Methodenartikel

Een robuust ontdekkingsplatform voor de identificatie van nieuwe mediatoren van melanoommetastase

DOI:

10.3791/63186

⸱

8 maart 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel beschrijft een workflow van technieken die worden gebruikt voor het testen van nieuwe kandidaat-mediatoren van melanoommetastase en hun werkingsmechanisme (s).

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Metastase is een complex proces waarbij cellen barrières moeten overwinnen die slechts onvolledig worden gemodelleerd door in vitro assays. Een systematische workflow werd opgezet met behulp van robuuste, reproduceerbare in vivo modellen en gestandaardiseerde methoden om nieuwe spelers in melanoommetastase te identificeren. Deze benadering maakt het mogelijk om gegevens in specifieke experimentele stadia te laten afleiden om de rol van een gen in metastase nauwkeurig te karakteriseren. Modellen worden vastgesteld door genetisch gemodificeerde melanoomcellen via intracardiale, intradermale of subcutane injecties in muizen te introduceren, gevolgd door monitoring met seriële in vivo beeldvorming. Zodra vooraf vastgestelde eindpunten zijn bereikt, worden primaire tumoren en/of metastasen-dragende organen geoogst en verwerkt voor verschillende analyses. Tumorcellen kunnen worden gesorteerd en onderworpen aan een van de verschillende 'omics'-platforms, waaronder eencellige RNA-sequencing. Organen ondergaan beeldvorming en immunohistopathologische analyses om de totale last van metastasen te kwantificeren en hun specifieke anatomische locatie in kaart te brengen. Deze geoptimaliseerde pijplijn, inclusief gestandaardiseerde protocollen voor engraftment, monitoring, weefseloogst, verwerking en analyse, kan worden gebruikt voor patiënt-afgeleide, kortetermijnculturen en gevestigde menselijke en muizencellijnen van verschillende vaste kankertypen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hoge mortaliteit geassocieerd met gemetastaseerd melanoom in combinatie met een toenemende incidentie van melanoom wereldwijd1 (een geschatte toename van 7,86% tegen 2025) vraagt om nieuwe behandelingsbenaderingen. Vooruitgang in doelontdekking hangt af van reproduceerbare modellen van metastase, een zeer complex proces. Gedurende de stappen van de gemetastaseerde cascade moeten melanoomcellen talloze barrières overwinnen om ontwijking van het immuunsysteem en kolonisatie van verre weefsels te bereiken2. De veerkracht en het aanpassingsvermogen van melanoomcellen komen voort uit een veelheid aan factoren, waaronder hun hoge genetische mutatielast3 en hun neurale crest-oorsprong, die cruciale fenotypische plasticiteitverlenen 3,4,5. Bij elke stap laten transcriptionele programma's metastaserende melanoomcellen van de ene toestand naar de andere overschakelen op basis van signalen van de kruisverwijzing met de micro-omgeving, bestaande uit het immuunsysteem6, het extracellulaire milieu 7,8 en de cellulaire architectuur van fysieke barrières9 waarmee ze in contact komen. Melanoomcellen ontsnappen bijvoorbeeld aan immuunsurveillance door de expressie van belangrijke immuun-priming tumor-uitgescheiden factoren te downreguleren6.

Studies beschrijven een "premetastatische niche", waarbij melanoomcellen chemokines en cytokines afscheiden om het verre "doel" -orgaan voor te bereiden op metastase10. Deze bevindingen roepen belangrijke vragen op over het orgaantropisme van gemetastaseerde melanoomcellen en de anatomische route die ze nemen om toegang te krijgen tot verre weefsels. Na intravasatie is bekend dat melanoomcellen uitzaaien via lymfevaten (lymfestelsel) en bloedvaten (hematogene verspreiding)2,11. Terwijl de meeste patiënten zich presenteren met gelokaliseerde ziekte, presenteert een kleine subset van gevallen zich met gemetastaseerde ziekte op afstand en geen lymfatische verspreiding (negatieve betrokkenheid van lymfeklieren)11, wat wijst op het bestaan van alternatieve gemetastaseerde routes voor melanoom.

Wanneer ze een gemetastaseerde site koloniseren, ondergaan melanoomcellen epigenetische en metabole aanpassingen12,13. Om toegang te krijgen tot nieuwe compartimenten en deze binnen te dringen, gebruiken melanoomcellen proteasen14 en cytoskeletale modificaties 11,15, waardoor ze naar hun nieuwe locatie kunnen reizen en groeien. De moeilijkheid bij het richten op melanoomcellen ligt in de complexiteit en het aantal van dergelijke aanpassingen; daarom moet het veld zich inspannen om experimenteel zoveel mogelijk stappen en aanpassingen na te bootsen. Ondanks talrijke vooruitgang in in vitro assays zoals organoïden en 3D-culturen16,17, vatten deze modellen de in vivo metastatische cascade slechts onvolledig samen.

Murine-modellen hebben waarde aangetoond door een balans te vinden tussen reproduceerbaarheid, technische haalbaarheid en simulatie van menselijke ziekten. Intravasculair, orthotopisch en heterotopisch geïmplanteerde melanoomcellen uit patiënt-afgeleide xenografts of kortetermijnculturen in immuungecompromitteerde of gehumaniseerde muizen vormen de ruggengraat van doelontdekking bij gemetastaseerd melanoom. Deze systemen missen echter vaak een cruciale biologische beperking op metastase: het immuunsysteem. Syngeneïsche melanoommetastasemodellen die deze beperking bezitten, zijn relatief schaars in het veld. Deze systemen, ontwikkeld in immunocompetente muizen, waaronder B16-F1018, de YUMM-familie van cellijnen19, SM120, D4M321, RIM322 of meer recent, de RMS23 en M1 (Mel114433), M3 (HCmel1274), M4 (B2905) 24 melanoomcellijnen, vergemakkelijken het onderzoek naar de complexe rol van de immuunrespons van de gastheer bij de progressie van melanoom.

Hier wordt een pijplijn voor melanoommetastase doelidentificatie gepresenteerd. Met toenemende en grotere 'omics'-datasets die worden gegenereerd uit melanoompatiëntencohorten, stellen we dat studies met de meeste klinische beloftes die zijn die voortkomen uit big data-integratie, wat leidt tot nauwgezette functionele en mechanistische ondervraging 25,26,27,28. Door muismodellen te gebruiken om potentiële doelen in het metastatische proces te bestuderen, kan men rekening houden met in vivo-specifieke gebeurtenissen en weefselinteracties, waardoor de kans op klinische vertaling toeneemt. Meerdere methoden om gemetastaseerde belasting te kwantificeren worden geschetst, die aanvullende gegevens over de resultaten van een bepaald experiment opleveren. Een protocol voor eencellige isolatie van tumoren in verschillende organen wordt beschreven om de onbevooroordeelde karakterisering van genexpressie in gemetastaseerde cellen te ondersteunen, die vooraf kunnen gaan aan single-cell of bulk RNA-sequencing.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De dierprocedures die betrokken zijn bij het volgende protocol zijn goedgekeurd door de New York University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Alle procedures worden uitgevoerd in faciliteiten die zijn goedgekeurd door de Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Figuur 1 toont de algemene experimentele benadering.

1. Patiënt-afgeleide melanoom korte termijn culturen (STC's)

  1. Plaats het weefsel in een petrischaaltje van 60 mm met 1 ml volledige RPMI (RPMI 1640 aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS), 2 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 1x MEM niet-essentiële aminozurenoplossing en penicilline (100 IE /ml) / streptomycine (100 μg / ml)).
    OPMERKING: Om de verhouding van tumorcellen te verhogen, ontleed en verwijder indien nodig het weefsel rond de tumor in de petrischaal, onder een microscoop, met behulp van steriele chirurgische instrumenten.
  2. Snijd het verse weefsel fijn met gesteriliseerde scheermesjes in blokjes van 1-2 mm. Voeg 4 ml volledige RPMI toe en pipetteer de inhoud van de plaat 5-10 keer op en neer met een serologische pipet van 10 ml.
  3. Breng de celsuspensie over in een polypropyleen conische buis van 15 ml en draai de cellen naar beneden (180 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C). Zuig het supernatant op, resuspend de celkorrel in 1 ml vers medium en breng de suspensie over in een 25 cm2 weefselkweekkolf.
  4. Om de weefselfragmenten aan de bodem te helpen hechten, plaatst u de kolf gekanteld in een hoek van 20°-30° in een weefselkweekincubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 20 minuten.
  5. Leg de kolf plat neer zodat het medium het weefsel kan bedekken en controleer dagelijks de status van de kweek. Splits de cellen wanneer ze 90-100% confluentie bereiken. Houd kortetermijnculturen op een "laag" passagenummer.
    OPMERKING: STC's zullen ongeveer 2 maanden na celisolatie en kweek worden vastgesteld, hoewel de werkelijke tijdlijn varieert tussen monsters en tumortypen. Na 10 tot 14 passages bereiken cellijnen 100% zuiverheid en bevatten ze alleen melanoomcellen29. De passagegetaldrempel wordt empirisch bepaald door veranderingen in celmorfologie, verdubbelingstijd en gedrag in vivo waar te nemen. Om heterogeniteit en andere kenmerken van de oudertumor te behouden, splits de cellen niet meer dan 1: 5.
  6. Bij het vaststellen van een STC en met elk cellijnmodel dat in dieren moet worden geïnjecteerd zoals beschreven in de volgende stappen, transduceren cellen met een verslaggever.
    OPMERKING: Een fluorescerende tag (bijv. rood fluorescerend eiwit (RFP), groen fluorescerend eiwit (GFP)) maakt bijvoorbeeld ex-vivo immunofluorescentiebeeldvorming en sortering van tumorcellen mogelijk door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS). Luciferase maakt in vivo bioluminescentie beeldvorming mogelijk, een nuttig hulpmiddel voor het monitoren van experimentele progressie (rubriek 4).

figure-protocol-1
Figuur 1: Schema dat de beschreven workflow illustreert, van integratie van patiëntgegevens tot het genereren en analyseren van in vivo gegevens van muizen. Afkortingen: LOF = functieverlies; GOF = versterking van functie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Xenograft implantatie

OPMERKING: De hier beschreven experimentele procedures worden uitgevoerd bij muizen met een verminderd adaptief en aangeboren immuunsysteem, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) muizen; of bij muizen die alleen adaptieve immuniteit missen, zoals de T-cel-deficiënte athymische / naakte (NU / J) muizen. Dieren zijn van mannelijk geslacht, 8 tot 10 weken oud. Vrouwen vertonen vaak een hoge incidentie van gonadale metastasen bij intracardiale injectie van tumorcellen, wat hun overleving vermindert.

  1. Bereid voor subcutane en intradermale injecties een 1:1 celsuspensie door een deel van de cellen gesuspendeerd in 1x Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline (DPBS) te mengen met een deel ontdooide extracellulaire matrixsubstraat (EMS) en houd op ijs bij 4 °C. Voor intravasculaire (intracardiale, intracarotis-, retro-orbitale, staartader- of milt) injecties suspensie de cellen alleen in DPBS.
    OPMERKING: Het juiste volume voor intradermale injecties moet zo laag mogelijk worden gehouden (30 μL). Voor subcutane injecties kan het geïnjecteerde volume oplopen tot 150 μL en voor intravasculaire injecties tot 250 μL (op basis van het gewicht van het dier). Voeg aan de eindcelsuspensie 10-30% extra volume injectaat toe, op basis van de geïnjecteerde hoeveelheid en de spuit die wordt gebruikt om rekening te houden met het dode volume in de sliptip en dat van de naald (bijv. Een tuberculinespuit van 1 ml met een naald van 30 G, 25 mm heeft een dood volume van 100 μL).
  2. Voer een pilot uit om het gedrag van de gebruikte cellijnen en de tijdlijn van tumorprogressie in vivo te karakteriseren. Voor intradermale injecties, begin met het injecteren van 1.000 tot 50.000 cellen / 30 μL. Voor subcutane injecties, begin met het injecteren van 10.000 tot 2 × 106 cellen / 150 μL. Voor intravasculaire (intracardiale, intracarotis, retro-orbitale en milt) injecties, begin met het injecteren van 50.000 cellen / 150 μL.
    OPMERKING: Intravasculaire injecties maken de dieren vatbaar voor embolische gebeurtenissen, hetzij door lucht in de bloedsomloop te brengen of door een overmatig aantal cellen te gebruiken die de kleine bloedvaten afsluiten. Meng de celsuspensie goed om klonteren te voorkomen. Bereid de spuit voor voordat u de celsuspensie laadt. Verwijder eventuele luchtbellen in de spuit. Houd de celsuspensie/spuiten op ijs tot het laden en de injectietijd.
  3. Anesthesie toedienen door inhalatie. Stel de zuurstofniveauregelaar in tussen 1-2 L/min. Plaats het dier in de inductiekamer met de isofluraanverdamper ingesteld op 2,5-5% voor inductie en 1,5-3% voor onderhoud.
    OPMERKING: Controleer de ademhaling en hartslag van het dier tijdens de inductiefase van de anesthesie. Laat het dier niet onbeheerd achter. Controleer niet meer dan één dier tegelijk. Titer de hoeveelheid anesthesie tot het gewicht van het dier.
  4. Verplaats het dier van de inductiekamer naar de neuskegel. Breng steriele vaseline oftalmische zalf aan op de ogen van het dier om drogen van het hoornvlies tijdens de procedure te voorkomen.
  5. Scheer de procedureplaats met een recht scheermesje gekanteld in een hoek van 30°. Reinig de huid van het ingreepgebied met 70% isopropylalcoholdoekjes. Voordat u verdere stappen uitvoert, beoordeelt u op een voldoende niveau van anesthesie door pedaalreflex.
  6. Voor intradermale injecties voert u de hele procedure uit in een bioveiligheidskast om aseptische omstandigheden te behouden.
    1. Verdoof en scheer het dier zoals beschreven in stappen 2.3-2.5.
    2. Pak de huid vast en trek deze naar achteren tegen het traject van de naaldsteek. Gebruik een naald van 31 G insulinespuit, 6 mm lang, in een scherpe hoek gehouden, de huid voorzichtig doorboren met de schuine kant naar boven gericht.
    3. Voel de drukafgifte aan de punt van de naald. Ga voorzichtig verder om in het intradermale compartiment te blijven en niet door de hele huiddiepte in de subcutis te gaan. Cruciaal: Als er een in de onderhuidse ruimte glijdt, verwijder dan de naald, verander het injectiegebied en plaats de naald opnieuw. Injecteer het volledige volume (30 μL) celsuspensie langzaam totdat een koepelvormige wheal wordt waargenomen.
      OPMERKING: Lage injectievolumes veroorzaken minder dissectie van de huidlagen en minder architecturale vervorming.
    4. Houd de naald erin en tel tot 5.
      OPMERKING: EMS wordt stroperig bij lichaamstemperatuur, waardoor terugstroming door de naaldpunctiewond wordt voorkomen.
    5. Verwijder de naald en breng het dier in een kooi op een warm kussen om te herstellen. Breng het dier terug naar de vivariumkooi na het herwinnen van het bewustzijn, wanneer het sternaal en ambulant is.
      OPMERKING: Controleer het dier continu tijdens alle procedures die in dit protocol worden beschreven. Laat het dier niet onbeheerd achter en controleer niet meer dan één dier tegelijk.
    6. Controleer de progressie van tumorgroei, gewichtsverlies en algehele gezondheidsstatus in samenwerking met veterinair personeel dagelijks in de eerste groeifase en intenser, indien nodig, nadat dieren beginnen af te vallen. Tijdens deze monitoringsessies: weeg de dieren en zet een grafiek uit om gewichtsverlies te controleren en controleer op tekenen van tumorzweren, neurologische, locomotorische en / of gedragssymptomen (lethargie, gebrek aan verzorging, lage voedsel- of waterinname).
      OPMERKING: Euthanaseer de dieren onmiddellijk na het waarnemen van tekenen van gevorderde ziekte (meer dan 20% gewichtsverlies, een lichaamsconditiescore van <2, extreem verminderde activiteitsniveaus, verlamming of epileptische aanvallen). Gebruik de euthanasiemethode die is goedgekeurd door de IACUC van de instelling (een geautomatiseerde CO2-kamer op tafel wordt bijvoorbeeld gebruikt om de dieren gedurende 15 minuten bloot te stellen aan CO2 , gevolgd door een secundaire methode van euthanasie, ofwel cervicale dislocatie, onthoofding of pneumothorax bilateraal geïnduceerd door de ribbenkast in te snijden).
    7. Neem metingen met remklauwen en gebruik de lengte (L) en de breedte (W) dimensies van de tumor om het volume (V) te berekenen met de formule:
      figure-protocol-2
  7. Voor subcutane injecties:
    1. Voer de volledige procedure uit in een bioveiligheidskast om aseptische omstandigheden te handhaven26,27.
    2. Verdoof en scheer het dier zoals beschreven in stappen 2.3-2.5.
    3. Gebruik een naald van 28 G tot 31 G insulinespuit, 6 mm lang, in een acute hoek gehouden, om de huid voorzichtig door te prikken met de schuine kant naar boven gericht. Voel de druk die twee keer aan het punt van de naald vrijkomt tijdens het passeren van de opperhuid, dermis en hypodermis.
      OPMERKING: De tweede keer dat een drukontlading aan de punt van de naald wordt gevoeld, geeft aan dat het onderhuidse compartiment is bereikt.
    4. Injecteer het volledige volume (30-150 μL) celsuspensie langzaam totdat een langwerpige ellipsvormige wheal wordt waargenomen. Houd de naald erin en tel tot 5. Tel tot 10 voor grotere volumes (meer dan 50 μL).
      OPMERKING: EMS wordt stroperig bij lichaamstemperatuur, waardoor terugstroming door de naaldpunctiewond wordt voorkomen.
    5. Verwijder de naald en breng het dier in een kooi op een warm kussen om te herstellen. Breng het dier terug naar zijn vivariumkooi na het herwinnen van het bewustzijn, wanneer het sternaal en ambulant is.
      OPMERKING: Let tijdens de postprocedurale controle op tekenen van complicaties (lage ademhalingsfrequentie, bloeding, langzaam herstel) en pak ze op de juiste manier aan. Als er geen verbetering wordt waargenomen, ga dan over tot humane euthanasieprocedures die worden beschreven in de OPMERKING van stap 2.6.6.
    6. Controleer het dier op tumorgroei, gewichtsverlies en algehele gezondheidsstatus zoals beschreven in stappen 2.6.6-2.6.7.
  8. Voor intracardiale injecties:
    1. Voer de hele procedure uit in een bioveiligheidskast om aseptische omstandigheden te handhaven26,30.
    2. Verdoof het dier zoals beschreven in stappen 2.3-2.4.
    3. Breng het dier over op het verwarmde platform van het echoapparaat en bevestig het met hypoallergene tape aan de neuskegel.
    4. Scheer de thorax met een recht scheermesje gekanteld in een hoek van 30°. Reinig de huid van het proceduregebied met 3 toepassingen van 10% povidon-jodium afgewisseld met 3 toepassingen van isopropylalcohol.
    5. Voordat u verdere stappen uitvoert, beoordeelt u op een voldoende niveau van anesthesie door pedaalreflex. Breng ultrasone gel aan op de procedureplaats.
    6. Vang het hartvenster op met de ultrasone sonde. Plaats de ultrasone sonde in het midden van de thorax aan de linkerkant van het dier om een horizontaal venster vast te leggen dat is georiënteerd om een dwarsdoorsnede (korte as) van de linker ventrikel te verkrijgen. Zorg ervoor dat de lange as van de sonde naar boven is gericht, bevestig de sonde in een hoek van 50° en het verwarmde platform in een hoek van 20°. Vergrendel de sonde en het steunframe op hun plaats.
    7. Trek de celsuspensie op terwijl u in de bioveiligheidskast werkt in een tuberculinespuit van 1 ml met een naald van 30 G, 25 mm. Verwijder eventuele luchtbellen in de spuit.
      OPMERKING: Het is belangrijk om een eencellige suspensie te creëren en te behouden terwijl cellen worden verwerkt en geïnjecteerd. Het verwijderen van luchtbellen is een belangrijke stap om luchtembolie te voorkomen. Een goed geprepareerd spuit-naaldsysteem voorkomt vermijdbare sterfgevallen in de experimentele groep. Trek altijd meer volume in de spuit dan er wordt geïnjecteerd. Het extra volume helpt de lucht te verwijderen door een deel van de celsuspensie terug te injecteren in een buis van 1,5 ml.
    8. Vergrendel de spuit in de stereotactische injector. Onder echografische begeleiding, verplaats de naald door de thoracale wand in de linker ventrikel van het hart. Injecteer het volledige volume (100-250 μL) celsuspensie langzaam.
    9. Verwijder de naald en breng het dier in een kooi op een warm kussen om te herstellen. Breng het dier terug naar zijn vivariumkooi na het herwinnen van het bewustzijn, wanneer het sternaal en ambulant is. Controleer het dier op tumorgroei, gewichtsverlies en algehele gezondheidsstatus zoals beschreven in stap 2.6.6.
  9. Voor intracarotide injecties:
    1. Voer de hele procedure uit op een goed gedesinfecteerd oppervlak om aseptische omstandigheden te helpen handhaven30.
    2. Verdoof het dier met een cocktail van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) door intraperitoneale injectie met een insulinespuit, 28 G naald. Breng steriele vaseline oftalmische zalf aan op de ogen van het dier om drogen van het hoornvlies tijdens de procedure te voorkomen.
    3. Scheer het ingreepgebied met een recht scheermesje gekanteld in een hoek van 30°. Voordat u verdere stappen uitvoert, beoordeelt u op een voldoende niveau van anesthesie door pedaalreflex.
    4. Plaats het dier onder een stereomicroscoop op een warmhoudkussen. Reinig de huid van het proceduregebied met 3 toepassingen van 10% povidon-jodium afgewisseld met 3 toepassingen van isopropylalcohol.
    5. Trek steriele persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM' s) en steriele handschoenen aan. Bereid het steriele veld voor door een steriel gordijn over het lichaam van het dier te leggen.
      OPMERKING: Als het steriele gordijn geen gat heeft dat geschikt is voor de grootte en locatie van de incisie, vouwt u het gordijn in tweeën en gebruikt u een Metzenbaum-schaar om het juiste gat in het midden van het steriele gordijn te knippen.
    6. Gebruik een scalpel of Iris schaar om de huid van de helft van de nek tot aan het borstbeen te snijden. Ontleed met twee microchirurgische tangen botweg de 2 submandibulaire speekselklieren in het middellijnvlak. Gebruik indien nodig een elektrische cautery voor hemostase.
    7. Ontleed de fascia rond de gemeenschappelijke halsslagader (CCA) van het manubrium naar de bifurcatie en ga mediaal door om de achterste wand van de externe halsslagader vrij te maken. Klem de uitwendige halsslagader (ECA) tijdelijk vast voordat u injecteert.
      OPMERKING: Bij het ontleden rond de omtrek van het CCA moet ervoor worden gezorgd dat de nervus vagus (ligt lateraal aan de slagader) niet wordt beschadigd.
    8. Laad de celsuspensie in een spuit van 1 ml met een naald van 33 G, 15 mm.
    9. Passeer twee 7-0 ligaturen onder de CCA en voer een losse instrumentknoop uit voor elk van de twee ligaturen. Gebruik een drukvatclip van 5 mm en 10 G en knip de ECA tijdelijk vast. Bind de proximale ligatuur; bind vervolgens de distale ligatuur losjes (naast de bifurcatie van de CCA). Gebruik de distale lus later om de bloeding na de injectie onder controle te houden.
    10. Gebruik de spuit met een naald van 33 G, 15 mm, prik voorzichtig de CCA met de schuine kant van de naald naar boven en onder een scherpe hoek. Injecteer het volledige volume (50-150 μL) celsuspensie langzaam.
    11. Pak de distale lus vast met de tang en til deze op terwijl u de naald verwijdert om het lumen van de CCA af te sluiten en het bloeden te stoppen. Vervang de spuit met een #7 Juwelierstang en bind de distale lus vast.
    12. Gooi nog een instrumentknoop op de distale ligatuur en verwijder de vaatklem van de ECA. Controleer het operatieveld op bloedingen en cauteriseer eventuele bloedende vaten vóór sluiting. Gebruik een nietapparaat van 9 mm om de huid van het dier te sluiten en plaats het dier op een warm kussen om te herstellen.
      OPMERKING: Verwijder de nietjes 7-10 dagen na de operatie.
    13. Dien pijnstillende medicatie subcutaan-Buprenorfine (0,3 mg / ml) elke 12 uur toe gedurende 72 uur na de operatie in een concentratie van 0,1 mg / kg.
      OPMERKING: Overweeg ook het gebruik van een pijnstillende medicatie met verlengde afgifte, waarvoor elke 72 uur 1 dosis nodig is.
    14. Breng het dier terug naar zijn vivariumkooi na het herwinnen van het bewustzijn, wanneer het sternaal en ambulant is. Controleer de dieren postoperatief dagelijks op tekenen van infectie of pijn op de operatieplaats, algemene gezondheidstoestand en complicaties.
      OPMERKING: Dieren die niet goed herstellen van een overlevingsoperatie kunnen extra doses pijnmedicatie krijgen en zullen humaan worden geëuthanaseerd als ze niet 72 uur na de operatie volledig zijn hersteld.
    15. Controleer het dier op tumorgroei, gewichtsverlies en algehele gezondheidsstatus zoals beschreven in stap 2.6.6.
  10. Voor retro-orbitale injecties:
    OPMERKING: Gebruik deze techniek als alternatief voor staartaderinjecties wanneer de operator getraind en bekwaam is in deze techniek en wanneer er een sterke wetenschappelijke rechtvaardiging is. Celsuspensies die via deze route worden toegediend, kunnen tumorgroei in de retro-orbitale ruimte veroorzaken; daarom moet zorgvuldig rekening worden gehouden met de risico's en voordelen bij het kiezen van deze techniek. Om bijvoorbeeld te profiteren van de directe circulatieverbinding van de retro-orbitale veneuze sinus met de intracerebrale aderen via anastomosen, selecteert u deze methode wanneer de vorming van hersentumoren is mislukt met behulp van andere injectieroutes.
    1. Voer de hele procedure uit in een bioveiligheidskast om aseptische omstandigheden te behouden. Trek steriele PBM's en handschoenen aan.
    2. Verdoof het dier zoals beschreven in stappen 2.3-2.4.
      OPMERKING: Breng voor deze procedure geen steriele vaseline oftalmische zalf aan op de ogen van het dier, omdat dit de injectie zal belemmeren; breng alleen lokale verdovingsdruppels aan.
    3. Laad de celsuspensie in een insulinespuit met een naald van 28-31 G, 6 mm.
    4. Met het dier in buikligging trekt u de oogleden in totdat het oog uitsteekt. Breng 1 druppel lokale verdoving aan in het oog aan de kant die de procedure ondergaat.
    5. Steek de naald in een hoek van 30-45° tussen het oog en de mediale epicanthus met de schuine kant naar beneden gericht. Injecteer de celsuspensie (10-150 μL) langzaam.
      OPMERKING: Langzamere bewegingen voorkomen schade aan het oog en de terugstroom van het injectaat.
    6. Voer de stappen uit die worden beschreven in 2.7.5-2.7.6.
  11. Voor miltinjecties:
    1. Voer de hele procedure uit in een bioveiligheidskast om aseptische omstandigheden te handhaven31. Trek steriele PBM's en steriele handschoenen aan.
    2. Verdoof en scheer het dier zoals beschreven in stappen 2.3-2.5.
    3. Plaats het dier in een rechterzij lighouding. Reinig de huid van het proceduregebied met 3 toepassingen van 10% povidon-jodium afgewisseld met 3 toepassingen van isopropylalcohol en bereid het chirurgische veld voor zoals beschreven in stap 2.9.5.
    4. Maak met een Metzenbaum-schaar of een scalpel een incisie van 1 cm in de linkerflank van de buikwand, gevolgd door een incisie in het peritoneum.
      OPMERKING: De milt wordt gezien door de doorschijnende buikwand na het maken van de huidincisie. Voer de peritoneale incisie precies op deze site uit.
    5. Leg de milt en de milt hilum bloot via de incisie. Gebruik een naald van 28-31 G insulinespuit, 6 mm lang, prik voorzichtig in de milt met de schuine kant van de naald naar boven en onder een scherpe hoek.
      OPMERKING: Als de prikwond bloedt, cauteriseer de plaats om bloedingen en terugstroom te beperken.
    6. Injecteer het volledige volume (50-100 μL) celsuspensie langzaam. Verwijder de naald. Plaats een klein gaasje op de milt en oefen druk uit met een tang. Klem de milt lichtjes tussen het gaas met behulp van een fijne muggentang en wacht 15 minuten.
    7. Voer een splenectomie uit door het milt hilum te binden met een 3-0 of 4-0 zijden hechtdraad, waarbij de bloedvaten indien nodig worden dichtgeschroeid. Sluit het peritoneum met een 5-0 polydioxanon (PDS) of polyglycolzuur absorbeerbare hechting.
    8. Voer de stappen uit die worden beschreven in stappen 2.7.5-2.7.6.
      OPMERKING: Dieren die bloedingscomplicaties vertonen of die 72 uur na de operatie niet volledig zijn hersteld, moeten op humane wijze worden geëuthanaseerd. Vergeet niet dat het welzijn van de muizen te allen tijde de prioriteit is.

3. Gefaseerde overlevingsoperatie (SSS)

  1. Bepaal op basis van de experimentele conclusies uit stap 2.2 de juiste tijd om de operatie te overleven. Selecteer, afhankelijk van de cellijn en experimentele hypothese, een eerder tijdstip voor tumorresectie (bij een tumorvolume = 150 mm3) of een later tijdstip (bij een tumorvolume = 500 mm3)26.
    OPMERKING: De limiet voor het tumorvolume is 1.500 mm3 wanneer de tumorbelasting hoog genoeg is om schadelijk te zijn voor het welzijn van het dier en vatbaar is voor complicaties.
  2. Verdoof en scheer het dier zoals beschreven in stappen 2.3-2.5.
    OPMERKING: De hele procedure wordt uitgevoerd in een bioveiligheidskast.
  3. Reinig de huid van het proceduregebied met 3 toepassingen van 10% povidon-jodium afgewisseld met 3 toepassingen van isopropylalcohol en bereid het chirurgische veld voor zoals beschreven in stap 2.9.5.
  4. Gebruik een irisschaar of een scalpel om de huid in te snijden, met behoud van een resectiemarge van 5-7 mm vanaf de rand van de tumor.
    OPMERKING: De marge voor resectie hangt af van het vermogen van de tumor om zich lokaal te verspreiden. Voor agressieve tumoren, verhoog de resectiemarge terwijl u ervoor zorgt dat er voldoende huid overblijft om de wondsluiting uit te voeren.
  5. In het geval van intradermale tumoren, reseceer de tumor samen met de omtrekkende huid.
  6. Voor subcutane tumoren, ontleed en verwijder de tumor onder de huid.
    OPMERKING: Als de tumor het peritoneum en/of de huid binnendringt, reseceer deze dan en bloc met de tumor en sluit het peritoneum met 5-0/4-0 PDS of polyglycolzuur absorbeerbare hechtingen.
  7. Sluit de wond met het nietapparaat van 9 mm.
    OPMERKING: Verwijder de nietjes 7-10 dagen na de operatie. Dien pijnstillende medicatie toe en plaats het dier op een warm kussen om te herstellen. Blijf pijnstillende medicatie toedienen gedurende 72 uur na de operatie, eenmaal per 12 uur volgens stap 2.9.13. Dieren met bloedingscomplicaties of die na de operatie niet volledig bij bewustzijn zijn gekomen, moeten op humane wijze worden geëuthanaseerd.
  8. Single-house het dier in een kooi, op een warm pad om te herstellen. Breng het dier terug naar de vivariumkooi na het herwinnen van het bewustzijn, wanneer het sternaal en ambulant is.
  9. Blijf het dier na de operatie controleren op lokale recidieven, gewichtsverlies, neurologische, locomotorische en / of gedragssymptomen (lethargie, gebrek aan verzorging, lage voedsel- of waterinname) en de algehele gezondheidsstatus.

4. In vivo beeldvorming (figuur 2A)

  1. Dien D-luciferinesubstraat (150 mg/kg) toe aan dieren door intraperitoneale injectie met een insulinespuit van 1 ml, naald van 28 g.
    OPMERKING: Tumorcellen moeten stabiel worden getransduceerd met het luciferase cDNA.
  2. Induceer anesthesie zoals beschreven in stappen 2.3-2.4, 6 minuten na de injectie met het D-luciferinesubstraat.
  3. Voer beeldvorming uit met behulp van een bioluminescentiebeeldvormingsscanner (in vivo beeldvormingssysteem)26.
  4. Verplaats het dier in de beeldvormingskamer en in de neuskegel. Stel tot 5 dieren tegelijk in beeld, afhankelijk van de capaciteit van het beeldvormingssysteem.
  5. Start het instrument door op initialiseren te drukken. Stel de belichtingstijd in op automatisch (1-120 s).
  6. Leg een lege afbeelding vast om indien nodig een achtergrond af te trekken. Klik op verwerven en sla de afbeelding op nadat de acquisitiereeks is voltooid.
  7. Plaats het dier terug in een kooi, die met 50% van het basisoppervlak boven een opwarmkussen zit om te herstellen van anesthesie. Breng het dier terug naar de vivariumkooi na het herwinnen van het bewustzijn, wanneer het sternaal en ambulant is.
  8. Voor gegevensanalyse in dezelfde in vivo beeldvormingssoftware waarmee de beelden zijn vastgelegd, navigeert u naar de map waar de afbeeldingen zijn opgeslagen en opent u de afbeeldingen van alle muizen die betrekking hebben op het experiment in één keer.
    OPMERKING: Analyse van één afbeelding tegelijk maakt normalisatie tussen groepen niet mogelijk.
  9. Stel de eenheden in op uitstraling (niet tellen). Zorg ervoor dat het selectievakje dat aangeeft dat het individu aangeeft, niet is aangevinkt, omdat dit normalisatie van het signaal tussen groepen voorkomt.
  10. Teken met behulp van de region of interest (ROI) tekentool cirkelvormige ROI's voor het hersengebied en rechthoekige ROI's voor het lichaam. Wees voorzichtig om de oren en neus uit te sluiten van de ROI van de hersenen, omdat ze de neiging hebben om niet-specifieke luminescentie uit te zenden. Om vertekening in dit proces te minimaliseren, tekent u alleen ROI's op de foto's van de muizen, zonder dat het lichtgevende signaal eroverheen wordt gelegd.
  11. Selecteer MRI's meten om het signaal te kwantificeren en de gegevens naar een spreadsheet te exporteren. Analyseer verschillen tussen groepen door de totale luminescerende flux (p/sec/cm2/sr) in de betreffende lichaamsgebieden uit te zetten.
    OPMERKING: Om de verschillen tussen groepen in hersentropisme specifiek te beoordelen, berekent u de verhouding tussen het hersensignaal en het lichaamssignaal voor elke muis. Dit controleert op intermouse variatie in totale tumorbelasting en verschillen in niveaus van luciferase-expressie tussen experimentele groepen.

5. Ex vivo magnetische resonantie beeldvorming

  1. Voer ex vivo MRI uit onmiddellijk na euthanasie. U kunt ook de interessante organen oogsten, ze tot 72 uur in formaline fixeren en de beeldvorming op een later tijdstip uitvoeren.
  2. Verkrijg de beelden met een 7-Tesla (7-T) (300-MHz) micro-MRI-systeem uitgerust met een NMR-console en een zero-boil-off, horizontale boringsmagneet of soortgelijke apparatuur.
    OPMERKING: De noodzaak van een actief afgeschermde gradiënt spoelinzet met de juiste afweging van prestaties is cruciaal. Het moet een gradiënt lineariteit van ten minste 50 mm dynamisch bolvormig volume (DSV) bieden om de reeks monsters die gelijktijdig worden onderzocht zonder geometrische vervorming te bedekken. De combinatie van gradiëntsterkte (variërend van 440 tot 750 mT/m) en de duty cycle die maximale gelijktijdige GELIJKSTROOM van 3 x 30 A tot 3 x 87 A mogelijk maakt, maakt adequate beeldvormingsprestaties mogelijk. De gebruikte gradiëntspoelinzet (zie de tabel met materialen) maakt de volgende prestaties mogelijk: 660 mT/m, 130 μs stijgtijd, 3 x 87 A en een DSV = 80 mm.
  3. Voer de scans uit met een commerciële zend-ontvangst circulair gepolariseerde radiofrequentiespoel van het hele muislichaam (OD = 59 mm, ID = 38 mm, L = 40 mm) afgestemd op 300,16 MHz, de 1H proton Larmor-frequentie.
    OPMERKING: Deze rf-sonde maakt het mogelijk om 3D-datasets te verzamelen met submillimetrische isotrope resolutie (<150 μm) tijdens nachtelijke scans van 8-12 uur.
  4. Detecteer de tumorbelasting met behulp van meerdere sequenties30.
    OPMERKING: Hyperintense signaal gedetecteerd door een T2-gewogen, Rapid Imaging with Refocused Echoes (RARE) sequentie herkent oedeem rond tumoren.
  5. Voer de 3D RARE-sequentie uit met de volgende acquisitieparameters: [120 μm]3 isotrope resolutie; acquisitietijd 5 uur, 27 min; herhalingstijd (TR) = 500 ms; echoafstand (ES) = 12,7 min; Turbofactor TFx = 12; effectieve echotijd (TEeff) = 76,2 ms; bandbreedte (BW) = 75 KHz; Matrixgrootte = 2843; gezichtsveld (FOV) = [4,0 mm]3; aantal gemiddelden (Nav) = 6.
  6. Detecteer metastasen met behulp van de volgende parameters.
    1. Gebruik voor gepigmenteerde metastasen met signaalverheldering een T1-gewogen 3D-gradiëntechosequentie met de volgende parameters: [120 μm]3 isotrope resolutie; acquisitietijd 2 uur, 41 min; TR = 20 ms; echotijd (TE) = 4,0 ms; flip hoek (FA) = 18°; BW = 75 KHz; Matrixgrootte = 2843; FOV = [34,0 mm]3; Nav = 6.
    2. Gebruik voor ongepigmenteerde en/of hemorragische metastasen een hypointense-signaal bij het verkrijgen van een T2*-gewogen, multigradient echo (MGE) sequentie (3D MGE, [120 μm]3 isotrope resolutie; acquisitietijd 3 h, 35 min; TR = 40 ms; TE = 3,6 ms; ES = 3,2 ms; 4 echo's; FA = 20°; BW = 100 kHz; Matrixgrootte = 2843; FOV = (34,0 mm)3; Nav = 4.
  7. Gebruik alle 3 de sequenties om de tumorlast te kwantificeren.
  8. Kruisverwijzing van de tumorgebieden die tijdens de analyse zijn geïdentificeerd met histologische secties om nauwkeurigheid te garanderen. Zie rubrieken 7 en 8.

6. Weefselverwerking voor single-cell of bulk RNA sequencing

  1. Euthanaseer het dier met behulp van een methode die is goedgekeurd door de IACUC van de instelling. Zie een van de procedures die worden beschreven in de NOTA van stap 2.6.6.
  2. Ontleed de interessante organen en plaats ze in afzonderlijke putten van een plaat met Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) op ijs. Werk snel en houd het weefsel te allen tijde op ijs om de levensvatbaarheid van de cel te maximaliseren.
    OPMERKING: De volgende stappen zijn specifiek voor hersenverwerking. Pas het collagenasetype aan het specifieke weefsel aan, op basis van uw behoeften.
  3. Bereid een bord met 6 putten met 3 ml HBSS in elke put.
  4. Om de dissectie te visualiseren en verder te begeleiden, gebruikt u een fluorescentiemicroscoop en identificeert u de gelabelde gebieden.
  5. Ontleed de fluorescerende gebieden en plaats de weefselfragmenten in de 6-putplaat (1 fragment per put als individuele gemetastaseerde foci moeten worden geanalyseerd of meerdere fragmenten van één orgaan als meerdere metastasen in hetzelfde orgaan moeten worden geanalyseerd). Gebruik steriele scheermesjes om het weefsel zo klein mogelijk in fragmenten te hakken (zonder meer dan 1-2 minuten aan deze stap voor elk monster te besteden).
    OPMERKING: Het beperken van de verwerkingstijd van de tumoren helpt de levensvatbaarheid van de cel te behouden.
  6. Aspirateer en breng de inhoud van elke put over naar een conische buis van 15 ml.
    OPMERKING: Snijd de punt van een pipetpunt van 1.000 μL om de overdracht van grotere fragmenten te vergemakkelijken.
  7. Voeg 1 ml HBSS toe aan de put en zorg ervoor dat de resterende weefselfragmenten / cellen worden overgebracht naar de buis van 15 ml, die een eindvolume van 4 ml zal bevatten. Voeg 50 μL collagenase type I (40 mg/ml) en 12,5 μL DNase I (2.000 eenheden/ml) toe aan elke buis.
  8. Plaats de conische buizen gedurende 45 minuten in een waterbad dat verwarmd is op 37 °C. Draai de conische buizen kort om de 5 minuten.
  9. Prewet een 70 μm zeef met HBSS. Gebruik het afgedekte uiteinde van een gesteriliseerde microcentrifugebuis of het plastic deel van een spuitzuiger en maal de weefselhomogenaten door een zeef van 70 μm in een nieuwe conische buis van 50 ml.
    OPMERKING: Het voorbevochtigen van de zeven met HBSS of FACS-buffer vergemakkelijkt het persen.
  10. Was de zeef met 1 ml HBSS. Prewet een 40 μm zeef met HBSS. Filtreer elk monster opnieuw door een zeef van 40 μm in een nieuwe conische buis van 50 ml. Voeg 1 ml FBS toe aan de zeef van 40 μm om het te wassen. Houd de conische buizen de hele tijd op ijs.
  11. Vul de conische buis tot 50 ml met ijskoude DPBS. Draai de cellen (180 × g gedurende 10 minuten bij 4 °C). Gooi het supernatant weg en pas op dat u de celkorrel niet verliest.
    OPMERKING: Voor hersenmonsters, resuspend de cellen in 2,5 ml 38% dichtheidsscheidingsoplossing (verdun in HBSS en opslaan bij kamertemperatuur (RT)). Breng over op 5 ml FACS-buizen. Draai gedurende 20 minuten op 800 × g. Snijd de punt van een pipetpunt van 1.000 μL en verwijder de bovenste vetlaag. Laat geen vet achter op de wanden van de buizen. Als er vet overblijft, draai dan opnieuw naar beneden en herhaal het proces. Dit is een cruciale stap. Verwijder de rest van de vloeibare fase (de pellet zal doorschijnend en moeilijk te visualiseren zijn).
  12. Resuspend de cellen in 1 ml rode bloedcel (RBC) lysisbuffer en incubeer gedurende 60 s bij RT. Blus de lysisoplossing door 20 ml DPBS toe te voegen.
  13. Draai de cellen gedurende 10 minuten bij 4 °C op 180 × g . Verwijder het supernatant en resuspend de cellen in 2 ml FACS-buffer (5% FBS in DPBS).
  14. Ga verder met het sorteren van gelabelde cellen en / of bibliotheekvoorbereiding voor bulk- of eencellige RNA-sequencing.
    OPMERKING: Cellen kunnen worden gesponnen, vastgevroren en opgeslagen bij -80 °C voorafgaand aan RNA-isolatie voor bulk RNA-seq.

7. Dierlijke weefselperfusie en voorbereiding voor immunohistologische analyses

  1. Verdoof het dier met een overdosis ketamine (300 mg/kg) en xylazine (30 mg/kg) cocktail door intraperitoneale injectie met een insulinespuit en een naald van 28 G.
  2. Stel het hart bloot door grove dissectie en maak een incisie in het rechteratrium. Houd het hart zachtjes op zijn plaats met een lange, gebogen tang naar voren gericht.
    OPMERKING: Formaline en paraformaldehyde (PFA) zijn kankerverwekkend. Lees het veiligheidsinformatieblad (SDS), vermijd blootstelling aan dampen en draag de juiste PBM's.
  3. Injecteer met een spuit van 10 ml met een naald van 22 G, 22 mm, 10 ml DPBS gevolgd door 10 ml 4% PFA in de linker ventrikel.
  4. Ga verder met het oogsten van de organen en laad ze in vooraf gelabelde histologische cassettes. Plaats de cassettes in een container van de juiste grootte die voldoende fixatief (formaline) bevat om de weefsels te bedekken.
    OPMERKING: Idealiter moet het fixatieve volume 5-10 keer het volume van de weefsels zijn.
  5. Bevestig de organen in de histologische cassettes in 10% formaline gedurende 48-72 uur. Gooi de 10% formaline weg en was de cassettes twee keer met 1x DPBS.
  6. Begin het uitdrogingsproces door de cassettes gedurende 2 uur onder te dompelen in 70% ethanol. Blijf de cassettes achtereenvolgens onderdompelen in toenemende ethanolconcentraties: 80%, 95%, 100% gedurende 1 uur elk. Vervang de 100% oplossing tweemaal na 1,5 uur. Dompel de cassettes gedurende 1,5 uur onder in xyleen en voer drie veranderingen van de oplossing uit.
  7. Sluit de cassettes in paraffine bij 58-60 °C. Sectie de paraffine blokken. Ga verder met hematoxyline en eosine (H & E) orimmunohistochemische kleuring.
  8. Om melanoomcellen te identificeren, gebruikt u een van deze markers of een paneel: S100, Melan-A, HMB-45, Tyrosinase, MITF. Gebruik indien mogelijk Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) kleuring omdat het een zeer specifieke menselijke celmarker is.
    OPMERKING: NuMA-kleuring biedt een scherpe afbakening tussen gastheer (muis) en geënt cellen (menselijk) die helpt bij beeldverwerking en daaropvolgende tumorkwantificeringsfasen.

figure-protocol-3
Figuur 2: Voorbeelden van BLI-, brightfield-, ex vivo fluorescentie- en H&E-kleuringsbeelden die de multipronged benadering illustreren voor de analyse van de effecten van kandidaatgenen bij melanoommetastase. (A) BLI,(B) BF, (C) ex vivo fluorescentie en (D) H&E-kleuringsbeelden. De afbeeldingen die ter illustratie worden gebruikt, komen overeen met een experiment waarbij 131/6-4L melanoomcellen getransduceerd met een niet-targeting control shRNA (shNTC) of een shRNA gericht op FUT8 werden geïnjecteerd in immunodeficiënte (NSG) muizen. FUT8-uitschakeling verminderde de gemetastaseerde verspreiding van melanoomcellen. Schaalbalken en kleurenbalken = p/sec/cm2/sr × 106 (A), 100 mm (B, C), 100 μm (D). Afkortingen: BLI = bioluminescentie beeldvorming; H&E = hematoxyline en eosine; shRNA = kort haarspeld RNA; shNTC = non-targeting controle shRNA; NSG = niet-obese diabetische ernstige gecombineerde immunodeficiëntie gamma; FUT8 = fucosyltransferase 8; BF = helder veld. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

8. Nuclear Mitotic Apparatus Protein (NuMA) kleuring (Figuur 3)

  1. Gebruik een anti-NuMA-antilichaam als een zeer mensspecifieke mitotische spindelmarker voor de identificatie en kwantificering van gemetastaseerde belasting in weefselsecties. 8.1. Zeer specifieke en gevoelige identificatie van melanoomcellen wordt bereikt.
  2. Als chromogene immunohistochemie voor NuMA wordt uitgevoerd op een automatisch immunostaining-instrument, volg dan deze stappen zoals beschreven32:
  3. Deparaffiniseer de secties in xyleen en rehydrateer ze in opeenvolgend dalende ethanolconcentraties. Houd de glaasjes gedurende 15 minuten ondergedompeld in xyleen en breng ze nog eens 15 minuten over in 100% ethanol.
    OPMERKING: De rest van de ethanolrehydratatiestappen (95%, 80%, 75%) duren elk 3 tot 5 minuten.
  4. Spoel de glaasjes af in gedeïoniseerd water.
  5. Voer epitoop ophalen uit door de dia's in een container (bijv. Coplin-kleurpot) onder te dompelen in een natriumcitraatbuffer van 10 mM, pH 6,0, in een magnetron van 1200 Watt op 100% vermogen gedurende 10 minuten.
  6. Gebruik ongeconjugeerd, polyklonaal konijn anti-humaan NuMA-antilichaam voor etikettering, verdund 1:7.000 in Tris-Bovine serumalbumine (BSA) (25 mM Tris, 15 mM NaCl, 1% BSA, pH 7,2). Voer de juiste positieve en negatieve controles parallel aan de studiesecties uit.
  7. Incubeer de dia's met het primaire antilichaam gedurende 12 uur. Detecteer het primaire antilichaam met geiten-anti-konijn HRP geconjugeerd multimeer en visualiseer het complex met 3,3-diaminobenzidine en een kopersulfaatversterker.
  8. Was de glaasjes in gedestilleerd water, counterstain met hematoxyline, droog uit en monteer met permanent medium.
    OPMERKING: De uitdrogingsstappen zijn het omgekeerde van de rehydratatiestappen beschreven in stap 8.3. Scan de dia's met de beschikbare scanner met een vergroting van 20x of 40x en upload ze naar een database.
  9. Teken met behulp van software ROI's om alle NuMA-gekleurde cellen in het orgaanweefsel op te nemen, met uitzondering van ander orgaanparenchym en lege ruimtes.
  10. Pas de instellingen aan om de NuMA-positieve en NuMA-negatieve cellen te categoriseren met behulp van de juiste positieve en negatieve controles voor elk orgaan. Gebruik een gevestigd softwarealgoritme om het totale aantal/percentage NuMA-positieve cellen voor elk monster te kwantificeren.

9. Weefselschijf immunofluorescentie

Om het gemetastaseerde stadium te identificeren waarin een bepaald kandidaat-gen nodig is (bijv. Extravasatie versus overleving na zaaien), kan men weefselschijfimmunofluorescentie op verschillende tijdstippen bepalen om tumorcelprogressie te volgen van injectie tot verre orgaaninvasie, zaaien en groei. Deze aanpak maakt het mogelijk om markers voor naburige cellen toe te voegen om de extravasatiegebeurtenis en de omringende micro-omgevingsveranderingen van de tumor vast te leggen33.

  1. Verdoof het dier zoals beschreven in stap 7.1.
  2. Injecteer 100 μg fluorofoor geconjugeerd Lycopersicon Esculentum (Tomaat) Lectine in de linker ventrikel van elk dier, 3 minuten voorafgaand aan de perfusie, om het vasculaire endotheel af te bakenen.
    OPMERKING: Geef de Tomato Lectin de tijd om in het hele systeem te recirculeren.
  3. Perfuseer het dier zoals beschreven in stappen 7.2-7.3. Oogst de organen van belang en breng ze over in vooraf gelabelde containers gevuld met 4% PFA. Fixeer het weefsel gedurende 24 tot 48 uur. Snijd het weefsel met behulp van een vibratome in plakken van 30-50 μm dik.
    OPMERKING: Dikte moet worden geoptimaliseerd. Plakjes tussen 30 μm en 50 μm dikte worden aanbevolen, vooral bij het uitvoeren van z-stack beeldvorming.
  4. Incubeer de plakjes in de blokkerende buffer (10% Normal Goat Serum, 2% BSA, 0,25% Triton X-100 in DPBS) gedurende 2 uur bij RT.
  5. Voer een kleuringsoptimalisatie-experiment uit.
    OPMERKING: Als antigeen ophaaltijd, buffers die worden gebruikt voor het ophalen van antigeen, temperatuur, verschillende antilichamen / verschillende partijen en het type weefsel dat de kleuring beïnvloedt, zijn optimalisatie-experimenten noodzakelijk.
  6. Voeg primaire antilichamen toe bij een geoptimaliseerde verdunning en incubeer gedurende een geoptimaliseerde tijd bij een geoptimaliseerde temperatuur (zie voorbeelden in tabel 1).
    OPMERKING: Gebruik geschikte controles voor primaire/secundaire antilichamen en niet-gekleurde weefselmonsters.
  7. Was de plakjes van het weefsel 3 keer gedurende 5 minuten met 0,25% Triton X-100 in DPBS.
  8. Incubeer de weefselplakken in secundair antilichaam verdund in blokkerende oplossing gedurende de gewenste tijd (tabel 1).
  9. Was de plakjes van het weefsel 3 keer gedurende 5 minuten met 0,25% Triton X-100 in DPBS.
  10. Kleur de kernen met 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) verdund 1:1.000 in DPBS of blokkerende buffer gedurende 5 min.
  11. Voeg 2 druppels antifade fluorescentie montagemedium toe aan een coverslip en monteer het weefsel op glazen dia's, zorg ervoor dat de plakjes volledig bedekt zijn door het montagemedium.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen direct op de plakjes zitten, omdat dit de microscopie vervormt.
  12. Leg confocale beelden vast met de beschikbare microscoop met behulp van een 60x olie-onderdompelingsobjectief.
    OPMERKING: Pas bij het verkrijgen van confocale afbeeldingen dezelfde instellingsparameters (spanning, luchtige eenheden en versterking) toe op alle afbeeldingen in het experiment.
  13. Leg niet-confocale beelden vast met de microscoop op 10x, 20x of 40x.
  14. Upload de foto's in een beeldanalysesoftware en analyseer ze door de parameters van keuze te vergelijken (d.w.z. gebied, aantal, intensiteit van markeringen of contact met aangrenzende cellen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volgende figuren illustreren hoe de beschreven workflow is toegepast voor de identificatie van nieuwe oorzaken van melanoommetastase. Figuur 2 vat de resultaten samen van een gepubliceerde studie waarin de effecten van het uitschakelen van het fucosyltransferase FUT8 bij in vivo melanoommetastase werden bestudeerd26. Kortom, analyse van glycomische gegevens van menselijke patiënten (verkregen door lectine-arrays) en transcriptomische profilering onthulde v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het doel van dit technisch rapport is om een gestandaardiseerde, top-to-bottom workflow te bieden voor het onderzoek naar potentiële actoren in melanoommetastase. Omdat in vivo experimenten kostbaar en tijdrovend kunnen zijn, zijn strategieën om de efficiëntie te maximaliseren en de waarde van de verkregen informatie te verhogen van het grootste belang.

Het is absoluut noodzakelijk om overal complementaire benaderingen te gebruiken om bevindingen binnen hetzelfde experiment te crossva...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken de afdeling Advanced Research Technologies (DART) van NYU Langone Health, en in het bijzonder het Experimental Pathology Research Laboratory, Genome Technology Center, Cytometry and Cell Sorting Laboratory, Pre-Clinical Imaging Core, die gedeeltelijk worden ondersteund door de Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH / NCI 5P30CA016087. We bedanken de NYU Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group (PI: Dr. Iman Osman) voor het bieden van toegang tot patiënt-afgeleide melanoom korte termijn culturen + (10-230BM en 12-273BM), die werden verkregen via IRB-goedgekeurde protocollen (Universal Consent studie #s16-00122 en Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group studie # 10362). We danken Dr. Robert Kerbel (Universiteit van Toronto) voor het leveren van 113/6-4L en 131/4-5B1 melanoomcellijnen* en Dr. Meenhard Herlyn (Wistar Institute) voor het leveren van WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 melanoom op korte termijn**. E.H. wordt ondersteund door NIH / NCI R01CA243446, P01CA206980, een American Cancer Society-Melanoma Research Alliance Team Science Award en een NIH Melanoma SPORE (NCI P50 CA225450; PI: I.O.). Figuur 1 is gemaakt met Biorender.com.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
#15 Scapel Blade WPI500242Voor chirurgische procedures
#3 Scapel HandleWPI500236Voor chirurgische procedures
1 mL Tuberculin syringe, slip tip BD309626Injecties
10 mL syringe, slip tip BD301029Perfusie
10% Formalin Sodium BufferedEK Industries4499-20LVoor perfusie/weefselfixatief
15 mL ConicalCorning 430052Celcultuur
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge TubesFalcon352196Celcultuur
200 Proof EthanolDeacon Labs04-355-223Histologie
22G – 22mm needleBD305156Perfusie
4-0 Vicryl SutureEthiconJ464GHechting
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde EMS15733-10Voor perfusie/weefselfixatief
40µmCorning431750Weefselverwerking
5-0 Absorbable Suture Ethicon6542000Sluiting
50 mL Conical Corning 430828Celcultuur
50mL Conical Polypropylene Centrifuge TubesFalcon352070Celcultuur
7-0 Silk suture FST18020-70Ligatuur
70µmCorning431751Weefselverwerking
Anti-fade mounting media  Vector LabsH-1000-10Immunofluorescence
Approximator applying Forceps, 10cm WPI14189Voor microchirurgische procedures
AvanceBruker3 HDNMR Console 
Biospec 7030 Bruker7030Micro MRI
BSABioregA941NuMA Kleuring
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm WPIWP5025501Voor microchirurgische procedures
Coplin Staining JarBel-Art F44208-1000Histologie
DAPISigma-AldrichD9542-1MGImmunofluorescence
dCas9-KRABAddgene110820Genetische manipulatie
DNase INEBM0303LWeefselverwerking
DPBSCorning21-030-CMWeefselverwerking
Extra Sharp Uncoated Single Edge BladeGEM62-0167Weefselverwerking
Extracellular Matrix Substrate Corning354234Overweeg de Growth Factor Reduced (als alternatief 
FBSCytivaSH30910.03Celcultuur
Fiji Image JFiji Image JSoftwareImmunofluorescence
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer Thermo FisherA16104NuMA Kleuring
Goat SerumGibcoPCN5000Immunofluorescence
HBSSCorning21-020-CVWeefselverwerking
Hematoxylin Richard-Allan Scientific 7231Histologie
Illumina III PerkinElmerCLS136334BLI-instrument
Insulin syringe 28G - 8mm needleBD329424Injecties
Insulin syringe 31G - 6mm needle BD326730Injecties
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serratedWPI504478Voor perfusie en chirurgische procedures
Isoflurane USPCovetrus11695067772Anesthesie
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm TipWPIWP6570Voor microchirurgische procedures
Ketamine HCl 100mg/mLMylan Ind.1049007Anesthesie
lentiCRISPRv2Addgene98290Genetische manipulatie
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649InvitrogenL32472Marker voor vasculaire endotheelcellen
MEM non-essential amino acids X 100Corning25-025-CICelcultuur
Metzenbaum ScissorsWPI503269Voor chirurgische procedures
Microinjection UnitKOPF5000Intracardiale injecties
NaClFisherS25877 NuMA Kleuring
Needle 30G x 25mmBD305128Intracardiale injectie
Needle 33G x 15mmHamilton7747-01Intracarotale injectie
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated JawsWPI14137-GVoor microchirurgische procedures
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ miceThe Jackson Laboratory005557Muurmodel
NU/J miceThe Jackson Laboratory002019Muurmodel
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human Abcam97585NuMA Kleuring
Penicillin-Streptomycin 10000U/mLGibco15140122Celcultuur
PercollGE0891-01dichtheidscheidingsoplossing 
PI Classic Surgical GlovesCardinal Health2D72PT75XChirurgie
pLKO Tet-OnAddgene21915Genetische manipulatie
Povidone-Iodine 10% SolutionMedlineMDS093943Chirurgie
Proparacaine Drops 0.5%Akorn PharmaAX

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN Estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
  2. Adler, N. R., Haydon, A., McLean, C. A., Kelly, J. W., Mar, V. J. Metastatic pathways in patients with cutaneous melanoma. Pigment Cell Melanoma Research. 30 (1), 13-27 (2017).
  3. Platz, A., Egyhazi, S., Ringborg, U., Hansson, J. Human cutaneous melanoma; a review of NRAS and BRAF mutation frequencies in relation to histogenetic subclass and body site. Molecular Oncology. 1 (4), 395-405 (2008).
  4. Alonso, S. R., et al. A high-throughput study in melanoma identifies epithelial-mesenchymal transition as a major determinant of metastasis. Cancer Research. 67 (7), 3450-3460 (2007).
  5. Rowe, C. J., Khosrotehrani, K. Clinical and biological determinants of melanoma progression: Should all be considered for clinical management. Australasian Journal of Dermatology. 57 (3), 175-181 (2016).
  6. Plebanek, M. P., et al. Pre-metastatic cancer exosomes induce immune surveillance by patrolling monocytes at the metastatic niche. Nature Communications. 8 (1), 1319(2017).
  7. Orgaz, J. L., et al. Loss of pigment epithelium-derived factor enables migration, invasion and metastatic spread of human melanoma. Oncogene. 28 (47), 4147-4161 (2009).
  8. Ladhani, O., Sanchez-Martinez, C., Orgaz, J. L., Jimenez, B., Volpert, O. V. Pigment epithelium-derived factor blocks tumor extravasation by suppressing amoeboid morphology and mesenchymal proteolysis. Neoplasia. 13 (7), 633-642 (2011).
  9. Ju, R. J., Stehbens, S. J., Haass, N. K. The role of melanoma cell-stroma interaction in cell motility, invasion, and metastasis. Frontiers in Medicine - Dermatology. 5, 307(2018).
  10. Wiley, H. E., Gonzalez, E. B., Maki, W., Wu, M. T., Hwang, S. T. Expression of CC chemokine receptor-7 and regional lymph node metastasis of B16 murine melanoma. Journal of the National Cancer Institute. 93 (21), 1638-1643 (2001).
  11. Meier, F., et al. Metastatic pathways and time courses in the orderly progression of cutaneous melanoma. British Journal of Dermatology. 147 (1), 62-70 (2002).
  12. Turner, N., Ware, O., Bosenberg, M. Genetics of metastasis: melanoma and other cancers. Clinical & Experimental Metastasis. 35 (5-6), 379-391 (2018).
  13. Ubellacker, J. M., et al. Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis. Nature. 585 (7823), 113-118 (2020).
  14. Cukierman, E., Pankov, R., Stevens, D. R., Yamada, K. M. Taking cell-matrix adhesions to the third dimension. Science. 294 (5547), 1708-1712 (2001).
  15. Cunningham, C. C., et al. Actin-binding protein requirement for cortical stability and efficient locomotion. Science. 255 (5042), 325-327 (1992).
  16. Unger, C., et al. Modeling human carcinomas: physiologically relevant 3D models to improve anti-cancer drug development. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 50-67 (2014).
  17. Fong, E. L., Harrington, D. A., Farach-Carson, M. C., Yu, H. Heralding a new paradigm in 3D tumor modeling. Biomaterials. 108, 197-213 (2016).
  18. Nakamura, K., et al. Characterization of mouse melanoma cell lines by their mortal malignancy using an experimental metastatic model. Life Science. 70 (7), 791-798 (2002).
  19. Meeth, K., Wang, J. X., Micevic, G., Damsky, W., Bosenberg, M. W. The YUMM lines: a series of congenic mouse melanoma cell lines with defined genetic alterations. Pigment Cell Melanoma Research. 29 (5), 590-597 (2016).
  20. Koya, R. C., et al. BRAF inhibitor vemurafenib improves the antitumor activity of adoptive cell immunotherapy. Cancer Research. 72 (16), 3928-3937 (2012).
  21. Jenkins, M. H. Multiple murine BRaf(V600E) melanoma cell lines with sensitivity to PLX4032. Pigment Cell Melanoma Research. 27 (3), 495-501 (2014).
  22. Tuncer, E., et al. SMAD signaling promotes melanoma metastasis independently of phenotype switching. The Journal of Clinical Investigation. 129 (7), 2702-2716 (2019).
  23. Schwartz, H., et al. Incipient Melanoma Brain Metastases Instigate Astrogliosis and Neuroinflammation. Cancer Research. 76 (15), 4359-4371 (2016).
  24. Perez-Guijarro, E., et al. Multimodel preclinical platform predicts clinical response of melanoma to immunotherapy. Nature Medicine. 26 (5), 781-791 (2020).
  25. Krepler, C., et al. A Comprehensive Patient-Derived Xenograft Collection Representing the Heterogeneity of Melanoma. Cell Reports. 21 (7), 1953-1967 (2017).
  26. Agrawal, P., et al. A systems biology approach identifies FUT8 as a driver of melanoma metastasis. Cell. 31 (6), 804-819 (2017).
  27. Hanniford, D., et al. Epigenetic silencing of CDR1as drives IGF2BP3-mediated melanoma invasion and metastasis. Cancer Cell. 37 (1), 55-70 (2020).
  28. Kim, H., et al. PRMT5 control of cGAS/STING and NLRC5 pathways defines melanoma response to antitumor immunity. Science Translational Medicine. 12 (551), (2020).
  29. de Miera, E. V., Friedman, E. B., Greenwald, H. S., Perle, M. A., Osman, I. Development of five new melanoma low passage cell lines representing the clinical and genetic profile of their tumors of origin. Pigment Cell Melanoma Research. 25 (3), 395-397 (2012).
  30. Morsi, A., et al. Development and characterization of a clinically relevant mouse model of melanoma brain metastasis. Pigment Cell Melanoma Research. 26 (5), 743-745 (2013).
  31. Huynh, C., et al. Efficient in vivo microRNA targeting of liver metastasis. Oncogene. 30 (12), 1481-1488 (2011).
  32. Zou, C., et al. Experimental variables that affect human hepatocyte AAV transduction in liver chimeric mice. Molecular Therapy Methods and Clinical Development. 18, 189-198 (2020).
  33. Kleffman, K., et al. Melanoma-secreted Amyloid Beta Suppresses Neuroinflammation and Promotes Brain Metastasis. bioRxiv. , 854885(2019).
  34. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging and Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  35. Sil, P., Wong, S. W., Martinez, J. More than skin deep: autophagy is vital for skin barrier function. Frontiers in Immunology. 9, 1376(2018).
  36. Chen, S., et al. Genome-wide CRISPR screen in a mouse model of tumor growth and metastasis. Cell. 160 (6), 1246-1260 (2015).
  37. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  38. Wang, T., et al. Identification and characterization of essential genes in the human genome. Science. 350 (6264), 1096-1101 (2015).
  39. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nucleic Acids Research. 30 (1), 207-210 (2002).
  40. Lappalainen, I., et al. The European Genome-phenome Archive of human data consented for biomedical research. Nature Genetics. 47 (7), 692-695 (2015).
  41. Cerami, E., et al. The cBio cancer genomics portal: an open platform for exploring multidimensional cancer genomics data. Cancer Discovery. 2 (5), 401-404 (2012).
  42. Grossman, R. L., et al. Toward a shared vision for cancer genomic data. New England Journal of Medicine. 375 (12), 1109-1112 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

In vivo modellenintracardiale injectieintradermale injectiesubcutane injectiebioluminescentie imagingsorteren van tumorcellensingle cell RNA sequencingimmunohistopathologiemetastasestremmer

Gerelateerde artikelen