Method Article

In vitro Karakterisering van Histone Chaperones met behulp van Analytische, Pull-Down en Chaperoning Assays

DOI:

10.3791/63218

⸱

December 29th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Life Sciences, 2Regional Centre for Biotechnology, 3School of Biotechnology, KIIT University, 4Department of Molecular Biophysics and Biochemistry, Yale University, 5Department of Pharmacology, University of Vermont College of Medicine

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft een reeks methoden die analytische grootte-uitsluitingschromatografie omvatten om histon chaperone oligomerisatie en stabiliteit te bestuderen, pull-down assay om histon chaperone-histon interacties te ontrafelen, AUC om de stoichiometrie van de eiwitcomplexen te analyseren, en histon chaperoning assay om functioneel een vermeende histon chaperone in vitro te karakteriseren.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Histoneiwitten associëren zich met DNA om het eukaryote chromatine te vormen. De basiseenheid van chromatine is een nucleosoom, bestaande uit een histon octameer bestaande uit twee kopieën van de kern histonen H2A, H2B, H3 en H4, omwikkeld door het DNA. Het octameer bestaat uit twee kopieën van een H2A/H2B-dimeer en een enkele kopie van een H3/H4-tetrameer. De sterk geladen kern histonen zijn gevoelig voor niet-specifieke interacties met verschillende eiwitten in het cellulaire cytoplasma en de kern. Histon chaperones vormen een diverse klasse van eiwitten die histonen van het cytoplasma naar de kern brengen en hun afzetting op het DNA ondersteunen, waardoor het nucleosoomassemblageproces wordt ondersteund. Sommige histon chaperones zijn specifiek voor H2A / H2B of H3 / H4, en sommige functioneren als chaperones voor beide. Dit protocol beschrijft hoe in vitro laboratoriumtechnieken zoals pull-down assays, analytische grootte-uitsluitingschromatografie, analytische ultracentrifugatie en histon chaperoning assay in tandem kunnen worden gebruikt om te bevestigen of een bepaald eiwit functioneel is als een histon chaperone.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nucleosomen samengesteld uit DNA- en histoneiwitten vormen de structurele eenheid van chromatine en reguleren verschillende kritieke cellulaire gebeurtenissen. Nucleosomen worden dynamisch geherpositioneerd en gehermodelleerd om DNA toegankelijk te maken voor verschillende processen zoals replicatie, transcriptie en vertaling 1,2. Histonen die zeer basaal zijn, hebben de neiging om te interageren met zure eiwitten in het cellulaire milieu of ondergaan aggregatie, wat leidt tot verschillende cellulaire defecten 3,4,5. Een groep speciale eiwitten genaamd histon chaperones helpen het transport van histonen van het cytoplasma naar de kern en voorkomen afwijkende histon-DNA-aggregatiegebeurtenissen 6,7. Fundamenteel slaan de meeste histon chaperones histonen op en brengen ze over op DNA op fysiologische ionische sterkte, waardoor de vorming van nucleosomenwordt bevorderd 8,9. Sommige histon chaperones hebben een duidelijke voorkeur voor de histon oligomeren H2A/H2B of H3/H410.

Histon chaperones worden gekenmerkt op basis van hun vermogen om nucleosomen te assembleren afhankelijk of onafhankelijk van DNA-synthese11. Chromatine assembly factor-1 (CAF-1) is bijvoorbeeld afhankelijk, terwijl histonregulator A (HIRA) onafhankelijk is van DNA-synthese12,13. Evenzo is de nucleoplasminefamilie van histon chaperones betrokken bij spermachromatine-decondensatie en nucleosoomassemblage14. De nucleosoomassemblage-eiwit (NAP) familieleden vergemakkelijken de vorming van nucleosoomachtige structuren in vitro en zijn betrokken bij de shuttling van histonen tussen cytoplasma en nucleus15. Nucleoplasmineen en NAP-familie-eiwitten zijn beide functionele histon chaperones, maar delen geen structurele kenmerken. In wezen staat geen enkel structureel kenmerk de classificatie van een eiwit als een histon chaperone16 toe. Het gebruik van functionele en biofysische assays samen met structurele studies werken het beste bij het karakteriseren van histon chaperones.

Dit werk beschrijft biochemische en biofysische methoden om een eiwit te karakteriseren als een histon chaperonne die nucleosoomassemblage helpt. Eerst werd analytische grootte-uitsluitingschromatografie uitgevoerd om de oligomere status en stabiliteit van histon chaperones te analyseren. Vervolgens werd een pull-down assay uitgevoerd om de drijvende krachten en het competitieve karakter van histone chaperone-histone interacties te bepalen. De hydrodynamische parameters van deze interacties konden echter niet nauwkeurig worden berekend met behulp van analytische grootte-uitsluitingschromatografie vanwege de vorm van het eiwit en zijn complexen die hun migratie door de kolom beïnvloeden. Daarom werd analytische ultracentrifugatie gebruikt, die macromoleculaire eigenschappen in de oplossing biedt, waaronder nauwkeurig molecuulgewicht, de stoichiometrie van interactie en de vorm van de biologische moleculen. Eerdere studies hebben uitgebreid gebruik gemaakt van in vitro histon chaperoning assay om histon chaperones zoals yScS11617, DmACF18, ScRTT106p19, HsNPM120 functioneel te karakteriseren. Histon chaperoning assay werd ook gebruikt om de eiwitten functioneel te karakteriseren als histon chaperones.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Analytische grootte-uitsluitingschromatografie om de oligomere status en stabiliteit van histon chaperonnes op te helderen

  1. Analyse van de oligomere status van histon chaperones
    1. Breng een 24 ml analytische maat-uitsluitingschromatografie (SEC) kolom met 1,2 kolomvolume (CV), d.w.z. 28,8 ml ontgaste SEC-buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl en 1 mM β-mercaptoethanol (β-ME)] bij 4 °C (zie Materiaaltabel) in evenwicht.
      OPMERKING: Kolomtype, buffersamenstelling en buffer-pH kunnen worden geselecteerd op basis van het eiwit van belang. Het injectievolume van het monster mag niet hoger zijn dan 500 μL voor een kolom van 24 ml. Ook moet de kolomdruk onder de 5 MPa worden gehouden.
    2. Bereid uit een eiwitvoorraadoplossing met een hogere concentratie 500 μL eiwitmonster van 0,5 mg/ml in ontgaste SEC-buffer en injecteer dit in de vooraf gebalanceerde kolom met behulp van een injectielus van 500 μL. Laat de chromatografie lopen met een isocratisch debiet van 0,2-0,3 ml/min met de SEC-buffer bij 4 °C.
    3. Monitor het elutieprofiel van het eiwit door de absorptie te meten bij een golflengte van 280 nm. Bij het omgaan met eiwitten zonder aromatische residuen, meet dan de absorptie bij 214 nm.
    4. Gebruik het elutievolume van het eiwit om het geschatte molecuulgewicht in kDa te berekenen met behulp van de standaardkalibratiecurve21.
      OPMERKING: De kalibratiecurve wordt voorbereid door het retentievolume van bekende eiwitten met molecuulgewicht uit te zetten tegen het logboek van hun respectieve molecuulgewichten (log Mr), geëlueerd met behulp van dezelfde kolom.
  2. Analyse van de thermische stabiliteit van de histon chaperones
    1. Neem 500 μL van 0,5 mg/ml van het eiwitmonster bereid in ontgaste SEC-buffer (hetzelfde als gebruikt in 1.1.1) in afzonderlijke microcentrifugebuizen en verwarm elke buis tot een bepaalde temperatuur tussen 20 °C en 90 °C (20 °C, 40 °C, 60 °C en 90 °C) gedurende 10 minuten in een waterbad.
    2. Centrifugeer vervolgens de warmtebehandelde monsters bij 16.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C, verzamel het supernatant met een micropipette en injecteer elk monster afzonderlijk met behulp van een injectielus van 500 μL in de analytische kolom, vooraf in evenwicht gebracht met de SEC-buffer bij 4 °C.
    3. Laat de chromatografie lopen met een isocratisch debiet van 0,2-0,3 ml/min met de SEC-buffer bij 4 °C.
    4. Observeer de positie en hoogte van de elutiepieken en zoek naar het verschijnen van extra pieken voor de verschillende monsters.
  3. Analyse van de chemische stabiliteit van de histon chaperones
    1. Om de zoutstabiliteit van histon chaperones te onderzoeken, incubeer 500 μL van 0,5 mg/ ml eiwitmonster bereid in een Tris-buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 1 mM β-ME] aangevuld met toenemende concentraties NaCl (300 mM, 600 mM, 1 M, 1,5 M en 2 M) in afzonderlijke microcentrifugebuizen gedurende 30 minuten bij 4 °C. Centrifugeer de monsters bij 16.200 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en houd het supernatant vast.
    2. Laad vervolgens de eiwitmonsters afzonderlijk in verschillende NaCl-concentraties, met behulp van een injectielus van 500 μL in de analytische kolom die vooraf in evenwicht is gebracht met 1,2 CV (28,8 ml) van de respectieve buffer met toenemende NaCl-concentraties bij 4 °C.
    3. Laat de chromatografie uitvoeren met een isocratisch debiet van 0,2-0,3 ml/min met 1 CV (24 ml) van de respectieve buffer bij 4 °C.
    4. Observeer de positie en hoogte van elutiepieken en zoek naar het verschijnen van extra pieken voor de verschillende monsters.
    5. Evenzo incubeer voor ureumstabiliteitsanalyse 500 μL eiwitmonster van 0,5 mg / ml eiwitmonster bereid in een Tris-buffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5) en 1 mM β-ME] aangevuld met toenemende ureumconcentraties (1 M, 2 M, 3 M, 4 M en 5 M) in afzonderlijke microcentrifugebuizen gedurende 16 uur bij kamertemperatuur. Centrifugeer de monsters bij 16.200 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en houd het supernatant vast.
    6. Laad vervolgens de met ureum behandelde eiwitmonsters afzonderlijk met behulp van een injectielus van 500 μL in de analytische kolom die vooraf in evenwicht is gebracht met 1,2 CV (28,8 ml) van de overeenkomstige buffer met verschillende ureumconcentraties bij kamertemperatuur.
    7. Laat de chromatografie lopen met een isocratisch debiet van 0,2-0,3 ml/min met 1 CV (24 ml) van de betreffende buffer bij kamertemperatuur.
      LET OP: Voer de experimenten niet uit met buffer die ureum bevat bij een lagere temperatuur, omdat ureum de neiging heeft om te kristalliseren en de kolom te beschadigen.
    8. Observeer de positie en hoogte van de elutiepieken en zoek naar het verschijnen van extra pieken voor de verschillende monsters.

2. Op zoutgradiënt gebaseerde pull-down assays om het type interacties te begrijpen dat bijdraagt aan de complexe vorming tussen histon oligomeren en een histon chaperone

  1. Pipetteer voor elke reactie van pull-down assay 40 μL Ni-NTA-hars in een spinkolom en was met steriel dubbel gedestilleerd water. Vervolgens moet de hars in evenwicht worden gebracht met 100 CV (4 ml) equilibratiebuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 10 mM imidazool, 10 μg/ml BSA en 1 mM β-ME] (zie materiaaltabel).
    OPMERKING: Pull-down kan ook worden uitgevoerd in een 1,5 ml microcentrifugebuis.
  2. Bereid het monster door 5 μM van het His-tagged histon chaperone te mengen met 20 μM histon H2A/H2B dimeer of H3/H4 tetrameer in de equilibratiebuffer. Incubeer het monster op ijs gedurende 1 uur.
    OPMERKING: H2A/H2B-dimeer en H3/H4-tetrameer worden bereid uit recombinante menselijke histonen21 en de integriteit van de oligomeren wordt bevestigd op basis van de geschatte moleculaire massa's door analytische ultracentrifugatie (AUC). Dezelfde histon oligomeren zijn gebruikt voor alle onderstaande experimenten.
  3. Laad de monsters in afzonderlijke voorgebalanceerde spinkolommen met Ni-NTA-hars uit stap 2.1, elk gelabeld voor een bepaalde zoutconcentratie, en houd de kolommen gedurende 30 minuten bij 4 °C. Centrifugeer de kolommen bij 1000 x g gedurende 1 min.
  4. Was vervolgens de kolommen met 100 CV (4 ml) wasbuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 50 mM imidazool, 0,2% Tween-20 en 1 mM β-ME] met verschillende zoutconcentraties (d.w.z. 300 mM, 500 mM, 600 mM, 700 mM, 800 mM, 900 mM en 1 M NaCl). Was elke kolom met een buffer met een bepaalde zoutconcentratie.
  5. Elueerde na de zoutwasstap het eiwit uit de verschillende kolommen met behulp van 100 μL elutiebuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 300 mM imidazool en 1 mM β-ME].
  6. Onderwerp vervolgens de geëlueerde monsters aan 18% SDS-PAGE22 en visualiseer de gel na kleuring met Coomassie Brilliant Blue R250 (zie Materiaaltabel). Als alternatief kunt u de hars rechtstreeks op de SDS-PAGE-gel laden in plaats van het gebonden eiwit uit de Ni-NTA-hars te elueren.
    OPMERKING: Equilibratie-, was- en elutiebuffersamenstellingen en pH kunnen worden gewijzigd afhankelijk van het eiwit van belang.

3. Competitieve pull-down assay om de voorkeur van een histone chaperone voor H2A / H2B of H3 / H4 te identificeren

  1. Spinkolom voorbereiden zoals beschreven in stap 2.1
  2. Incubeer 5 μM van de histon chaperone met 20 μM H2A/H2B dimeer in 300 μL equilibratiebuffer (bereid in stap 2.1) gedurende 30 minuten op ijs.
    OPMERKING: De verhouding van histon oligomeer tot histon chaperone in de reactie kan worden gekozen op basis van bekende bindende stoichiometriegegevens; gebruik een vijfvoudige overtollige histon als er geen informatie beschikbaar is.
  3. Centrifugeer het histon chaperone-H2A/H2B complex bij 16.200 x g gedurende 5 min bij 4 °C om eventuele neerslag te verwijderen. Laad vervolgens het monster op de spinkolom die vooraf in evenwicht is gebracht met de equilibratiebuffer (bereid in stap 2.1) en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  4. Was de kolom met 100 CV (4 ml) wasbuffer [20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 300 mM NaCl, 50 mM imidazol, 0,2% Tween-20 en 1 mM β-ME] om overtollig H2A/H2B-dimeer te verwijderen. Meng vervolgens het histon chaperone-H2A/H2B complex met 20-60 μM H3/H4 tetrameer en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
  5. Spoel de kolom opnieuw met 100 CV (4 ml) wasbuffer (bereid in stap 3.4) om elk ongebonden H3/H4-tetrameer te verwijderen en eluut het monster met behulp van elutiebuffer (bereid in stap 2.5). Onderwerp de geëlueerde monsters aan 18% SDS-PAGE en visualiseer na het kleuren met Coomassie Brilliant Blue R250.
    OPMERKING: De test kan worden omgekeerd, waarbij eerst H3 / H4-tetrameer kan worden gemengd met de chaperonne, het complex kan binden aan Ni-NTA-kralen en het complex vervolgens kan worden geïncubeerd met verschillende concentraties H2A / H2B-dimeer.

4. Analytische ultracentrifugatie - sedimentatiesnelheid (AUC-SV) experimenten om de bindende stoichiometrie tussen histon chaperones en histonen te analyseren

  1. Monstervoorbereiding voor AUC
    1. Dialyseer het gereconstitueerde histon H2A/H2B dimeer, H3/H4 tetrameer en de histon chaperone afzonderlijk door een 7 kDa cut-off dialysebuis23, tegen een dialysebuffer [20 mM Tris (pH 7,5), 300 mM NaCl en 1 mM β-ME] (zie Materiaaltabel). Om achtergrondfouten als gevolg van buffermismatch te minimaliseren, voert u dialyse uitgebreid uit tegen de dialysebuffer, bij voorkeur drie keer over een periode van 24 uur.
      OPMERKING: De initiële OD280 van de eiwitmonsters moet een twee tot een drievoudig hogere waarde hebben om een uiteindelijke OD280 van 0,3-0,5 te bereiken. Dit wordt in wezen gedaan om de effecten van verdunning teniet te doen.
    2. Zuiver H2A/H2B dimeer, H3/H4 tetrameer en de histon chaperone individueel met de dialysebuffer, met behulp van analytische grootte-uitsluiting chromatografie (zoals vermeld in stap 1). Sla de buffer op van de run om later verdere verdunningen voor te bereiden en als referentie in de AUC-cel te gebruiken.
  2. Monster laden voor AUC
    1. Meng de gezuiverde eiwitten in een eindvolume van 450 μL met behulp van dialysebuffer uit stap 4.1.1 om een OD280 van 0,3-0,6 te bereiken. Meng de histon chaperone met H2A/H2B dimeer of H3/H4 tetrameer voor complexe vorming in afzonderlijke reactiebuizen. Incubeer de eiwitmengsels gedurende 2-3 uur.
      OPMERKING: Als alternatief kunnen sedimentatiegegevens worden verkregen met een interferentie-optisch scansysteem in de analytische ultracentrifuge. Afzonderlijk, voor het mengen van gezuiverde eiwitten, fixeert u de histon chaperoneconcentratie en incubeert u deze met toenemende concentraties van de histon-oligomeren om de exacte stoichiometrie te verkrijgen.
    2. Monteer de cel met een dubbel sectormiddenstuk en kwartsvensters voor het AUC-SV-experiment met behulp van een absorptiedetector van de analytische ultracentrifuge zoals eerder in detail beschreven24.
    3. Vul 400 μL van de monsteroplossing en 420 μL dialysebuffer in de twee sectoren (respectievelijk monster- en referentiesectoren) van de cel.
      OPMERKING: In de referentiesector wordt een groter volume buffer gebruikt om de referentiemeniscus boven de meniscus van het monster te houden. Als u echter een optisch interferentiesysteem gebruikt, vult u de twee sectoren met hetzelfde volume.
    4. Weeg en balanceer de cellen nauwkeurig en laad ze in een titanium rotor met vier plaatsen (zie Materiaaltabel). Lijn de cellen uit met behulp van de markeringen aan de onderkant van de cellen en de rotor. Laad de rotor in de centrifuge, sluit het deksel en laat een vacuüm ontwikkelen totdat de druk daalt tot minder dan 15 micron Hg en de rotortemperatuur stabiliseert tot 20 °C (duurt meestal 2-2,5 uur).
      OPMERKING: AUC-bedrijfsparameters omvatten experimentele temperatuur, rotorsnelheid, het interval tussen scans en het aantal scans dat moet worden verzameld. In het geval van SV-experimenten wordt het scaninterval gegeven op basis van de moleculaire massa van het eiwit; kleinere eiwitten vereisen grotere tijdsintervallen tussen de scans. De rotorsnelheid wordt ook ingesteld op basis van de verwachte moleculaire massa van het eiwit en het experiment wordt uitgevoerd bij 20 °C. De absorptiegegevens worden gemonitord bij 280 nm.
    5. Om de exacte stoichiometrie te verkrijgen, houdt u de histon chaperoneconcentratie constant en incubeert u met toenemende concentraties histon oligomeren om verzadiging te bereiken.
  3. AUC data-analyse
    1. Voer de gegevensanalyse uit zoals eerder beschreven25. Bereken in het kort de dichtheid en viscositeit voor de buffercomponenten met behulp van het programma SEDNTERP26 (zie Materiaaltabel). Bereken op dezelfde manier het gedeeltelijke specifieke volume van het eiwit op basis van de aminozuursamenstelling, ook met behulp van SEDNTERP.
    2. Laad de gegevens van de AUC-machine in het programma SEDFIT27 en definieer de meniscus (rode lijn), de celonder (blauwe lijn) en gegevensanalysegrenzen (groene lijnen). Kies continue C('s) verdeling als model.
    3. Stel vervolgens een resolutiemaximum in tot 100; ingestelde sedimentatiecoëfficiënt (s), s min: 0 en s max: 10-15; stel de wrijvingsverhouding in eerste instantie in op 1,2 en kies ervoor om te zweven om de verhouding uit de gegevens af te leiden; stel het betrouwbaarheidsniveau (F-ratio; die de omvang van de regularisatie bepaalt) in op 0,68 voor 1 sigma regularisatie; stel partiële specifieke volume-, bufferdichtheids- en bufferviscositeitswaarden in zoals verkregen uit SEDNTERP.
    4. Druk op RUN om de software toe te staan de Lamm-vergelijking27 op te lossen. Pas de parameters aan als er een significante gegevensafwijking is. Nadat u de parameters hebt aangepast, drukt u op FIT om alle parameters te verfijnen. Beoordeel de kwaliteit van de pasvorm op basis van de RMSD-waarde (root-mean-square deviation), die minder dan 0,01 signaaleenheden moet zijn.
    5. Schat de moleculaire massa's van de pieken door de optie te kiezen: toon piek "Mw in c (s)" in de weergavefunctie van de hoofdwerkbalk, die informatie zal geven over de 's' van het molecuul / complex.

5. Plasmid supercoiling assay om histon chaperoning functie te bevestigen

  1. Nucleosoom assemblage reactie
    1. Meng 2 μM H3/H4 tetrameer en 4 μM H2A/H2B dimeer met toenemende concentraties van de histon chaperone (1-6 μM) in een assemblagebuffer [20 mM Tris HCl (pH 7,5), 1 mM DTT, 1 mM MgCl2, 0,1 mg/ml BSA en 100 mM NaCl] tot een eindvolume van 50 μL. Incubeer het mengsel bij 4 °C gedurende 30 min.
    2. Gelijktijdig, in een afzonderlijke reactie, voorbehandeling 500 ng van de negatief gesupercoileerde pUC19 plasmide met 1 μg topoisomerase I enzym (zie materiaaltabel) in de assemblagebuffer in een eindvolume van 50 μL en incubeer bij 30 °C gedurende 30 minuten.
      OPMERKING: Topoisomerase I ontspant het supercoiled dubbelstrengs plasmide-DNA door een enkelstrengs nick te genereren. Een topoisomerase I-enzym van eukaryote oorsprong, zoals het in de handel verkrijgbare tarwekiem topoisomerase I of recombinant uitgedrukte Drosophila melanogaster topoisomerase I, zou kunnen worden gebruikt.
    3. Combineer vervolgens het H3/H4-tetrameer, H2A/H2B-dimeer, histon chaperonnemengsel (uit stap 5.1.1), het ontspannen plasmide-DNA-reactiemengsel (uit stap 5.1.2) en incubeer verder bij 30 °C gedurende 90 minuten.
      OPMERKING: Stel twee controlereacties in voor de test; de ene met de histon chaperone en het relaxte plasmide DNA (maar niet de histonen) en de andere met de histon oligomeren en het relaxte plasmide DNA (maar niet de histon chaperone).
    4. Stop de assemblagereactie door 100 μL 2x stopbuffer (40 mM EDTA, 2% SDS en 0,4 mg/ml proteïnase K) toe te voegen en gedurende 30 minuten bij 37 °C te incuberen.
      OPMERKING: Stopbuffer deproteiniseert het plasmide-DNA door denaturatie en proteolyse van gebonden histonen.
  2. Fenol-chloroform extractie en ethanol precipitatie
    1. Voeg een gelijk volume Tris-verzadigd fenol toe aan de buis die het reactiemengsel uit stap 5.1.4 bevat en meng goed, gevolgd door centrifugatie bij 16.200 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Verzamel voorzichtig de bovenste waterige fase met het plasmide-DNA met een micropipette en meng met een gelijk volume chloroform. Vortex het mengsel en centrifugeer bij 16.200 x g gedurende 10 min bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Isoamylalcohol kan in deze stap worden opgenomen om een wazige interface tussen de waterige en organische fasen te voorkomen.
    3. Verzamel vervolgens de bovenste waterige fase, voeg 1/10e volume van 3 M natriumacetaat (pH 5,5) en 2,5 volumes ijskoude ethanol toe (zie Materiaaltabel). Meng de oplossing goed door de buis 3-4 keer om te keren en bewaar het mengsel gedurende 30 minuten in een vriezer van -20 °C voor volledige precipitatie van het plasmide-DNA.
    4. Centrifugeer het monster uit stap 5.2.3 bij 16200 x g gedurende 10 minuten en gooi het supernatant voorzichtig weg. Houd de buizen open bij kamertemperatuur totdat zelfs sporenhoeveelheden ethanol verdampen, waardoor het neergeslagen plasmide-DNA in de buis achterblijft.
  3. Voer de agarose gel-elektroforese uit om het plasmide supercoiling-effect te observeren.
    1. Los het neergeslagen plasmide-DNA uit stap 5.2.4 op in steriel dubbel gedestilleerd water.
    2. Los de monsters op een 1% agarose gel in 1x Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer (40 mM Tris, 20 mM azijnzuur en 1 mM EDTA) (zie Tabel van materialen).
    3. Kleur de gel met 0,2-0,5 μg / ml concentratie ethidiumbromide en observeer onder UV om de DNA-banden op de gel te visualiseren.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het recombinante N-terminale nucleoplasminedomein van het eiwit FKBP53 uit Arabidopsis thaliana werd onderworpen aan analytische SEC. Het elutiepiekvolume werd uitgezet tegen de standaardcurve om de oligomere toestand ervan te identificeren. De analytische SEC-resultaten toonden aan dat het domein bestaat als een pentameer in oplossing, met een geschatte molecuulmassa van 58 kDa (figuur 1A, B). Verder werd het nucleoplasminedomein geanalyseerd op thermische en chemi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk demonstreert en valideert een uitgebreide reeks protocollen voor de biochemische en biofysische karakterisering van een vermeende histon chaperonne. Hierin werden recombinant tot expressie gebrachte en gezuiverde NAP-familie-eiwitten, AtNRP1 en AtNRP2, en het N-terminale nucleoplasminedomein van AtFKBP53 gebruikt om de protocollen te demonstreren. Dezelfde reeks experimenten zou heel goed kunnen worden gebruikt om de functionele kenmerken van voorheen niet-gekarakteriseerde histon chaperones van elk organisme af...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Er werd geen belangenverstrengeling gemeld.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De extramurale subsidies aan Dileep Vasudevan van de Science and Engineering Research Board, government of India [CRG/2018/000695/PS] en het Department of Biotechnology, Ministry of Science and Technology, Government of India [BT/INF/22/SP33046/2019], evenals de intramurale steun van het Institute of Life Sciences, Bhubaneswar worden zeer erkend. We bedanken mevrouw Sudeshna Sen en mevrouw Annapurna Sahoo voor hun hulp bij de voorbereiding van histon. De gesprekken met onze collega's Dr. Chinmayee Mohapatra, Mr. Manas Kumar Jagdev en Dr. Shaikh Nausad Hossain worden ook erkend.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Azijnzuur (glaciaal)SigmaA6283
AcrylamideMP Biomedicals814326
AgaroseMP Biomedicals193983
AKTA Pure 25M FPLCCytiva29018226Instrument voor eiwitzuivering
Ammoniumpersulfaat (APS)SigmaA3678
An-60Ti rotorBeckman Coulter361964Rotor voor analytische ultracentrifugatie
Bovine serum albumine (BSA)SigmaA7030
ChloroformSigmaC2432
Coomassie briljantblauw R 250Sigma1.15444
Dialysebuis (7 kDa cut-off)Thermo Fisher68700Voor dialyse van eiwitmonsters
Dithiothreitol (DTT)MP Biomedicals100597
DNA Loading DyeNew England BiolabsB7025S
EDTA dinatriumzoutMP Biomedicals194822
Elektronische balansShimadzuATX224R
EthanolSigmaE7023
Ethidiumbromide (EtBr)SigmaE8751
Gel Doc SysteemBio-Rad12009077Voor het beeldvormen van gels na kleuring
Horizontaal gelelektroforeseapparaatBio-Rad1704405Instrument voor agarose gelelektroforese
Zoutzuur (HCl)Sigma320331
ImidazoolMP Biomedicals102033
Magnesiumchloride (MgCl2)SigmaM8266
MicropipettenEppendorfZ683779Voor het pipetteren van micro-volumes
Mini-PROTEAN elektroforesesysteemBio-Rad1658000Instrument voor SDS-PAGE
N,N-methyleen-bis-acrylamideMP Biomedicals800172
Nano dropThermo FisherND-2000Voor het meten van eiwit- en DNA-concentraties
Ni-NTA agaroseInvitrogenR901-15Harskralen voor pull-down assay
Optima AUC analytische ultracentrifugeBeckman CoulterB86437Instrument voor analytische ultracentrifugatie
pH MeterMettler ToledoMT30130863
FenolSigmaP4557
Plasmid isolatiekitQiagen27104
Proteinase KSigma-Aldrich1.07393
pUC19Thermo FisherSD0061Plasmid voor supercoiling assay
Gekoelde hogesnelheidscentrifugeThermo Fisher75002402
SDS-PAGE eiwitmarkerBio-Rad1610317
SEDFITGratis softwareprogramma voor analyse van analytische ultracentrifugatiegegevens
SEDNTERPGratis softwareprogramma om de viscositeit en dichtheid van buffer en partiële specifieke volume van een eiwit te schatten
SigmaPrep Spin ColumnsSigmaSC1000Voor pull-down assay
NatriumacetaatSigmaS2889
Natriumchloride (NaCl)MerckS9888
Natriumdodecylsulfaat (SDS)MP Biomedicals102918
Superdex 200 Increase 10/300 GLCytiva28990944Kolom voor analytische exclussiechromatografie
Superdex 75 Increase 10/300 GLCytiva29148721Kolom voor analytische exclussiechromatografie
TEMEDSigma1.10732
Topoisomerase IInspiralisWGT102Enzym gebruikt in plasmid supercoiling assay
Tris baseMerckT1503
Tween-20SigmaP1379
UreaMP Biomedicals191450
WaterbadNüveNB 5Voor warmtebehandeling van eiwitmonsters
β-mercaptoethanol (β-ME)SigmaM6250

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hübner, M. R., Eckersley-Maslin, M. A., Spector, D. L. Chromatin organization and transcriptional regulation. Current Opinion in Genetics and Development. 23 (2), 89-95 (2013).
  2. Lai, W. K. M., Pugh, B. F. Understanding nucleosome dynamics and their links to gene expression and DNA replication. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 18 (9), 548-562 (2017).
  3. Kim, U. J., Han, M., Kayne, P., Grunstein, M. Effects of histone H4 depletion on the cell cycle and transcription of Saccharomyces cerevisiae. EMBO Journal. 7 (7), 2211-2219 (1988).
  4. Prado, F., Aguilera, A. Partial depletion of histone H4 increases homologous recombination-mediated genetic instability. Molecular and Cellular Biology. 25 (4), 1526-1536 (2005).
  5. Meeks-Wagner, D., Hartwell, L. H. Normal stoichiometry of histone dimer sets is necessary for high fidelity of mitotic chromosome transmission. Cell. 44 (1), 43-52 (1986).
  6. Groth, A., et al. Human Asf1 regulates the flow of S phase histones during replicational stress. Molecular Cell. 17 (2), 301-311 (2005).
  7. Laskey, R. A., Honda, B. M., Mills, A. D., Finch, J. T. Nucleosomes are assembled by an acidic protein which binds histones and transfers them to DNA. Nature. 275 (5679), 416-420 (1978).
  8. Das, C., Tyler, J. K., Churchill, M. E. A. The histone shuffle: histone chaperones in an energetic dance. Trends in Biochemical Sciences. 35 (9), 476-489 (2010).
  9. Akey, C. W., Luger, K. Histone chaperones and nucleosome assembly. Current Opinion in Structural Biology. 13 (1), 6-14 (2003).
  10. De Koning, L., Corpet, A., Haber, J. E., Almouzni, G. Histone chaperones: An escort network regulating histone traffic. Nature Structural and Molecular Biology. 14 (11), 997-1007 (2007).
  11. Eitoku, M., Sato, L., Senda, T., Horikoshi, M. Histone chaperones: 30 years from isolation to elucidation of the mechanisms of nucleosome assembly and disassembly. Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (3), 414-444 (2008).
  12. Quivy, J. P., Grandi, P., Almouzni, G. Dimerization of the largest subunit of chromatin assembly factor 1: importance in vitro and during Xenopus early development. EMBO Journal. 20 (8), 2015-2027 (2001).
  13. Ray-Gallet, D., et al. HIRA is critical for a nucleosome assembly pathway independent of DNA synthesis. Molecular Cell. 9 (5), 1091-1100 (2002).
  14. Frehlick, L. J., Eirín-López, J. M., Ausió, J. New insights into the nucleophosmin/nucleoplasmin family of nuclear chaperones. Bioessays. 29 (1), 49-59 (2007).
  15. Ito, T., Bulger, M., Kobayashi, R., Kadonaga, J. T. Drosophila NAP-1 is a core histone chaperone that functions in ATP-facilitated assembly of regularly spaced nucleosomal arrays. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 3112-3124 (1996).
  16. Elsässer, S. J., D'Arcy, S. Towards a mechanism for histone chaperones. Biochimica et Biophysica Acta. 1819 (3-4), 211-221 (2013).
  17. Rodríguez-Campos, A., Koop, R., Faraudo, S., Beato, M. Transcriptionally competent chromatin assembled with exogenous histones in a yeast whole cell extract. Nucleic Acids Research. 32 (13), 111(2004).
  18. Levenstein, M. E., Kadonaga, J. T. Biochemical analysis of chromatin containing recombinant Drosophila core histones. Journal of Biological Chemistry. 277 (10), 8749-8754 (2002).
  19. Huang, S., et al. Rtt106p is a histone chaperone involved in heterochromatin-mediated silencing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (38), 13410-13415 (2005).
  20. Swaminathan, V., Kishore, A. H., Febitha, K. K., Kundu, T. K. Human histone chaperone nucleophosmin enhances acetylation-dependent chromatin transcription. Molecular and Cellular Biology. 25 (17), 7534-7545 (2005).
  21. Singh, A. K., Datta, A., Jobichen, C., Luan, S., Vasudevan, D. AtFKBP53: A chimeric histone chaperone with functional nucleoplasmin and PPIase domains. Nucleic Acids Research. 48 (3), 1531-1550 (2020).
  22. Scofield, B. T. K. H. Protein Electrophoresis. , (2012).
  23. Andrew, S. M., Titus, J. A., Zumstein, L. Dialysis and concentration of protein solutions. Current Protocols in Toxicology, Appendix 3. , 1-5 (2002).
  24. Balbo, A., Zhao, H., Brown, P. H., Schuck, P. Assembly, loading, and alignment of an analytical ultracentrifuge sample cell. Journal of Visualized Experiments. (33), e1530(2009).
  25. Padavannil, A., Brautigam, C. A., Chook, Y. M. Molecular size analysis of recombinant importin-histone complexes using analytical ultracentrifugation. Bio-protocol. 10 (10), 3625(2019).
  26. Zhao, H., Brautigam, C. A., Ghirlando, R., Schuck, P. Overview of current methods in sedimentation velocity and sedimentation equilibrium analytical ultracentrifugation. Current Protocols in Protein Science. , Chapter 20, Unit20.12 (2013).
  27. Schuck, P. Size-distribution analysis of macromolecules by sedimentation velocity ultracentrifugation and Lamm equation modelling. Biophysical Journal. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  28. Kumar, A., Kumar Singh, A., Chandrakant Bob de, R., Vasudevan, D. Structural characterization of Arabidopsis thaliana NAP1-related protein 2 (AtNRP2) and comparison with its homolog AtNRP1. Molecules. 24 (12), 2258(2019).
  29. Liu, W. H., Roemer, S. C., Port, A. M., Churchill, M. E. A. CAF-1-induced oligomerization of histones H3/H4 and mutually exclusive interactions with Asf1 guide H3/H4 transitions among histone chaperones and DNA. Nucleic Acids Research. 45 (16), 9809(2017).
  30. Bowman, A., et al. The histone chaperones Vps75 and Nap1 form ring-like, tetrameric structures in solution. Nucleic Acids Research. 42 (9), 6038-6051 (2014).
  31. Newman, E. R., et al. Large multimeric assemblies of nucleosome assembly protein and histones revealed by small-angle X-ray scattering and electron microscopy. Journal of Biological Chemistry. 287 (32), 26657-26665 (2012).
  32. Edlich-Muth, C., et al. The pentameric nucleoplasmin fold is present in Drosophila FKBP39 and a large number of chromatin-related proteins. Journal of Molecular Biology. 427 (10), 1949-1963 (2015).
  33. Franco, A., et al. Structural insights into the ability of nucleoplasmin to assemble and chaperone histone octamers for DNA deposition. Scientific Reports. 9 (1), 9487(2019).
  34. Xiao, H., Jackson, V., Lei, M. The FK506-binding protein, Fpr4, is an acidic histone chaperone. FEBS Letters. 580 (18), 4357-4364 (2006).
  35. Graziano, G. Role of hydrophobic effect in the salt-induced dimerization of bovine beta-lactoglobulin at pH 3. Biopolymers. 91 (12), 1182-1188 (2009).
  36. Burgess, R. J., Zhang, Z. Histone chaperones in nucleosome assembly and human disease. Nature Structural and Molecular Biology. 20 (1), 14-22 (2013).
  37. Donham, D. C., Scorgie, J. K., Churchill, M. E. The activity of the histone chaperone yeast Asf1 in the assembly and disassembly of histone H3/H4-DNA complexes. Nucleic Acids Research. 39 (13), 5449-5458 (2011).
  38. Avvakumov, N., Nourani, A., Côté, J. Histone chaperones: Modulators of chromatin marks. Molecular Cell. 41 (5), 502-514 (2011).
  39. Ransom, M., Dennehey, B. K., Tyler, J. K. Chaperoning histones during DNA replication and repair. Cell. 140 (2), 183-195 (2010).
  40. Chu, X., et al. Importance of electrostatic interactions in the association of intrinsically disordered histone chaperone Chz1 and histone H2A.Z-H2B. PLoS Computational Biology. 8 (7), 1002608(2012).
  41. Heidarsson, P. O., et al. Disordered proteins enable histone chaperoning on the nucleosome. bioRxiv. , (2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Histone ChaperonesChromatin AssemblyPull Down AssayAnalytical UltracentrifugationSize Exclusion ChromatographyPlasmid Super CoilingNucleosome AssemblyH2A H2B DimerH3 H4 TetramerProtein DNA Interaction

Related Articles