Optogenetica gebruiken om neuroplasticiteit om te keren en cocaïne zoeken bij ratten te remmen

Samenvatting

De hier beschreven methoden schetsen een procedure die wordt gebruikt om cocaïne-geïnduceerde plasticiteit in een gedragsrelevant circuit bij ratten op optogenetisch om te keren. Aanhoudende laagfrequente optische stimulatie van thalamo-amygdala synapsen induceert langdurige depressie (LTD). In vivo optogenetisch geïnduceerde LTD bij cocaïne-ervaren ratten resulteerde in de daaropvolgende verzwakking van cue-gemotiveerde drug seeking.

Samenvatting

Dit protocol demonstreert de stappen die nodig zijn om optogenetische hulpmiddelen te gebruiken om cocaïne-geïnduceerde plasticiteit in thalamo-amygdala-circuits om te keren om het daaropvolgende cocaïnezoekgedrag bij de rat te verminderen. In ons onderzoek hadden we ontdekt dat wanneer ratten zelf intraveneuze cocaïne toedienen in combinatie met een audiovisuele cue, synapsen gevormd bij inputs van de mediale geniculate kern van de thalamus (MGN) op de belangrijkste neuronen van de laterale amygdala (LA) sterker worden naarmate de cue-cocaïne associatie wordt geleerd. We veronderstelden dat het omkeren van de door cocaïne geïnduceerde plasticiteit bij deze synapsen cue-gemotiveerde cocaïnezoekgedrag zou verminderen. Om dit type neuromodulatie in vivo te bereiken, wilden we synaptische langdurige depressie (LTD) induceren, die de sterkte van MGN-LA-synapsen vermindert. Hiervoor gebruikten we optogenetica, die neuromodulatie van hersencircuits met behulp van licht mogelijk maakt. De exciterende opsine oChiEF werd uitgedrukt op presynaptische MGN-terminals in de LA door een AAV met oChiEF in de MGN te injecteren. Optische vezels werden vervolgens geïmplanteerd in de LA en 473 nm laserlicht werd gedurende 15 minuten gepulseerd met een frequentie van 1 Hz om LTD te induceren en cocaïne-geïnduceerde plasticiteit om te keren. Deze manipulatie produceert een langdurige vermindering van het vermogen van signalen geassocieerd met cocaïne om drugszoekende acties te induceren.

Inleiding

Middelenmisbruik is een zeer ernstig probleem voor de volksgezondheid in de VS en wereldwijd. Ondanks tientallen jaren van intensief onderzoek zijn er zeer weinig effectieve therapeutische opties ^1,2. Een grote tegenslag voor de behandeling is het feit dat chronisch drugsgebruik langdurige associatieve herinneringen genereert tussen omgevingssignalen en het medicijn zelf. Herblootstelling aan drugsgerelateerde signalen stimuleert fysiologische en gedragsmatige reacties die aanhoudend drugsgebruik en terugval motiveren³. Een nieuwe therapeutische strategie is om op geheugen gebaseerde behandelingen uit te voeren die gericht zijn op het manipuleren van de circuits die betrokken zijn bij het reguleren van drug-cue-associaties. Onlangs werd waargenomen dat synapsen in de laterale amygdala (LA), met name die welke voortkomen uit de mediale geniculate nucleus (MGN) van de thalamus, worden versterkt door herhaalde cue-geassocieerde cocaïne zelftoediening, en dat deze potentiëring cocaïnezoekgedrag kan ondersteunen ^4,5. Daarom werd voorgesteld dat cue-geïnduceerde re-integratie kon worden verzwakt door plasticiteit bij MGN-LA synapsen om te keren.

Het vermogen om de synaptische plasticiteit van een specifiek hersencircuit nauwkeurig te richten, is een grote uitdaging voor het veld geweest. Traditionele farmacologische hulpmiddelen hebben enig succes gehad bij het verminderen van terugvalgedrag, maar worden beperkt door het onvermogen om individuele synapsen te manipuleren. De recente ontwikkeling van in vivo optogenetica heeft echter de tools opgeleverd die nodig zijn om deze beperkingen te overwinnen en neurale paden te beheersen met temporele en ruimtelijke precisie ^6,7,8. Door lichtgevoelige opsins in een specifiek hersencircuit tot expressie te brengen, kan laserlicht vervolgens worden gebruikt om het circuit te activeren of te remmen. Frequentieafhankelijke optische stimulatie kan worden gebruikt om specifiek de synaptische plasticiteit van het circuit in een zich gedragend dier te manipuleren.

Dit manuscript schetst de procedure die is gevolgd om het gedragsrelevante MGN-LA-circuit te manipuleren met behulp van in vivo optogenetica. Eerst werd de exciterende opsine oChIEF uitgedrukt in de MGN en werden optische vezels bilateraal geïmplanteerd in de LA. Dieren werden vervolgens getraind om zelf cocaïne toe te dienen op een cue-afhankelijke manier, wat de MGN-LA-route versterkt. Vervolgens werd aanhoudende, laagfrequente stimulatie met 473 nm laserlicht gebruikt om circuitspecifieke LTD te produceren. Het omkeren van de plasticiteit geïnduceerd door cocaïnegebruik genereerde een langdurige vermindering van het vermogen van signalen om acties te activeren die geassocieerd zijn met drugszoekgedrag.

Protocol

De experimenten die in dit protocol worden beschreven, waren in overeenstemming met de richtlijnen van de National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals en werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de University of Pittsburgh. Alle procedures werden uitgevoerd met volwassen, naïeve Sprague-Dawley-ratten die bij aankomst 275-325 g wogen.

1. Bouw van optische vezelimplantaten en patchkabels

1. Bereid optische vezelimplantaten voor volgens eerder gepubliceerde protocollen⁹. Experimenten beschreven in dit protocol gebruikten 200 μm kernvezel (0,5 NA) en Ø1,25 mm Multimode LC / PC Keramische ferrule, Ø230 μm gatgrootte.
   1. Gebruik een Dremel-gereedschap om het onderste derde deel van een ferrule te scoren (het dichtst bij het platte uiteinde van de ferrule). Het scoren van de ferrules helpt hen gehecht te blijven aan tandcement, waardoor de kans toeneemt dat ze veilig blijven gedurende de hele duur van het experimenteren.
   2. Gebruik draadsnijders om ~35 mm vezel te snijden. Gebruik fiber stripping tool om ~25 mm vezel te strippen, waardoor 10 mm onbelicht blijft.
   3. Bereid warmte-uithardende epoxy volgens de instructies van de fabrikant. Los 1 g harspoeder op in 100 mg verharderverbinding. Bevestig een stompe naald van 25 gauge aan een spuit van 1 ml. Vul de spuit met epoxy en bevestig een stompe naaldpunt van 25 gauge.
   4. Gebruik een bankschroef of klem om de ferrule stevig vast te houden met de platte kant naar boven en de bolle kant naar beneden. Voeg met de met epoxy gevulde spuit één druppel epoxy toe aan de platte kant van de ferrule en wees voorzichtig om overtollige epoxy van de zijkanten van de ferrule af te vegen.
   5. Steek het gestripte deel van de vezel door de ferrule waardoor een extra 5 mm gestripte vezel wordt blootgesteld. In het geval van LA-implantaten wordt de vezel 7,9 mm ventraal geïmplanteerd tot bregma, dus de blootgestelde lengte van niet-gespannen vezels moet ~ 13 mm zijn.
   6. Hard de epoxy uit met een warmtepistool gedurende ongeveer 30-40 s totdat deze zwart / amber van kleur wordt.
   7. Scoor de vezel direct op het grensvlak van het bolle uiteinde van de ferrule met een diamantmes en gebruik een vinger om de vezel voorzichtig af te tikken.
   8. Poets het bolle uiteinde van de ferrule door vast te houden met een hemostat, zorg ervoor dat u gelijkmatige druk uitoefent en maak 20 cirkelvormige rotaties elk op een reeks polijstpapier (van hoge kwaliteit tot lage kwaliteit; 5, 3, 1, 0,3 μm).
   9. Bevestig de niet-gespannen vezel aan de tafel met behulp van tape en score gestripte vezels, waardoor een extra 2 mm voorbij de ventrale coördinaat overblijft (voor LA-implantaten is de uiteindelijke lengte van de vezel ~ 10 mm). Gebruik een hemostat om aan de ferrule te trekken en de vezel gelijkmatig te breken waar deze is gescoord. Pas op dat u vezels niet volledig snijdt tijdens het scoren, anders wordt de kern van de vezel beschadigd.
2. Bouw patchkabels die compatibel zijn met optische vezelimplantaten. Op maat ontworpen patchkabels werden aangeschaft (zie materiaaltabel). Als alternatief kunnen patchkabels worden gebouwd volgens eerder gepubliceerde protocollen⁹.
   OPMERKING: De diameter en NA van de ferrulevezel en patchkabelvezel moeten overeenkomen op de koppelingsverbinding om overmatig verlies van licht te voorkomen, wat kan resulteren in het niet voldoende stimuleren van neurale activiteit.
3. Meet de lichtopbrengst via de patchkabel en optische vezelimplantaten door patchkabel/optische vezel aan een geschikte laserlichtbron (473 nm, 1 mW output) te bevestigen en de output te meten met een lichtsensor. Een succesvol geconstrueerde vezel zendt een concentrische lichtcirkel uit en heeft niet meer dan 30% lichtverlies.

2. Intraveneuze katheterisatie van knaagdieren, virusafgifte en implantatie van optische vezels

1. Bereid het dier voor op een operatie.
   1. Verdoof ratten volledig met verdoving naar keuze op basis van institutionele richtlijnen. Een optie is ketaminehydrochloride (87,5-100 mg / kg, i.m.) en xylazinehydrochloride (5 mg / kg, i.m.). Zorg ervoor dat de rat volledig verdoofd is door te controleren op het ontbreken van een teenknijpreflex.
      LET OP: Ketamine is een gereguleerde stof die moet worden behandeld volgens institutionele richtlijnen.
      OPMERKING: Intramusculaire injectie van anesthetica wordt in deze studie gebruikt omdat het een snellere en betrouwbaardere anesthesie-inductie produceerde dan intraperitoneale injectie. Controleer continu de ademhaling en het reactievermogen van de rat en bied thermische ondersteuning tijdens de operatie.
   2. Scheer een groot deel van de rug van de rat (bovenrug van net boven de schouderbladen tot het midden van de rug), evenals het gebied van de nek onder de rechtervoorpoot en de hoofdhuid.
   3. Plaats de rat in het operatiegebied en breng puralube (kunstmatige tranen) aan op de ogen. Injecteer een lichaamsgewichtvolume carprofen (analgeticum) subcutaan (s.c.) door de huid van de bovenrug en injecteer vervolgens 5 ml Lactated Ringer's oplossing s.c. door de huid van de onderrug.
   4. Ontsmet alle chirurgische plaatsen door een stuk steriel gaas met betadine te bevochtigen en het met een cirkelvormige beweging over het geschoren chirurgische gebied af te vegen. Herhaal vervolgens het proces met 70% ethanol. Herhaal deze afwisselende cyclus drie keer.
2. Voer intraveneuze katheterimplantatie uit volgens eerder gepubliceerde protocollen ^4,10.
   OPMERKING: Een chirurgisch gordijn wordt tijdens deze operatie niet gebruikt om irritatie tijdens katheterimplantatie te voorkomen. Steriliseer alle instrumenten en apparatuur voor gebruik. Gebruik steriele handschoenen en vervang de handschoenen als er contact wordt gemaakt met een niet-steriel oppervlak.
3. Onmiddellijk na katheterimplantaties moet u de rat in een stereotaxisch frame vastzetten om AAV-injecties uit te voeren.
   1. Lever een subcutane (s.c) injectie van 2% lidocaïne (0,2-0,3 ml) op de hoofdhuid als een lokaal verdovingsmiddel.
      OPMERKING: Lokale verdoving wordt niet gebruikt tijdens de intraveneuze katheterimplantatie om wijzigingen in de chirurgische uitkomsten te voorkomen.
   2. Sluit een 26-gauge roestvrijstalen injectiecanule aan op een Hamilton-spuit gevuld met 1 μL geconcentreerde AAV-oplossing: AAV5-hSyn-tdTomato of AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      OPMERKING: oChIEF is een variant van de blauwlichtgevoelige opsinekanaalrhodopsine (ChR2), die kan reageren op een breed frequentiebereik ^8,11, en daarom nut heeft voor de laagfrequente LTD-experimenten die in dit protocol worden besproken, maar ook voor hoogfrequente LTP-experimenten (hier niet besproken). De oChIEF-constructie werd geschonken door Dr. Roger Tsien en verwerkt voor verpakking en zuivering door de Duke Viral Vector Core. Er is ten minste 3-4 weken nodig tussen de injectiedag en de dag van LTD-inductie om optimale virusexpressie in MGN-axonterminals mogelijk te maken.
      LET OP: Over het algemeen wordt AAV beschouwd als een bioveiligheidsniveau 1 (BSL-1) organisme, met een laag risico op zelfinfectie, tenzij een helpervirus wordt gebruikt bij de productie ervan. Het gebruik ervan vereist IACUC-goedkeuring en de juiste PBM moeten te allen tijde worden gebruikt in overeenstemming met institutionele richtlijnen om onnodige blootstelling te beperken.
   3. Maak met behulp van een scalpel een incisie van 0,5 mm van de voorkant naar de achterkant van de schedel en verwijder bovenliggend weefsel om het oppervlak van de schedel bloot te leggen.
   4. Egaliseer de kop van de rat in de voorste/achterste as en nul stereotaxische coördinaten naar bregma.
   5. Boor drie kleine gaatjes door de schedel met behulp van een Dremel-gereedschap uitgerust met een kleine boor. Gebruik de schroevendraaier om roestvrijstalen schroeven (M2x4 965-A2) stevig op hun plaats te monteren.
      OPMERKING: Schroeven zijn nodig voor een goede binding van tandcement en het creëren van stevige, duurzame kopkappen. De positie van de schroeven moet worden verspreid over de voorste-achterste as van de schedel en weg van de AAV-injectieplaats.
   6. Boor bilaterale gaten voor injectie van AAV op basis van de coördinaten van de Rattenhersenatlas (Watson en Paxinos)¹² voor het mediale deel van de mediale geniculate nucleus (MGN); in mm van bregma, AP: -5,4; ML: ±3,0; DV: -6,6. Verlaag langzaam de injectiecanulee (4 mm/min) totdat deze in de MGN is geplaatst. Injecteer geconcentreerde AAV-oplossing met een snelheid van 0,1 μL/min.
   7. Laat de injectiecanule 5 minuten op zijn plaats nadat de infusies zijn voltooid om diffusie weg van de canule mogelijk te maken en trek vervolgens de canule langzaam uit de hersenen terug.
4. Onmiddellijk na virusinjecties, doorgaan met het implanteren van optische vezels ^4,9 gericht op MGN-LA terminals.
   1. Gebruik een Dremel-gereedschap om bilaterale gaten te boren voor optische vezelimplantaten gericht op de laterale amygdala (in mm van bregma, AP: -3.0; ML ±5.1).
   2. Gebruik een tang om de ferrule van het optische vezelimplantaat te pakken en bevestig deze aan de stereotaxische adapters, zodat ze veilig op hun plaats worden gehouden.
   3. Verlaag langzaam de vezels met een snelheid van 2 mm / min, totdat de punt van de vezel in het dorsale gedeelte van de LA zit (DV: -7,9 mm).
   4. Bevestig ferrules eerst aan de schedel met behulp van een dunne laag Loctite instant lijm gevolgd door tandcement en bedek ferrules met ferrule sleeves met een diameter van 1,25 mm en stofdeksels.
      OPMERKING: De keuze van de lijm voor het bevestigen van de ferrules aan de schedel moet worden goedgekeurd door de lokale of institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik. Loctite wordt voor dit onderzoek gebruikt om de ferrules na vallen en opstaan betrouwbaar aan de schedel te bevestigen met meerdere lijmen; er kunnen echter beschikbare alternatieven worden overwogen.
5. Na chirurgische ingrepen huisvest u ratten individueel en biedt u gratis toegang tot voedsel en water. Bied postoperatieve zorg in overeenstemming met institutionele richtlijnen. Spoel katheters dagelijks met zoutoplossing die gentamicine (5 mg / ml) en heparine (30 USP / ml) bevat om de doorgankelijkheid te behouden. Ten minste 5 dagen na de operatie en 24 uur voor het begin van gedragsexperimenten, beperkt voedsel ratten tot ~ 90% van hun vrije voedende gewicht.

3. Zelftoediening van knaagdiercocaïne en instrumentele hefboomuitsterving

OPMERKING: Alle gedragsprocedures worden uitgevoerd in standaard operante conditioneringskamers, uitgerust met twee intrekbare hendels aan één muur, een stimuluslicht boven elke hendel, een toongenerator, een huislamp en een infusiepomp.

1. Onderwier ratten aan dagelijkse 1-h cocaïne (2 mg / ml) zelftoedieningstrainingen volgens een FR1-schema van versterking.
   1. Plaats ratten elke dag in een operante kamer en laat ratten met een hefboom drukken. Een druk op de aangewezen 'actieve hefboom' (tegenwicht over linker- en rechterhendels) resulteert in een cocaïne-infusie (1,0 mg/kg/infusie) en een presentatie van 10 s van een samengestelde licht- en toonkeu. Een druk op de aangewezen 'inactieve hefboom' heeft geen geprogrammeerde effecten.
   2. Ga door met zelftoedieningsexperimenten gedurende ten minste 10 d en totdat ratten met succes ten minste 8 infusies / dag verdienen gedurende 3 opeenvolgende dagen. Het niet bereiken van acquisitiecriteria op dag 20 resulteert in uitsluiting van het onderzoek.
2. Nadat met succes aan de acquisitiecriteria is voldaan, onderwerpen ratten aan 1 uur instrumentele uitstervingssessies gedurende 6-10 d.
   1. Plaats ratten in operante kamers en laat ratten vrijelijk drukken. Reacties op zowel de actieve als de inactieve hefboom hebben echter geen geprogrammeerde gevolgen.
   2. Laat ratten dagelijks doorgaan met het uitsterven van instrumenten totdat er gemiddeld < 25 hefboomdrukken gedurende twee opeenvolgende dagen plaatsvindt.

4. In vivo optogenetische inductie van LTD

OPMERKING: Optogenetische remmingsexperimenten vinden plaats 24 uur na de laatste dag van instrumentele extinctie.

1. Sluit patchkabels aan op een blauwe laserdiode van 473 nm via een roterende verbinding die boven een schone, standaard knaagdierhuiskooi hangt met de afdekking verwijderd. Met deze opstelling kunnen knaagdieren vrij door de kooi bewegen tijdens de optogenetische stimulatie.
2. Schakel de laserdiode in volgens de gebruiksaanwijzing en sluit deze aan op een pulsgenerator. Pas de instellingen aan, zodat de rat bij het inschakelen 900 2-ms lichtpulsen bij 1 Hz ontvangt.
   LET OP: De juiste oogbescherming moet te allen tijde worden gebruikt tijdens het gebruik van de laser.
3. Meet de lichtintensiteit via het patchsnoer met behulp van een lichtsensor. Pas de intensiteit van de laser aan zodat de lichtopbrengst via de patchkabel ~5-7 mW is.
4. Plaats ratten in een schone kooi. Verwijder stofdeksels en ferrule sleeves, waardoor de ferrules bloot komen te liggen. Sluit patchkabels bilateraal aan op de optische vezelimplantaten. Laat ratten de omgeving gedurende 3 minuten verkennen voorafgaand aan ltd-inductie.
5. Schakel de pulsgenerator in om optogenetische stimulatie te starten.
   OPMERKING: Hoewel onwaarschijnlijk, als rat bijwerkingen op stimulatie ervaart, wordt het experiment onmiddellijk beëindigd en worden ratten op de juiste manier geëuthanaseerd op basis van institutionele richtlijnen.
6. Houd ratten na LTD-inductie 3 minuten in de kooi en plaats ze vervolgens terug in hun thuiskooien.
7. Gebruik voor controle-experimenten dezelfde stimulatieprocedure bij ratten die het AAV5-tdTomato-controlevirus tot expressie brengen. Voor schijnexperimenten bevestigt u een patchkabel aan de optische vezel van ratten die het AAV5-oChIEF-virus tot expressie brengen, maar er wordt geen stimulatie geleverd tijdens een sessie van 15 minuten.

5. Test het effect van optogenetische stimulatie op cue-geïnduceerde cocaïne zoeken

1. Plaats ratten 24 uur na in vivo optogenetische stimulaties terug in operante conditioneringskamers. Ratten worden onderworpen aan een 1-h standaard cue-geïnduceerde herplaatsingssessie om cocaïnezoekgedrag te beoordelen.
   OPMERKING: Tijdens cue-geïnduceerde re-integratie levert een respons op de actieve hefboom een 10-s presentatie van de cocaïne-geassocieerde cue op, maar geen cocaïne-infusies.
2. Geef een tweede herplaatsingstest ten minste 1 week na de eerste test om te bepalen of optogenetische LTD-inductie resulteert in een langdurige onderdrukking van cocaïne zoeken

6. Kleuring, fluorescentie en beeldvorming voor histologische verificatie van virale expressie en plaatsing van optische vezels

1. Maak 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en 4% paraformaldehyde (PFA). Bewaar beide oplossingen op ijs. Het totale volume zal afhangen van het aantal ratten in het onderzoek (~100 ml PBS en 200 ml PFA zal per rat worden gebruikt).
   LET OP: PFA is een giftige chemische stof en bekend carcinogeen. Wees goed voorzichtig om inademing en contact met de huid te voorkomen. Het gebruik en de verwijdering ervan moeten in overeenstemming zijn met de institutionele richtsnoeren, met inbegrip van het gebruik van de juiste PBM en een chemische stromingskap.
2. Installatie peristaltische pomp bij een debiet van 20 ml/min. Vul slang van pomp met 1x PBS. Bevestig een stompe naald van 20 gauge aan het uiteinde van de buis.
3. Verdoof ratten diep met natriumpentobarbital (100 mg/kg, i.p.). Bevestig de diepte van de anesthesie door een gebrek aan reactie op teenknijpen voordat u verder gaat.
   OPMERKING: Natriumpentobarbital wordt gebruikt omdat de perfusie een terminale procedure is.
4. Gebruik een chirurgische schaar om de buikholte van de rat onder het middenrif open te snijden. Snijd de ribbenkast rostrale langs de zijranden om het hart van de rat bloot te leggen. Gebruik hemostat om het rostrale deel van de ribbenkast weg te klemmen van het hart. Snijd al het bovenliggende vetweefsel dat het hart omringt weg.
5. Steek de stompe naald door de linker ventrikel en omhoog in de aorta. Snijd een klein gaatje in het rechter atrium om de oplossing af te voeren terwijl deze terugkeert naar het hart.
6. Perfuseer elke rat met 1x PBS gedurende 5 minuten gevolgd door 4% PFA, pH 7,4 gedurende 10 min.
7. Onthoofd de rat, haal de hersenen eruit en postfixeer het in 4% PFA gedurende 24 uur. Breng vervolgens de hersenen over naar 30% sucrose-oplossing gedurende 2-3 d.
8. Sectie hersenen op 50 μm met behulp van een cryostaat.
9. Monteer alle plakjes met de LA of MGN op glazen dia's en coverslip.
10. Beeldsegmenten met behulp van een epifluorescente microscoop om de AAV-oChIEF-tdTomato-expressie in de MGN en de projecties naar de LA te verifiëren, evenals de plaatsing van de optische vezel boven de LA.

7. Perfusie en acute hersenschijfvoorbereiding voor elektrofysiologische experimenten

OPMERKING: Elektrofysiologische experimenten worden uitgevoerd op een subset van dieren om het succes van in vivo LTD te valideren.

1. Bereid elektrofysiologische oplossingen met behulp van de in de tabellen 1-3 ^4,13 vermelde reagentia. Stel de pH van alle oplossingen in op 7,4 met HCl en stel de osmolariteit in op 300-310 mOsm/kg H₂O. Maak oplossingen vers voorafgaand aan experimenten en bewaar ze maximaal 1 week bij 4 °C. Verzadig alle oplossingen met carbogen (95% O₂/5% CO₂) te allen tijde tijdens gebruik.
2. Gebruik isofluraan volgens de lokale of institutionele dierverzorging en gebruiksrichtlijnen, verdoof de rat diep in een afgesloten euthanasiekamer.  Controleer of het dier volledig verdoofd is via de teen-knijpreflex.
3. Vul een klein bekerglas met 50 ml ijskoude snijoplossing. Vul de slang van de peristaltische pomp met een oplossing en pas het debiet aan op 20 ml / min. Bevestig een stompe naald van 20 gauge aan het uiteinde van de buis.
4. Open de buikholte (zie stappen 6.4 en 6.5) en perfuseer rat kort met snijoplossing (maximaal 1-2 min).
5. Na perfusie, onthoofd rat onmiddellijk. Verwijder de hersenen en plaats deze in een klein bekerglas gevuld met 4 °C snijoplossing gedurende 30 s-1 min.
6. Breng hersenen over met een spatel en bevestig ze snel naar de kamer van een vibratoom. Verwijder de pia met een fijne tang. Vul de kamer met een snijoplossing van 4 °C en bereid acute coronale plakjes (250 μm dik) van de amygdala met een snelheid van 0,37 mm/sec en een frequentie van 70 Hz.
7. Als plakjes worden verkregen, plaatst u ze allemaal in een met snijoplossing gevulde bewaarkamer en incubeert u ze gedurende 10-12 minuten bij 37 °C. Ongeveer 5-7 plakjes met de LA kunnen per dier worden verkregen.
8. Breng plakjes over naar een bekerglas met kamertemperatuur (RT) holdingoplossing en laat >30 minuten herstellen voordat u experimenteert.
   OPMERKING: Plakjes blijven over het algemeen gezond terwijl ze 4-6 uur in de bewaaroplossing worden bewaard. Vanwege het fluorescerende karakter van de AAV worden plakjes bewaard bij weinig licht.

8. Ex vivo elektrofysiologische opnames

1. Bereid intracellulaire oplossingen met behulp van de in de tabellen 4-5 vermelde reagentia.
   OPMERKING: Intracellulaire oplossingen moeten voorafgaand aan experimenten worden gemaakt en kunnen langdurig (3-12 maanden) worden bewaard bij -80 °C of op korte termijn (1-2 maanden) bij -20 °C. Oplossingen worden pH aangepast tot 7,3 (met CsOH voor Cs-gebaseerde intracellulaire oplossing en met KOH voor K-gebaseerde intracellulaire oplossing). Stel in op een uiteindelijke osmolariteit van 290-300 mOsm/kg H₂O.
2. Bereid 500 mM picrotoxine stockoplossing opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO).
   OPMERKING: Picrotoxinevoorraden worden gealiquoteerd en opgeslagen bij -20 °C. Op de dag van gebruik worden aliquots ontdooid en toegevoegd aan de registratieoplossing tot een eindconcentratie van 100 μM.
   LET OP: Picrotoxine is een niet-competitieve antagonist van GABA_A-receptoren , dus infusie van picrotoxine heeft een stimulerend effect. Het is ernstig giftig door orale inname of huidabsorptie. De juiste PBM's moeten te allen tijde worden gebruikt bij het werken met picrotoxine.
3. Breng plakjes over naar een rechtopstaande microscoop die is ontworpen voor elektrofysiologische experimenten.
4. Tijdens experimenten worden plakjes continu geperfuseerd met een opnameoplossing die wordt verwarmd tot 31-33 °C.
5. Vergroot de LA met behulp van een 4x-doelstelling. Identificeer de belangrijkste neuronen door morfologie met een 40x water onderdompeling lens.
6. Gebruik een glazen pipet (3-5 MΩ) gevuld met een op Cs gebaseerde intracellulaire oplossing (voor spanningsklemexperimenten) of een op K gebaseerde intracellulaire oplossing (voor stroomklemexperimenten) om patchklemopnamen voor hele cellen te verkrijgen.
7. Identificeer AAV-geïnfecteerde MGN axonale projecties onder fluorescentie (met behulp van een RFP-filter). Stimuleer projecties met behulp van een dpss-laser met blauw licht (473 nm) die is aangesloten op een pulsgenerator.
   LET OP: Om de laserblootstelling te beperken, wordt gecollimeerd laserlicht gekoppeld aan een fluorescerende poort op de microscoop en gericht op het segment door het doel.
   OPMERKING: In de spanningsklemmodus worden exciterende postsynaptische stromen (EPSC's) optisch opgeroepen bij 0,1 Hz. Neuronen die input ontvangen van AAV-geïnfecteerde MGN-neuronen zullen betrouwbare EPSC's vertonen.
8. Om ex vivo LTD te induceren, registreert u in de huidige klemmodus een stabiele basislijn van exciterende postsynaptische potentialen (EPSP's) gedurende ten minste 10 minuten. Lever vervolgens 900 2-ms pulsen van 473-nm licht met een frequentie van 1 Hz (totale tijd = 15 min). Neem vervolgens continu EPSP's op 0,1 Hz op gedurende ≥60 min.

Resultaten

Een tijdlijn met de volgorde van experimenten is weergegeven in figuur 1. Gedurende gedragsexperimenten dient het aantal cocaïne-infusies en het aantal reacties op de actieve hefboom als een maat voor de intensiteit van cocaïnezoekgedrag. Tijdens de eerste dagen van zelftoediening van cocaïne moet het aantal actieve reacties geleidelijk toenemen gedurende elke acquisitiedag, voordat het in de tweede week stabiliseert. Omgekeerd moeten inactieve hefboomresponsen gedurende het gehele experimen...

Discussie

Zoals hierboven beschreven, zijn er verschillende kritieke stappen die belangrijk zijn voor het bereiken van de juiste experimentele resultaten. Het protocol zal waarschijnlijk alleen effectief zijn bij dieren die op de juiste manier cocaïne zelftoediening krijgen, en tot op heden is het alleen getest met behulp van de hierboven beschreven parameters. Het is mogelijk dat de cocaïnedosis, het schema van versterking en cue-parameters kunnen worden gewijzigd met waarschijnlijk weinig effect op gedragsuitkomsten, met uitzond...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
0.9% Saline	Fisher Scientific	NC0291799
A.M.P.I. Stimulus Isolator	Iso-Flex
AAV5.hSyn.oChIEF.tdTomato	Duke Viral Vector Core (via Roger Tsien)	#268	Zie Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
AAV5.hSyn.tdTomato (Control)	Duke Viral Vector Core Control		Zie Lin et al., 2009; Nabavi et al., 2014
Artificial Tears (Opthalmic Ointment)	Covetrus	70349
ATP Magnesium Salt	Fisher Scientific	A9187
Betadine	Butler Schein	38250
Calcium chloride	Fisher Scientific	C1016
Cesium chloride	Fisher Scientific	289329
Cesium hydroxide	Fisher Scientific	516988
Cesium methanesulfonate	Fisher Scientific	C1426
Cocaine HCl	NIDA Drug Supply Center	9041-001
Cryostat	Leica	CM1950
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DMSO	Fisher Scientific	BP231-1
Dual-Channel Temperature Controller	Warner Instruments	TC-344C
EGTA	Fisher Scientific	E3889
Ethanol	University of Pittsburgh Chemistry Stockroom	200C5000
Ferrule Dust Caps	Thor Labs	CAPL	Witte plastic dust caps voor 1.25 mm Ferrules
Ferrule Mating Sleeves	Doric Lenses	F210-3011	Sleeve_BR_1.25, Brons, 1.25 mm ID
Ferrules	Precision Fiber Products	MM-FER2007C-2300	Ø1.25 mm Multimode LC/PC Keramische ferrule, Ø230 μm gatsgrootte
Fiber Optic	Thor Labs	FP200URT	200 μm kern multimode glasvezel (0.5 NA)
Fiber Optic Rotary Joint	Prizmatix	(Besteld bij Amazon)	18 mm diameter, FC-FC connector voor glasvezel
Fiber Stripping Tool	Thor Labs	T12S21
Fluoroshield met DAPI	Sigma-Aldrich	F6057
Gentamicin	Henry Schein	6913
GTP Sodium Salt	Fisher Scientific	G8877
Hamilton-spuiten	Hamilton	80085	10 μL volume, 26 gauge, 2 inch, puntstijl 3
Heat Gun	Allied Electronics	972-6966	250 V, 750-800 °F
Heat-Curable Epoxy	Precision Fiber Products	PFP-353ND-8OZ
Heparine	Henry Schein	55737
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Hydrochloridezuur	Fisher Scientific	219405490
Isofluran	Henry Schein	29405
Ketamine HCl	Henry Schein	55853	Ketamine is een gereguleerde stof en moet worden behandeld volgens institutionele richtlijnen
Lactated Ringer's	Henry Schein	9846
Laser, driver en laser-naar-vezel koppeling	OEM Laser Systems	BL-473-00100-CWM-SD-xx-LED-0	100 mW, 473-nm, diode-gepompte vaste-staat laser (Eén optie)
L-glutathion	Fisher Scientific	G4251
Lidocaïne	Butler Schein	14583
Light Sensor	Thor Labs	PM100D	Compacte energiemeter console met digitaal display
Loctite instantlijm	Grainger	5E207
Magnesiumsulfaat	Sigma-Aldrich	203726
Microelectrode Amplifier/Data Acquisition	Molecular Devices	MULTICLAMP700B / Digidata 1440A
Microinjector pomp	Harvard Apparatus	70-4501	Dual spuit
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-200/ROE-200
Microscoop	Olympus	BX51WI	Staande microscoop voor elektrofysiologie
Microscoop	Olympus	BX61VS	Epifluorescente slide-scanning microscoop
N-methyl-D-glucamine	Sigma-Aldrich	M2004
Orthojet tandheelkundig cement, vloeibaar	Lang Dental	1504BLK	zwart
Orthojet tandheelkundig cement, poeder	Lang Dental	1530BLK	Hedendaags poeder, zwart
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148
Patch Cables	Thor Labs	FP200ERT	Multimode, FT030 Buizen
Picrotoxin	Fisher Scientific	AC131210010
Polishing Disc	Thor Labs	D50FC
Polishing Pad	Thor Labs	NRS913	9" x 13"
Polishing Paper	Thor Labs	LFG5P	5 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG3P	3 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG1P	1 μm grit
Polishing Paper	Thor Labs	LFG03P	0.3 μm grit
Kaliumchloride	Sigma-Aldrich	P9333
Kaliumhydroxide	Fisher Scientific	P5958
Kaliummethanesulfonaat	Fisher Scientific	83000
QX-314-Cl	Alomone Labs	Q-150
Rimadyl (Carprofen)	Henry Schein	24751
Self-Administration Chambers/Software	Med Associates	MED-NP5L-D1
Natriumbicarbonaat	Sigma-Aldrich	S5761
Natriumchloride	Sigma-Aldrich	S7653
Natriumhydroxide	Sigma-Aldrich	1064980500
Natrium-L-ascorbaat	Sigma-Aldrich	A7631
Natriumpentobarbital	Henry Schein	243