Om een axeeninsect te verkrijgen, wordt het eioppervlak gesteriliseerd en wordt de uitgekomen larve vervolgens grootgebracht met behulp van axeenbladeren. Deze methode biedt een efficiënte manier voor axeeninsectenbereiding zonder antibiotica toe te dienen of een kunstmatig dieet te ontwikkelen, dat ook kan worden toegepast op andere bladetende insecten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het voorbereiden en fokken van axeeninsecten met weefsel gekweekte zaailingen voor gastheer-darmmicrobiota-interactiestudies van de bladkever
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Insectendarmen worden gekoloniseerd door diverse bacteriën die de fysiologische eigenschappen van de gastheer diepgaand kunnen beïnvloeden. Het introduceren van een bepaalde bacteriestam in een axeeninsect is een krachtige methode om de microbiële darmfunctie te verifiëren en de mechanismen op te helderen die ten grondslag liggen aan interacties tussen darmmicroben en gastheer. Het toedienen van antibiotica of het steriliseren van eioppervlakken zijn twee veelgebruikte methoden om darmbacteriën van insecten te verwijderen. Naast de mogelijke nadelige effecten van antibiotica op insecten, gaven eerdere studies echter aan dat het voeren van antibiotica darmbacteriën niet kon elimineren. Kiemvrije kunstmatige diëten worden dus over het algemeen gebruikt om axeeninsecten te behouden, wat een vervelend en arbeidsintensief proces is dat niet volledig kan lijken op voedingscomponenten in natuurlijk voedsel. Hier wordt een efficiënt en eenvoudig protocol beschreven om axeenlarven van een bladkever (Plagiodera versicolora) te bereiden en te onderhouden. In het bijzonder werden oppervlakken van de kevereieren gesteriliseerd, waarna kiemvrije populierenbladeren werden gebruikt om axeenlarven op te voeden. De axeenstatus van de insecten werd verder bevestigd door middel van cultuurafhankelijke en cultuuronafhankelijke testen. Gezamenlijk, door het combineren van eierdesinfectie en kiemvrije teelt, werd een efficiënte en handige methode ontwikkeld om axeen P. versicolora te verkrijgen, een gemakkelijk overdraagbaar hulpmiddel voor andere bladetende insecten.
Inleiding
Net als bij zoogdieren is het spijsverteringskanaal van insecten een holte voor voedselvertering en -absorptie. De meeste insecten herbergen diverse commensale bacteriën die gedijen in hun darmen en leven van voeding geleverd door gastheren1. De darmcommensale gemeenschap heeft een diepgaande invloed op meerdere fysiologische processen bij insecten, waaronder voedselvertering en ontgifting 2,3,4, voeding en ontwikkeling 5,6,7, verdediging tegen pathogenen en p....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Insectenopfok
- Houd de P. versicolora populatie in een groeikamer op de conditie van 27 °C en 70 ± 5% relatieve vochtigheid met een fotoperiode van 16 h licht/8 h donker. Leg ze in geperforeerde plastic dozen met betegeld nat absorberend papier en voer ze verse populierentakken. Spuit schoon water op absorberend papier om vocht vast te houden en ververs de takken om de twee dagen.
- Isoleer volwassenen voor ovipositie na verpopping. Voer ze zachte bladeren om meer eieren te krijgen.
- Verzamel nieuw gelegde eieren (binnen 24 uur). Leg de eieren gedurende 60 uur op vochtig absorberend papier om axeenlarven te bereid....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De levensfasen van P. versicolora zijn weergegeven in figuur 1. Het volwassen mannetje is kleiner dan het volwassen vrouwtje (figuur 1A). In het veld clustert de kever zijn eieren op een blad; hier werden vier eieren losgemaakt van een blad (figuur 1B). De populierenstengelsegmenten en zaailingen die worden gebruikt voor het fokken van axeeninsecten zijn weergegeven in figuur 2. De darm van een.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Bereiding van kiemvrije larven en het verkrijgen van gnotobiotische larven door specifieke bacteriestammen opnieuw te introduceren, zijn krachtige methoden om de mechanismen die ten grondslag liggen aan gastheer-microbe-interacties op te helderen. Pas uitgekomen larven verkrijgen darmmicrobiota op twee belangrijke manieren: verticale overdracht van de moeder naar het nageslacht of horizontale acquisitie van broers en zussen en de omgeving34. De eerste kan worden vervuld door ouderlijke overdracht .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door de National Natural Science Foundation of China (31971663) en het Young Elite Scientists Sponsorship Program door CAST (2020QNRC001).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm spuitfilter | Millipore | SLGP033RB | |
| 1 mg/mL NAA-stockoplossing | a. Bereid 0.1 M NaOH-oplossing (los 0.8 g NaOH op in 200 mL gedistilleerd water). b. Voeg 0.2 g NAA toe in een 250 mL beker, voeg een beetje 0.1 M NaOH-oplossing toe tot NAA is opgelost en pas het eindvolume aan tot 200 mL met gedistilleerd water. c. Filter de oplossing om bacteriën te verwijderen met een 0.22 µm spuitfilter en een 50 mL steriele spuit, verpak de oplossing in 1.5 mL centrifugebuizen en bewaar bij -20 °C. | ||
| 1.5 mL microcentrifugebuisjes | Sangon Biotech | F600620 | |
| 10x PBS-stockoplossing | Biosharp Life Sciences | BL302A | |
| 2 M KOH-oplossing | Los 22.44 g KOH op (molecuulgewicht: 56.1) in 200 mL gedistilleerd water en autoclaveer het gedurende 20 min bij 121 °C. | ||
| 250 mL en 2.000 mL bekers | Shubo | sb16455 | |
| 50 mL steriele spuiten | Jinta | JT0125789 | |
| 500 mL maatcilinder | Shubo | sb1601 | |
| 50x TAE-stockoplossing | a. Los 242 g Tris en 18.612 g EDTA op in 700 mL gedistilleerd water. b. Pas de pH aan tot 7.8 met ongeveer 57.1 mL azijnzuur. c. Pas het eindvolume aan tot 1.000 mL. d. De stockoplossing werd verdund tot 1x TAE-buffer bij gebruik. | ||
| 75% ethanol | Xingheda trade | ||
| α-naftaleenazijnzuur (NAA) | Solarbio Life Sciences | 86-87-3 | |
| Absorbeerpapier | 22.3 cm x 15.3 cm x 9 cm | ||
| Azijnzuur | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Agar | Coolaber | 9002-18-0 | |
| Agarose | Biowest | 111860 | |
| Autoclaaf | Panasonic | MLS-3781L-PC | |
| Parelslag homogenisator | Jing Xin | XM-GTL64 | |
| DNA-extractiekit | MP Biomedicals | 116560200 | |
| EDTA | Saiguo Biotech | 1340 | |
| Filterpapier | Jiaojie | 70 mm diameter | |
| Gelelektroforese-eenheid | Bio-rad | 164-5052 | |
| Gel Signaal Green nucleïnezuurkleuring | TsingKe | TSJ003 | |
| Kiemvrije populierenzaailingen | Shan Xin populier uit Ludong University in Shandong Province | ||
| Golden Star Super PCR Master Mix (1,1×) | TsingKe | TSE101 | |
| Kweekkamer | Ruihua | HP400GS-C | |
| LB-agarmedium | a. Los 5 g tryptone, 5 g NaCl, 2.5 g gistextract op in 300 mL gedistilleerd water. b. Pas het eindvolume aan tot 500 mL, breng de oplossing over naar een 1.000 mL kegelfles en voeg 7,5 g agar toe. c. Autoclaveer het medium gedurende 20 min bij 121 °C. | ||
| Mini centrifuge | DRAGONLAB | D1008 | |
| MS basismedium | Coolaber | PM1121-50L | M0245 |
| MS vast medium voor kiemvrije populierenzaailingencultuur | a. Los 4.43 g MS basismediumpoeder en 30 g sucrose op in 800 mL gedistilleerd water. b. Pas de pH aan tot ongeveer 5.8 met 2 M KOH door een pH-meter. c. Pas het eindvolume aan tot 1.000 mL, verdeel in twee delen, breng over naar twee 1.000 mL kegelflessen en voeg 2.6 g agar per 500 mL toe. d. Autoclaveer gedurende 20 min bij 121 °C. | ||
| NanoDrop 1000 spectrofotometer | Thermo Fisher Scientific | ||
| Schilderkwast | 1 cm breedte, gebruikt om de eieren te verzamelen | ||
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PCR Thermo Cyclers | Eppendorf | 6331000076 | |
| Petrischalen | Supin | 90 mm diameter | |
| pH-meter | METTLER TOLEDO | FE20 | |
| Pipetten 0,2-2 µL | Gilson | ECS000699 | |
| Pipetten 100-1.000 µL | Eppendorf | 3120000267 | |
| Pipetten 20-200 µL | Eppendorf | 3120000259 | |
| Pipetten 2-20 µL | Eppendorf | 3120000232 | |
| Plantenweefselkweekcontainer | Chembase | ZP21 | 240 mL |
| Kunststof doos | 2,35 L | ||
| Kaliumhydroxide (KOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Primers voor het amplificeren van het bacteriële 16S rRNA-gen | Sangon Biotech | 27-F: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’, 1492R: 5’-ACGGATACCTTGTTACGAC-3’ | |
| Natriumchloride (NaCl) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Natriumhydroxide (NaOH) | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Stalen ballen | 0,25 mm | gebruikt om weefsels te malen | |
| Stereomicroscoop | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sucrose | Sinopharm Chemical Reagent Co. Ltd | ||
| Trans2K plus II DNA-marker | Transgene Biotech | BM121-01 | |
| Tris base | Bio |
Referenties
- Moran, N. A., Ochman, H., Hammer, T. J. Evolutionary and ecological consequences of gut microbial communities. Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 50 (1), 451-475 (2019).
- Warnecke, F., et al. M....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
