Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Driedimensionale beeldvorming met hoge resolutie van de voetzool vasculatuur in een Murine Hindlimb Gangreen model

3.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63284

⸱

16 maart 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dewitt Daughtry Family Department of Surgery, University of Miami Miller School of Medicine, 2Vascular Biology Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 3University of Miami, 4Analytical Imaging Core Facility, University of Miami

In dit artikel

Samenvatting

Het huidige protocol beschrijft een uniek, klinisch relevant model van perifere arteriële ziekte dat femorale slagader en aderelektrocoagulatie combineert met de toediening van een stikstofmonoxidesynthaseremmer om hindlimb gangreen te induceren in FVB-muizen. Intracardiale DiI-perfusie wordt vervolgens gebruikt voor hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van de voetzool vasculatuur.

Samenvatting

Perifere arteriële ziekte (PAD) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit als gevolg van chronische blootstelling aan atherosclerotische risicofactoren. Patiënten die lijden aan de meest ernstige vorm, chronische ledemaatbedreigende ischemie (CLTI), worden geconfronteerd met aanzienlijke beperkingen in het dagelijks leven, waaronder chronische pijn, beperkte loopafstand zonder pijn en niet-genezende wonden. Preklinische modellen zijn ontwikkeld bij verschillende dieren om PAD te bestuderen, maar muis hindlimb ischemie blijft de meest gebruikte. Er kan een aanzienlijke variatie zijn in reactie op ischemische belediging in deze modellen, afhankelijk van de gebruikte muizenstam en de plaats, het aantal en de middelen van arteriële verstoring. Dit protocol beschrijft een unieke methode die femorale slagader en ader elektrocoagulatie combineert met de toediening van een stikstofmonoxidesynthase (NOS) -remmer om op betrouwbare wijze voetzoolgangreen te induceren in Friend Virus B (FVB) muizen die lijken op het weefselverlies van CLTI. Terwijl traditionele middelen voor het beoordelen van reperfusie zoals laser Doppler perfusie beeldvorming (LDPI) nog steeds worden aanbevolen, wordt intracardiale perfusie van de lipofiele kleurstof 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchloraat (DiI) gebruikt om de vasculatuur te labelen. Daaropvolgende confocale laserscanmicroscopie met volledige mount maakt een hoge resolutie, driedimensionale (3D) reconstructie van voetkussen vasculaire netwerken mogelijk die een aanvulling vormt op traditionele middelen om reperfusie in hindlimb ischemiemodellen te beoordelen.

Inleiding

Perifere arteriële ziekte (PAD), gekenmerkt door verminderde bloedtoevoer naar de ledematen als gevolg van atherosclerose, treft 6,5 miljoen mensen in de Verenigde Staten en 200 miljoen mensen wereldwijd1. Patiënten met PAD ervaren een verminderde ledemaatfunctie en kwaliteit van leven, en degenen met CLTI, de meest ernstige vorm van PAD, lopen een verhoogd risico op amputatie en overlijden met een 5-jarig sterftecijfer van bijna 50%2. In de klinische praktijk worden patiënten met enkel-brachiale indices (ABI) <0,9 geacht PAD te hebben, en patiënten met ABI <0,4 geassocieerd met rustpijn of weefselverlies als clti3. De symptomen variëren tussen patiënten met vergelijkbare ABI's, afhankelijk van de dagelijkse activiteit, spiertolerantie voor ischemie, anatomische variaties en verschillen in collaterale ontwikkeling4. Cijfer- en ledemaatgangreen is de meest ernstige manifestatie van alle vasculaire occlusieve ziekten die resulteren in CLTI. Het is een vorm van droge necrose die de zachte weefsels mummifieert. Naast atherosclerotisch PAD kan het ook worden waargenomen bij patiënten met diabetes, vasculiciden zoals de ziekte van Buerger en het fenomeen van Raynaud, of calcifylaxie in de setting van nierziekte in het eindstadium5,6.

Verschillende preklinische modellen zijn ontwikkeld om de pathogenese van PAD /CLTI te bestuderen en de werkzaamheid van potentiële behandelingen te testen, waarvan de meest voorkomende muisachterlimb ischemie blijft. Het induceren van hindlimb ischemie bij muizen wordt meestal bereikt door de obstructie van de bloedstroom uit de iliacale of femorale slagaders, hetzij door hechtingsligatie, elektrocoagulatie of andere middelen om het gewenste vat te vernauwen7. Deze technieken verminderen de perfusie naar de achterpoot drastisch en stimuleren neovascularisatie in de dij- en kuitspieren. Er zijn echter essentiële muriene stamafhankelijke verschillen in gevoeligheid voor ischemische belediging, deels als gevolg van anatomische verschillen in collaterale verdeling8,9. C57BL/6-muizen zijn bijvoorbeeld relatief resistent tegen ischemie van de hindlimb, wat een verminderde ledemaatfunctie aantoont, maar over het algemeen geen bewijs van gangreen in het voetkussen. Aan de andere kant hebben BALB / c-muizen een inherent slecht vermogen om te herstellen van ischemie en ontwikkelen ze meestal auto-amputatie van de voet of het onderbeen na alleen ligatie van de dijbeenslagader. Deze ernstige reactie op ischemie vernauwt het therapeutische venster en kan longitudinale beoordeling van ledemaatreperfusie en -functie uitsluiten. Interessant is dat genetische verschillen in een enkele kwantitatieve eigenschap locus op murinechromosoom 7 betrokken zijn bij deze differentiële gevoeligheid van C57BL / 6 en BALB / c muizen voor weefselnecrose en ledemaatreperfusie10.

Vergeleken met C57BL/6- en BALB/c-stammen vertonen FVB-muizen een intermediaire maar inconsistente respons op alleen ligatie van de dijbeenslagader. Sommige dieren ontwikkelen voetpad gangreen in de vorm van zwarte ischemische nagels of gemummificeerde cijfers, weer anderen zonder openlijke tekenen van ischemie11. Gelijktijdige toediening van Nω-Nitro-L-arginine methylesterhydrochloride (L-NAME), een stikstofmonoxidesynthase (NOS)-remmer12, voorkomt compenserende vaatverwijdende mechanismen en verhoogt verder oxidatieve stress in achterhandweefsel. In combinatie met ligatie of stolling van de femorale slagader produceert deze aanpak consequent verlies van voetzoolweefsel bij FVB-muizen dat lijkt op de atrofische veranderingen van CLTI, maar zelden evolueert naar auto-amputatie van ledematen11. Oxidatieve stress is een van de kenmerken van PAD/CLTI en wordt vermeerderd door endotheeldisfunctie en verminderde biologische beschikbaarheid van stikstofmonoxide (NO)13,14. NO is een pluripotent molecuul dat gewoonlijk gunstige effecten uitoefent op de arteriële en capillaire bloedstroom, de hechting en aggregatie van bloedplaatjes en de rekrutering en activering van leukocyten13. Van verlaagde NOS is ook aangetoond dat het het angiotensine-converterende enzym activeert, dat oxidatieve stress induceert en de progressie van atherosclerose versnelt15.

Zodra een model van hindlimb ischemie is vastgesteld, zijn monitoring van de daaropvolgende ledemaatreperfusie en het therapeutische effect van mogelijke behandelingen ook nodig. In het voorgestelde muriene gangreenmodel kan de mate van weefselverlies eerst worden gekwantificeerd met behulp van de Faber-score om het bruto uiterlijk van de voet te beoordelen (0: normaal, 1-5: verlies van nagels waarbij de score het aantal aangetaste nagels vertegenwoordigt, 6-10: atrofie van cijfers waarbij de score het aantal aangetaste cijfers vertegenwoordigt, 11-12: gedeeltelijke en volledige voetatrofie, respectievelijk)9. Kwantitatieve metingen van hindlimbperfusie worden vervolgens meestal uitgevoerd met behulp van LDPI, dat afhankelijk is van Doppler-interacties tussen laserlicht en rode bloedcellen om perfusie op pixelniveau aan te geven in een interessegebied (ROI)16. Hoewel deze techniek kwantitatief, niet-invasief en ideaal is voor herhaalde metingen, biedt het geen korrelige anatomische details van de achterste vasculatuur16. Andere beeldvormingsmodaliteiten, zoals micro-computertomografie (micro-CT), magnetische resonantieangiografie (MRA) en röntgenmicroangiografie, blijken ofwel kostbaar, vereisen geavanceerde instrumentatie of anderszins technisch uitdagend16. In 2008 beschreven Li et al. een techniek voor het labelen van bloedvaten in het netvlies met de lipofiele carbocyaninekleurstof DiI17. DiI integreert in endotheelcellen en kleurt door directe diffusie vasculaire membraanstructuren zoals angiogene spruiten en pseudopodale processen17,18. Vanwege de directe afgifte in endotheelcellen en de zeer fluorescerende aard van de kleurstof, biedt deze procedure intense en langdurige etikettering van bloedvaten. In 2012 pasten Boden et al. de techniek van DiI-perfusie aan het murine hindlimb ischemia-model aan via whole-mount imaging van geoogste dij-adductorspieren na ligatie van de femorale slagader19.

De huidige methode biedt een relatief goedkope en technisch haalbare manier om neovascularisatie te beoordelen als reactie op hindlimb ischemie en gen- of celgebaseerde therapieën. In een verdere aanpassing beschrijft dit protocol de toepassing van DiI-perfusie om de voetzoolvasculatuur in hoge resolutie en 3D in een murinemodel van hindlimb gangreen in beeld te brengen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle dierproeven beschreven in het protocol werden goedgekeurd door de University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). FVB-muizen, zowel mannelijk als vrouwelijk, in de leeftijd van 8-12 weken, werden gebruikt voor de studie.

1. Bereiding van L-NAME-oplossing

  1. Bereid onder steriele omstandigheden in een laminaire stromingskap een L-NAME-stamoplossing door 1 g L-NAME-poeder (zie Materiaaltabel) op te lossen met 20 ml steriel water om een oplossing van 50 mg/ml te maken. Bewaar de stamoplossing in 300-500 μL aliquots bij -20 °C gedurende maximaal 3 maanden.
  2. Om een werkende L-NAME-oplossing te maken, ontdooit u een aliquot L-NAME-stamoplossing en verdunt u met PBS (1:4) onder steriele omstandigheden om een uiteindelijke concentratie van 10 mg/ml te verkrijgen.
  3. Om PBS (pH 7,4) te bereiden, lost u 8 g NaCl, 0,2 g KCl, 1,44 g Na2HPO4 en 0,23 g NaH2PO4 op in 800 ml gedestilleerd water. Stel de pH in op 7,4 met HCl. Voeg water toe aan een totaal volume van 1.000 ml en filtreer door een flessendekselfilter van 0,22 μm.
    OPMERKING: Intraperitoneale (IP) injectie van 4 μL/g L-NAME werkoplossing komt overeen met de gewenste dosis van 40 mg/kg L-NAME. L-NAME-werkoplossing moet tijdens het gebruik op ijs worden gehouden en er moeten dagelijks nieuwe verdunningen worden gemaakt met vers ontdooide aliquots van stockoplossing.

2. Chemische en chirurgische inductie van hindlimb gangreen

  1. Verkrijg FVB-muizen, in de leeftijd van 8-12 weken, hetzij van een fokker of gefokt in de faciliteit (zie Tabel met materialen). Dien 2 uur voor de operatie een IP-dosis van 40 mg/kg L-NAME toe.
  2. Verdoving muizen met IP-injectie van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine (zie Tabel met materialen) verdund in PBS. Bevestig adequate sedatie door de afwezigheid van een teenknijperreflex en blijf de ademhalingsfrequentie tijdens de procedure controleren.
    1. Verwijder het haar van bilaterale achterpoten en liezen met een schaar en/of een ontharingscrème. Plaats het dier onder een chirurgische microscoop in rugligging; verleng en plak de ledematen op hun plaats. Steriliseer het chirurgische veld door de povidon-jodiumoplossing om de korte termijn op de operatieplaats aan te brengen.
  3. Gebruik onder 10-20x vergroting een schaar of een scalpel om een incisie van 1 cm langs de liesplooi te maken die net inferieur is aan het liesband. Gebruik een fijne tang en een steriele wattenstaafplicator om het inguinale vetkussen zijdelings zijdelings van het inguinale ligament te ontleden en de onderliggende femurschede bloot te leggen, zodat de dijbeenslagader, ader en zenuw duidelijk worden geïdentificeerd (figuur 1).
  4. Doorboort met een fijne tang de femurschede. Borstel de heupzenuw voorzichtig weg van de dijbeenslagader. Identificeer de start van de laterale circumflexe tak van de femorale slagader (LCFA) diep naar de heupzenuw (figuur 1).
    1. Ga verder met elektrocoagulatie van de dijbeenslagader en ader net proximaal aan de LCFA door het cautery-apparaat te activeren (zie Tabel met materialen) en voorzichtig contact te maken met de bloedvaten met een zijwaartse beweging, zodat de heupzenuw goed geïsoleerd is en beschermd blijft tegen thermisch letsel. Verdeel het gecoaguleerde vatsegment met een schaar.
  5. Ga verder met de blootstelling van de distale foetale slagader en ader door het inguinale vetkussen mediaal te mobiliseren. Identificeer de oppervlakkige epigastrische slagader en saphenopopliteale overgang meer distaal.
    1. Doorprik de dijbeenschede tussen deze twee locaties en ontleed de heupzenuw zorgvuldig weg van de femorale vaten. Ga verder met stolling en transsectie van de dijbeenslagader en ader zoals beschreven in stap 2.4.1.
  6. Irrigeer het operatieveld met een spuit gevuld met steriel PBS. Verkrijg hemostase door zachte druk uit te oefenen met een wattenstaafje applicator gedurende 3-5 minuten op alle gebieden van bloeding.
    1. Ga verder met het sluiten van de incisie met behulp van absorbeerbare 5-0 hechting op een eenvoudige continue manier. Dien een subcutane dosis buprenorfine van 1 mg/kg met aanhoudende afgifte toe (zie Tabel met materialen) voor postoperatieve pijnverlichting.
  7. Bevestig het verlies van voetzoolperfusie in de geligeerde achterpoot door LDPI (zie Tabel met materialen). Terwijl het nog steeds verdoofd is, plaatst u het dier op een donker schuimkussen in een buikligging onder de LDPI-machine en gebruikt u lussen van elektrische tape om de voeten op hun plaats te houden.
    1. Ga verder met LDPI van bilaterale voeten. Zodra het scannen is voltooid, tekent u een ROI rond elk voetpad en verkrijgt u de gemiddelde fluxwaarden.
    2. Bereken de perfusie-index als de verhouding van de gemiddelde fluxwaarden van het geligeerde en niet-geligeerde voetpad. Zorg ervoor dat de perfusie-index lager is dan 0,1.
  8. Breng het dier terug naar een schone kooi met een verwarmingskussen of bovenlicht om de kerntemperatuur van het lichaam te behouden. Zorg voor volledig herstel van anesthesie voordat u muizen terugbrengt naar de dierenfaciliteit.

3. Postoperatieve toediening van L-NAME en controle van hindlimb gangreen

  1. Dien op postoperatieve dagen 1-3 een extra IP-dosis van 40 mg/kg L-NAME toe aan elk dier. Evalueer tegelijkertijd zorgvuldig de voet van de ischemische ledemaat.
  2. Kwantificeer de mate van hindlimb ischemie en gangreen met behulp van de Faber hindlimb ischemia score9. Scores 1-5: aantal ischemische nagels; scores 6-10: 1-5 ischemische cijfers; scores 11 en 12: gedeeltelijke en volledige voetatrofie. Record Faber scoort op postoperatieve dagen 1-3 en daarna wekelijks.

4. Bereiding van DiI en werkoplossingen voor dierlijke perfusie

  1. Om DiI-stamoplossing te bereiden, lost u 100 mg DiI-kristallen (zie Tabel met materialen) op in 16,7 ml 100% ethanol. Dek af met aluminiumfolie en laat een nacht in het donker bij kamertemperatuur op een schommelplatform staan.
  2. Om het verdunningsmiddel te bereiden, lost u 50 g glucose op in 1.000 ml gedestilleerd water om een 5% glucose-oplossing te verkrijgen. Filter door een 0,22 μm flesdekselfilter. Meng PBS en 5% glucose-oplossingen in een verhouding van 1:4 om een werkende verdunningsoplossing te bereiden.

5. Installatie van apparatuur en DiI-perfusie

  1. Maak dii-werkoplossing door onmiddellijk voor gebruik 200 μl dii-stockoplossing toe te voegen aan 10 ml van de werkverdunningsoplossing (bereid in stap 4.2). Schud met de hand om goed te mengen.
  2. Sluit twee of drie 3-weg stopkranen en een 25 G vlindernaald in serie aan. Bereid 10 ml spuiten met 4 ml PBS, 10 ml DiI-oplossing en 10 ml 10% neutraal gebufferde formaline (zie materiaaltabel).
  3. Sluit de spuit met formaline aan op de proximale instroompoort en injecteer de oplossing om lucht uit de lijn te spoelen; draai aan de stopkraan om de poort te sluiten. Herhaal dezelfde procedure achtereenvolgens en verbind de spuiten met DiI en vervolgens PBS met respectievelijk de middelste en distale instroompoorten, waarbij u ervoor zorgt dat alle luchtbellen door de stopkraan worden gespoeld.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat er geen luchtbellen zijn in een deel van de stopkraan of slang. Luchtbellen kunnen kleine slagaders afsluiten tijdens perfusie, wat resulteert in een slechte intravasculaire DiI-verdeling en gecompromitteerde beeldvormingsresultaten.
  4. Zodra de installatie is voltooid, euthanaseer het dier door een overdosis CO2 in een inductiekamer.
  5. Plaats het te doordrenken dier in rugligging op een absorberend kussen en zet de oksels en onderste ledematen vast met naalden.
  6. Maak met een schaar een transversale incisie om de buikholte te openen. Leg bloot en verdeel vervolgens het linker- en rechtermembraan om toegang te krijgen tot de thoracale holte.
    1. Snijd de borstwand aan weerszijden van het borstbeen van de onderste ribben naar de eerste of tweede ribben, waarbij de interne thoracale (borst) slagaders mediaal worden vermeden. Gebruik een hemostaat (zie Tabel met materialen) om het onderste uiteinde van het borstbeen vast te pakken en reflecteer het naar het hoofd van het dier om de thoracale holte bloot te leggen.
  7. Identificeer de linker ventrikel, die lichter van kleur lijkt dan de rechter ventrikel. Pak het hart voorzichtig vast met een stompe tang en steek de vlindernaald in de linker ventrikel.
    1. Gebruik een schaar of een naald van 18 G om het rechteratrium te doorboren, waardoor bloed en perfusieoplossingen terugkeren naar het hart om te draineren. Stabiliseer de naald met één of twee handen, zorg ervoor dat u niet per ongeluk de rechter ventrikel doorboort en de long doordrenkt in plaats van systemische circulatie.
  8. Open de poort naar de spuit met PBS en injecteer handmatig 2-4 ml met een snelheid van 1-2 ml / min gedurende 1-2 minuten om bloed uit het vasculaire systeem te spoelen. Zorg voor een succesvolle perfusie door bloedingen uit het rechteratrium te observeren. Sluit na injectie de poort van de PBS-spuit.
  9. Open de poort naar de spuit met DiI en injecteer 5-10 ml met een snelheid van 1-2 ml / min gedurende 5 minuten. Controleer de oren, neus en handpalmen die licht roze moeten worden met de injectie van DiI-oplossing. Sluit na de injectie de poort van de DiI-spuit en wacht 2 minuten om de kleurstof te kunnen incorporeren voordat het fixatief wordt geïnjecteerd.
  10. Open de poort naar de spuit met formaline en injecteer 5-10 ml met een snelheid van 1-2 ml / min gedurende 5 minuten. Verwijder na de injectie de naald uit de linker ventrikel en ga verder met het oogsten van de weefsels van belang.
  11. Gebruik een zware schaar om het scheenbeen bij de enkel te ontwrichten, waardoor de linker- en rechtervoet volledig van de onderbenen worden gescheiden. Plaats de geoogste voeten in een 6- of 12-well plaat met 1-2 ml 10% formaline-oplossing. Wikkel het bord in met folie en bewaar een nacht bij 4 °C.

6. Voorbereiding van voetzoolweefsel voor confocale laserscanmicroscopie

  1. Vervang de volgende dag de fixatieve oplossing in 6- of 12-well plaat door 1-2 ml PBS per put.
  2. Om de voet te villen, maakt u eerst een longitudinale incisie met een scalpel op de plantaire en dorsale aspecten van de voet. Verwijder vervolgens met behulp van een getande tang en een kleine hemostaat voorzichtig alle huid van de voet en de cijfers, zonder de onderliggende zachte weefsels te beschadigen.
  3. Ga verder met het monteren en in beeld brengen van weefsels, bij voorkeur binnen 1-2 dagen na perfusie en oogst. U kunt ook voetpads terugbrengen naar 6- of 12-well-platen met 1-2 ml PBS; dek af met folie en bewaar bij 4 °C om de fluorescentie tot 1 maand te behouden.
  4. Om weefsels te monteren, plaatst u de voeten individueel tussen twee glazen microscoopglaasjes met een schuimbiopsiepad over zichzelf gevouwen (een of twee keer afhankelijk van de weefseldikte) aan elk uiteinde (zie Tabel met materialen). Gebruik twee kleine bindclips om de glasdia's aan elk uiteinde samen te persen (uiteindelijke dikte ongeveer 1 mm).
    OPMERKING: Dikkere weefsels vereisen langere scantijden. Het gevilde voetkussen kan een dag voor de beeldvorming tussen glasdia's worden samengeperst om de weefseldikte te verminderen.

7. Confocale laser scanning microscopie

  1. Bereid je voor op de beeldvormingssessie: zet het beeldvormingssysteem aan en start de acquisitiesoftware (zie Tabel met materialen). Gebruik een objectief met een lage vergroting/laag numeriek diafragma (bijvoorbeeld x5/0,15) om beelden vast te leggen, omdat lenzen met een lagere vergroting doorgaans langere werkafstanden hebben die nodig zijn voor dit experiment.
  2. Klik op Ja voor het dialoogvenster Werkgebied activeren. Activeer de 561 nm-laser op het tabblad Configuratie. Activeer op het hoofdscherm een zichtbaar straalpad door op de knop Zichtbaar te klikken. Stel een detector in op het bereik van 570-600 nm door op het bijbehorende actieve selectievakje te klikken.
  3. Selecteer het pictogram Tile Scan op het tabblad Acquire > Acquisition en stel de gewenste resolutie in (512 x 512 of 1024 x 1024).
  4. Plaats droog gemonteerd (geen water of PBS toegevoegd) weefselmonster gecomprimeerd tussen glasglaasjes op het microscooppodium en breng weefsel in beeld.
  5. Als u de scangrenzen wilt instellen, navigeert u naar de linker- of rechterbovenhoek van het voorbeeld. Klik op het tabblad Acquisitie onder het menu Tile Scan op de knop Positie markeren. Navigeer naar de tegenovergestelde hoek (respectievelijk rechtsonder of links) en klik nogmaals op de knop Positie markeren.
  6. Om de diepte van de Z-stack in te stellen, klikt u op de knop Live in de linkerbenedenhoek van het scherm en navigeert u naar het midden van het voorbeeld. Gebruik de z-asknop om naar de onderkant van het voorbeeld te scrollen.
  7. Klik op het tabblad Acquisitie onder het menu Z-Stack op de knop Begin . Blader door naar de bovenkant van het voorbeeld en klik op de knop Beëindigen . Klik op Z-stapgrootte en stel deze in op de gewenste waarde (bijv. 50 μm).
  8. Klik in de rechterbenedenhoek van het scherm op Start om de beeldacquisitie te starten.

8. Kwantitatieve analyse en 3D-reconstructie van de vasculariteit van de voetzool

  1. Download en installeer de nieuwste versie van Fiji (ImageJ) en de Vessel Analysis plugin20. Open microscopie-afbeeldingsbestanden in Fiji, die individuele Z-series combineren tot Z-stapels die in de z-as kunnen worden bekeken met behulp van de schuifregelaar onder aan de afbeelding.
  2. Selecteer de samengestelde Z-stack-afbeelding en kies vervolgens in het menu Afbeelding de optie Stapels > Z-project om een tweedimensionale projectie te maken. Converteer vervolgens de Z-projectie naar binair onder Proces > Binair > Binair maken.
  3. Voer de vasculaire dichtheidsplug-in uit onder Plug-ins > vasculaire dichtheid. Wanneer u hierom wordt gevraagd, gebruikt u de cursor om een ROI rond de omtrek van het voetpad en de cijfers te traceren. Let op de vaatdichtheid die wordt gerapporteerd, die wordt uitgedrukt als een percentage van de ROI (vasculaire gebiedsfractie).
  4. Als u 3D-reconstructies in Fiji wilt maken, selecteert u Stapels > 3D-project en stelt u de gewenste rotatieas, hoek en snelheid in onder het menu Afbeelding. U kunt ook Volume Viewer selecteren in het menu Plug-ins om afbeeldingen als segmenten te visualiseren of de reconstructie in de gewenste assen te manipuleren.
  5. Voor meer betrokken 3D-rendering gebruikt u alternatieve beeldanalyse- en verwerkingssoftware (zie Tabel met materialen). Converteer bestanden naar het gewenste softwareformaat en steek individuele tegelscans met behulp van de tegelstikfunctionaliteit.
  6. Nadat u afzonderlijke tegelscans aan elkaar hebt genaaid, opent u het samengestelde bestand en gaat u verder met het renderen van het volumeoppervlak. Klik op Nieuwe Surface toevoegen om de wizard Surface maken te openen en gebruik de pijlen om door menu's te schakelen, met name het instellen van de ROI en drempelintensiteit. Eenmaal tevreden met de oppervlakteweergave, gebruikt u de animatiefunctionaliteit om video's van de verwerkte afbeelding te maken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol beschrijft een betrouwbaar middel om ischemie en weefselverlies in het muriene voetpad te induceren met behulp van een combinatie van femorale slagader en veneuze coagulatie met L-NAME-toediening, een stikstofmonoxidesynthaseremmer, bij gevoelige FVB-muizen. Figuur 1 beschrijft de anatomie van de muriene achterpootvasculatuur en geeft de plaatsen van de femorale slagader en veneuze stolling aan (geel X), net proximaal aan de laterale circumflex femorale slagader (LCFA) en proxim...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel muis hindlimb ischemie het meest gebruikte preklinische model is om neovascularisatie in PAD en CLTI te bestuderen, is er een significante variatie in de ernst en het herstel van ischemie, afhankelijk van de specifieke muisstam die wordt gebruikt en de plaats, het aantal en de methode van arteriële verstoring. De combinatie van ligatie van de femorale slagader en IP-toediening van L-NAME kan op betrouwbare wijze hindlimb gangreen induceren bij FVB-muizen11. Dezelfde behandeling resulteert i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies aan Z-J L en OC V van de National Institutes of Health [R01HL149452 en VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. We bedanken ook de Microscopie en Imaging Facility van het Miami Project to Cure Paralysis aan de University of Miami School of Medicine voor het bieden van toegang tot hun beeldanalyse- en verwerkingssoftware.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Binder clips (small)Kantoorartikelenwinkel
Buprenorfine (langdurig vrijgevend)
Butterfly naald (25 G met Luer-Lok)VWR10148-584
Confocale laser-scanning microscoopLeicaTCS SP5
DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat)InvitrogenD282
Elektrocauterisatie-apparaatGemini Cautery System5917
Ethanol (100%)VWR89370-084
Fiji (ImageJ) softwareNIHGebruikte versie 2.1.0. Gratis download, geen licentie vereist.
SchuimbiopsiekussentjesFisher Scientific22-038-221
Formaline (neutraal gebufferd, 10%)VWR89370-094
FVB muizenJackson Laboratory001800
GlucoseSigma-AldrichG7528
HCl (1 M)Sigma-Aldrich13-1700
Imaris softwareOxford InstrumentsGebruikte versie 9.6.0.
IsofluraanPivetalNDC 46066-755-04
KClSigma-AldrichP9333
Ketamine
L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methylester hydrochloride)Sigma-AldrichN5751
Laser Doppler perfusie beeldvormerMoorLDImoorLDI2-HIRGebruikte moorLDI V5 software.
Microscoopglaasjes (25 x 75 x 1 mm)VWR48311-703
Na2HPO4Sigma-AldrichS7907
NaClSigma-AldrichS7653
NaH2PO4Sigma-AldrichS8282
NaOHSigma-AldrichS8263
Naalden (27 G)BD305109
Povidon-jood staafje (10%)MedlineMDS093901ZZ
Chirurgische instrumentenRoboz SurgicalFijne pincetten, naaldvoerder, veerschaar en hemostaat worden aanbevolen.
Naad (5-0 absorbeerbaar)DemeTECHG275017B0P
Spuiten (10 mL)BD305482
Drieweg stopkranenCole-Parmer19406-49
Vascular Analysis PluginGratis download, geen licentie vereist. Zie referentie: Elfarnawany (2015).
Xylazin

Referenties

  1. Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
  2. Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of critical limb ischemia: A review of recent literature. Vascular Health and Risk Management. 15, 187-208 (2019).
  3. Mills, J. L., et al. The society for vascular surgery lower extremity threatened limb classification system: Risk stratification based on Wound, Ischemia, and foot Infection (WIfI). Journal of Vascular Surgery. 59 (1), 220-234 (2014).
  4. Conte, M. S., et al. Global vascular guidelines on the management of chronic limb-threatening ischemia. Journal of Vascular Surgery. 69 (6), (2019).
  5. Yeager, R. A. Relationship of hemodialysis access to finger gangrene in patients with end-stage renal disease. Journal of Vascular Surgery. 36 (2), 245-249 (2002).
  6. Al Wahbi, A. Autoamputation of diabetic toe with dry gangrene: A myth or a fact. Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 11, 255-264 (2018).
  7. Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M. D., Cooke, J. P. Murine model of hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (23), e1035(2009).
  8. Hellingman, A. A., et al. Variations in surgical procedures for hind limb ischaemia mouse models result in differences in collateral formation. European Journal of Vascular and Endovascular Surgery. 40 (6), 796-803 (2010).
  9. Chalothorn, D., Clayton, J. A., Zhang, H., Pomp, D., Faber, J. E. Collateral density, remodeling, and VEGF-A expression differ widely between mouse strains. Physiological Genomics. 30 (2), 179-191 (2007).
  10. Dokun, A. O., et al. A quantitative trait locus (LSq-1) on mouse chromosome 7 is linked to the absence of tissue loss after surgical hindlimb ischemia. Circulation. 117 (9), 1207-1215 (2008).
  11. Parikh, P. P., et al. A Reliable Mouse Model of Hind limb Gangrene. Annals of Vascular Surgery. 48, 222-232 (2018).
  12. Kopincová, J., Púzserová, A., Bernátová, I. L-NAME in the cardiovascular system - nitric oxide synthase activator. Pharmacological Reports. 64 (3), 511-520 (2012).
  13. Soiza, R. L., Donaldson, A. I. C., Myint, P. K. Pathophysiology of chronic peripheral ischemia: new perspectives. Therapeutic Advances in Chronic Disease. 11, 1-15 (2020).
  14. McDermott, M. M., et al. Skeletal muscle pathology in peripheral artery disease a brief review. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40 (11), 2577-2585 (2020).
  15. Usui, M., et al. Pathogenic role of oxidative stress in vascular angiotensin-converting enzyme activation in long-term blockade of nitric oxide synthesis in rats. Hypertension. 34 (4), 546-551 (1999).
  16. Aref, Z., de Vries, M. R., Quax, P. H. A. Variations in surgical procedures for inducing hind limb ischemia in mice and the impact of these variations on neovascularization assessment. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 1-14 (2019).
  17. Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nature Protocols. 3 (11), 1703-1708 (2008).
  18. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: Versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends in Neurosciences. 12 (9), 333-341 (1989).
  19. Boden, J., et al. Whole-mount imaging of the mouse hindlimb vasculature using the lipophilic carbocyanine dye DiI. BioTechniques. 53 (1), 3-6 (2012).
  20. Elfarnawany, M. H. Signal processing methods for quantitative power doppler microvascular angiography. Electronic Thesis and Dissertation Repository. , 3106(2015).
  21. Matic, M., Matic, A., Djuran, V., Gajinov, Z., Prcic, S., Golusin, Z. Frequency of peripheral arterial disease in patients with chronic venous insufficiency. Iranian Red Crescent Medical Journal. 18 (1), 1-6 (2016).
  22. Ammermann, F., et al. Concomitant chronic venous insufficiency in patients with peripheral artery disease: Insights from MR angiography. European Radiology. 30 (7), 3908-3914 (2020).
  23. Yang, Y., et al. Cellular and molecular mechanism regulating blood flow recovery in acute versus gradual femoral artery occlusion are distinct in the mouse. Journal of Vascular Surgery. 48 (6), 1546-1558 (2008).
  24. Padgett, M. E., McCord, T. J., McClung, J. M., Kontos, C. D. Methods for acute and subacute murine hindlimb ischemia. Journal of Visualized Experiments. (112), e54166(2016).
  25. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-432 (2018).
  26. Greco, A., et al. Repeatability, reproducibility and standardisation of a laser doppler imaging technique for the evaluation of normal mouse hindlimb perfusion. Sensors. 13 (1), 500-515 (2013).
  27. Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: Functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS ONE. 8 (12), 84047(2013).
  28. Hlushchuk, R., Haberthür, D., Djonov, V. Ex vivo microangioCT: Advances in microvascular imaging. Vascular Pharmacology. 112, 2-7 (2019).
  29. Robertson, R. T., et al. Use of labeled tomato lectin for imaging vasculature structures. Histochemistry and Cell Biology. 143 (2), 225-234 (2015).
  30. Lee, J. J., et al. Systematic interrogation of angiogenesis in the ischemic mouse hind limb: Vulnerabilities and quality assurance. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 40, 2454-2467 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Perifeer Arterieel VaatlijdenLedemaatische IschemieDiI perfusieConfocale MicroscopieCoagulatie van de Femorale ArterieStikstofoxide synthaseremmerVasculaire Reconstructie
Driedimensionale beeldvorming met hoge resolutie van de voetzool vasculatuur in een Murine Hindlimb Gangreen model
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.