Methodenartikel

Functionele beoordeling van kinesine-7 CENP-E in spermatocyten met behulp van in vivo remming, immunofluorescentie en flowcytometrie

DOI:

10.3791/63271

⸱

28 december 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Genetics, The School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, 2Key Laboratory of Stem Cell Engineering and Regenerative Medicine, Fujian Province University, 3Fujian Obstetrics and Gynecology Hospital, 4Medical Research Center, Fujian Maternity and Child Health Hospital, Affiliated Hospital of Fujian Medical University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit artikel meldt een in vivo remming van CENP-E door middel van abdominale chirurgie en testiculaire injectie van GSK923295, een waardevol model voor mannelijke meiotische deling. Met behulp van de immunofluorescentie, flowcytometrie en transmissie-elektronenmicroscopietests tonen we aan dat CENP-E-remming resulteert in chromosoomafwijking en genoominstabiliteit in spermatocyten van muizen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij eukaryoten is meiose essentieel voor genoomstabiliteit en genetische diversiteit in seksuele voortplanting. Experimentele analyses van spermatocyten in teelballen zijn van cruciaal belang voor het onderzoek naar spindelassemblage en chromosoomsegregatie bij mannelijke meiotische deling. De spermatocyt van de muis is een ideaal model voor mechanistische studies van meiose, maar de effectieve methoden voor de analyse van spermatocyten ontbreken. In dit artikel wordt een praktische en efficiënte methode beschreven voor de in vivo remming van kinesine-7 CENP-E in spermatocyten van muizen. Een gedetailleerde procedure voor testiculaire injectie van een specifieke remmer GSK923295 door middel van abdominale chirurgie bij 3 weken oude muizen wordt gepresenteerd. Verder wordt hier een reeks protocollen beschreven voor weefselverzameling en -fixatie, hematoxyline-eosinekleuring, immunofluorescentie, flowcytometrie en transmissie-elektronenmicroscopie. Hier presenteren we een in vivo remmingsmodel via buikchirurgie en testiculaire injectie, dat een krachtige techniek zou kunnen zijn om mannelijke meiose te bestuderen. We tonen ook aan dat CENP-E-remming resulteert in chromosoomafwijking en metafasestilstand in primaire spermatocyten tijdens meiose I. Onze in vivo remmingsmethode zal mechanistische studies van meiose vergemakkelijken, dienen als een nuttige methode voor genetische modificaties van mannelijke kiembanen en een licht werpen op toekomstige klinische toepassingen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Meiose is een van de belangrijkste, zeer rigide, evolutionair geconserveerde gebeurtenissen in eukaryote organismen en is essentieel voor gametogenese, seksuele voortplanting, genoomintegriteit en genetische diversiteit 1,2,3. Bij zoogdieren ondergaan de geslachtscellen twee opeenvolgende celdelingen, meiose I en II, na een enkele ronde DNA-replicatie. In tegenstelling tot zusterchromatiden bij mitose, paren gedupliceerde homologe chromosomen en scheiden zich in twee dochtercellen tijdens meiose I 4,5. Bij meiose II trekken zusterchromatiden uit elkaar en scheiden zich om haploïde gameten te vormen zonder DNA-replicatie6. Fouten in een van de twee meiotische delingen, waaronder spindelassemblagedefecten en chromosoommissegregatie, kunnen leiden tot het verlies van gameten, steriliteit of aneuploïdiesyndromen 7,8,9.

Accumulerende studies hebben aangetoond dat kinesine-familiemotoren een cruciale rol spelen bij de regulatie van chromosoomuitlijning en -segregatie, spindelassemblage, cytokinese en celcyclusprogressie in zowel mitotische als meiotische cellen10,11,12. Kinesine-7 CENP-E (Centromeer eiwit E) is een plus-end-gerichte kinetochoormotor die nodig is voor chromosoomcongres, chromosoomtransport en -uitlijning, en de regulatie van spindelassemblagecontrolepunt in mitose 13,14,15,16,17,18. Tijdens meiose leidt CENP-E-remming door de specifieke remmer GSK923295 tot celcyclusstilstand, chromosoomafwijking, spindeldesorganisatie en genoominstabiliteit in spermatogene cellen19. De lokalisatiepatronen en dynamiek van CENP-E bij de centromeren van delende spermatocyten geven aan dat CENP-E interageert met kinetochooreiwitten voor de sequentiële assemblage van centromeren tijdens meiose I20,21. In eicellen is CENP-E vereist voor chromosoomuitlijning en de voltooiing van meiose I13,22,23. Antilichamen of morfolino-injectie van CENP-E resulteert in verkeerd uitgelijnde chromosomen, abnormale kinetochoororiëntatie en meiose die ik arresteer in zowel muis- als Drosophila-eicellen 23. Vergeleken met de essentiële rollen van CENP-E bij mitose, blijven de functies en mechanismen van CENP-E in meiose grotendeels onbekend. Gedetailleerde mechanismen van CENP-E in chromosoomcongres en genoomstabiliteit in mannelijke meiotische cellen moeten nog worden opgehelderd.

Spermatogenese is een complex en langdurig fysiologieproces, waarbij sequentiële spermatogoniaproliferatie, meiose en spermiogenese betrokken zijn. Daarom is het hele proces buitengewoon moeilijk om in vitro te worden gereproduceerd bij zoogdieren en andere soorten24,25. Het is onmogelijk om spermatocytendifferentiatie te induceren na het pachyteenstadium in vitro. Studies naar mannelijke meiotische delingen zijn over het algemeen beperkt gebleven tot experimentele analyses van vroege meiotische profase25,26. Ondanks vele technologische inspanningen, waaronder kortetermijncultuur van spermatocyten27,28 en orgaankweekmethoden25, zijn er weinig effectieve methoden om mannelijke meiotische deling te bestuderen. Bovendien resulteert genetische deletie van essentiële genen meestal in ontwikkelingsstilstand en embryonale letaliteit. Muizenembryo's zonder CENP-E kunnen bijvoorbeeld niet implanteren en kunnen zich niet ontwikkelen na implantatie29, wat een obstakel is in mechanistische studies van CENP-E in meiose. Alles bij elkaar genomen kan het opzetten van een praktisch en haalbaar systeem om mannelijke meiotische deling te bestuderen het onderzoeksveld van meiose aanzienlijk bevorderen.

De kleincellige remmer is een krachtig hulpmiddel om kinesinemotoren in celdeling en ontwikkelingsprocessen te bestuderen. De allosterische remmer, GSK923295, bindt specifiek aan het CENP-E-motordomein, blokkeert de afgifte van ADP (adenosinedifosfaat) en stabiliseert uiteindelijk de interacties tussen CENP-E en microtubuli30. In deze studie wordt een in vivo remmingsmuismodel gepresenteerd door middel van abdominale chirurgie en testiculaire injectie van GSK923295. CENP-E-remming resulteert in chromosoomafwijking in metafase I van primaire spermatocyten. Bovendien leidt CENP-E-remming tot meiotische arrestatie van spermatocyten en de verstoring van spermatogenese. Een reeks protocollen wordt beschreven voor de analyse van spermatocyten en kan worden toegepast om meiotische spindelmicrotubuli, homologe chromosomen en subcellulaire organellen in spermatocyten te observeren. Onze in vivo remmingsmethode is een effectieve methode voor het bestuderen van meiotische deling en spermatogenese.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle dierproeven werden beoordeeld en goedgekeurd door het Animal Care and Use Committee van de Fujian Medical University (protocolnummer SYXK 2016-0007). Alle muizenexperimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de relevante richtlijnen van de verzorging en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health (NIH-publicaties nummer 8023, herzien 1978).

1. Constructie van GSK923295-gemedieerde CENP-E-remmingsmuismodellen

  1. Steriliseer de chirurgische instrumenten bij 121 °C gedurende 30 min. Bestraal de chirurgische ultraschone werkbank met ultraviolet-C (UVC) gedurende 2 uur. Weeg de 3 weken oude mannelijke ICR-muizen (Institute of Cancer Research) die voor de experimenten zijn gebruikt en bereken de benodigde doses anesthetica.
  2. Verdoof muizen door toediening van een combinatie van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) via intraperitoneale injectie. Controleer op de diepte van de anesthesie van de muizen door een combinatie van muis hoornvliesreflex, nociceptieve reflex, ademhaling en spiertonus. Bevestig dat de muizen diep verdoofd zijn.
    OPMERKING: Plaats het dier op een verwarmingskussen om thermische ondersteuning te bieden tijdens de operatie.
  3. Bind de muizenpoten vast en bevestig ze op de wasbak. Plaats een druppel veterzalf op muizenogen om uitdroging te voorkomen terwijl u onder narcose bent. Scheer het buikhaar van de muis van de onderbuik naar het scrotum met behulp van een proefdierlijk scheermes. Beveilig het operatiegebied met een steriel gordijn.
  4. Desinfecteer de ventrale buik met een Betadine-scrub gevolgd door 75% ethanol driemaal. Open de buikholte met een steriel scalpel en maak een opening van <5 mm.
  5. Klem de huid vast met steriele chirurgische klemmen en trek aan het epididymale vetkussen met een steriele ontleedtang om de teelballen te lokaliseren met een steriel pincet. Bevestig de testis met een steriele tang onder een stereoscoop en injecteer langzaam 10 μL GSK923295 in seminifere tubuli in een eindconcentratie van 10 μM met behulp van 10 μL rheodyne30. Injecteer voor de samenstelling van de controlegroep 10 μL 1% DMSO (dimethylsulfoxide)/PBS (fosfaat gebufferde zoutoplossing).
    OPMERKING: Bewaar de GSK923295 oplossing in een concentratie van 10 mM bij -80 °C. Los 0,1 μL GSK923295 10 mM op in 100 μL PBS-oplossing om de 10 μM GSK923295 oplossing te bereiden.
  6. Duw de testis voorzichtig terug in de buikholte met een steriele chirurgische tang. Hecht het buikvlies en de huid afzonderlijk met twee tot vier hechtingen met behulp van de hechtlijn met een diameter van 0,1 mm.
  7. Label een plaats van 3 x 3 mm op de rug van het dier met een permanente marker na een buikoperatie, plaats de muis terug naar de voederkooi en zorg voor een schone en pathogeenvrije omgeving met voldoende voedsel en water.
  8. Houd het milieu in een steriele toestand door de gefilterde lucht, het gesteriliseerde voedsel en water. Zorg voor het dier totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om sternale lighouding te behouden. Voor postoperatieve analgesie, dien een dosis buprenorfine (0,1 mg / kg) subcutaan elke 12 uur gedurende 3 dagen. Zorg ervoor dat de muis niet wordt teruggebracht naar het gezelschap van andere dieren totdat deze volledig is hersteld.
    OPMERKING: De muizen krijgen postoperatieve zorg en geven de wond op de juiste manier lokale anesthesie met behulp van 0,5% lidocaïne om postoperatieve pijn te verminderen wanneer dat nodig is.

2. Hematoxyline-eosine (HE) kleuring en histopathologie

  1. Vier dagen na een buikoperatie euthanaseer je de muizen met CO 2 met een stroomsnelheid van 2 L/min in een CO2-kamer. Bevestig de dood door cervicale dislocatie als een bevestigende methode van euthanasie. Gebruik een chirurgische schaar om het scrotum te openen en verwijder de teelballen met een tang. Verzamel muistestikels 4 dagen na GSK923295 injectie en fixeer ze in 30 ml 10% formaldehyde-oplossing bij kamertemperatuur gedurende 12 uur.
  2. Voor gradiëntdehydratie incubeert u het monster achtereenvolgens in 40 ml 70% ethanol gedurende 1 uur, in 40 ml 85% ethanol gedurende 1 uur, in 40 ml 95% ethanol gedurende 1 uur en in 40 ml 100% ethanol gedurende 1 uur.
  3. Incubeer het monster in 40 ml xyleen gedurende 40 minuten en vervolgens in 40 ml paraffine gedurende 1 uur bij 65 °C. Plaats de weefsels op de bodem van de insluitdoos. Voeg de gesmolten paraffine toe aan de insluitdoos. Koel de weefsels af voor volledige stolling bij 4 °C gedurende 6 uur.
  4. Bevestig de monsters op de houder van het ultramicrotoom, houd de hoek tussen de monsters en het mesoppervlak op 5-10° en pas de plakdikte aan op 5 μm. Bereid de 5 μm dikke secties voor met behulp van een ultramicrotoom, spreid de dia's uit in een waterbad bij 40 °C en droog de secties gedurende 12 uur in een schuifdroger bij 37 °C.
  5. Incubeer de glaasjes in 200 ml xyleen gedurende 40 minuten, in 200 ml 100% ethanol gedurende 6 minuten, in 200 ml 95% ethanol gedurende 2 minuten, in 200 ml 90% ethanol gedurende 2 minuten, in 200 ml 80% ethanol gedurende 2 minuten en in 200 ml 70% ethanol gedurende 2 minuten, respectievelijk.
  6. Spoel de dia's gedurende 5 minuten in gedestilleerd water en kleurt ze met de Mayer's hematoxyline-oplossing gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur.
    OPMERKING: Mayer's hematoxyline-oplossing: 0,011 mol / L hematoxyline, 6,7% watervrije ethanol, 0,646 mol / L aluminiumkaliumsulfaat en 0,003 mol / L natriumjodaat.
  7. Spoel de glijbanen gedurende 5 minuten af in stromend water en incubeer gedurende 2 minuten met gedestilleerd water.
  8. Incubeer de glaasjes gedurende 3 s in 1% ethanolhydrochloride en spoel ze vervolgens gedurende 2 minuten in stromend water.
  9. Bevlek het monster met 1% eosine gedurende 15 s en incubeer ze vervolgens met 95% ethanol gedurende 5 s, met 100% ethanol gedurende 2 minuten en in xyleen gedurende 40 minuten.
  10. Sluit de platen af met 15 μL neutrale gom en de 24 x 50 mm coverslip.

3. Immunofluorescentie en confocale microscopie

  1. Verzamel de 5 μm dikke paraffinesecties van muistestikels voor immunofluorescentie. Incubeer de dia's in xyleen gedurende 40 minuten, in 100% ethanol gedurende 6 minuten, in 95% ethanol gedurende 2 minuten, in 90% ethanol gedurende 2 minuten, in 80% ethanol gedurende 2 minuten en in 70% ethanol gedurende 2 minuten. Spoel de dia's gedurende 5 minuten in gedestilleerd water en spoel de dia's af met 0,01 M PBS gedurende 5 minuten.
  2. Plaats de glaasjes in de antigeen retrieval oplossing (0,01 M citraatbuffer) en kook onder hoge druk met behulp van een snelkookpan gedurende 4 minuten voor het ophalen van antigeen. Koel de dia's op natuurlijke wijze af tot kamertemperatuur. Spoel tweemaal af met gedestilleerd water gedurende 5 minuten en met PBS gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: 0,01 M citraatbuffer (pH 6,0): 2,1 mmol/L citroenzuur, 11,6 mmol/L trinatriumcitraatdihydraat.
  3. Permeabiliseer cellen door de dia's gedurende 10 minuten te incuberen in 500 μL van 0,25% TritonX-100/PBS. Spoel de dia's drie keer af met PBS gedurende 5 minuten.
  4. Voor antigeenblokkering incubeer u de monsters met 300 μL 3% runderserumalbumine (BSA)/PBST (0,1% Tween-20 in PBS) gedurende 1 uur. Incubeer de monsters met de primaire antilichamen in 3% BSA/PBST gedurende 16 uur bij 4 °C. Doe de glaasjes in een bevochtigde doos om te voorkomen dat de weefsels uitdrogen. Verwarm de dia's op natuurlijke wijze tot kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
  5. Gooi het primaire antilichaam weg en spoel de dia's vervolgens drie keer gedurende 5 minuten in PBST. Verdun secundaire antilichamen in 3% BSA/PBST. Incubeer de monsters met secundaire antilichamen gedurende 1-2 uur bij 37 °C. Spoel de monsters vijf keer af in PBST gedurende 5 minuten.
  6. Bevlek de kernen met 50 μL van 4', 6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Monteer de coverslip met het anti-fade montagemedium en sluit de coverslip af met nagellak.
  7. Observeer en registreer fluorescerende signalen in de dia's met behulp van een fluorescerende microscoop uitgerust met een NA 40x / 0,75 objectief.

4. Flowcytometrie

  1. Verzamel muistestikels in petrischalen van 6 cm en knip de teelballen in1 mm 3 stukken met een chirurgische schaar.
  2. Verwerk de teelballen met 1 ml 1% collagenase in een centrifugebuis van 1,5 ml gedurende 10 minuten bij 37 °C en centrifugeer de monsters vervolgens gedurende 5 minuten bij 1.000 x g om spermatogene cellen neer te slaan.
  3. Gooi het supernatant weg en voeg vervolgens 1 ml 0,25% trypsine-EDTA-oplossing (ethyleendiaminetetra-azijnzuur) toe gedurende 20 minuten bij 37 °C en centrifugeer de monsters vervolgens gedurende 5 minuten bij 1.000 x g .
  4. Gooi het supernatant weg en incuber de neergeslagen cellen vervolgens met 1 ml 70% koude ethanol gedurende meer dan 8 uur bij 4 °C.
  5. Centrifugeer de monsters op 1.000 x g gedurende 5 minuten en verzamel vervolgens celsedimenten. Kleur de spermatogene cellen met 500 μL propidiumjodide (PI) kleuringsoplossing (50 μg/ml PI, 100 μg/ml RNase A en 0,2% Triton X-100 in PBS) bij 37 °C gedurende 30 minuten.
    OPMERKING: Schud de centrifugebuis om de 5 minuten voorzichtig om celaggregaties te voorkomen.
  6. Filter de monsters met behulp van een scherm met 300 mesh om celresten te verwijderen; verzamel de cellen in een stroombuis en bewaar ze bij 4 °C.
  7. Detecteer fluorescentiesignalen en lichtverstrooiing op de excitatiegolflengte van 488 nm met behulp van een flowcytometer. Analyseer het DNA-gehalte en de lichtverstrooiing met behulp van de Modfit MFLT32-software.

5. Transmissie-elektronenmicroscopie

  1. Snijd de teelballen in 1 mm 3 stukken met behulp van het scherpe scalpel en incuber de monsters snel met3 % glutaaraldehyde-1,5% paraformaldehyde-oplossing in 0,1 M PBS (pH 7,2) gedurende 4 uur bij 4 °C om de veranderingen van ultrastructuur te voorkomen. Spoel de monsters drie keer af met 0,1 M PBS gedurende 5 minuten.
    OPMERKING: Het scalpel en de schaar moeten scherp zijn en proberen kunstmatig knijpen en trekken te vermijden. De verwerking van monsters moet worden uitgevoerd in de fixatievloeistof.
  2. Fixeer de monsters in 1% osmic acid-1,5% kaliumferrocyanide-oplossing bij 4 °C gedurende 1,5 uur. Droog het water met filtreerpapier en spoel de monsters drie keer af met 0,1 M PBS gedurende 5 minuten.
  3. Droog de monsters uit in 40 ml 50% ethanol gedurende 10 minuten bij 4 °C. Incubeer de monsters in 40 ml 70% ethanol verzadigd uraniumacetaat kleurstof bij 4 °C gedurende 12 uur, in 40 ml 90% ethanol gedurende 10 minuten bij 4 °C, in 40 ml 90% ethanol-aceton gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en in 40 ml watervrij aceton gedurende 10 minuten driemaal bij kamertemperatuur.
  4. Incubeer de monsters in watervrij aceton-epoxyhars 618 inbeddingsmiddelen (v / v = 1:1) mengsel gedurende 1,5 uur en vervolgens ingebed in epoxyhars 618 inbeddingsmiddelen bij 35 °C gedurende 3 uur.
  5. Voor harspolymerisatie incubeer u de monsters in epoxyhars 618-inbeddingsmiddelen bij 35 °C gedurende 12 uur, bij 45 °C gedurende 12 uur en vervolgens bij 60 °C gedurende 24 uur.
  6. Installeer de monsters en het glazen mes en pas vervolgens de afstanden tussen de monsters en het mes aan. Bereid de 90 nm dikke ultradunne secties voor met behulp van een ultradunne microtoom. Snijd de monsters met een constante snelheid en plaats de dia's vervolgens op een nikkelen gaas. Leg de glaasjes in een petrischaaltje op kamertemperatuur.
  7. Bevlek de dia's gedurende 10 minuten met 2% uranylacetaat en bevlek de monsters vervolgens gedurende 10 minuten met 2% loodcitraat. Spoel de glaasjes af met gedestilleerd water. Droog de glijbanen 24 uur op kamertemperatuur.
  8. Observeer de dia's en neem elektronenbeelden op bij 70-100 kV met behulp van een transmissie-elektronenmicroscoop.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We hebben met succes een in vivo CENP-E-remmingsmodel van muistestikels geconstrueerd door middel van abdominale chirurgie en testiculaire injectie van GSK92329519. De belangrijkste technische stappen van deze methode zijn weergegeven in figuur 1. Na testiculaire injectie van GSK923295 gedurende 4 dagen werden de teelballen geoogst voor verdere analyses. In de controlegroep was de spermatogene golf in de seminifere tubuli regelmatig en georganiseerd (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie hebben we een in vivo CENP-E-remmingsmodel van muistestikels opgesteld met behulp van de buikchirurgie en micro-injectie van GSK923295. De abdominale chirurgie en testiculaire injectiemethode die in dit onderzoek wordt gebruikt, heeft de volgende voordelen. Ten eerste is het niet beperkt tot de leeftijd van muizen. Experimentatoren kunnen testiculaire injectie in een vroeg stadium uitvoeren, bijvoorbeeld bij muizen van 3 weken oud of jonger. Ten tweede heeft GSK923295 een specifiek en uitstekend r...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We bedanken alle leden van het Cytoskeleton Laboratory aan de Fujian Medical University voor nuttige discussies. We bedanken Jun-Jin Lin van het Public Technology Service Center, Fujian Medical University voor technische assistentie bij flowcytometrie. We bedanken Ming-Xia Wu en Lin-Ying Zhou bij Electron Microscopy Lab van Public Technology Service Center, Fujian Medical University voor technische assistentie bij elektronenmicroscopie. We bedanken Si-Yi Zheng, Ying Lin, Qi Ke en Jun Song van het Experimental Teaching Center of Basic Medical Sciences aan de Fujian Medical University voor hun steun. Deze studie werd ondersteund door de volgende beurzen: National Natural Science Foundation of China (subsidienummer 82001608), Natural Science Foundation of Fujian Province, China (subsidienummer 2019J05071), Fujian Provincial Health Technology Project (subsidienummer 2018-1-69), Startup Fund for Scientific Research, Fujian Medical University (subsidienummer 2017XQ1001), Fujian Medical University high level talents scientific research start-up funding project (subsidienummer XRCZX2017025) en Onderzoeksproject van online onderwijs en onderwijs van afgestudeerde studenten Chinese geneeskunde (beursnummer B-YXC20200202-06).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.25% Trypsin-EDTAGibco25200056
1 ml SyringeVerschillende commerciële merken beschikbaarSteriele.
1.5 mL Centrifuge tubeAxygenMCT-150-C
50 mL Centrifuge TubeCorning430828
6 cm Petri dishCorning430166
95% EthanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009164
tubulin rabbit polyclonal antibodyBeyotimeAF0001Voor immunofluorescentie-assays. Gebruik bij 1:100.
rabbit anti-Histone H3 (phospho S10) monoclonal antibodyAbcamab267372Voor immunofluorescentie-assays. Gebruik bij 1:100.
rabbit anti-TUBA4A polyclonal antibodySangon BiotechD110022Voor immunofluorescentie-assays. Gebruik bij 1:100.
Anti-SYCP3 rabbit monoclonal antibodyAbcamab175191Voor immunofluorescentie-assays. Gebruik bij 1:100.
Adhesion microscope slidesCITOTEST188105
Alexa fluor 488-labeled goat anti-rabbit antibodyBeyotimeA0423Sencodary antibody. Gebruik bij 1:500.
Aluminium potassium sulphateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10001060
Anhydrous ethanolSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd100092690
Anti-fade mounting mediumBeyotimeP0131Voorkomt verbleken van fluorescente signalen.
BD FACS Canto IIBD BiosciencesFACS Canto II
Bovine Serum AlbuminSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd69003435
CentrifugeEppendorf5424BK745380
Chloral hydrateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80037516
Citric acidShanghai Experiment Reagent Co., Ltd122670
CollagenaseSangon BiotechA004194-0100
CoverslipsCITOTEST10212020C20 × 20 mm. Dikte 0,13-0,16 mm.
DAPIBeyotimeC1006
Dye vatVerschillende commerciële merken beschikbaar91347802
Eosin Y, alcohol solubleSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd71014460
EtherSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10009318
Formaldehyde - aqueous solutionSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10010018
GSK923295MedChemExpressHY-10299
Hematoxylin, anhydrousSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd71020784
ICR mouseShanghai SLAC Laboratory Animal Co., Ltd
Image J softwareNational Institutes of Healthhttps://imagej.nih.gov/ij/Fluorescente beeldanalyse.
Leica ultramicrotomeLeica
Leica EM UC-7 ultramicrotomeLeicaEM UC7
Modfit MFLT32Verity Software HouseVoor analyse van flowcytometrie resultaten.
Nail polishVerschillende commerciële merken beschikbaar
Neutral gumSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10004160
Nikon Ti-S2 microscopeNikonTi-S2
Picric acidSinopharm Chemical Reagent Co.,LtdJ60807
RheodyneSangon BiotechF519160-000110 μl rheodyne
Sliced paraffinSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd69019461
Sodium iodateSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80117214
Surgical instrumentsVerschillende commerciële merken beschikbaarVoor buikchirurgie. Steriliseer bij 121 °C, 20 min.
Transmission electron microscopeFEITecnai G2
Trisodium citrate dihydrateShanghai Experiment Reagent Co., Ltd173970
Triton X-100Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd30188928Verdun in steriele PBS tot een werkoplossing van 0,25%.
Tween 20Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd30189328Verdun in steriele PBS tot een werkoplossing van 0,1%.
ParaformaldehydeSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd80096618
XyleneSinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd10023418

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenormand, T., Engelstädter, J., Johnston, S. E., Wijnker, E., Haag, C. R. Evolutionary mysteries in meiosis. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 371 (1706), 20160001(2016).
  2. Brandeis, M. New-age ideas about age-old sex: separating meiosis from mating could solve a century-old conundrum. Biological Reviews of the Cambridge Philosophical Society. 93 (2), 801-810 (2018).
  3. Lane, S., Kauppi, L. Meiotic spindle assembly checkpoint and aneuploidy in males versus females. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 76 (6), 1135-1150 (2019).
  4. Handel, M. A., Schimenti, J. C. Genetics of mammalian meiosis: regulation, dynamics and impact on fertility. Nature Reviews Genetics. 11 (2), 124-136 (2010).
  5. Miller, M. P., Amon, A., Ünal, E. Meiosis I: when chromosomes undergo extreme makeover. Current Opinion in Cell Biology. 25 (6), 687-696 (2013).
  6. Duro, E., Marston, A. L. From equator to pole: splitting chromosomes in mitosis and meiosis. Genes & Development. 29 (2), 109-122 (2015).
  7. Eaker, S., Pyle, A., Cobb, J., Handel, M. A. Evidence for meiotic spindle checkpoint from analysis of spermatocytes from Robertsonian-chromosome heterozygous mice. Journal of Cell Science. 114, Pt 16 2953-2965 (2001).
  8. Faisal, I., Kauppi, L. Reduced MAD2 levels dampen the apoptotic response to non-exchange sex chromosomes and lead to sperm aneuploidy. Development. 144 (11), 1988-1996 (2017).
  9. Bolcun-Filas, E., Handel, M. A. Meiosis: the chromosomal foundation of reproduction. Biology of Reproduction. 99 (1), 112-126 (2018).
  10. Lawrence, C. J., et al. A standardized kinesin nomenclature. The Journal of Cell Biology. 167 (1), 19-22 (2004).
  11. Cross, R. A., McAinsh, A. Prime movers: the mechanochemistry of mitotic kinesins. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (4), 257-271 (2014).
  12. Camlin, N. J., McLaughlin, E. A., Holt, J. E. Motoring through: the role of kinesin superfamily proteins in female meiosis. Human Reproduction Update. 23 (4), 409-420 (2017).
  13. Yen, T. J., Li, G., Schaar, B. T., Szilak, I., Cleveland, D. W. CENP-E is a putative kinetochore motor that accumulates just before mitosis. Nature. 359 (6395), 536-539 (1992).
  14. Wood, K. W., Sakowicz, R., Goldstein, L. S., Cleveland, D. W. CENP-E is a plus end-directed kinetochore motor required for metaphase chromosome alignment. Cell. 91 (3), 357-366 (1997).
  15. Abrieu, A., Kahana, J. A., Wood, K. W., Cleveland, D. W. CENP-E as an essential component of the mitotic checkpoint in vitro. Cell. 102 (6), 817-826 (2000).
  16. Mao, Y., Desai, A., Cleveland, D. W. Microtubule capture by CENP-E silences BubR1-dependent mitotic checkpoint signaling. The Journal of Cell Biology. 170 (6), 873-880 (2005).
  17. Gudimchuk, N., et al. Kinetochore kinesin CENP-E is a processive bi-directional tracker of dynamic microtubule tips. Nature Cell Biology. 15 (9), 1079-1088 (2013).
  18. Yu, K. W., Zhong, N., Xiao, Y., She, Z. Y. Mechanisms of kinesin-7 CENP-E in kinetochore-microtubule capture and chromosome alignment during cell division. Biology of the Cell. 111 (6), 143-160 (2019).
  19. She, Z. Y., et al. Kinesin-7 CENP-E regulates chromosome alignment and genome stability of spermatogenic cells. Cell Death Discovery. 6, 25(2020).
  20. Parra, M. T., et al. Sequential assembly of centromeric proteins in male mouse meiosis. PLoS Genetics. 5 (3), 1000417(2009).
  21. Parra, M. T., et al. Expression and behaviour of CENP-E at kinetochores during mouse spermatogenesis. Chromosoma. 111 (1), 53-61 (2002).
  22. Duesbery, N. S., et al. CENP-E is an essential kinetochore motor in maturing oocytes and is masked during mos-dependent, cell cycle arrest at metaphase II. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (17), 9165-9170 (1997).
  23. Gui, L., Homer, H. Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes. Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).
  24. Parks, J. E., Lee, D. R., Huang, S., Kaproth, M. T. Prospects for spermatogenesis in vitro. Theriogenology. 59 (1), 73-86 (2003).
  25. Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
  26. Staub, C. A century of research on mammalian male germ cell meiotic differentiation in vitro. Journal of Andrology. 22 (6), 911-926 (2001).
  27. Handel, M. A., Caldwell, K. A., Wiltshire, T. Culture of pachytene spermatocytes for analysis of meiosis. Developmental Genetics. 16 (2), 128-139 (1995).
  28. La Salle, S., Sun, F., Handel, M. A. Isolation and short-term culture of mouse spermatocytes for analysis of meiosis. Methods in Molecular Biology. 558, 279-297 (2009).
  29. Putkey, F. R., et al. Unstable kinetochore-microtubule capture and chromosomal instability following deletion of CENP-E. Developmental Cell. 3 (3), 351-365 (2002).
  30. Wood, K. W., et al. Antitumor activity of an allosteric inhibitor of centromere-associated protein-E. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (13), 5839-5844 (2010).
  31. Nam, D., Sershon, R. A., Levine, B. R., Della Valle, C. J. The use of closed incision negative-pressure wound therapy in orthopaedic surgery. Journal of the American Academy Orthopaedic Surgeons. 26 (9), 295-302 (2018).
  32. She, Z. Y., et al. Kinesin-5 Eg5 is essential for spindle assembly and chromosome alignment of mouse spermatocytes. Cell Division. 15, 6(2020).
  33. She, Z. Y., et al. Kinesin-6 family motor KIF20A regulates central spindle assembly and acrosome biogenesis in mouse spermatogenesis. Biochimica et Biophysica Acta-Molecular Cell Research. 1867 (4), 118636(2020).
  34. Wellard, S. R., Hopkins, J., Jordan, P. W. A seminiferous tubule squash technique for the cytological analysis of spermatogenesis using the mouse model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (132), e56453(2018).
  35. Sato, M., Ishikawa, A., Kimura, M. Direct injection of foreign DNA into mouse testis as a possible in vivo gene transfer system via epididymal spermatozoa. Molecular Reproduction and Development. 61 (1), 49-56 (2002).
  36. Coward, K., et al. Expression of a fluorescent recombinant form of sperm protein phospholipase C zeta in mouse epididymal sperm by in vivo gene transfer into the testis. Fertility and Sterility. 85, 1281-1289 (2006).
  37. Davis, S., et al. Potent inhibition of microRNA in vivo without degradation. Nucleic Acids Research. 37 (1), 70-77 (2009).
  38. Zhao, H. T., et al. LRRK2 antisense oligonucleotides ameliorate α-Synuclein inclusion formation in a Parkinson's Disease mouse model. Molecular Therapy-Nucleic Acids. 8, 508-519 (2017).
  39. Shahzad, K., et al. CHOP-ASO Ameliorates Glomerular and Tubular Damage on Top of ACE Inhibition in Diabetic Kidney Disease. Journal of the American Society of Nephrology. 3, 2021040431(2021).
  40. Kang, K., Niu, B., Wu, C., Hua, J., Wu, J. The construction and application of lentiviral overexpression vector of goat miR-204 in testis. Research in Veterinary Science. 130, 52-58 (2020).
  41. Karabasheva, D., Smyth, J. T. Preparation of Drosophila larval and pupal testes for analysis of cell division in live, intact tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e60961(2020).
  42. Wiltshire, T., Park, C., Caldwell, K. A., Handel, M. A. Induced premature G2/M-phase transition in pachytene spermatocytes includes events unique to meiosis. Developmental Biology. 169 (2), 557-567 (1995).
  43. Cobb, J., Cargile, B., Handel, M. A. Acquisition of competence to condense metaphase I chromosomes during spermatogenesis. Developmental Biology. 205 (1), 49-64 (1999).
  44. Cobb, J., Reddy, R. K., Park, C., Handel, M. A. Analysis of expression and function of topoisomerase I and II during meiosis in male mice. Molecular Reproduction and Development. 46 (4), 489-498 (1997).
  45. Inselman, A., Handel, M. A. Mitogen-activated protein kinase dynamics during the meiotic G2/MI transition of mouse spermatocytes. Biology of Reproduction. 71 (2), 570-578 (2004).
  46. Muramatsu, T., Shibata, O., Ryoki, S., Ohmori, Y., Okumura, J. Foreign gene expression in the mouse testis by localized in vivo gene transfer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 233 (1), 45-49 (1997).
  47. Yamazaki, Y., et al. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells by deoxyribonucleic acid injection into seminiferous tubules and subsequent electroporation. Biology of Reproduction. 59 (6), 1439-1444 (1998).
  48. Yamazaki, Y., Yagi, T., Ozaki, T., Imoto, K. In vivo gene transfer to mouse spermatogenic cells using green fluorescent protein as a marker. The Journal of Experimental Zoology. 286 (2), 212-218 (2000).
  49. Coward, K., Kubota, H., Parrington, J. In vivo gene transfer into testis and sperm: developments and future application. Archives of Andrology. 53 (4), 187-197 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CENP E inhibitiemuizenspermatocytenabdominale chirurgietesticulaire injectieimmunofluorescentiekleuringchromosoomsegregatiespindelassemblagetransmissie elektronenmicroscopie

Gerelateerde artikelen