Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Synthese van masarimycine, een kleine molecuulremmer van grampositieve bacteriegroei

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63191

⸱

7 januari 2022

 ,  , 
1Department of Science and Technology, Bryant University, 2Center for Health and Behavioral Sciences, Bryant University

In dit artikel

Samenvatting

Een gedetailleerd protocol wordt gepresenteerd voor het bereiden van de bacteriostatische diamide masarimycine, een kleine molecuul sonde die de groei van Bacillus subtilis en Streptococcus pneumoniae remt door zich te richten op de afbraak van de celwand. De toepassing ervan als chemische sonde wordt aangetoond in synergie/antagonisme assays en morfologische studies met B. subtilis en S. pneumoniae.

Samenvatting

Peptidoglycan (PG) in de celwand van bacteriën is een unieke macromoleculaire structuur die vorm en bescherming tegen de omgeving verleent. Centraal in het begrijpen van celgroei en -deling staat de kennis van hoe PG-degradatie de biosynthese en celwandassemblage beïnvloedt. Onlangs is de metabole etikettering van PG door de introductie van gemodificeerde suikers of aminozuren gemeld. Hoewel chemische ondervraging van biosynthetische stappen met kleine molecuulremmers mogelijk is, zijn chemische biologie-instrumenten om PG-afbraak door autolysinen te bestuderen onderontwikkeld. Bacteriële autolysines zijn een brede klasse van enzymen die betrokken zijn bij de strak gecoördineerde afbraak van PG. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor het voorbereiden van een sonde met kleine moleculen, masarimycine, een remmer van N-acetylglucosaminidase LytG in Bacillus subtilis, en celwandmetabolisme in Streptococcus pneumoniae. Bereiding van de remmer via microgolf-geassisteerde en klassieke organische synthese wordt verstrekt. De toepasbaarheid ervan als een hulpmiddel om Gram-positieve fysiologie in biologische assays te bestuderen, wordt gepresenteerd.

Inleiding

Peptidoglycaan (PG) is een mesh-achtig polymeer dat celvorm en -structuur afbakent in zowel Gram-positieve als Gram-negatieve bacteriën 1,2. Dit heteropolymeer is een matrix van aminosuikers die door korte peptiden 3,4,5,6 worden verknoopt met een ruggengraat die bestaat uit β-(1,4)-gebonden afwisselende N-acetylglucosamine (GlcNAc) en N-acetylmuramic acid (MurNAc) residuen (Figuur 1)1. Aan het C-3 lactylgedeelte van MurNAc is het stengelpeptide bevestigd. Het metabolisme van PG omvat een strak gecoördineerd systeem van biosynthetische en degradatieve enzymen om nieuw materiaal in de celwand op te nemen 7,8. Afbraak van PG wordt uitgevoerd door enzymen die gezamenlijk autolysines9 worden genoemd en verder worden geclassificeerd op basis van de specificiteit van de gesplitste binding. Autolysinen nemen deel aan vele cellulaire processen, waaronder celgroei, celdeling, beweeglijkheid, PG-rijping, chemotaxis, eiwitsecretie, genetische competentie, differentiatie en pathogeniciteit10,11. Het ontrafelen van de specifieke biologische functies van individuele autolysines kan ontmoedigend zijn, deels als gevolg van functionele redundantie. Recente biofysische 8,12,13 en computationele studies12 hebben echter nieuw inzicht gegeven in hun rol in het PG-metabolisme. Daarnaast hebben recente rapporten meer inzicht gegeven in de synthese14 en membraangemedieerde 15,16,17 stappen in PG-metabolisme. Een grondig begrip van de relatie tussen degradatieve en synthetische routes van PG-metabolisme zou aanleiding kunnen geven tot eerder onaangeboorde antibioticadoelen.

Hoewel er aanzienlijke vooruitgang is geboekt in de methodologie om glycobiologie in eukaryoten te bestuderen, is bacteriële glycobiologie en in het bijzonder PG-metabolisme niet in een vergelijkbaar tempo gevorderd. Huidige chemische benaderingen om pg-metabolisme te bestuderen omvatten fluorescerend gelabelde antibiotica18, fluorescerende sondes19,20 en metabole etikettering 21,22,23,24. Deze nieuwe benaderingen bieden nieuwe manieren om het bacteriële celwandmetabolisme te ondervragen. Hoewel sommige van deze strategieën in staat zijn om PG in vivo te labelen, kunnen ze soortspecifiek19 zijn, of alleen werken bij stammen zonder een bepaalde autolysine25. Veel PG-etiketteringsstrategieën zijn bedoeld voor gebruik met geïsoleerde celwanden26 of met in vitro gereconstitueerde PG-biosyntheseroutes 20,27,28. Het gebruik van fluorescerend gelabelde antibiotica is momenteel beperkt tot biosynthetische stappen en transpeptidatie18.

De huidige kennis van bacteriële autolysines en hun rol in het celwandmetabolisme komt uit genetische en in vitro biochemische analyse 11,29,30,31,32. Hoewel deze benaderingen een schat aan informatie hebben opgeleverd over deze belangrijke klasse van enzymen, kan het ontcijferen van hun biologische rol een uitdaging zijn. Bijvoorbeeld, als gevolg van functionele redundantie33, deletie van een autolysine resulteert in de meeste gevallen niet in het stoppen van de bacteriegroei. Dit ondanks hun impliciete rol in celgroei en deling 7,12. Een andere complicatie is dat genetische deletie van bacteriële autolysines aanleiding kan geven tot metafenotypen34. Metafenotypen komen voort uit het complexe samenspel tussen de route die wordt beïnvloed door de genetische deletie en andere onderling verbonden paden. Zo kan een metafenotype ontstaan via een direct effect zoals het ontbreken van een enzym, of een indirect effect zoals een verstoring van regulatoren.

Momenteel zijn er slechts een paar remmers van glycosidase autolysinen zoals N-acetylglucosaminidasen (GlcNAcase) en N-acetylmuramidases, die kunnen worden gebruikt als chemische sondes om de afbraak van PG te bestuderen. Om dit aan te pakken, is de diamide masarimycine (voorheen aangeduid als fgkc) geïdentificeerd en gekarakteriseerd35 als een bacteriostatische remmer van Bacillus subtilis groei die zich richt op de GlcNAcase LytG32 (figuur 1). LytG is een exo-werkende GlcNAcase36, een lid van cluster 2 binnen glycosylhydrolasefamilie 73 (GH73). Het is de belangrijkste actieve GlcNA-zaak tijdens vegetatieve groei32. Voor zover wij weten, masarimycine is de eerste remmer van een PG-werkende GlcNAcase die de cellulaire groei remt. Aanvullende studies van masarimycine met Streptococcus pneumoniae vonden dat masarimycine waarschijnlijk het celwandmetabolisme in dit organisme remt37. Hier wordt de bereiding van masarimycine gerapporteerd voor gebruik als een chemische biologiesonde om de fysiologie te bestuderen in de Gram-positieve organismen B. subtilis en S. pneumoniae. Voorbeelden van morfologische analyse van subminimale remmende concentratiebehandeling met masarimycine, evenals een synergie / antagonisme-assay worden gepresenteerd. Synergie- en antagonismetests met behulp van antibiotica met goed gedefinieerde werkingsmechanismen kunnen een nuttige manier zijn om verbanden tussen cellulaire processen te onderzoeken 38,39,40.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Algemene methoden

OPMERKING: Alle verbindingen werden gekocht bij standaardleveranciers en gebruikt zonder verdere zuivering.

  1. Voer dunnelaagchromatografie (TLC) uit op een aluminiumplaat die is voorgecoat met silicagel XG F254. Detecteer vlekken onder een UV-lamp, door onderdompeling in p-anisaldehydevlek of door blootstelling aan I2-damp.
  2. Registreer alle nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectra op een 400 MHz spectrometer.
    OPMERKING: 1H-NMR en 13C-NMR spectra werden verwezen naar resterende oplosmiddelpieken. Koppelingsconstanten worden gegeven in [Hz] en chemische verschuivingen in [ppm].
  3. Record atmosferische druk chemische ionisatie (APCI) massaspectrometrie spectra van masarimycine op een compacte massaspectrometer uitgerust met een atmosferische vaste stof analyse sonde.

2. Algemene procedure voor de bereiding van masarimycine

OPMERKING: Voer de onderstaande stappen uit in een zuurkast.

  1. Bereid een 0,1 M-oplossing in methanol van elke reactant: cyclohexylamine, cyclohexylcarboxaldehyde, o-joodbenzoëzuur en cyclohexylisocytanide35.
    LET OP: Cyclohexylamine, cyclohexyl isocyanide en cyclohexylcarboxaldehyde zijn ontvlambaar. Ze kunnen huidcorrosie veroorzaken en orale, dermale, respiratoire of reproductieve toxiciteit veroorzaken. Houd verbindingen uit de buurt van open vuur, hete oppervlakken en ontstekingsbronnen. Draag de juiste huid- en oogbescherming, werk in een goed geventileerde ruimte en vermijd inademing van dampen of nevel. Houd flessen voor opslag goed gesloten en bewaar ze op een koele, droge plaats. Bewaar cyclohexylcarboxaldehyde in een exsiccator onder een N2-atmosfeer .
  2. Meng 5 ml cyclohexylamine (0,1 M oplossing in methanol) en 5 ml cyclohexylcarboxaldehyde (0,1 M in methanol) in een afgedekte ronde bodemkolf en roer de oplossing met behulp van een magnetische roerstaaf gedurende 30 minuten op een roerplaat bij 40 °C in een zandbad. Controleer de temperatuur met behulp van een thermometer die ongeveer 1 cm onder het zandoppervlak is geplaatst.
  3. Voeg na 30 minuten 5 ml cyclohexylisocyanide (0,1 M oplossing in methanol) toe aan de oplossing uit stap 2.2 en roer nog eens 20 minuten bij 50 °C. Voeg ten slotte 5 ml o-joodbenzoëzuur (0,1 M oplossing in methanol) toe aan het reactiemengsel en blijf gedurende 3-5 uur roeren bij 55 °C.
  4. Controleer de voortgang van de reactie periodiek door TLC ongeveer elk uur nadat het bovenstaande reactiemengsel gedurende 3 uur was geroerd.
  5. Knip een strook van 3 cm x 6 cm TLC-plaat met aluminium achterkant. Teken met een #2 potlood een lijn op ongeveer 1 cm van de onderkant. Plaats met behulp van een glazen microcapillair ongeveer 5 μL van het reactiemengsel op de TLC-plaat en laat het drogen.
  6. Voeg aan een bekerglas van 150 ml voldoende mobiele fase (90:10 hexaan: isopropanol) toe om de bodem van het bekerglas te bedekken. Plaats met een pincet de bovenstaande TLC-plaat voorzichtig in het bekerglas en zorg ervoor dat de TLC-plaat gelijkmatig in de mobiele fase komt. Bedek de bovenkant van het bekerglas met een stukje tinfoil.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de mobiele fase de lijn en het gevlekte monster niet bedekt.
  7. Laat de mobiele fase de TLC-plaat opgaan totdat deze ongeveer 1 cm onder de bovenkant van de plaat ligt. Verwijder de TLC-plaat en teken met een potlood een lijn die de afgelegde afstand van de mobiele fase aangeeft. Laat de TLC-plaat drogen in een zuurkast.
  8. Eenmaal gedroogd, plaats de TLC-plaat in een bekerglas met een kleine hoeveelheid vaste I2 en dek het bekerglas af met een stuk tinfolie. Monitor de TLC op de ontwikkeling van geel/bruine vlekken. Eenmaal ontwikkeld, verwijdert u de TLC-plaat en markeert u de locatie van de vlekken met een potlood (aanvullende figuur 1).
    OPMERKING: Als ik2 vlekken niet markeer, zal de vlek na verloop van tijd verdwijnen. Vlekken kunnen ook op de TLC-plaat worden gevisualiseerd door UV-licht, p-anisaldehydekleuring of kaliumpermanganaatkleuring (zie Aanvullende informatie).
  9. Bereken Rf-waarden voor alle gevisualiseerde vlekken met behulp van de volgende formule:
    Rf = figure-protocol-1
  10. Beschouw de reactie als voltooid wanneer slechts één plek met Rf = 0,3 zichtbaar is op de TLC-plaat. Verwijder het oplosmiddel in een roterende verdamper onder verlaagde druk en droog het ruwe product (verkregen als een geelbruine olie) onder een hoog vacuüm totdat alle methanol is verdampt.
  11. Los het gedroogde ruwe product op in 30 ml ethylacetaat en breng het over in een trechter van het separatoreum. Ethylacetaat achtereenvolgens extraheren met 1 M HCl (2 x 30 ml), H2O (30 ml), verzadigde NaHCO3-oplossing (2 x 30 ml), H2O (30 ml) en verzadigde NaCl-oplossing (2 x 30 ml). Gooi de waterige lagen weg.
    OPMERKING: De ethylacetaatlaag is de bovenste laag in elk van de extracties. Schud voor elke extractie krachtig de separatortrechter met het ethylacetaat en de waterige oplossing (HCl, H2O, NaHCO3 of NaCl) en laat de lagen volledig scheiden.
  12. Verwijder de ethylacetaatlaag uit de trechter en vang deze op in een Erlenmeyer. Voeg een spatel vol Na2SO4 (watervrij) toe om restwater uit ethylacetaat te verwijderen.
    OPMERKING: De ethylacetaatoplossing wordt als droog beschouwd wanneer Na2SO4 in de kolf vrij rondloopt en niet klontert. Als Na2SO4 samenklontert, kan een extra spatel van Na2SO4 worden toegevoegd.
  13. Filtreer de gedroogde ethylacetaatoplossing door #1 filterpapier om Na2SO4 te verwijderen. Was het filtreerpapier met een kleine hoeveelheid ethylacetaat. Plaats de gefilterde ethylacetaatoplossing in een kolf met ronde bodem en verwijder het oplosmiddel op een roterende verdamper onder verlaagde druk om masarimycine als olie te verkrijgen zodra al het ethylacetaat is verwijderd.
  14. Los de hierboven verkregen masarimycine-olie op in een minimale hoeveelheid (1-2 ml) van 9:1 hexaan: isopropanol en roer op een magnetische roerplaat totdat alle verbinding is opgelost.
  15. Zuiver de opgeloste masarimycine door flitschromatografie met behulp van een 12 g normale fase silica flitskolom.
    1. Breng de flitskolom in evenwicht met 10 kolomvolumes van de mobiele fase (99:1 hexaan: isopropanol) met het instrument dat is ingesteld op een debiet van 15 ml/min.
      OPMERKING: Nadat de evenwichtsbalans is voltooid, stopt u de stroom en koppelt u de bovenkant van de kolom los van het systeem.
    2. Zuig opgeloste masarimycine op met een spuit van 5 ml. Sluit de spuit rechtstreeks aan op de bovenkant van de gebalanceerde flitskolom en injecteer de oplossing in de kolom. Sluit de geladen kolom opnieuw aan op het flitschromatografiesysteem en start de gradiëntelutie.
    3. Eluteer masarimycine uit de kolom met behulp van gradiëntelutie tot een uiteindelijke mobiele faseconcentratie van 10:90 hexaan: isopropanol over 12 kolomvolumes. Controleer de elutie van masarimycine via absorptie bij 230 en 254 nm.
    4. Verzamel de verbindingen die uit de kolom worden geëlueerd door een fractiecollector die 20 ml oplosmiddel per fractie verzamelt.
      OPMERKING: Als een flashchromatografiesysteem niet beschikbaar is, kan de zuivering van masarimycine worden uitgevoerd via een zwaartekrachtsiliciumkolom met een 3:1 (hexaan: ethylacetaat) mobiele fase. Fracties die masarimycine bevatten, kunnen worden geïdentificeerd door TLC met behulp van dezelfde mobiele fase. Visualisatie van TLC-vlekken werd gedaan met UV-licht, I2-damp of kaliumpermanganaatkleuring.
    5. Identificeer fracties die masarimycine bevatten door TLC (stappen 2.5-2.9) of massaspectrometrie op een compacte massaspectrometer uitgerust met een atmosferische analysesonde voor vaste stoffen. Droog het eindproduct onder vacuüm (~ 0,3 mbar).
      OPMERKING: Masarimycine wordt routinematig verkregen als een kleurloze olie of vaste stof met een opbrengst van 55% -70% met betrekking tot mmol van cyclohexylcarboxaldehyde toegevoegd aan de reactie. Bereken de uiteindelijke opbrengst van masarimycine door de massa van de gezuiverde masarimycine te verkrijgen en de theoretische opbrengst van de reactie te berekenen met behulp van de volgende formule:
      % opbrengst = figure-protocol-2 x 100%
  16. Bevestig de structuur van masarimycine door NMR.
    1. Los ~10 mg masarimycinemonster op in 0,5 ml CDCl3. Breng met behulp van een Pasteur-pipet de oplossing over in een NMR-buis van 5 mm en sluit de buis af. Plaats de NMR-buis in de spectrometer.
    2. Verkrijg 1H- en 13C NMR-spectra met behulp van vooraf ingestelde experimenten van de fabrikant. Chemische verschuivingstoewijzingen en representatieve spectra zijn opgenomen in aanvullende figuren 3-4.
  17. Bewaar masarimycine droog of opgelost in DMSO (eindconcentratie van 25 mM) bij -20 °C tot gebruik.

3. Microgolfprocedure voor de bereiding van masarimycine

  1. Bereid 0,6 M oplossingen van cyclohexylamine, cyclohexylcarboxaldehyde, cyclohexylisocyanide en o-joodbenzoëzuur in acetonitril.
  2. Voeg een roerstaaf en 10 ml acetonitril toe aan een glazen injectieflacon met microgolfreactie.
  3. Voeg 2 ml cyclohexylamine (0,6 M in acetonitril), 2 ml cyclohexylcarboxaldehyde (0,6 M in acetonitril) en 7 ml acetonitril toe aan de injectieflacon.
  4. Plaats de injectieflacon met microgolfreactie in de microgolfcarrousel. Roer het mengsel, verwarm het gedurende 30 minuten bij 50°C bij een vermogensinstelling van 400 W en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
  5. Voeg 2 ml o-joodbenzoëzuur (0,6 M methanol) en 2 ml cyclohexylisoocyanide (0,6 M in acetonitril) toe aan de injectieflacon. Roer het mengsel, verwarm het tot 100 °C in de magnetron gedurende 40 minuten bij een vermogensinstelling van 400 W en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
  6. Controleer de voortgang van de reactie door TLC (90:10 hexaan: isopropanol) met behulp van I2 damp na het voltooien van stap 3.5.
    OPMERKING: Als TLC aantoont dat de reactie onvolledig is (d.w.z. meerdere plekken op TLC), plaatst u de reactieflacon terug in de magnetron en stelt u de microgolfomstandigheden in die worden beschreven in stap 3.5.
  7. Zodra de reactie is voltooid, giet u de oplossing in een kolf met ronde bodem van 100 ml en verdampt u deze tot droogheid met behulp van een roterende verdamper.
  8. Volg stappen 2.6-2.16 hierboven om de waterige work-up, zuivering en karakterisering van masarimycine te voltooien.

4. Synergie en antagonisme assay

  1. Kweek Streptococcus pneumoniae R6 op Mueller-Hinton (MH) agarplaten met 5% (v/v) schapenbloed bij 37 °C onder anaerobe omstandigheden. Gebruik in alle experimenten tweede passagecellen gekweekt in 5 ml MH-bouillon bij 37 °C onder anaërobe omstandigheden tot OD600 ~ 0,4 is.
  2. Onderwerp de remmers masarimycine en optochin aan seriële 1:2 verdunningen in respectievelijke oplosmiddelen, waarbij de resulterende concentraties de minimale remmende concentratie (MIC) waarden van elke remmer flankeren.
    1. Maak de eerste verdunning van masarimycine in dimethylsulfoxide (DMSO) tot een concentratie van 100 μM is bereikt. Maak vanaf dit punt masarimycine verdunningen in MH-bouillon. Bereid optochinenvoorraadoplossing (3,5 mM) door in de handel verkrijgbare optochine (zie materiaaltabel) op te lossen in steriele MH-bouillon.
      OPMERKING: Masarimycine stock oplossingen werden gemaakt op 25 mM in DMSO.
  3. Voeg aan een steriele 96-well microtiterplaat 2 μL aliquots van elke optochin verdunning toe aan elke rij van de plaat. Voeg aan dezelfde plaat 2 μL aliquots van elke masarimycineverdunning toe aan elke kolom om een reeks optochin- en masarimycineconcentraties op de plaat te creëren (figuur 2).
  4. Voeg steriele MH-bouillon (93 μL) toe aan elke put die de bovenstaande remmers bevat. Ent de microtiterplaten met 5 μL cultuur (OD600 ~0,4) vanaf stap 4.1.
    OPMERKING: Het inenten van de 96-putplaat gebeurt meestal onder anaerobe omstandigheden in een anaeroob werkstation. Het uiteindelijke volume in de put is 100 μL.
  5. Kweek culturen gedurende 18 uur bij 37 °C onder anaërobe omstandigheden, gevolgd door de toevoeging van 30 μL van 0,01% (m/v) oplossing van resazurin natriumzout. Incubeer de plaat bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten om de vorming en stabilisatie van kleur mogelijk te maken.
    OPMERKING: Resazurin-oplossing wordt bereid door de verbinding op te lossen in gedestilleerd water en kan maximaal twee weken bij 4 °C worden bewaard.
  6. Lees direct de concentratiewaarden van de plaat af en wijs de laagste inhibitorconcentratie toe waarvoor geen bacteriegroei wordt waargenomen (blauwe kleur) als [X] (zie stap 4.7.1), d.w.z. de laagste remmende concentratie van het geneesmiddel in aanwezigheid van het co-geneesmiddel.
    OPMERKING: Positieve bacteriegroei wordt in de putten geïdentificeerd door de resazurinekleurstof die roze wordt. MIC-waarden voor elk geneesmiddel alleen (d.w.z. bij afwezigheid van co-drug) worden op een vergelijkbare manier bepaald met behulp van de resazurin MIC-test35 met elk geneesmiddel afzonderlijk (aanvullende figuur 5). MIC's in S. pneumoniae zijn respectievelijk 7,8 μM en 15,85 μM voor masarimycine en optochin.
  7. Bepaal de fractionele remmende concentratie (FIC) en FIC-index (FICI) met behulp van de volgende vergelijkingen.
    1. FIC= [X]/MICx, waarbij [X] (uit stap 4.6) de laagste remmende concentratie van het geneesmiddel is in aanwezigheid van het co-geneesmiddel, en MICx de laagste remmende concentratie van het geneesmiddel in afwezigheid van het co-geneesmiddel.
    2. FICI = FICmasarimycine + FICantibioticum
      OPMERKING: FICI < 0,5 = synergetisch, 0,5 < FICI < 1 = additief, 1 < FICI < 4 = onverschillig, FICI > 4 = antagonistisch.

5. Morfologisch onderzoek

  1. Kweek Bacillus subtilis 11774 op Luria-Bertani (LB) agarplaten (10 g/L trypton, 5 g/L gistextract en 5 g/L NaCl) met 1,5% Bacto agar bij 37 °C. Gebruik in alle experimenten tweede passagecellen gekweekt in 5 ml LB-bouillon bij 37 °C tot OD600 = 1. Kweek S.pneumoniae op dezelfde manier als in stap 4.1.
  2. Na het verkrijgen van een celkweekdichtheid met OD600nm = 1 voor B. subtilis, of OD600nm = 0,4 voor S. pneumoniae, voeg masarimycine met behulp van een pipet toe aan de kweekbuis met het label "behandeld" tot een eindconcentratie van 3,8 μM (0,75x MIC voor B.subtilis), of 5,85 μM (0,75x MIC voor S.pneumoniae). Voeg aan de tweede kweekbuis met het label "controle" een equivalent volume DMSO toe.
  3. Voor B.subtilis plaatst u de monsters gedurende 90 minuten in een incubator bij 37 °C met schudden bij 150 tpm. Voor S. pneumoniae, incubateer de cellen zonder te schudden onder anaerobe omstandigheden.
  4. Na 90 min, de culturen chemisch fixeren in een 1:10 mengsel (v/v) van kweekmedia en fixing buffer (20 mM HEPES, 1% formaldehyde (pH 6,8)) bij 4 °C gedurende de nacht. Nadat het bevestigen is voltooid, brengt u 10-20 μL monsters aan op glazen microscoopglaasjes met behulp van een pipet en laat u ze aan de lucht drogen. Bevestig de luchtgedroogde monsters door de glasglaasjes te verwarmen met een Bunsen-brander.
  5. Na warmtefixatie, vlekmonsters met toevoeging van 100 μL 0,1% (m/v) methyleenblauw (oplossing in 20% (v/v) ethanol). Incubeer de bevlekte glaasjes gedurende 10 minuten en spoel de overtollige kleurstof weg met dH2O. Verwarm vervolgens de gekleurde dia's voorzichtig tot 60 °C in een oven gedurende 15-20 minuten om cellen naar een gemeenschappelijk brandpuntsvlak te brengen.
  6. Verzegel de gekleurde monsters door een microscoopdeksel over de gekleurde cellen te plaatsen. Sluit vervolgens de randen af met microscoopglaascement. Plaats het verzegelde microscoopglaasje op het microscooppodium en breng het beeld scherp met een vergroting van 100x met behulp van bright-field microscopie.
  7. Plaats een druppel dompelolie op de microscoopglaasjes en breng het gezichtsveld scherp met een vergroting van 1000x. Verkrijg microfoto's met behulp van een camera die aan de microscoop en de bijbehorende software is bevestigd. Verkrijg afbeeldingen met behulp van de automatische witbalans- en diafragma-instellingen in de software.
    OPMERKING: Als alternatief kunnen afbeeldingen worden verwerkt met behulp van de open-source ImageJ-software.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Masarimycine is een bacteriostatische remmer met klein molecuul van B. subtilis en S. pneumoniae en er is aangetoond dat het de exo-werkende GlcNAcase LytG in B. subtilis35,37 remt en zich richt op de celwand in S. pneumoniae37. Masarimycine kan efficiënt worden bereid door de klassieke of microgolfondersteunde organische synthese met opbrengsten in het bereik van 55% -70%. Microgolf-geassisteerde synthe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Masarimycine is een enkele micromolaire bacteriostatische remmer van B. subtilis35 en S. pneumoniae37 groei. Bij B. subtilis is aangetoond dat masarimycine de GlcNAcase LytG35 remt, terwijl het precieze moleculaire doelwit in de celwand van S. pneumoniae niet is geïdentificeerd37. Synthese van masarimycine met behulp van de klassieke organische synthese of microgolfprocedure biedt de remmer een goede...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Reid, C. W. heeft intellectueel eigendom met betrekking tot specifieke toepassingen van masarimycine.

Dankbetuigingen

Onderzoek werd ondersteund door de National Science Foundation onder subsidienummer 2009522. NMR-analyse van masarimycine werd ondersteund door de National Science Foundation major research instrumentation program award onder subsidienummer 1919644. Alle meningen, bevindingen en conclusies of aanbevelingen die in dit materiaal worden geuit, zijn die van de auteurs en weerspiegelen niet noodzakelijkerwijs de opvattingen van de National Science Foundation.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-Iodobenzoic acidSIGMA-ALDRICHI7675-25Gcorrosief, irriterend, lichtgeel tot oranje-bruine poeder
2-PropanolSIGMA-ALDRICH109827-4Lontbrandbaar, irriterend, kleurloze vloeistof
AcetonitrileSIGMA-ALDRICH34851-4Lontbrandbaar, irriterend, kleurloze vloeistof
Aluminum backed silica platesSorbtech4434126silica gel XG F254 op aluminium gedekte platen
chloroform-dSIGMA-ALDRICH151823-50Goplosmiddel voor NMR
Compact Mass SpectrometerAdvion-InterchimAdvion CMScompacte massaspectrometer uitgerust met APCI-bron en atmosferische vaste stoffen analyse sonde
Corning Costar 96 well flat bottom plates-sterilefisher chemical07-200-90voor synergie/antagonisme tests
cover slipsfisher chemical12-547voor microscopie
CyclohexanecarboxaldehydeCHEM-IMPEX INT'L INC.24451ontbrandbaar, irriterend, kleurloze tot roze vloeistof
Cyclohexyl isocyanideSIGMA-ALDRICH133302-5Girriterend, kleurloze vloeistof, extreem onaangename geur
CyclohexylamineSIGMA-ALDRICH240648-100MLcorrosief, ontvlambaar, irriterend, kleurloze vloeistof tenzij verontreinigd
Ethyl acetateSIGMA-ALDRICH537446-4Lontbrandbaar, irriterend, kleurloze vloeistof
flash silica cartridge (12g)Advion-InterchimPF-50SIHP-F0012pakket met flash silica kolommen (12g) voor zuivering van masarimycin
formaldehydeSIGMA-ALDRICHF8775-25MLfixeermiddel voor microscopie
HEPESSIGMA-ALDRICHH8651-25Gbuffer voor microscopie fixeeroplossing
Hexane, mixture of isomersSIGMA-ALDRICH178918-4Lmilieubelastend, ontvlambaar, irriterend, gezondheidsrisico, kleurloze vloeistof
High performance compact mass spectrometerAdvionexpressionAtmosferische vaste stoffen analyse sonde (ASAP), lage resolutie
High VaceppendorfVacufuge plusvacuüm ondersteund door centrifugale kracht en temperatuur
Hydrochloric acidSIGMA-ALDRICH258148-2.5Lcorrosief, irriterend, kleurloze vloeistof
hydrochloric acidSIGMA-ALDRICH320331-2.5Lsterk zuur
immersion oilfisher chemical12-365-19voor microscopie
Iodine, resublimed crystalsAlfa Aesar41955milieubelastend, irriterend, gezondheidsrisico, donkergrijze/paarse kristallen
Mestre MnovaMestreLab Researchsoftware voor het verwerken van NMR-spectra
MethanolSIGMA-ALDRICH439193-4Lontbrandbaar, toxisch, gezondheidsrisico, kleurloze vloeistof
methylene blueSIGMA-ALDRICHM9140-25Gmicroscoopverf voor het kleuren van celwanden
meuller-hinton agar plates + 5% sheep bloodfisher chemicalB21176Xgroeimedium voor Streptococcus pneumoniae
meuller-hinton brothfisher chemicalDF0757-17-6groeimedium voor Streptococcus pneumoniae
microscope slidesfisher chemical22-310397voor microscopie
Microwave Synthesis LabstationMILESTONESTART SYNTHapparaat dat de ventilatie van een afzuigkap vereist, uitgerust met synthese carrousel
NMR tubesSIGMA-ALDRICHZ562769-5EA5mm NMR buizen 600 MHz
Nuclear Magnetic Resonance (NMR)BrukerAscend 400grote supergeleidende magneet (400MHz)
optochinfisher chemicalAAB21627MCethylhydrocupreine hydrochloride
petrie platesCelltreat229695voor het bereiden van agar platen voor bacteriegroei
Primo Star Bright field/Phase contrast Microscope with ERc5s cameraZeissvoor morfologie studies
puriFlashinterchimXS520plusflash chromatografie zuiveringssysteem
resazurinSIGMA-ALDRICHR7017-1Gvoor synergie/antagonisme tests
Rotary EvaporatorHeidolphHei-VAP Value "The Collegiate"oplosmiddel verdamper
Sodium bicarbonateSIGMA-ALDRICHS6014-500Girriterend, wit poeder
Sodium chloridefisher chemicalS271-1kristallijn, kleurloos
Sodium chlorideSIGMA-ALDRICHS5886-500Gvoor groei van B.subtilis en bereiding van LB media
Sodium sulfateSIGMA-ALDRICH7985592-500Gwatervrij, korrelig, wit
tryptonefisher chemicalBP1421-500voor groei van B.subtilis en bereiding van LB media
Whitney DG250 WorkstationMicrobiology InternationalDG250anaërobe werkstation. Anaërobe gasmengsel gebruikt: 5% waterstof, 10% koolstofdioxide, rest stikstof
yeast extractfisher chemicalBP1422-500voor groei van B.subtilis en bereiding van LB media
Zen Lite (blue) softwareZeissvoor het verkrijgen van micrografieën
```

Referenties

  1. Vollmer, W., Blanot, D., de Pedro, M. A. Peptidoglycan structure and architecture. FEMS Microbiology Review. 32 (2), 149-167 (2008).
  2. Munita, J. M., Bayer, A. S., Arias, C. A. Evolving resistance among Gram-positive pathogens. Clinical Infectious Diseases. 61, suppl-2 48-57 (2015).
  3. Vollmer, W., Bertsche, U. Murein (peptidoglycan) structure, architecture and biosynthesis in Escherichia coli. Biochimica Biophysica Acta. 1778 (9), 1714-1734 (2008).
  4. Vollmer, W., Höltje, J. -V. The architecture of the murein (peptidoglycan) in Gram-negative bacteria: vertical scaffold or horizontal layer(s). Journal of Bacteriology. 186 (18), 5978-5987 (2004).
  5. Clarke, A. J. Compositional analysis of peptidoglycan by high-performance anion-exchange chromatography. Analytical Biochemistry. 212 (2), 344-350 (1993).
  6. Kim, S. J., Chang, J., Singh, M. Peptidoglycan architecture of Gram-positive bacteria by solid-state NMR. Biochimica Biophysica Acta. 1848, 350-362 (2014).
  7. Koch, A. L., Doyle, R. J. Inside-to-outside growth and turnover of the wall of gram-positive rods. Journal of Theoretical Biology. 117 (1), 137-157 (1985).
  8. Beeby, M., Gumbart, J. C., Roux, B., Jensen, G. J. Architecture and assembly of the Gram-positive cell wall. Molecular Microbiology. 88 (4), 664-672 (2013).
  9. Shockman, G. D., Daneo-Moore, L., Kariyama, R., Massidda, O. Bacterial walls, peptidoglycan hydrolases, autolysins, and autolysis. Microbial Drug Resistance. 2 (1), 95-98 (1996).
  10. Dijkstra, A. J., Keck, W. Peptidoglycan as a barrier to transenvelope transport. Journal of Bacteriology. 178 (19), 5555-5562 (1996).
  11. Blackman, S. A., Smith, T. J., Foster, S. J. The role of autolysins during vegetative growth of Bacillus subtilis 168. Microbiology. 144, 73-82 (1998).
  12. Misra, G., Rojas, E. R., Gopinathan, A., Huang, K. C. Mechanical consequences of cell-wall turnover in the elongation of a Gram-positive bacterium. Biophysical Journal. 104 (11), 2342-2352 (2013).
  13. Wheeler, R., et al. Bacterial cell enlargement requires control of cell wall stiffness mediated by peptidoglycan hydrolases. mBio. 6 (4), 00660(2015).
  14. Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Chemical tools to characterize peptidoglycan synthases. Current Opinion in Chemical Biology. 53, 44-50 (2019).
  15. Welsh, M. A., Schaefer, K., Taguchi, A., Kahne, D., Walker, S. Direction of chain growth and substrate preferences of shape, elongation, division, and sporulation-family peptidoglycan glycosyltransferases. Journal of the American Chemial Society. 141 (33), 12994-12997 (2019).
  16. Rubino, F. A., et al. Detection of transport intermediates in the peptidoglycan flippase MurJ identifies residues essential for conformational cycling. Journal of the American Chemical Society. 142 (12), 5482-5486 (2020).
  17. Sjodt, M., et al. Structure of the peptidoglycan polymerase RodA resolved by evolutionary coupling analysis. Nature. 556 (7699), 118-121 (2018).
  18. Tiyanont, K., et al. Imaging peptidoglycan biosynthesis in Bacillus subtilis with fluorescent antibiotics. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 103 (29), 11033-11038 (2006).
  19. Lebar, M. D., et al. Reconstitution of peptidoglycan cross-linking leads to improved fluorescent probes of cell wall synthesis. Journal of the American Chemical Society. 136 (31), 10874-10877 (2014).
  20. Do, T., Page, J. E., Walker, S. Uncovering the activities, biological roles, and regulation of bacterial cell wall hydrolases and tailoring enzymes. Journal of Biological Chemistry. 295 (10), 3347-3361 (2020).
  21. Liang, H., et al. Metabolic labelling of the carbohydrate core in bacterial peptidoglycan and its applications. Nature Communications. 8, 15015(2017).
  22. DeMeester, K. E., et al. Metabolic incorporation of N-acetyl muramic acid probes into bacterial peptidoglycan. Current Protocol in Chemical Biology. 11 (4), 74(2019).
  23. Lazor, K. M., et al. Use of Bioorthogonal N-acetylcysteamine (SNAc) analogues and peptidoglycan O-acetyltransferase B (PatB) to label peptidoglycan. The FASEB Journal. 32, 630(2018).
  24. Wang, Y., Leimkuhler-Grimes, C. Fluorescent labeling of the carbohydrate backbone of peptidoglycan to track degradation in vivo. The FASEB Journal. 29, (2015).
  25. Kuru, E., et al. In probing of newly synthesized peptidoglycan in live bacteria with fluorescent D-amino acids. Angewandte Chemie International Edition. 51 (50), 12519-12523 (2012).
  26. Zhou, R., Chen, S., Recsei, P. A dye release assay for determination of lysostaphin activity. Analytical Biochemistry. 171 (1), 141-144 (1988).
  27. Qiao, Y., et al. Lipid II overproduction allows direct assay of transpeptidase inhibition by β-lactams. Nature Chemical Biology. 13 (7), 793-798 (2017).
  28. Lebar, M. D., et al. Forming cross-linked peptidoglycan from synthetic Gram-negative lipid II. Journal of the American Chemical Society. 135 (12), 4632-4635 (2013).
  29. Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. Role of the D-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity. Journal of Bacteriology. 191 (18), 5775-5784 (2009).
  30. Yukie, S., Miki, K., Yoshio, N., Kuniaki, T., Yoshihisa, Y. Identification and characterization of an autolysin-encoding gene of Streptococcus mutans. Infection and Immunity. 73 (6), 3512-3520 (2005).
  31. Domenech, M., García, E., Moscoso, M. In vitro destruction of Streptococcus pneumoniae biofilms with bacterial and phage peptidoglycan hydrolases. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 55 (9), 4144-4148 (2011).
  32. Horsburgh, G. J., Atrih, A., Williamson, M. P., Foster, S. J. LytG of Bacillus subtilis is a novel peptidoglycan hydrolase: the major active glucosaminidase. Biochemistry. 42 (2), 257-264 (2003).
  33. Vermassen, A., et al. Cell wall hydrolases in bacteria: insight on the diversity of cell wall amidases, glycosidases and peptidases toward peptidoglycan. Frontiers in Microbiology. 10, 331(2019).
  34. Martin-Galiano, A. J., Yuste, J., Cercenado, M. I., de la Campa, A. G. Inspecting the potential physiological and biomedical value of 44 conserved uncharacterised proteins of Streptococcus pneumoniae. BMC Genomics. 15, 652(2014).
  35. Nayyab, S., et al. Diamide inhibitors of the Bacillus subtilis N-acetylglucosaminidase LytG that exhibit antibacterial activity. ACS Infectioius Diseases. 3 (6), 421-427 (2017).
  36. Lipski, A., et al. Structural and biochemical characterization of the β-N-acetylglucosaminidase from Thermotoga maritima: Toward rationalization of mechanistic knowledge in the GH73 family. Glycobiology. 25 (3), 319-330 (2014).
  37. Haubrich, B. A., et al. Inhibition of Streptococcus pneumoniae autolysins highlight distinct differences between chemical and genetic inactivation. bioRxiv. , 300541(2020).
  38. Farha, M. A., et al. Inhibition of WTA synthesis blocks the cooperative action of PBPs and sensitizes MRSA to β-lactams. ACS Chemical Biology. 8 (1), 226-233 (2013).
  39. Lehár, J., et al. Chemical combination effects predict connectivity in biological systems. Molecular Systems Biology. 3 (1), 80(2007).
  40. Farha, M. A., et al. Antagonism screen for inhibitors of bacterial cell wall biogenesis uncovers an inhibitor of undecaprenyl diphosphate synthase. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 112 (35), 11048-11053 (2015).
  41. Palomino, J. C., et al. Resazurin microtiter assay plate: simple and inexpensive method for detection of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (8), 2720-2722 (2002).
  42. Odds, F. C. Synergy, antagonism, and what the chequerboard puts between them. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 52 (1), 1(2003).
  43. Arrigucci, R., Pozzi, G. Identification of the chain-dispersing peptidoglycan hydrolase LytB of Streptococcus gordonii. PLoS One. 12 (4), 0176117(2017).
  44. Bai, X. -H., et al. Structure of pneumococcal peptidoglycan hydrolase LytB reveals insights into the bacterial cell wall remodeling and pathogenesis. of Biological Chemistry. 289 (34), 23403-23416 (2014).
  45. Garcia, P., Gonzalez, M. P., Garcia, E., Lopez, R., Garcia, J. L. LytB, a novel pneumococcal murein hydrolase essential for cell separation. Molecular Microbiology. 31 (4), 1275-1281 (1999).
  46. Giladi, M., Altman-Price, N., Levin, I., Levy, L., Mevarech, M. FolM, a new chromosomally encoded dihydrofolate reductase in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 185 (23), 7015-7018 (2003).
  47. Chua, P. R., et al. Effective killing of the human pathogen Candida albicans by a specific inhibitor of non-essential mitotic kinesin Kip1p. Molecular Microbiology. 65 (2), 347-362 (2007).
  48. Rico-Lastres, P., et al. Substrate recognition and catalysis by LytB, a pneumococcal peptidoglycan hydrolase involved in virulence. Scientific Reports. 5, 16198(2015).
  49. Vollmer, W., et al. The cell wall of Streptococcus pneumoniae. Microbiology Spectrum. 7 (3), (2019).
  50. Massidda, O., Nováková, L., Vollmer, W. From models to pathogens: how much have we learned about Streptococcus pneumoniae cell division. Environmental Microbiology. 15 (12), 3133-3157 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Masarimycine syntheseGram positieve remmerbacteri le autolysinespeptidoglycaandegradatieflitschromatografiedunlaagchromatografieBacillus subtilisStreptococcus pneumoniaecelwandmetabolismeveldmicroscopie
Synthese van masarimycine, een kleine molecuulremmer van grampositieve bacteriegroei
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.