cells as a disease modeling and drug screening platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  3. Ovics, P., et al. Drug development and the use of induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for disease modeling and drug toxicity screening. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), 7320(2020).
  4. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
  5. Takahashi, A., Camacho, P., Lechleiter, J. D., Herman, B. Measurement of intracellular calcium. Physiological Reviews. 79 (4), 1089-1125 (1999).
  6. Smith, N. A., et al. Fluorescent Ca(2+) indicators directly inhibit the Na,K-ATPase and disrupt cellular functions. Science Signaling. 11 (515), (2018).
  7. Shen, Y., et al. A genetically encoded Ca2+ indicator based on circularly permutated sea anemone red fluorescent protein eqFP578. BMC Biology. 16 (1), 9(2018).
  8. Qian, Y., et al. A genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicator. Nature Methods. 16 (2), 171-174 (2019).
  9. Wu, J., et al. Red fluorescent genetically encoded Ca2+ indicators for use in mitochondria and endoplasmic reticulum. Biochemical Journal. 464 (1), 13-22 (2014).
  10. Zarowny, L., et al. and high-performance genetically encoded Ca2+ indicator based on mneongreen fluorescent protein. ACS Sensors. 5 (7), 1959-1968 (2020).
  11. Potekhina, E. S., et al. Drug screening with genetically encoded fluorescent sensors: today and tomorrow. International Journal of Molecular Sciences. 22 (1), 148(2021).
  12. Chang, Y. -F., et al. Non-invasive phenotyping and drug testing in single cardiomyocytes or beta-cells by calcium imaging and optogenetics. PLoS One. 12 (4), 0174181(2017).
  13. Chang, Y. -F., Arai, Y., Nagai, T. Optogenetic activation during detector "dead time" enables compatible real-time fluorescence imaging. Neuroscience Research. 73 (4), 341-347 (2012).
  14. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  15. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111, 1-3 (2015).
  16. Jang, Y., et al. Modulating cardiomyocyte and fibroblast interaction using layer-by-layer deposition facilitates synchronisation of cardiac macro tissues. Soft Matter. 16 (2), 428-434 (2020).
  17. Leonard, R. G., Talbert, R. L. Calcium-channel blocking agents. Clinical Pharmacology. 1 (1), 17-33 (1982).
  18. Sanguinetti, M. C., Jurkiewicz, N. K. Two components of cardiac delayed rectifier K+ current. Differential sensitivity to block by class III antiarrhythmic agents. The Journal of General Physiology. 96 (1), 195-215 (1990).
  19. Lees-Miller, J. P., Duan, Y., Teng, G. Q., Duff, H. J. Molecular determinant of high-affinity dofetilide binding to HERG1 expressed in Xenopus oocytes: Involvement of S6 sites. Molecular Pharmacology. 57 (2), 367-374 (2000).
  20. Kamiya, K., Niwa, R., Mitcheson, J. S., Sanguinetti, M. C. Molecular determinants of HERG channel block. Molecular Pharmacology. 69 (5), 1709-1716 (2006).
  21. Fukushima, H., et al. Specific induction and long-term maintenance of high purity ventricular cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells. PLoS One. 15 (11), 0241287(2020).
  22. Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophysical Journal. 111 (6), 1119-1131 (2016).
  23. Suzuki, J., et al. Imaging intraorganellar Ca2+ at subcellular resolution using CEPIA. Nature Communications. 5, 4153(2014).
  24. Qian, Y., et al. Improved genetically encoded near-infrared fluorescent calcium ion indicators for in vivo imaging. PLoS Biology. 18 (11), 3000965(2020).
  25. Dynes, J. L., Amcheslavsky, A., Cahalan, M. D. Genetically targeted single-channel optical recording reveals multiple Orai1 gating states and oscillations in calcium influx. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (2), 440-445 (2016).
  26. Broyles, C. N., Robinson, P., Daniels, M. J. Fluorescent, bioluminescent, and optogenetic approaches to study excitable physiology in the single cardiomyocyte. Cells. 7 (6), 51(2018).
  27. Cao, F., et al. Comparison of gene-transfer efficiency in human embryonic stem cells. Molecular Imaging and Biology. 12 (1), 15-24 (2010).
  28. Ma, Y., Ramezani, A., Lewis, R., Hawley, R. G., Thomson, J. A. High-level sustained transgene expression in human embryonic stem cells using lentiviral vectors. Stem Cells. 21 (1), 111-117 (2003).
  29. Haery, L., et al. Adeno-associated virus technologies and methods for targeted neuronal manipulation. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 93(2019).
  30. Nieuwenhuis, B., et al. Optimization of adeno-associated viral vector-mediated transduction of the corticospinal tract: Comparison of four promoters. Gene Therapy. 28 (1), 56-74 (2021).
  31. Smith, R. L., et al. Characterization of promoter function and cell-type-specific expression from viral vectors in the nervous system. Journal of Virology. 74 (23), 11254-11261 (2000).
  32. Fang, Y., et al. Safety and efficacy of an immune cell-specific chimeric promoter in regulating anti-PD-1 antibody expression in. CAR T cells. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 19, 14-23 (2020).

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Registratie van calciumsignaleniPSC cardiomyocytenhigh throughput imagingoptogenetische controlegenetisch gecodeerde calciumindicatorencardiotoxiciteitstestenanalyse van calciumtransi ntenhigh content imaging systeemmultiwell plaatassay
High-Throughput optische controle en opname calciumsignaal in iPSC-afgeleide cardiomyocyten voor toxiciteitstests en fenotypische geneesmiddelenscreening
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.