De hier beschreven methoden schetsen een procedure die wordt gebruikt om cocaïne-geïnduceerde plasticiteit in een gedragsrelevant circuit bij ratten op optogenetisch om te keren. Aanhoudende laagfrequente optische stimulatie van thalamo-amygdala synapsen induceert langdurige depressie (LTD). In vivo optogenetisch geïnduceerde LTD bij cocaïne-ervaren ratten resulteerde in de daaropvolgende verzwakking van cue-gemotiveerde drug seeking.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Optogenetica gebruiken om neuroplasticiteit om te keren en cocaïne zoeken bij ratten te remmen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dit protocol demonstreert de stappen die nodig zijn om optogenetische hulpmiddelen te gebruiken om cocaïne-geïnduceerde plasticiteit in thalamo-amygdala-circuits om te keren om het daaropvolgende cocaïnezoekgedrag bij de rat te verminderen. In ons onderzoek hadden we ontdekt dat wanneer ratten zelf intraveneuze cocaïne toedienen in combinatie met een audiovisuele cue, synapsen gevormd bij inputs van de mediale geniculate kern van de thalamus (MGN) op de belangrijkste neuronen van de laterale amygdala (LA) sterker worden naarmate de cue-cocaïne associatie wordt geleerd. We veronderstelden dat het omkeren van de door cocaïne geïnduceerde plasticiteit bij deze synapsen cue-gemotiveerde cocaïnezoekgedrag zou verminderen. Om dit type neuromodulatie in vivo te bereiken, wilden we synaptische langdurige depressie (LTD) induceren, die de sterkte van MGN-LA-synapsen vermindert. Hiervoor gebruikten we optogenetica, die neuromodulatie van hersencircuits met behulp van licht mogelijk maakt. De exciterende opsine oChiEF werd uitgedrukt op presynaptische MGN-terminals in de LA door een AAV met oChiEF in de MGN te injecteren. Optische vezels werden vervolgens geïmplanteerd in de LA en 473 nm laserlicht werd gedurende 15 minuten gepulseerd met een frequentie van 1 Hz om LTD te induceren en cocaïne-geïnduceerde plasticiteit om te keren. Deze manipulatie produceert een langdurige vermindering van het vermogen van signalen geassocieerd met cocaïne om drugszoekende acties te induceren.
Inleiding
Middelenmisbruik is een zeer ernstig probleem voor de volksgezondheid in de VS en wereldwijd. Ondanks tientallen jaren van intensief onderzoek zijn er zeer weinig effectieve therapeutische opties 1,2. Een grote tegenslag voor de behandeling is het feit dat chronisch drugsgebruik langdurige associatieve herinneringen genereert tussen omgevingssignalen en het medicijn zelf. Herblootstelling aan drugsgerelateerde signalen stimuleert fysiologische en gedragsmatige reacties die aanhoudend drugsgebruik en terugval motiveren3. Een nieuwe therapeutische strategie is om op geheugen gebaseerde be....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De experimenten die in dit protocol worden beschreven, waren in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Pittsburgh. Alle procedures werden uitgevoerd met volwassen, naïeve Sprague-Dawley-ratten die bij aankomst 275-325 g wogen.
1. Bouw van optische vezelimplantaten en patchkabels
- Bereid optische vezelimplantaten voor volgens eerder gepubliceerde protocollen9. Experimenten beschreven in dit protocol gebruikte....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een tijdlijn met de volgorde van experimenten is weergegeven in figuur 1. Gedurende gedragsexperimenten dient het aantal cocaïne-infusies en het aantal reacties op de actieve hefboom als een maat voor de intensiteit van cocaïnezoekgedrag. Tijdens de eerste dagen van zelftoediening van cocaïne moet het aantal actieve reacties geleidelijk toenemen gedurende elke acquisitiedag, voordat het in de tweede week stabiliseert. Omgekeerd moeten inactieve hefboomresponsen gedurende het gehele experimen.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Zoals hierboven beschreven, zijn er verschillende kritieke stappen die belangrijk zijn voor het bereiken van de juiste experimentele resultaten. Het protocol zal waarschijnlijk alleen effectief zijn bij dieren die op de juiste manier cocaïne zelftoediening krijgen, en tot op heden is het alleen getest met behulp van de hierboven beschreven parameters. Het is mogelijk dat de cocaïnedosis, het schema van versterking en cue-parameters kunnen worden gewijzigd met waarschijnlijk weinig effect op gedragsuitkomsten, met uitzond.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Niets te onthullen.
Dankbetuigingen
De auteurs willen de steun erkennen van USPHS-subsidies K01DA031745 (MMT), R01DA042029 (MMT), DA035805 (YHH), F31DA039646 (MTR), T32031111 (MTR) en het Pennsylvania Department of Health.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.9% Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | |
| A.M.P.I. Stimulus Isolator | Iso-Flex | ||
| AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato | Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien) | #268 | Zie Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 |
| AAV5.hSyn.tdTomato (Control) | Duke Viral Vector Core Control | Zie Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014 | |
| Artificial Tears (Opthalmic Ointment) | Covetrus | 70349 | |
| ATP Magnesium Salt | Fisher Scientific | A9187 | |
| Betadine | Butler Schein | 38250 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | C1016 | |
| Cesium chloride | Fisher Scientific | 289329 | |
| Cesium hydroxide | Fisher Scientific | 516988 | |
| Cesium methanesulfonate | Fisher Scientific | C1426 | |
| Cocaine HCl | NIDA Drug Supply Center | 9041-001 | |
| Cryostat | Leica | CM1950 | |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| DMSO | Fisher Scientific | BP231-1 | |
| Dual-Channel Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344C | |
| EGTA | Fisher Scientific | E3889 | |
| Ethanol | University of Pittsburgh Chemistry Stockroom | 200C5000 | |
| Ferrule Dust Caps | Thor Labs | CAPL | Witte plastic dust caps voor 1.25 mm Ferrules |
| Ferrule Mating Sleeves | Doric Lenses | F210-3011 | Sleeve_BR_1.25, Brons, 1.25 mm ID |
| Ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2007C-2300 | Ø1.25 mm Multimode LC/PC Keramische ferrule, Ø230 μm gatsgrootte |
| Fiber Optic | Thor Labs | FP200URT | 200 μm kern multimode glasvezel (0.5 NA) |
| Fiber Optic Rotary Joint | Prizmatix | (Besteld bij Amazon) | 18 mm diameter, FC-FC connector voor glasvezel |
| Fiber Stripping Tool | Thor Labs | T12S21 | |
| Fluoroshield met DAPI | Sigma-Aldrich | F6057 | |
| Gentamicin | Henry Schein | 6913 | |
| GTP Sodium Salt | Fisher Scientific | G8877 | |
| Hamilton-spuiten | Hamilton | 80085 | 10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, puntstijl 3 |
| Heat Gun | Allied Electronics | 972-6966 | 250 V, 750-800 °F |
| Heat-Curable Epoxy | Precision Fiber Products | PFP-353ND-8OZ | |
| Heparine | Henry Schein | 55737 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrochloridezuur | Fisher Scientific | 219405490 | |
| Isofluran | Henry Schein | 29405 | |
| Ketamine HCl | Henry Schein | 55853 | Ketamine is een gereguleerde stof en moet worden behandeld volgens institutionele richtlijnen |
| Lactated Ringer's | Henry Schein | 9846 | |
| Laser, driver en laser-naar-vezel koppeling | OEM Laser Systems | BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0 | 100 mW, 473-nm, diode-gepompte vaste-staat laser (Eén optie) |
| L-glutathion | Fisher Scientific | G4251 | |
| Lidocaïne | Butler Schein | 14583 | |
| Light Sensor | Thor Labs | PM100D | Compacte energiemeter console met digitaal display |
| Loctite instantlijm | Grainger | 5E207 | |
| Magnesiumsulfaat | Sigma-Aldrich | 203726 | |
| Microelectrode Amplifier/Data Acquisition | Molecular Devices | MULTICLAMP700B / Digidata 1440A | |
| Microinjector pomp | Harvard Apparatus | 70-4501 | Dual spuit |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MPC-200/ROE-200 | |
| Microscoop | Olympus | BX51WI | Staande microscoop voor elektrofysiologie |
| Microscoop | Olympus | BX61VS | Epifluorescente slide-scanning microscoop |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Orthojet tandheelkundig cement, vloeibaar | Lang Dental | 1504BLK | zwart |
| Orthojet tandheelkundig cement, poeder | Lang Dental | 1530BLK | Hedendaags poeder, zwart |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch Cables | Thor Labs | FP200ERT | Multimode, FT030 Buizen |
| Picrotoxin | Fisher Scientific | AC131210010 | |
| Polishing Disc | Thor Labs | D50FC | |
| Polishing Pad | Thor Labs | NRS913 | 9" x 13" |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG5P | 5 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG3P | 3 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG1P | 1 μm grit |
| Polishing Paper | Thor Labs | LFG03P | 0.3 μm grit |
| Kaliumchloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Kaliumhydroxide | Fisher Scientific | P5958 | |
| Kaliummethanesulfonaat | Fisher Scientific | 83000 | |
| QX-314-Cl | Alomone Labs | Q-150 | |
| Rimadyl (Carprofen) | Henry Schein | 24751 | |
| Self-Administration Chambers/Software | Med Associates | MED-NP5L-D1 | |
| Natriumbicarbonaat | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Natriumchloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Natriumhydroxide | Sigma-Aldrich | 1064980500 | |
| Natrium-L-ascorbaat | Sigma-Aldrich | A7631 | |
| Natriumpentobarbital | Henry Schein | 243 |
Referenties
- Connors, N. J., Hoffman, R. S. Experimental treatments for cocaine toxicity: A difficult transition to the bedside. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 347 (2), 251-257 (2013).
- Makani, R., Pradhan, B., Shah, U., Parikh, T.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
