Identificatie van de bron van uitgescheiden eiwitten in de nier door Brefeldin A-injectie

Samenvatting

Het identificeren van het celtype dat verantwoordelijk is voor het afscheiden van cytokinen is noodzakelijk om de pathobiologie van nierziekte te begrijpen. Hier beschrijven we een methode om nierweefsel kwantitatief te kleuren voor cytokines geproduceerd door nierepitheel- of interstitiële cellen met behulp van brefeldin A, een secretieremmer, en celtypespecifieke markers.

Samenvatting

Chronische nierziekte (CKD) staat in de top tien van belangrijkste doodsoorzaken in de VS. Acuut nierletsel (AKI), hoewel vaak te herstellen, maakt patiënten vatbaar voor CKD op latere leeftijd. Nierepitheelcellen zijn geïdentificeerd als belangrijke signaalknooppunten in zowel AKI als CKD, waarbij de cellen het verloop van de ziekte kunnen bepalen door de secretie van cytokines en andere eiwitten. Vooral bij CKD hebben verschillende bewijslijnen aangetoond dat onaangepast gerepareerde buisvormige cellen de ziekteprogressie stimuleren door de secretie van transformerende groeifactor-bèta (TGF-β), bindweefselgroeifactor (CTGF) en andere profibrotische cytokines. Het identificeren van de bron en het relatieve aantal uitgescheiden eiwitten van verschillende celtypen in vivo blijft echter een uitdaging.

Dit artikel beschrijft een techniek waarbij brefeldin A (BFA) wordt gebruikt om de secretie van cytokinen te voorkomen, waardoor de kleuring van cytokinen in nierweefsel mogelijk wordt met behulp van standaard immunofluorescerende technieken. BFA remt het transport van het endoplasmatisch reticulum (ER) naar het Golgi-apparaat, dat nodig is voor de secretie van cytokines en andere eiwitten. Injectie van BFA 6 uur voor het offeren leidt tot een opbouw van TGF-β, PDGF en CTGF in de proximale tubuluscellen (PTC's) in een muizencisplatinemodel van AKI en TGF β in een aristolochinezuur (AA) muismodel van CKD. Uit analyse bleek dat BFA + cisplatine of BFA + AA het TGF-β-positieve signaal significant verhoogde in vergelijking met BFA + zoutoplossing, cisplatine of AA alleen. Deze gegevens suggereren dat BFA kan worden gebruikt om het celtype te identificeren dat specifieke cytokinen produceert en om de relatieve hoeveelheden en/of verschillende soorten geproduceerde cytokinen te kwantificeren.

Inleiding

Geschat wordt dat >10% van de wereldbevolking een vorm van nierziekte heeft¹. Gedefinieerd door het snelle begin, is AKI grotendeels te genezen; een episode van AKI kan patiënten echter vatbaar maken voor het ontwikkelen van CKD op latere leeftijd ^2,3. In tegenstelling tot AKI wordt CKD gekenmerkt door progressieve fibrose en verslechtering van de nierfunctie, wat leidt tot nierziekte in het eindstadium waarvoor nierfunctievervangende therapie nodig is. De meeste verwondingen aan de nieren zijn gericht op de gespecialiseerde epitheelcellen, zoals podocyten of proximale tubuluscellen, waaruit het nefron^{bestaat 4,5}. Na verwonding helpen de overlevende epitheelcellen de herstelreactie te coördineren door de afscheiding van cytokines en andere eiwitten. Op deze manier kunnen de overlevende cellen de immuunrespons moduleren, de hermodellering van de extracellulaire matrix sturen en het herstel van organen bevorderen.

Cytokinen zijn kleine, uitgescheiden eiwitten die essentieel zijn voor het moduleren van de rijping, groei en het reactievermogen van meercellige organismen ^6,7. Ze functioneren als signaalboodschappers tussen verschillende celtypen, waaronder immuun- en epitheelcellen⁸. Hoewel wordt aangenomen dat cytokinen voornamelijk worden uitgescheiden door immuuncellen, heeft langdurig onderzoek aangetoond dat nierepitheel- en interstitiële cellen ook cytokinen afscheiden als signalen voor andere residente niercellen, zoals tubuluscellen, interstitiële cellen en immuuncellen ^9,10. Met name PTC's spelen een belangrijke rol in de start- en herstelfase na AKI¹¹. Het is echter bekend dat maladaptief gerepareerde PTC's profibrotische cytokines afscheiden, zoals transformerende groeifactor-β (TGF-β), van bloedplaatjes afgeleide groeifactor-D (PDGF-D) en bindweefselgroeifactor (CTGF), wat bijdraagt aan de progressie van CKD¹². Nierepitheelcellen gebruiken dus uitgescheiden cytokines om nierbeschadiging te moduleren.

Hoewel bekend is dat nierepitheelcellen cytokinen afscheiden, waren de exacte bron en relatieve bijdrage van elk celtype moeilijk te bepalen vanwege de technische uitdagingen van het bestuderen van uitgescheiden eiwitten¹³. Flowcytometrie, een veelgebruikte benadering om cytokines te meten, is een uitdaging om uit te voeren op beschadigde nieren, vooral bij zeer fibrotische nieren. Met Cre-recombinase aangedreven door een cytokinepromotor, worden cytokinereportermuizen vaak gebruikt om het celtype te identificeren dat een bepaald cytokine tot expressie brengt. Het gebruik van reportermuizen is echter beperkt vanwege de vereiste om reportermuizen te kruisen in verschillende knock-outachtergronden, het gebrek aan geschikte reporters en het feit dat er slechts één cytokine tegelijk kan worden geanalyseerd. Het is dus noodzakelijk om een eenvoudige, veelzijdige en betaalbare techniek te ontwikkelen voor het detecteren van cytokine-afgevende niercellen.

Onze hypothese was dat injectie van BFA, een secretieremmer die het endoplasmatisch reticulum-Golgi-transport in vivo blokkeert, de kleuring van uitgescheiden eiwitten in nierweefsel mogelijk zou maken (Figuur 1A,B), zoals aangetoond met op flowcytometrie gebaseerde assays^14,15. Samen met celtype-specifieke makers zou deze techniek kunnen worden gebruikt om de bron en relatieve bijdrage van cytokine-producerende cellen in beschadigde nieren te identificeren. In tegenstelling tot monsters voor flowcytometrie, kunnen gefixeerde weefsels op lange termijn worden bewaard met behoud van eiwitten en cellulaire structuren, waardoor een grondiger onderzoek van de secretoire cellen mogelijk is. Om deze hypothese te testen, werden de nieren van muizen gewond met een model van AKI (cisplatine) en een model van CKD (aristolochinezuurnefropathie (AAN)), geïnjecteerd met BFA en gekleurd met behulp van standaard immunofluorescerende technieken.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met het protocol voor het gebruik van dieren dat is goedgekeurd door het Institutional Animal Care and User Committee van het Vanderbilt University Medical Center.

1. Dieren

1. Gebruik 8-12 weken oude BALB/c mannelijke muizen (lichaamsgewicht: ongeveer 25 g) voor door cisplatine of aristolochinezuur geïnduceerde nefropathie.
2. Zorg ervoor dat de muizen gezond zijn en geen duidelijke tekenen van angst of wonden door gevechten hebben.
   OPMERKING: Wonden, vooral aan de staart, kunnen het hier beschreven protocol verstoren. Er werd gekozen voor BALB/c-muizen omdat het bij deze muizen gemakkelijker is om de staartader voor injectie te visualiseren. Het hier beschreven protocol werkt voor andere muizenstammen; De dosering van cisplatine of aristolochinezuur kan echter van stam tot soort verschillen.

2. Cisplatine-injectie

1. Los cisplatine op in steriele zoutoplossing tot een uiteindelijke concentratie van 1 mg/ml.
   OPMERKING: Cisplatine lost niet volledig op bij kamertemperatuur. Het moet in een zuurkast worden behandeld.
2. Verwarm de cisplatineoplossing in een waterbad van 37 °C en draai herhaaldelijk totdat de cisplatine volledig is opgelost.
3. Weeg de muizen en bereken de hoeveelheid cisplatineoplossing die nodig is om 20 mg/kg lichaamsgewicht (lichaamsgewicht) te injecteren.
4. Desinfecteer de buikhuid met afwisselend 3x afwisselend povidon-jodium (7,5%) en alcohol (70%) wattenstaafjes.
5. Injecteer de cisplatineoplossing met een injectiespuit van 25 G via een insulinespuit met een naald van 25 G intraperitoneaal.
6. Ga verder met rubriek 4 op dag 3 na de injectie.

3. Aristolochisch zuur (AA) injectie

1. Los aristolochinezuur-I op in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een eindconcentratie van 0,5 mg/ml.
   OPMERKING: AA moet in een zuurkast worden behandeld. AA-I moet worden gebruikt omdat het de dominante vorm is die nierbeschadiging veroorzaakt.
2. Verwarm de AA-oplossing in een waterbad bij 37 °C en draai herhaaldelijk tot het volledig is opgelost.
3. Weeg de muizen en bereken het volume van de te injecteren AA-oplossing 5 mg/kg lichaamsgewicht.
4. Ontsmet de buikhuid 3x met een povidon-jodium (7,5%) en alcohol (70%) wattenstaafje.
5. Injecteer de AA-oplossing met behulp van een insulinespuit met een naald van 25 G intraperitoneaal.
6. Injecteer AA om de dag voor een totaal van 3 injecties.
7. Ga verder met rubriek 4 op dag 42 na de laatste injectie.

4. Bereiding van BFA-oplossing

1. Los BFA op in dimethylsulfoxide in een concentratie van 10 mg/ml om een stockoplossing te maken.
2. Bewaar de stockoplossing bij -20 °C.
3. Verdun de BFA-stockoplossing met steriel PBS bij de uiteindelijke werkconcentratie van 1,25 mg/ml
   OPMERKING: Bereid elke keer onmiddellijk voor de injectie een verse werkoplossing.

5. Injectie van BFA in de staartader

1. Voorafgaand aan de injectie zet u de kooi half op, half van een verwarmingskussen gedurende 10 minuten om ervoor te zorgen dat de muizen warm zijn om een daling van de lichaamstemperatuur te voorkomen, wat vasoconstrictie van bloedvaten in de staart kan veroorzaken en de injectie kan verstoren.
   NOTITIE: Plaats de kooi op de verwarmingskussens zodat de helft van de kooi op de pad ligt en de andere helft niet. Op die manier kunnen de muizen, als ze warm aanvoelen, naar de andere kant van de kooi gaan en vice versa.
2. Houd de muizen in bedwang met in de handel verkrijgbare bevestigingsmiddelen van de juiste grootte.
3. Desinfecteer de staart driemaal met povidon-jodium en alcoholdoekje zoals hierboven beschreven.
4. Houd de staart horizontaal en visualiseer de laterale staartaders (Figuur 1C). Gebruik een lichtbron onder de staart om de aderen te visualiseren.
5. Breng een naald van 28 g in en houd de naald en spuit evenwijdig aan de ader in de richting van het hoofd.
6. Injecteer 200 μl van de 1,25 mg/ml BFA-oplossing (0,25 mg BFA). Wacht tot de ader helder is terwijl het bloed wordt vervangen door de injectieoplossing, wat aangeeft dat de injectie is gelukt.
7. Verwijder de naald en druk voorzichtig op de staart totdat het bloeden stopt.
8. Breng de muizen terug naar de kooi en controleer ze op extra bloedingen of tekenen van angst.

6. Offeren en oogsten van de nieren

1. Euthanaseer de muizen met een overdosis isofluraan gevolgd door cervicale dislocatie 6 uur na BFA-injectie.
   OPMERKING: Het 6-uurs tijdstip werd gekozen op basis van literatuur die aantoont dat 6 uur BFA-behandeling in andere organen voldoende accumulatie van cytokinen in cellen mogelijk maakt om ze te visualiseren door immunofluorescerende kleuring¹⁶.
2. Onmiddellijk na het offeren worden de buik en het hart van de muis blootgelegd door een ventrale incisie in de middellijn.
3. Verzamel 100-500 μL bloed voor een bloedureumstikstof (BUN) test door middel van hartpunctie. Gebruik naalden van 25 G met insulinespuiten van 1 ml om het bloed op te vangen. Om stolling te voorkomen, voegt u 5 μl heparineoplossing (100 mg/15 ml dH₂O) toe aan elk monster.
   OPMERKING: Er is minimaal 20 μL bloed nodig voor de BUN-test; ongeveer 500 μL kan echter worden verzameld door middel van een hartpunctie na euthanasie, wat nuttig kan zijn voor andere testen. Verzamel zoveel mogelijk bloed.
4. Bewaar de bloedmonsters op ijs totdat de nieren zijn verzameld in rubriek 7 hieronder.
   1. Centrifugeer de bloedmonsters bij 1.300 × g gedurende 10 minuten.
   2. Isoleer het plasma voorzichtig en bewaar het bij -20 °C totdat het klaar is om de BUN-test in rubriek 17 hieronder uit te voeren. U kunt de plasmamonsters ook bewaren voor creatininetesten.

7. Perfusie en verwijdering van de nieren

1. Verzink de muis met 10-20 ml PBS door de linker hartkamer met behulp van een spuit van 20 ml met een stroomsnelheid van 2-4 ml/min totdat het perfusaat helder wordt.
2. Verwijder de nieren door de nierslagader en -ader met een tang dicht bij de papil te houden en de bloedvaten aan de zijkant weg van de nier door te snijden.
3. Verwijder de niercapsule voorzichtig door deze met de hand of met een fijne, steriele tang af te pellen.
4. Afhankelijk van het antilichaam gaat u verder met rubriek 8 voor de bereiding van gefixeerd in paraffine ingebed weefsel of rubriek 10 voor de bereiding van gefixeerd bevroren weefsel.
   OPMERKING: De weefselverwerking moet worden geoptimaliseerd voor elk antilichaam dat voor kleuring kan worden gebruikt.

8. In paraffine ingebed weefsel voor TGF-β en PDGF-D kleuring

1. Snijd de nier in tweeën door deze op een schone glasplaat te plaatsen en horizontaal door te snijden met een nieuw scheermesje. Plaats de helft in 10 ml 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS gedurende 24 uur op een end-over-end rotator met een snelheid van 10 omwentelingen per min (rpm).
   OPMERKING: De hele nier is niet nodig voor secties. De ene helft van de nier kan worden bewaard of gebruikt voor andere tests.
2. Vervang de PFA door 70% ethanol.
3. Dien in dit stadium de nierhelft in voor verwerking en paraffine-inbedding, snijd vervolgens het in paraffine ingebedde nierweefsel in secties bij 4-6 μm met behulp van een microtoom en monteer ze op voorgereinigde, geladen objectglaasjes^17,18.
   OPMERKING: Nieren werden verwerkt en ingebed in paraffine door de Vanderbilt University Medical Center Translational Pathology Shared Resource en bewaard bij kamertemperatuur.

9. Deparaffinisatie en rehydratatie

1. Plaats de objectglaasjes in een rekje voor het kleuren van objectglaasjes en dompel ze 5 minuten onder in een kleurpotje met D-limoneen, zorg ervoor dat het weefsel volledig ondergedompeld is. Herhaal dit in een kuiltje met verse D-Limoneen.
2. Rehydrateer de weefsels door de objectglaasjes elk 5 minuten gedurende 5 minuten onder te dompelen in seriële verdunningen van ethanol 100% (2x), 95%, 90% en 70%.
3. Was de dia's in vloeiende dH₂O gedurende 5 min.
4. Voer het antigeenonderzoek uit door de secties in citraatbuffer (pH 6,0) in een snelkookpan bij 121 °C en 15 psi gedurende 45 minuten te incuberen.
5. Was de dia's 20 minuten in stromende dH₂O.
6. Ga verder naar sectie 12.

10. Voorbereiding van bevroren weefsel voor CTGF-kleuring

1. Snijd de nier langs de horizontale as in tweeën met behulp van een vers scheermesje.
   OPMERKING: De hele nier is niet nodig voor secties. De ene helft van de nier kan worden bewaard of gebruikt voor andere tests.
2. Doe de nierhelft in 10 ml 0,5% PFA in een tube van 15 ml op een rotator gedurende 2 uur bij 4 °C met een snelheid van 10 rpm.
3. Decanteer de PFA in een container voor correcte verwijdering en voeg 10 ml 0,1 M glycine toe in PBS gedurende 1 uur bij 4 °C met een snelheid van 10 tpm.
4. Decanteer de glycine, voeg 10 ml 15% sacharose opgelost in PBS toe en plaats de buis een nacht op een rotator bij 4 °C en 10 tpm.
5. Decanteer de 15% sucrose en vervang deze door 10 ml 30% sucrose opgelost in PBS gedurende 1 uur bij 4 °C en 10 rpm.
6. Vul de inbeddingsmal met een optimale snijtemperatuurverbinding (OCT) en veranker de nierhelft vanaf stap 10.5 met het snijvlak van de nier naar beneden gericht.
7. Plaats de vorm met de halve nier en OCT voorzichtig in een plas vloeibare stikstof om te bevriezen.
   OPMERKING: Laat de vloeibare stikstof niet rechtstreeks in contact komen met de OCT, omdat dit kan leiden tot belvorming. Bij het gebruik van vloeibare stikstof moeten de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen worden gedragen, zoals een veiligheidsbril/gelaatsscherm, cryogene handschoenen en laboratoriumjas. Het is het beste om een lange tang van ~25 cm te gebruiken om de mallen in vloeibare stikstof te plaatsen.
8. Eenmaal ingevroren, bewaar de vorm bij -80 °C.

11. Bevroren secties

1. Zorg ervoor dat de cryostaat -20 °C is.
2. Bewaar mallen met monsters in OCT in de cryostaat bij -20 °C gedurende 2 uur om de temperatuur in evenwicht te brengen.
3. Verwijder de vorm door de lipjes vast te houden en vanaf de onderkant te drukken.
4. Leg verse OCT op een preparaathouder en plaats het bevroren preparaatblok erop, met de tissuezijde van de preparaathouder af.
5. Plaats de preparaathouder en het preparaat op het vriesplateau.
6. Plaats een verzwaarde warmteafvoer op het blok om het oppervlak af te vlakken. Houd het deksel van de cryostaat gesloten wanneer het niet in gebruik is om temperatuurschommelingen te voorkomen.
7. Zodra de verse OCT tussen het sampleblok en de samplehouder is bevroren, controleert u of de verbinding goed vastzit.
8. Klem de preparaathouder op de cryostaatmicrotoomkop.
9. Begin met doorsnijden totdat het weefsel zichtbaar is in het preparaatblok.
10. Snijd het nierweefsel door op 4-6 μm en pak de secties op op een met kamertemperatuur geladen dia¹⁹.
11. Zodra het weefsel is opgepakt, bewaart u het objectglaasje bij -20 °C tot -80 °C tot het klaar is om te kleuren. Laat het pas ontdooien als het klaar is om te beginnen met kleuren.
12. Haal de objectglaasjes uit de opslag voordat u ze kleurt en laat ze opwarmen tot kamertemperatuur. Laat de secties niet opdrogen.
13. Eenmaal op kamertemperatuur wast u de secties onmiddellijk twee keer 5 minuten met PBS op kamertemperatuur om de OCT-verbinding te verwijderen.
14. Ga verder naar sectie 12.

12. Immunofluorescentie kleuring

1. Omlijn de weefselsecties met een hydrofobe barrièremarkeerstift. Houd een afstand van ten minste 5 mm van het weefsel tot de omtrek van de hydrofobe barrière.
2. Voeg 50 μL blokkeerbuffer met 3% ezelinnenserum en 0,1% Triton in 1% runderserumalbumine/Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) toe aan de sectie en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
3. Verdun de primaire antilichamen met PBS in de juiste concentratie. Gebruik voor de detectie van cytokinen 50 μL oplossingen van primaire antilichamen gericht tegen TGF-β1 (1:200), PDGF-D (1:400) en CTGF (1:200). Gebruik voor het labelen van myofibroblasten 50 μL van een oplossing van het primaire antilichaam gericht tegen alfa-gladde spieractine (α-SMA) geconjugeerd met Cy3 bij 1:200.
4. Verwijder de blokkeeroplossing en voeg de primaire antilichamen toe aan de sectie, zorg ervoor dat deze niet uit de cirkelvormige hydrofobe omtrek lekt en incubeer een nacht bij 4 °C in een bevochtigde kamer. Breng de hydrofobe barrière opnieuw aan als er lekkage optreedt.
5. Was 3x met PBS gedurende 5 min.
6. Verdun de juiste secundaire antilichamen bij 1:200 met PBS.
7. Incubeer de monsters met 50 μl secundaire antilichaamoplossingen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
8. Was met PBS gedurende 5 min.
9. Verdund lotustetragonolobuslectine (LTL) geconjugeerd met fluoresceïne in PBS met Ca²⁺ en Mg²⁺ in een concentratie van 10 μg/ml.
   OPMERKING: Ca²⁺ en Mg²⁺ zijn nodig voor LTL-binding.
10. Incubeer de weefsels met 50 μl LTL-oplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
11. Wassen met PBS met Ca²⁺ en Mg²⁺ gedurende 5 min.
12. Incubeer met 50 μl 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 5 μg/ml in water) om DNA/kernen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te kleuren.
13. Monteer de dekglaasjes door 20 μL antifade-montagereagens op het weefsel toe te voegen en het dekglaasje langzaam te plaatsen. Wacht 24 uur totdat het antifade-reagens is gestold voordat u de beeldvorming uitvoert.
    OPMERKING: Lectinebinding kan na verloop van tijd verslechteren, wat resulteert in signaalverlies. Het is het beste om met lectine bevlekte monsters snel na het opstellen van het montagereagens af te beelden. Als signaalverlies wordt waargenomen, kunnen Ca²⁺ en Mg²⁺ aan het montagereagens worden toegevoegd om de kleuring te behouden.

13. Acquisitie van afbeeldingen

1. Zet de omgekeerde microscoop aan (zie de Materiaaltabel) met een geautomatiseerde XY-trap.
2. Selecteer het 20x objectief.
3. Open de software voor het verzamelen van afbeeldingen (zie de materiaaltabel).
4. Klik op Live om het liveweergavevenster te openen.
5. Zoek het weefselgedeelte en zorg ervoor dat het scherp is.
6. Klik op het menu Verkrijgen en selecteer Grote afbeelding scannen.
7. Stel in het venster Grote afbeelding scannen het gebied in dat moet worden gescand door het werkgebied met de joystick naar het meest linkse deel van het weefselgedeelte te verplaatsen en op de pijl naar links te klikken. Herhaal dit voor de bovenste, meest rechtse en onderste weefselsegmenten.
8. Klik op het acquisitiemenu .
9. Zorg ervoor dat het selectievakje voor grote afbeelding is ingeschakeld.
   1. Als u meerkanaalsbeelden vastlegt, klikt u op het tabblad Lambda .
   2. Klik op elk kanaal en stel de belichtingstijd in op een niveau waarop de vlekken zichtbaar zijn zonder verzadiging van enig deel van het beeld.
      OPMERKING: Deze instellingen moeten consistent zijn binnen één experimentele groep. Het wijzigen van acquisitie-instellingen tussen monsters leidt tot onnauwkeurige resultaten.
   3. Herhaal stap 9.2 voor elk kanaal dat moet worden verzameld.
10. Klik op Scannen.

14. Analyse van het beeld

1. Open de software voor het verzamelen van afbeeldingen.
2. Klik op Bestand | Open en selecteer de afbeelding.
3. Klik met de rechtermuisknop op het afbeeldingsvenster en kies een veelhoekig interessegebied (ROI).
4. Geef een overzicht van de ROI met de tool uit de vrije hand . Maak een overzicht van de LTL-positieve tubuluscellen of α-SMA-positieve interstitiële cellen.
5. Klik op het tabblad Meting | Drempel.
6. Stel de boven- en ondergrens van de drempel in door de schuifregelaars aan weerszijden van het positieve signaalgebied aan te passen.
7. Klik op het tabblad ROI .
8. Klik op het pictogram Exporteren om de waarden op te slaan. Gebruik spreadsheetsoftware om het percentage positief signaalgebied/ROI-gebied te berekenen.

15. Alternatief: Beeldanalyse met gratis software (ImageJ)

1. Open afbeeldingJ.
2. Klik op Bestand | Open om een afbeelding te bekijken.
3. Klik op selecties uit de vrije hand.
4. Selecteer de ROI door te schetsen met de tool uit de vrije hand . Maak een overzicht van de LTL-positieve tubuluscellen of α-SMA-positieve interstitiële cellen.
5. Klik op het menu Bewerken en selecteer Buiten wissen.
6. Klik op Analyseren en selecteer Meten om het ROI-gebied te bepalen.
7. Ga naar afbeelding | Kleur | Gesplitste kanalen.
8. Pas de boven- en ondergrens van de drempel aan om het positieve signaalgebied te detecteren.
9. Klik op Analyseren en selecteer Meten.
10. Sla de gegevens op.
11. Open de gegevens met spreadsheetsoftware en bereken de verhouding tussen positief signaalgebied en ROI-gebied.

16. Optioneel: Beeldvorming met confocale laserscanmicroscoop

OPMERKING: Om afbeeldingen met een hogere resolutie te verkrijgen voor publicatie, zorgt het scannen van confocale microscopie voor duidelijkere beelden en minder achtergrond in nierweefsel.

1. Zet de confocale lasermicroscoop aan (zie de Materiaaltabel).
2. Selecteer 40x objectief (zie de Tabel met Materialen).
3. Klik op het tabblad Zoeken en zoek de weefsels door de focus aan te passen.
4. Ga naar het tabblad Acquisitie , klik op Kanalen en kies 1 AU in pinhole-instelling.
5. Pas de intensiteit van de laserversterking in elk kanaal zo aan dat het positieve signaal zichtbaar maar niet verzadigd is. Zorg ervoor dat de instellingen binnen een set experimentele samples constant blijven.
6. Klik op Snappen en sla de afbeelding op in het gewenste formaat.

17. Plasma BUN-niveau

1. Verwijder de monsters bij -20 °C en ontdooi ze op ijs.
2. Verdun het plasma met dH₂O in een verhouding van 1:10.
3. Zet voor elk monster drie afzonderlijke reacties in tweevoud op een plaat met 96 putjes.
   1. Voeg voor monster plus standaard 5 μL 200 mg/dL ureum en 20 μL verdund plasma toe.
   2. Voeg alleen voor het monster 5 μl dH₂O en 20 μl verdund plasma toe.
   3. Voeg voor het blanco monster 5 μl dH₂O en 20 μl verdund plasma toe.
4. Meng 85 μl van het reagens + 1 μl urease per monster om de werkoplossing te bereiden.
5. Voeg 80 μl van de werkoplossing toe aan de putjes "monster plus standaard" en "monster alleen".
6. Voeg 80 μl van het reagens (geen urease) toe aan het 'monster blanco' putje uit stap 17.3 hierboven.
7. Tik zachtjes op de plaat om te mengen en incubeer deze gedurende 5 minuten op kamertemperatuur.
8. Lees OD₅₆₀ af met een plaatlezer.
9. Bereken de ureumconcentratie Eq (1) en zet deze om naar BUN met behulp van Eq (2).
   Ureum (mg/dL) = (Alleen monster-Monster blanco)/(Standaard-Monster alleen) x (Standaard/4) x (verdunningsfactor) (1)
   BUN (mg/dL) = Ureum concentratie/2,14 (2)
   OPMERKING: Deze test meet het ureumgehalte (molecuulgewicht: 60) van het serum; BUN verwijst echter alleen naar het stikstofgehalte van ureum (molecuulgewicht: 28). Er is dus een correctie van 2,14 (60/28) nodig om de ureumconcentratie om te rekenen naar BUN.

Resultaten

Om de rol van tubulaire epitheelcellen bij de productie van cytokines na cisplatine-geïnduceerde AKI te onderzoeken, werd cisplatine geïnjecteerd in een concentratie van 20 mg/kg, gevolgd door een intraveneuze injectie van 0,25 mg BFA op dag 3 na de cisplatine-injectie. De nieren werden 6 uur later geoogst. In paraffine ingebedde nieren werden doorgesneden en gekleurd met TGF-β, PDGF-D en CTGF, representatieve cytokines die verantwoordelijk zijn voor weefselherstel bij AKI. Zoals te zien...

Discussie

Van nier-PTC's is bekend dat ze AKI en CKD reguleren door de secretie van TGF-β, TNF-α, CTGF, PDGF, vasculaire endotheliale groeifactor en vele andere eiwitten 20,21,22,23. Evenzo scheiden glomeruli, distale tubuli en andere nierepitheelcellen, evenals interstitiële cellen, deze en/of andere eiwitten af tijdens letsel 24,25,26.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 mL Insulin syringes	BD	329654
10 mL Syringe	BD	302995
2 mL tube	Fisher brand	05-408-138
20 mL Syringe	BD	302830
25 G needles	BD	305125
28 G needles	BD	329424
96-well-plate	Corning	9017
Aristolochic acid-I	Sigma-Aldrich	A9461
α-SMA antibody conjugated with Cy3	Sigma-Aldrich	C6198	RRID:AB_476856
Blade for cryostat	C.L. Sturkey. Inc	DT315R50
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Brefeldin A	Sigma-Aldrich	B6542
Cisplatin	Sigma-Aldrich	P4394
Citric acid	Sigma-Aldrich	791725
Confocal microscope	ZEISS	LSM710
Confocal microscopy objectives	ZEISS	40x / 1.10 LD C-Apochromat WATER
Confocal software	ZEISS	ZEN
Coplin jar	Fisher Scientific	19-4
Cover glass	Fisher brand	12545F
Cryostat	Leica	CM1850
CTGF antibody	Genetex	GTX124232	RRID:AB_11169640
Cy3-AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	711-165-152	RRID: AB_2307443
Cy5-AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)	Jackson immunoresearch	705-175-147	RRID: AB_2340415
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418
Disposable base molds	Fisher brand	22-363-553
donkey serum	Jackson immunoresearch	017-000-121
Ethanol	Decon Labs, Inc.	2701
Forceps	VETUS	ESD-13
Glycine	Fisher brand	12007-0050
Heating pads	Kent scientific	DCT-20
Heparin sodium salt	ACROS organics	41121-0010	100mg/15ml of dH2O
Humidified chamber	Invitrogen	44040410	A plastic box covered in foil can be used as an alternative humidified chamber.
Insulin syringes	BD	329461
Inverted microscope	NIKON	Eclipse Ti-E2	immunofluorescence
KIM-1 antibody	R & D	AF1817	RRID: AB_2116446
Lemozole (Histo-clear)	National diagnostics	HS-200
lotus tetragonolobus lectin	Vector	FL-13212
Microscope slide	Fisher scientific	12-550-343
Microtome	Reichert	Jung 820 II
monochrome CMOS camera	NIKON	DS-Qi-2
Mouse surgical kit	Kent scientific	INSMOUSEKIT
NIS Elements	NIKON
Objectives	NIKON	Plan Apo 20x/0.75	image acquisition software linked to Eclipse Ti-E2 (invertd microscope)
OCT compound	Scigen	4586
Pap pen	Vector	H-4000
PBS with calcium and magnesium	Corning	21-030-CV
PBS without calcium and magnesium	Corning	21-031-CV
PDGF-D antibody	Thermo-Fisher scientific	40-2100
PFA	Electron Microscopy Science	15710	RRID: AB_2533455
Plate reader	Promega	GloMax® Discover Microplate Reader	4% PFA is diluted from 16% in PBS.
povidone-iodine (Betadine)	Avrio Health L.P.	NDC 67618-151-17
Pressure cooker	Tristar 8	Qt. Power Cooker Plus
ProLong Gold Antifade Reagent	Invitrogen	P36930
Quantichrom Urea (BUN) assay Kit II	BioAssay Systems	DUR2-100
Single-edge razor blade for kidney dissection (.009", 0.23 mm)	IDL tools	521013
Slide warmer	Lab Scientific Inc.,	XH-2001
Software	NIKON	NIS elements
Sucrose	RPI	S24060
TGF-b1 anitbody	Sigma-Aldrich	SAB4502954
Tris EDTA buffer	Corning	46-009-CM	RRID: AB_10747473
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	SLBR6660V
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	SLBR6660V
Triton	Sigma-Aldrich	9002-93-1
Tween 20	Sigma-Aldrich	P1379
White Glass Charged Microscope Slide, 25 x 75 mm Size, Ground Edges, Blue Frosted	Globe Scientific	1358D