Methodenartikel

Een contrast van drie inentingstechnieken die worden gebruikt om het ras van onbekend Fusarium oxysporum f.sp. te bepalen. niveum Isolaten

DOI:

10.3791/63181

⸱

28 oktober 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Pathology, University of Florida, 2University of Florida Institute of Food and Agricultural Sciences, 3Gulf Coast Research and Education Center, University of Florida, 4Horticultural Sciences Department, University of Florida, 5Tropical Research and Education Center, University of Florida, 6Department of Horticulture, University of Georgia

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het beheren van Fusarium-verwelking van watermeloen vereist kennis van de aanwezige pathogene rassen. Hier beschrijven we de worteldip, aangetaste kernel seeding en gemodificeerde tray-dip inentingsmethoden om hun werkzaamheid aan te tonen bij rastypering van de pathogene schimmel Fusarium oxysporum f. sp niveum (Fon).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fusarium verwelking van watermeloen (Citrullus lanatus), veroorzaakt door Fusarium oxysporum f. sp. niveum (Fon), is opnieuw opgedoken als een belangrijke productiebeperking in het zuidoosten van de VS, vooral in Florida. De inzet van geïntegreerde plaagbestrijdingsstrategieën, zoals rasspecifieke resistente cultivars, vereist informatie over de diversiteit en bevolkingsdichtheid van de ziekteverwekker op de velden van telers. Ondanks enige vooruitgang in de ontwikkeling van moleculaire diagnostische hulpmiddelen om pathogene isolaten te identificeren, vereist rasbepaling vaak bioassay-benaderingen.

Rastypering werd uitgevoerd door worteldipinenting, besmette kernelzaaimethode en de gemodificeerde tray-dip-methode met elk van de vier watermeloenverschillen (Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey, Plant Introduction 296341-FR). Isolaten krijgen een rasaanduiding toegewezen door berekening van de ziekte-incidentie vijf weken na inenting. Als minder dan 33% van de planten voor een bepaalde cultivar symptomatisch was, werden ze gecategoriseerd als resistent. De cultivars met een incidentie van meer dan 33% werden als vatbaar beschouwd. Dit artikel beschrijft drie verschillende methoden van inenting om ras, worteldip, besmette kernel en gemodificeerde tray-dip inenting vast te stellen, waarvan de toepassingen variëren afhankelijk van het experimentele ontwerp.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De bodemschimmels die deel uitmaken van het Fusarium oxysporum species complex (FOSC) zijn impactvolle hemibiotrofe plantpathogenen die ernstige ziekten en opbrengstverlies kunnen veroorzaken in een breed scala van gewassen1. Fusarium verwelking van watermeloen, veroorzaakt door F. oxysporum f. sp. niveum (Fon), is de afgelopen decennia over de hele wereld toegenomen in omvang, incidentie en ernst 2,3. Bij zaailingen lijken de symptomen van Fusarium-verwelking vaak op demping. Bij oudere planten wordt het gebladerte grijs, chlorotisch en necrotisch. Uiteindelijk gaat het verwelken van de planten over tot volledige instorting van de plant en de dood4. Direct opbrengstverlies treedt op als gevolg van de symptomen en plantensterfte, terwijl indirect opbrengstverlies kan optreden als gevolg van schade door de zon veroorzaakt door de eliminatie van het bladluifel5. Seksuele voortplanting en bijbehorende voortplantingsstructuren zijn nooit waargenomen in F. oxysporum. De ziekteverwekker produceert echter twee soorten aseksuele sporen, micro- en macroconidia, evenals grotere, langdurige overlevingsstructuren genaamd chlamydospores, die vele jaren in de bodem kunnen overleven6.

De FOSC wordt ingedeeld in formae speciales op basis van waargenomen gastheerbereiken, meestal beperkt tot één of enkele gastheersoorten1. Hoewel recent onderzoek heeft aangetoond dat dit soortencomplex een samenstelling van 15 verschillende soorten kan zijn, zijn de specifieke soorten die watermeloen infecteren momenteel onbekend7. F. oxysporum f. sp. niveum (Fon) is de naam voor de groepen stammen die uitsluitend Citrullus lanatus of de gedomesticeerde watermeloeninfecteren 8,9. F. oxysporumstammen binnen de meeste pathogene formae speciales vertonen bepaalde niveaus van diversiteit met betrekking tot hun genetische componenten en virulentie ten opzichte van een gastheersoort. De ene stam kan bijvoorbeeld alle cultivars van een gastheer infecteren, terwijl een andere alleen de meer gevoelige cultivars kan infecteren. Om een dergelijke variatie te verklaren, worden deze groepen informeel ingedeeld in rassen op basis van evolutionaire relaties of gemeenschappelijke fenotypische kenmerken. Binnen Fon zijn vier rassen (0, 1, 2 en 3) gekarakteriseerd op basis van hun pathogeniciteit tegen een reeks geselecteerde watermeloencultivars, waarbij de ontdekking van ras 3 onlangs10 plaatsvond.

Ondanks deze schijnbare diversiteit zijn de morfologieën van sporen of koppeltekens niet te onderscheiden tussen de rassen van Fon-rassen, wat betekent dat moleculaire of fenotypische assays nodig zijn om het unieke ras van een isolaat te identificeren11. Moleculair onderzoek heeft enkele genetische verschillen geïdentificeerd. De rol van Uitgescheiden in Xylem (SIX) effectoren is bijvoorbeeld al jaren bestudeerd in F. oxysporum, en sommige van deze effectoren bevinden zich op de chromosomen die worden uitgewisseld tijdens horizontale genoverdracht12. SIX6 is bijvoorbeeld te vinden in Fon races 0 en 1, maar niet in race 213. ZES effectoren zijn betrokken bij de pathogeniciteit van F. oxysporum f. sp. lycopersici en F. oxysporum f. sp. cubense, die Fusarium-verwelking veroorzaken op tomaat en banaan, respectievelijk 14,15,16,17. De analyse van SIX-effectorprofielen tussen stammen van F. oxysporum f. sp. spiniciae, de Fusarium-verwelkingspathogeen op spinazie, heeft classificatie mogelijk gemaakt die de genetische en fenotypische diversiteit nauwkeurig weerspiegelt18. De verschillen tussen virulentiemechanismen van Fon-rassen zijn momenteel echter niet volledig begrepen en moleculaire assays die bij hun gebruik zijn ontwikkeld, hebben inconsistente en onnauwkeurige resultaten laten zien19. Daarom zijn fenotypische resultaten van infectietests momenteel de beste manier om isolaten te classificeren.

F. oxysporum infecteert aanvankelijk gastheren via de wortels voordat het zich een weg baant naar het xyleem20. Dit maakt directe inenting van de wortels van een bepaalde gastheercultivar een effectieve manier om rastypering uit te voeren en is de basis van de worteldip- en traydipinentingsmethoden21. Wanneer een gastheer niet wordt geïnfecteerd, bevindt F. oxysporum zich in de grond en kan het jarenlang inactief blijven. Het kweken van vatbare watermeloencultivars in grond uit een interessegebied is een manier om te testen op de aanwezigheid van Fon. Het uitbreiden van deze methode met cultivars van verschillende bekende niveaus van resistentie in grond die opzettelijk is aangetast met Fon is ook een goede manier om rastypering uit te voeren (tabel 1) en is de basis van de besmette kernelzaaimethode. De aangepaste tray-dip methode is een variant op de oorspronkelijke tray-dip methode die een high-throughput race-typering mogelijk maakt waarbij veel planten en veldisolaten snel kunnen worden onderzocht22. Belangrijke factoren van een snelle en succesvolle rastyperingsbioassay zijn onder meer het gebruik van cultivars die verschillen in resistentie tegen de verschillende pathogene rassen hebben gedocumenteerd, ervoor zorgen dat het entmateriaal zowel biologisch actief als overvloedig is tijdens infectie, het handhaven van een omgeving die zowel bevorderlijk is voor de ziekteverwekker als de gastheer, en het gebruik van een consistent beoordelingssysteem voor ernst of incidentie van ziekte. Dit artikel beschrijft de root-dip23,24, infested kernel seeding25,26 en gemodificeerde tray-dip22 methoden voor fenotypische race-typering op basis van de hierboven beschreven principes.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ras bepalen met root-dip methode (RDM)

  1. Voorbereiding van de experimentele omgeving
    1. Omdat symptoomexpressie sterk afhankelijk is van omgevingsomstandigheden, moet u planten in een gecontroleerd gebied houden. Controleer de relatieve vochtigheid, temperatuur, fotoperiode en lichtintensiteit (figuur 1).
      1. Stel de temperatuur in op 26-28 °C, de relatieve vochtigheid op 50-75% en stel een fotoperiode van 16 uur in om voldoende plantengroei en gezondheid te garanderen.
        OPMERKING: Om hypoxie, verwelking van zaailingen en / of zaadrot te voorkomen, mag u niet te veel water geven of stilstaand water rond de zaailingen toestaan.
      2. Gebruik twee tl-buizen, elk met ten minste 1850 lumen licht en een kleurtemperatuur van 2.800 K per lampbank om fotosynthetische groei te ondersteunen.
      3. Houd het gebied schoon en gebruik hygiënische praktijken, waaronder het verwijderen van afvalgrond en plantenresten, om schade door plagen en incidentele infecties te voorkomen.
    2. Plantomstandigheden
      1. Vul 8 x 16-cels (25 cm breedte x 50 cm lengte) startflats met plantmedium en tik naar beneden om de grond enigszins te comprimeren (figuur 2).
      2. Verkrijg zaden van de vier differentiële cultivars: Black Diamond/Sugar Baby, Charleston Grey/Allsweet/Dixielee, Calhoun Grey en PI-296341-FR.
      3. Zaai zaden met hun top (puntig uiteinde) naar boven gericht tot een diepte die gelijk is aan hun lengte. Nadat de zaden zijn gezaaid, bedek je het medium met de begraven zaden met 100% Fuller's Earth of een ander bentonietkleialternatief voor een diepte van 0,3175-0,635 cm.
      4. Benevel de flats om het medium te dempen zonder stilstaand of poolwater te creëren. Houd daarna de media vochtig door elke 180 minuten 20 s te vernevelen of eenmaal per dag met de hand water te geven totdat het zaad ongeveer 5 dagen ontkiemt. Na ontkieming, geef eenmaal per dag water en indien nodig om de groei van zaailingen te ondersteunen.
    3. Mediavoorbereiding
      OPMERKING: Beide media zijn stevig gemaakt met extra gegranuleerde agar om sporenoogst mogelijk te maken door het oppervlak te schrapen.
      1. Geklaard V8 sapmedium (V8)
        1. Bereid 500 ml geklaard V8-sapmedium (V8)27 door 100 ml geklaard V8 origineel 100% groentesap toe te voegen met 1% CaCO3 tot 400 ml gedestilleerd water.
        2. Voeg 7,5 g gegranuleerde agar toe.
        3. Meng de ingrediënten goed, autoclaaf, en laat afkoelen tot 50 °C voordat je ze in steriele petrischaaltjes giet.
      2. Kwartsterkte aardappel dextrose agar media (qPDA)
        1. Bereid qPDA-medium door 4,5 g gegranuleerde agar toe te voegen aan 500 ml gedestilleerd water, voeg 3,8 g aardappeldextrose-agar toe.
        2. Meng de ingrediënten goed, autoclaaf en laat afkoelen tot 50 °C voordat je 12-15 ml in steriele petrischalen giet.
  2. Voorbereiding van experimentele behandelingen
    1. Bereid het entmateriaal voor.
      1. Plaats vijf dagen na het planten (dpp) geïnfiltreerde papieren schijven (1-1,25 cm diameter) met het gewenste F. oxysporuma-isolaat op één V8- en één qPDA-plaat en bewaar ze gedurende acht dagen 28 in een incubator (~28 °C) (figuur 3A).
      2. Breng op de achtste dag van de schimmelgroei en de dag voorafgaand aan de inenting (zie rubriek 1.3.2) de V8- en qPDA-platen over van de incubator naar een bioveiligheidskast.
      3. Geef voor elk isolaat 6 ml gesteriliseerd gedeïoniseerd water af op elke V8- en qPDA-kweekplaat.
      4. Verwijder conidia door een steriele celverspreider over het mediumoppervlak te schrapen (figuur 3B). Pool de vloeibare conidiale suspensie en breng deze over in een steriele kweekbuis van 50 ml (figuur 3C).
      5. Herhaal dit proces totdat het totale vloeibare conidiale suspensievolume in de kweekbuis van 50 ml ongeveer 12 ml is.
      6. Voordat u overgaat tot een ander isolaat, steriliseert u het werkgebied en de celstrooier met alcohol. Steriliseer de celstrooier door deze door een Bunsen-brander te laten gaan nadat u deze in ≥70% ethanol hebt gedompeld.
      7. Zodra de vloeibare conidiale suspensies zijn overgebracht naar kweekbuizen voor alle isolaten, kwantificeert u het aantal sporen. Vortex eerst een individuele kweekbuis van 50 ml en doseer 10 μL in elke kamer van een hemacytometer. Bereken vervolgens het aantal sporen in de hemacytometer zoals eerder beschreven29.
      8. Bereid de uiteindelijke entoplossing door het berekende volume voor 106 + 10% over te brengen naar een andere steriele kweekbuis en breng het totale volume op 30 ml door steriel gedeïoniseerd water toe te voegen.
      9. Bewaar deze kweekbuizen 's nachts bij 8 ± 1 °C.
        OPMERKING: Dit kan worden gedaan zonder verlies van conidiale levensvatbaarheid, zoals aangegeven door niet-gepubliceerde gegevens.
  3. Inenting
    1. Bereid de inenting voor.
      1. Voorafgaand aan de dag van inenting, geef dertien dagen oude zaailingen stevig water tot draagkracht van de bodem.
      2. Label de inzet vooraf met relevante informatie, waaronder het te testen isolaat, de watermeloencultivar en de datum van inenting.
      3. Plaats 6 x 12-cels (20 cm breedte x 40 cm lengte) piepschuimen flats, eerder ontsmet met 10% bleekmiddel en goed gespoeld, om de ingeënte planten te ontvangen.
      4. Voorzetsel alle benodigde materialen (zie de Tabel met materialen).
    2. Ent de plantenwortels.
      1. Geef de planten enkele uren voor aanvang van de inenting stevig water. Verwijder ten minste 2 uur na het water geven de plantjes uit de 8 x 16-cel piepschuimen flats en spoel hun wortels om eventuele aanhangende plantmateriaaldeeltjes te verwijderen.
      2. Bewaar de gespoelde planten tijdelijk in schone containers met leidingwater tot gebruik, waarbij de cultivars gescheiden van elkaar blijven (figuur 4A). Scheid de plantjes in groepen van zes individuen en houd de zaailinggroepen gewikkeld in natte papieren handdoeken op een laboratoriumbak om uitdroging te voorkomen.
      3. Plaats 25-30 cm3 aarde op de bodem van elke cel van de 6 x 12 array piepschuimbak en gebruik een spuitfles om de grond nat te maken totdat deze zichtbaar vochtig is.
      4. Ent de planten en herplant ze in volgorde volgens de cultivar, zodat Black Diamond, Charleston Grey, Calhoun Grey en vervolgens PI 296341 01 FR van links naar rechts worden geplant.
      5. Begin met de gezonde controle en plaats een groep van zes onbeschadigde zaailingen van dezelfde cultivar in de 50 ml buisjes met het entmateriaal. Gebruik in het geval van de gezonde bestrijding kraanwater in plaats van een sporensuspensie. Ent de planten als laatste met de positieve controle (Fon race 3).
      6. Eenmaal in de buis, zorg ervoor dat de plantenwortels het entmateriaal (kraanwater) bereiken en eraan worden blootgesteld.
      7. Vortex de buizen met plantenpootwortels 30 s ondergedompeld (figuur 4B). Plaats na het vortexen een enkel plantje per cel in de 6 x 12 piepschuimen flats. Plaats de planten van dezelfde cultivar in dezelfde kolom in de bak.
      8. Ontsmet na plaatsing gehandschoende handen door ze gedurende 30 s in emmers met 0,7% beschikbare chlooroplossing te houden, gevolgd door een spoeling van leidingwater gedurende 1 minuut.
      9. Bedek daarna de geplaatste plantjes met plantmedium en zet voorzichtig uit. Gebruik een spuit of pipet om de plantjes voorzichtig water te geven met 20 ml per plantlet terwijl u spatten vermijdt.
      10. Voordat u doorgaat naar de volgende set planten, ontsmet u de gehandschoende handen opnieuw met behulp van chlooroplossing en een spoeling met kraanwater.
      11. Nadat alle plantjes zijn herplant, geef je ze opnieuw minimaal water om afvloeiing van entmateriaal te voorkomen.
      12. Houd de plantjes een nacht vast in een afgesloten, donkere omgeving met een gemiddelde temperatuur van 27 °C. Breng de volgende dag de planten over naar de kas en houd de gemiddelde temperatuur op 27 ° C.
  4. Onderhoud en verzorging van ingeënte planten
    1. Om overloop van overtollig water te voorkomen, geeft u de flats drie keer per dag gedurende 4-5 dagen licht water totdat de planten stabiliseren.
    2. Controleer de trays 2-3 keer per dag gedurende ten minste drie dagen om te zorgen voor voldoende en gelijkmatige dekking van het water geven.
    3. Vermijd uitdroging door zonlicht of schaduw door de flats te draaien en/of indien nodig aanvullende schaduw/water te geven.
    4. Bemest de planten bij 3 dpp met een 20-20-20 snel afgevende meststof (10 g / 3,78 L) met een snelheid van 3-6 ml per liter water.
    5. Bemest wekelijks gedurende 3-4 weken.
    6. Behoud dezelfde licht- en omgevingsomstandigheden tijdens deze stap.

2. Race bepalen door Infested kernel methode (IKM)

  1. Aantasting van de pitten
    1. Bereid het entmateriaal voor.
      1. Ofwel uit een opgeslagen of nieuw verzameld monster, isoleer en kweek een F. oxysporum f. sp. niveum-stam van belang op een plaat van qPDA tot het punt dat de groei de helft van de plaat bedekt.
        OPMERKING: Dit toont aan dat het actief en levensvatbaar is, wat nodig is voor een aanzienlijke aantasting van het graan in latere stappen.
    2. Bereid de pitten voor.
      1. Meet op een schaal 200 g rogge (Secale spp.) bessen (of Maxie var. tarwe (Triticum spp.) pitten) af in een voldoende grote container en giet ze in een of meer erlenmeyers met een glas van 1 L. Voeg steriel leidingwater toe aan de kolven om de korrels tot ten minste 5 cm volledig te bedekken (figuur 5A).
      2. Week de pitten bij kamertemperatuur (~24 °C) gedurende 2 uur. Giet het water uit de kolven af; sluit de opening aan met een stuk katoenen rol gewikkeld in kaasdoek; en bedek de opening met aluminiumfoliefolie (figuur 5B).
    3. Ontsmet de pitten. Zodra het graan water heeft opgenomen, autoclaaf het twee keer op twee verschillende manieren om andere ongewenste microben te doden voorafgaand aan inenting.
      1. Autoclaaf de korrel in de voorbereide kolven gedurende de eerste keer op een zwaartekrachtcyclus (121,2 °C, 1,06 kg/cm2) gedurende 1 uur met een droogtijd van 5 minuten. Laat de kolven afkoelen tot kamertemperatuur.
      2. Voordat u de tweede keer autoclaveert, brengt u de korrels over in een kleine champignonkweekzak met een filter van 0,5 μm. Verwijder de lucht uit de zak en vouw vervolgens het overtollige plastic om de zak.
      3. Plaats de zak in een plastic, autoclaafveilige bak. Dek de bak af met aluminiumfoliefolie (figuur 5C).
        OPMERKING: Gebruik geen metalen bak bij het autoclaveren van de korrels in de zakken, omdat dit ertoe kan leiden dat de zakken smelten.
      4. Autoclaaf de bak op een zwaartekrachtcyclus gedurende 1 uur met 5 minuten droogtijd, dezelfde cyclus als voorheen.
        OPMERKING: Autoclaaf de zak alleen de tweede keer, niet de eerste keer, omdat het filter en de poort kunnen worden aangetast als de zakken twee keer worden geautoclaveerd. Voorkom condensatie op het filter door de zakken langzaam en volledig te laten afkoelen voordat ze uit de autoclaaf worden verwijderd, omdat het kweekzakfilter in gevaar komt als het nat wordt.
    4. Ent de pitten.
      1. Door met de kweekplaat en de zak in een bioveiligheidskast te werken, snijdt u agarschijven met een diameter van 6 mm uit de zone van actieve groei op de kweekplaat met een steriele kurkboring van # 4-formaat. Vouw de zak open. Gebruik een strikte steriele techniek om 5 agarschijven in de zak te plaatsen. Gebruik een steriele maatcilinder van 50 ml om 35 ml steriel leidingwater te meten en voeg dit toe aan de zak.
      2. Rol de opening van de zak enigszins op en spuit vervolgens de buitenkant in met 70% ethanol om het oppervlak te steriliseren.
        OPMERKING: Spuit het filter niet, want dat vocht zal het ook in gevaar brengen.
      3. Sluit de zak door de hoeken naar het midden te vouwen en vervolgens twee keer boven het filter. Zet de tas vast met zakklemmen en doorzichtige vinylbuizen die door de fabrikant zijn geleverd.
        LET OP: De klemmen zijn herbruikbaar.
      4. Haal de zak uit de bioveiligheidskast.
    5. Bewaar de ziekteverwekker voor groei.
      1. Berg de tas rechtop. Zorg ervoor dat het filter van de andere kant van de zak wordt weggetrokken om maximale gasuitwisseling mogelijk te maken (figuur 5D).
      2. Incubeer de materialen bij kamertemperatuur gedurende ongeveer drie weken. Herverdeel de korrels regelmatig om een gelijkmatige groei van de ziekteverwekker te garanderen.
        LET OP: De tassen zijn niet herbruikbaar.
  2. Infectie van watermeloenzaailingen met besmet graan
    1. Bron watermeloenzaden zoals eerder beschreven.
    2. Bepaal de experimentele groepen.
      OPMERKING: De enige vereiste stam(en) van het pathogeen zijn de isolaten die worden getest op rasidentificatie. Negatieve en positieve controles zullen echter helpen om vergelijkingen te maken met planten zonder infectie of een specifiek infectieniveau.
      1. Om een negatieve controle te bereiden, gebruikt u tarwekorrels die zijn gesteriliseerd volgens de eerder genoemde methode, maar zonder inenting.
      2. Om een positieve controle te bereiden, gebruikt u tarwekorrels die zijn geënt met een reeds geclassificeerde stam ter vergelijking met het onbekende isolaat.
    3. Combineer aarde en graan.
      1. Meet 14 korrels aangetaste pitten in een grote plastic zak (figuur 5E). Vul plastic potten (15 cm diameter x 10 cm hoog) met potgrond om de benodigde hoeveelheid mix te meten. Leeg het mengsel in de zak. Maak een luchtkussen in de zak en draai of sluit deze dicht.
      2. Meng de pitten en de grond door de zak meerdere keren om te keren. Voor een negatief besturingselement voert u hetzelfde proces uit in een andere zak met schone kernels. Voor een positieve controle voert u hetzelfde proces uit in een andere zak met pitten die besmet zijn met de vergelijkingsstam.
      3. Vul vier aan het oppervlak gesteriliseerde potten met het aangetaste grondmengsel. Voor een negatieve controle, pot dat mengsel voordat u Fon-verontreinigde grond hanteert.
    4. Zaai de watermeloenzaadjes.
      1. Zaai zes zaden in elke pot. Zorg ervoor dat elke pot slechts zaden van één cultivar bevat. Plaats de zaden met het uiteinde van het zaad naar boven gericht om een goede groei tijdens de opkomst mogelijk te maken (figuur 6A).
      2. Maak met een spuitfles de bovenste 0,3-0,6 cm grond nat met water. Plaats een doorzichtige plastic schaal (15 cm diameter) onder en over elke pot om een vochtige omgeving te creëren voor het ontkiemen van zaden (figuur 6B).
    5. Stel groeiomstandigheden vast.
      1. Geef de potten drie keer per dag water met een spuitfles om turgeslibditeit te behouden zonder afvloeiing totdat de zaden zijn ontkiemd (ongeveer 5 dagen).
        OPMERKING: De hoeveelheid water die wordt gebruikt, neemt toe met de plantgrootte en potgrootte.
      2. Zodra de zaden zijn ontkiemd, verplaats je de bovenste schaal naar de onderkant van de pot.
      3. Geef de planten dagelijks water als dat nodig is voor een optimale plantengroei. Stel de planten bloot aan een fotoperiode van 16 uur onder lichtomstandigheden die vergelijkbaar zijn met die welke eerder zijn beschreven en een temperatuur van 27 °C (± 1 °C).

3. Race bepalen met modified tray-dip methode (MTDM)

  1. Voorbereiding van de materialen voor inentingen
    1. Stel plantomstandigheden vast.
      1. Vul 48-cel (3,68 cm breedte x 5,98 cm lengte x 4,69 cm diepte) inzetstukken met stoom gepasteuriseerd zand: turf: vermiculiet (4:1:1) en tik naar beneden om de grond enigszins samen te drukken. Plaats de inzetstukken in plastic bakjes (27,9 cm breed x 53,3 cm lengte x 5,1 cm diep).
      2. Zaai de zaden met hun apex (proximaal uiteinde) naar boven gericht tot een diepte gelijk aan hun lengte.
      3. Bron de zaden zoals eerder beschreven.
      4. Houd daarna de media vochtig door elke 180 minuten 20 s te vernevelen of eenmaal per dag met de hand water te geven.
      5. Na ontkieming (ongeveer 5 dagen), eenmaal per dag water geven en indien nodig om de groei van de zaailingen te ondersteunen.
    2. Bereid de media voor.
      1. Bereid qPDA-medium door 5,625 g gegranuleerde agar toe te voegen aan 500 ml gedestilleerd water; voeg 4,875 g aardappel dextrose agar toe. Meng de ingrediënten goed, autoclaaf en koel af tot 50 °C voordat je ze in steriele petrischalen giet. Sluit de petrischaaltjes af met parafilm en bewaar de borden in een koelkast (4 °C) tot gebruik.
      2. Om bouillonmedium te bereiden, weeg en voeg 24 g aardappeldextrose toe aan een fles van 1 L. Breng het mengsel op 1000 ml door gedestilleerd water aan de fles toe te voegen en plaats de fles op een hete plaat en roer tot het is opgelost. Doseer 100 ml van de bouillon in erlenmeyers van 250 ml. Gebruik kaasdoek om de kolven en autoclaaf af te sluiten.
    3. Bereid het entmateriaal voor.
      1. Ent zeven dagen voor het planten vijf qPDA-platen met geïnfiltreerd papier28 en bewaar ze acht dagen in een geïncubeerde ruimte op een donkere cyclus van 14 h/10 h22.
      2. Breng op de zevende dag twee 1 cm2 agarpluggen over in elke Erlenmeyer van 250 ml met 100 ml aardappeldextrose. Plaats de Erlenmeyers op een tafelschudder bij 200 tpm gedurende 7 dagen op een licht/donkercyclus van 14 h/10 h.
      3. Oogst op de dag van inenting (14 dagen na het zaaien) de sporen door het entmateriaal door vier lagen steriel kaasdoek te filteren.
      4. Bepaal de microconidiale concentratie in de kolven met behulp van een hemocytometer zoals eerder beschreven. Bereid een entsuspensie van 7 L in een plastic kuip (40,6 cm breedte x 67,3 cm lengte x 16,8 cm diepte) door het juiste volume sporensuspensie over te brengen in steriel water voor een uiteindelijke sporenconcentratie van 1 × 106 ml−1 (figuur 7A).
  2. Inenting
    1. Breng veertien dagen na het zaaien (ten minste de eerste echte bladfase) de celinzetstukken met de zaailingen over in zwemvliezen (26,9 cm breed x 53,7 cm lang x 6,28 cm diep). Plaats de bakken met zwemvliezen met de zaailingen voorzichtig in een plastic bak met daarin de entsuspensie van 7 liter. Ent elke lade één voor één in (figuur 7B).
    2. Laat de zaailingen 15 min ongestoord in het entmateriaal blijven. Breng na 15 minuten de celinzetstukken met de ingeënte zaailingen voorzichtig over in gatloze trays (27,9 cm breed x 53,3 cm lang x 5,1 cm diep). Herhaal dit proces voor elke lade.
    3. Plaats de gatloze trays op de kasbank en geef indien nodig water. Zorg voor dezelfde licht- en omgevingscondities als beschreven voor de worteldip bioassay.

4. Ziekteclassificatie

  1. Selecteer tijdsintervallen voor beoordeling.
    1. Voor de worteldip- en gemodificeerde traydipmethoden begint u een week nadat de planten zijn ingeënt en gaat u nog vier weken wekelijks door.
      OPMERKING: De gecombineerde dataset zal gedurende deze periode vijf sets waarnemingen bevatten.
    2. Terwijl u de kernelmethode gebruikt, begint u pas met beoordelingen zodra de zaailingen tevoorschijn komen en gaan u wekelijks door voor een totaal van zes beoordelingen.
  2. Observeer en bereken de incidentie.
    1. Maak tijdens elke beoordeling digitale afbeeldingen om de voortgang van de ziekte te documenteren.
    2. Meld de incidentie van verwelking en plantensterfte. Bereken de incidentie door de som van symptomatische planten te nemen in vergelijking met de gezonde controle en het aantal dode planten als percentage van het totale aantal planten in die cultivar.
  3. Analyseer de resultaten. Vergelijk de infectiepatronen tussen de cultivars en tussen experimentele groepen als controles werden gebruikt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze experimenten helpen bij het definiëren van de relatieve weerstand van vaak gekweekte cultivars (tabel 1). Deze informatie kan vervolgens worden gebruikt om managementaanbevelingen te sturen op basis van lokale Fon-populaties. Met andere woorden, als ras 0 of 1 bekend is in een commercieel veld, dan kan de boer geneigd zijn om een "resistente" variëteit zoals Calhoun Gray, Sunsugar of gelijkwaardig te kweken. De resultaten van de bioassays met behulp van alle methoden laten zien dat wanneer de zaaili...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er zijn drie methoden voor rastypering gepresenteerd. Elk van deze methoden is het meest geschikt voor specifieke vragen en experimentele omstandigheden. De infestatiemethode voor aangetaste pitten (bodeminfestatie) is misschien eenvoudiger en eenvoudiger, waardoor het vooral nuttig is voor de beoordeling van pathogeniciteit30. Het gebruik van deze methode voor eenvoudige race-typering is zeer effectief. Het toepassen van de methode om de resistentie van een specifieke cultivar te bepalen kan echt...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We willen Dr. Ali en het Plant Molecular Diagnostic Laboratory bedanken, evenals Dr. Pingsheng Ji aan de Universiteit van Georgia, wiens leiderschap en ondersteuning hebben bijgedragen aan het opzetten van ons Fon-programma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100% Fuller’s EarthSigma-AldrichF200-5KG
1 L glazen Erlenmeyer kolfPYREX4980-1L
15 mL falconbuizenFisher Scientific14-959-49B
50 mL graduatiecilinderLab Safety Supply41121805
50 mL Eppendorf Conische buizenFisher Scientific05-413-921
AluminiumfolieReynolds Wrap720
BleachWalmart587192290
BunsenbranderFisher Scientific03-391-301
CaCO3sigma-Aldrich239216
Cell spreadersFisher Scientific08-100-11
KaasdoekLions Services, Inc8305-01-125-0725
Doorzichtige plastic schalenVisions Wave999RP6CLSS~15 cm diameter
Doorzichtige vinylbuis voor klampjes van paddenstoelzakkenShroom Supply6" voor kleine zak, 8" voor middelgrote zak, 10" voor grote zak
Katoenen wattenFisherbrand22-456-885Steriele
EthanolFisher ChemicalA4094100%, vervolgens combineren met water om 70% te maken voor gebruik
Fluorescente buisverlichtingMaxLumeModel T52800 K Kleurtemperatuur, 24'' of 48'' lang
Gegranuleerde agarVWR International90000-786
HandspuitflesAbility One24122002~0.95 L
HemacytometerFisher Scientific02-671-55ATweekamer hemacytometer
LabladetjesFisher Scientific15-236-2A
Grote, afsluitbare plastic zakkenZiploc43080538 cm x 38 cm
Sproeier / gieterBar5FB10H22
Klamp voor paddenstoelzakShroom Supply6" voor kleine zak, 8" voor middelgrote zak, 10" voor grote zak
NitrilhandschoenenFisher Scientific19-130-1597D
Biologische roggebessenShroom Supply0.5 gallon of 25 lb zakken
P1000 pipet en tipsFisher Scientific14-388-100
PetrischalenFisherbrandFB0875713Rond, 100 mm diameter, 15 mm hoogte
PlantmediumJolly GardenerPro-Line C/B
Kunststof kanBrandTechUX06008501 L of groter
Kunststof plantpottenNeo/SCI01-1177~15 cm diameter en ~10 cm hoogte
Kunststof, autoclaafbestendige bakThermo ScientificUX06010223 L
Kwartsterk aardappeldextrose agar mediumCole-ParmerUX1420028Gebruik poeder in combinatie met recept voor QPDA
Wetenschappelijke weegschaal, meet in gOhaus30208458Elke nauwkeurige weegschaal die 200g kan vasthouden en meten, zal werken
Grootte #4 kurkboorderCole-ParmerNC9585352
Kleine paddenstoel kweekzakShroom Supply0.5 micron filter, komt ook in middelgrote en grote maten
GrondschepWalmart563876946
Styrofoam flats (6 x 12 cellen)SpeedlingModel TR72A
Styrofoam flats (8 x 16 cellen)SpeedlingModel TR128A
Spuit (5 of 10 mL)fisher Scientific14-829-19C
TijdwaarnemerWalmartTM-01
V8 Original 100% GroentesapWalmart564638212
VortexFisher Scientific02-215-418
Watermeloenzaad - Black DiamondWillhite Seed Inc17
Watermeloenzaad - Calhoun GrayHolmes Seed Company4440
Watermeloenzaad - Charleston GrayBonnie Plants7.15339E+11
Watermeloenzaad - PI 296341-FRContact auteursContact auteurs
Tarwekorrels (Maxie var.) (optioneel)Alachua County Feed & Seed

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Edel-Hermann, V., Lecomte, C. Current status of Fusarium oxysporum formae speciales and races. Phytopathology. 109 (4), 512-530 (2019).
  2. Everts, K. L., Himmelstein, J. C. Fusarium wilt of watermelon: Towards sustainable management of a re-emerging plant disease. Crop Protection. 73, 93-99 (2015).
  3. Martyn, R. Cucurbitaceae 2012. Proceedings of the Xth EUCARPIA Meeting on Genetics and Breeding of Cucurbitaceae. , University of Cukurova, Ziraat Fakultesi. Antalya, Turkey. 136-156 (2012).
  4. Roberts, P., Dufault, N., Hochmuth, R., Vallad, G., Paret, M. [PP352] Fusarium wilt (Fusarium oxysporum f. sp. niveum) of watermelon. EDIS. 2019 (5), 4(2019).
  5. Keinath, A. Integrated management for Fusarium wilt of watermelon. Land-Grant Press by Clemson Extension, LGP 1022. , Available from: http://lgpress.clemson.edu/publication/integrated-management-for-fusarium-wilt-of-watermelon (2019).
  6. Costa, A. E. S., et al. Resistance to Fusarium wilt in watermelon accessions inoculated by chlamydospores. Scientia Horticulturae. 228, 181-186 (2018).
  7. Lombard, L., Sandoval-Denis, M., Lamprecht, S. C., Crous, P. Epitypification of Fusarium oxysporum-clearing the taxonomic chaos. Persoonia: Molecular Phylogeny and Evolution of Fungi. 43, 1(2019).
  8. Martyn, R. D. Fusarium wilt of watermelon: 120 years of research. Horticultural Reviews. 42 (1), 349-442 (2014).
  9. Zhou, X., Everts, K. Characterization of a regional population of Fusarium oxysporum f. sp. niveum by race, cross pathogenicity, and vegetative compatibility. Phytopathology. 97 (4), 461-469 (2007).
  10. Zhou, X., Everts, K., Bruton, B. Race 3, a new and highly virulent race of Fusarium oxysporum f. sp. niveum causing Fusarium wilt in watermelon. Plant Disease. 94 (1), 92-98 (2010).
  11. Leslie, J. F., Summerell, B. A. The Fusarium laboratory manual. , John Wiley & Sons. (2008).
  12. Lo Presti, L., et al. Fungal effectors and plant susceptibility. Annual Review of Plant Biology. 66, 513-545 (2015).
  13. Niu, X., et al. The FonSIX6 gene acts as an avirulence effector in the Fusarium oxysporum f. sp. niveum-watermelon pathosystem. Scientific Reports. 6 (1), 1-7 (2016).
  14. Lievens, B., Houterman, P. M., Rep, M. Effector gene screening allows unambiguous identification of Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici races and discrimination from other formae speciales. FEMS Microbiology Letters. 300 (2), 201-215 (2009).
  15. Houterman, P. M., Cornelissen, B. J., Rep, M. Suppression of plant resistance gene-based immunity by a fungal effector. PLoS Pathogens. 4 (5), 1000061(2008).
  16. Houterman, P. M., et al. The effector protein Avr2 of the xylem-colonizing fungus Fusarium oxysporum activates the tomato resistance protein I-2 intracellularly. The Plant Journal. 58 (6), 970-978 (2009).
  17. Czislowski, E., et al. Investigation of the diversity of effector genes in the banana pathogen, Fusarium oxysporum f. sp. cubense, reveals evidence of horizontal gene transfer. Molecular Plant Pathology. 19 (5), 1155-1171 (2018).
  18. Batson, A. M., Fokkens, L., Rep, M., du Toit, L. J. Putative effector genes distinguish two pathogenicity groups of Fusarium oxysporum f. sp. spinaciae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 34 (2), 141-156 (2021).
  19. Keinath, A. P., DuBose, V. B., Katawczik, M. M., Wechter, W. P. Identifying races of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in South Carolina recovered from watermelon seedlings, plants, and field soil. Plant Disease. 104 (9), 2481-2488 (2020).
  20. Gordon, T. R. Fusarium oxysporum and the Fusarium wilt syndrome. Annual Review of Phytopathology. 55, 23-39 (2017).
  21. Martyn, R., Netzer, D. Resistance to races 0, 1, and 2 of Fusarium wilt of watermelon in Citrullus sp. PI-296341-FR. HortScience. 26 (4), 429-432 (1991).
  22. Meru, G., McGregor, C. Genotyping by sequencing for SNP discovery and genetic mapping of resistance to race 1 of Fusarium oxysporum in watermelon. Scientia Horticulturae. 209, 31-40 (2016).
  23. Freeman, S., Rodriguez, R. A rapid inoculation technique for assessing pathogenicity of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and F. o. melonis on cucurbits. Plant Disease. 77 (12), 1198-1201 (1993).
  24. Martyn, R. Fusarium oxysporum f. sp. niveum race 2: A highly aggressive race new to the United States. Plant Disease. 71 (3), 233-236 (1987).
  25. Lai, X., et al. Evaluating inoculation methods to infect sugar beet with Fusarium oxysporum f. Beat and F. secorum. Plant Disease. 104 (5), 1312-1317 (2020).
  26. Kirk, W., et al. Optimizing fungicide timing for the control of Rhizoctonia crown and root rot of sugar beet using soil temperature and plant growth stages. Plant Disease. 92 (7), 1091-1098 (2008).
  27. Ferguson, A., Jeffers, S. Detecting multiple species of Phytophthora in container mixes from ornamental crop nurseries. Plant Disease. 83 (12), 1129-1136 (1999).
  28. Fong, Y., Anuar, S., Lim, H., Tham, F., Sanderson, F. A modified filter paper technique for long-term preservation of some fungal cultures. Mycologist. 14 (3), 127-130 (2000).
  29. Rice, W. N. The hemocytometer method for detecting fungus spore load carried by wheat. Proceedings of the Association of Official Seed Analysts of North America. 31, 124-127 (1939).
  30. Kleczewski, N. M., Egel, D. S. A diagnostic guide for Fusarium wilt of watermelon. Plant Health Progress. 12 (1), 27(2011).
  31. Dhingra, O. D., Sinclair, J. B. Basic plant pathology methods. , CRC Press. (2017).
  32. Latin, R., Snell, S. Comparison of methods for inoculation of muskmelon with Fusarium oxysporum f. sp. melonis. Plant Disease. 70 (4), 297-300 (1986).
  33. Martyn, R. An iInitial survey of the United States for races of Fursarium oxysporum f. HortScience. 24 (4), 696-698 (1989).
  34. Zhou, X., Everts, K. Races and inoculum density of Fusarium oxysporum f. sp. niveum in commercial watermelon fields in Maryland and Delaware. Plant Disease. 87 (6), 692-698 (2003).
  35. Fulton, J. C., et al. Phylogenetic and phenotypic characterization of Fusarium oxysporum f. sp. niveum isolates from Florida-grown watermelon. PLoS One. 16 (3), 0248364(2021).
  36. Zhou, X., Everts, K. Quantification of root and stem colonization of watermelon by Fusarium oxysporum f. sp. niveum and its use in evaluating resistance. Phytopathology. 94 (8), 832-841 (2004).
  37. Nutter, F. W., Esker, P. D., Netto, R. A. C. Disease assessment concepts and the advancements made in improving the accuracy and precision of plant disease data. European Journal of Plant Pathology. 115 (1), 95-103 (2006).
  38. Nutter, F., Gleason, M., Jenco, J., Christians, N. Assessing the accuracy, intra-rater repeatability, and inter-rater reliability of disease assessment systems. Phytopathology. 83 (8), 806-812 (1993).
  39. Chiang, K. -S., Bock, C. H., Lee, I. -H., El Jarroudi, M., Delfosse, P. Plant disease severity assessment-how rater bias, assessment method, and experimental design affect hypothesis testing and resource use efficiency. Phytopathology. 106 (12), 1451-1464 (2016).
  40. Nita, M., Ellis, M., Madden, L. Reliability and accuracy of visual estimation of Phomopsis leaf blight of strawberry. Phytopathology. 93 (8), 995-1005 (2003).
  41. Zhang, Z., Zhang, J., Wang, Y., Zheng, X. Molecular detection of Fusarium oxysporum f. sp. niveum and Mycosphaerella melonis in infected plant tissues and soil. FEMS Microbiology Letters. 249 (1), 39-47 (2005).
  42. Lin, Y. -H., et al. Development of the molecular methods for rapid detection and differentiation of Fusarium oxysporum and F. oxysporum f. sp. niveum in Taiwan. New Biotechnology. 27 (4), 409-418 (2010).
  43. van Dam, P., de Sain, M., Ter Horst, A., vander Gragt, M., Rep, M. Use of comparative genomics-based markers for discrimination of host specificity in Fusarium oxysporum. Applied and Environmental Microbiology. 84 (1), 01868(2018).
  44. Baayen, R. P., et al. Gene genealogies and AFLP analyses in the Fusarium oxysporum complex identify monophyletic and nonmonophyletic formae speciales causing wilt and rot disease. Phytopathology. 90 (8), 891-900 (2000).
  45. O'Donnell, K., Kistler, H. C., Cigelnik, E., Ploetz, R. C. Multiple evolutionary origins of the fungus causing Panama disease of banana: concordant evidence from nuclear and mitochondrial gene genealogies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (5), 2044-2049 (1998).
  46. Laurence, M., Summerell, B., Liew, E. Fusarium oxysporum f. sp. canariensis: evidence for horizontal gene transfer of putative pathogenicity genes. Plant Pathology. 64 (5), 1068-1075 (2015).
  47. Hudson, O., et al. Marker development for differentiation of Fusarium oxysporum f. sp. Niveum race 3 from races 1 and 2. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 822(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Fusarium verwelkingsziekteWatermeloenziekteRace typeringWorteldompelmethodeBesmette KernmethodeTray dompelmethodePathogeenisolaatZiekteincidentieResistente Cultivars

Gerelateerde artikelen