Het huidige protocol beschrijft een uniek, klinisch relevant model van perifere arteriële ziekte dat femorale slagader en aderelektrocoagulatie combineert met de toediening van een stikstofmonoxidesynthaseremmer om hindlimb gangreen te induceren in FVB-muizen. Intracardiale DiI-perfusie wordt vervolgens gebruikt voor hoge resolutie, driedimensionale beeldvorming van de voetzool vasculatuur.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Driedimensionale beeldvorming met hoge resolutie van de voetzool vasculatuur in een Murine Hindlimb Gangreen model
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Perifere arteriële ziekte (PAD) is een belangrijke oorzaak van morbiditeit als gevolg van chronische blootstelling aan atherosclerotische risicofactoren. Patiënten die lijden aan de meest ernstige vorm, chronische ledemaatbedreigende ischemie (CLTI), worden geconfronteerd met aanzienlijke beperkingen in het dagelijks leven, waaronder chronische pijn, beperkte loopafstand zonder pijn en niet-genezende wonden. Preklinische modellen zijn ontwikkeld bij verschillende dieren om PAD te bestuderen, maar muis hindlimb ischemie blijft de meest gebruikte. Er kan een aanzienlijke variatie zijn in reactie op ischemische belediging in deze modellen, afhankelijk van de gebruikte muizenstam en de plaats, het aantal en de middelen van arteriële verstoring. Dit protocol beschrijft een unieke methode die femorale slagader en ader elektrocoagulatie combineert met de toediening van een stikstofmonoxidesynthase (NOS) -remmer om op betrouwbare wijze voetzoolgangreen te induceren in Friend Virus B (FVB) muizen die lijken op het weefselverlies van CLTI. Terwijl traditionele middelen voor het beoordelen van reperfusie zoals laser Doppler perfusie beeldvorming (LDPI) nog steeds worden aanbevolen, wordt intracardiale perfusie van de lipofiele kleurstof 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanineperchloraat (DiI) gebruikt om de vasculatuur te labelen. Daaropvolgende confocale laserscanmicroscopie met volledige mount maakt een hoge resolutie, driedimensionale (3D) reconstructie van voetkussen vasculaire netwerken mogelijk die een aanvulling vormt op traditionele middelen om reperfusie in hindlimb ischemiemodellen te beoordelen.
Inleiding
Perifere arteriële ziekte (PAD), gekenmerkt door verminderde bloedtoevoer naar de ledematen als gevolg van atherosclerose, treft 6,5 miljoen mensen in de Verenigde Staten en 200 miljoen mensen wereldwijd1. Patiënten met PAD ervaren een verminderde ledemaatfunctie en kwaliteit van leven, en degenen met CLTI, de meest ernstige vorm van PAD, lopen een verhoogd risico op amputatie en overlijden met een 5-jarig sterftecijfer van bijna 50%2. In de klinische praktijk worden patiënten met enkel-brachiale indices (ABI) <0,9 geacht PAD te hebben, en patiënten met ABI <0,4 geassocieerd met rustpijn of weefselverlies als
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven beschreven in het protocol werden goedgekeurd door de University of Miami Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). FVB-muizen, zowel mannelijk als vrouwelijk, in de leeftijd van 8-12 weken, werden gebruikt voor de studie.
1. Bereiding van L-NAME-oplossing
- Bereid onder steriele omstandigheden in een laminaire stromingskap een L-NAME-stamoplossing door 1 g L-NAME-poeder (zie Materiaaltabel) op te lossen met 20 ml steriel water om een oplossing van 50 mg/ml te maken. Bewaar de stamoplossing in 300-500 μL aliquots bij -20 °C gedurende maximaal 3 maanden.
- Om een w....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol beschrijft een betrouwbaar middel om ischemie en weefselverlies in het muriene voetpad te induceren met behulp van een combinatie van femorale slagader en veneuze coagulatie met L-NAME-toediening, een stikstofmonoxidesynthaseremmer, bij gevoelige FVB-muizen. Figuur 1 beschrijft de anatomie van de muriene achterpootvasculatuur en geeft de plaatsen van de femorale slagader en veneuze stolling aan (geel X), net proximaal aan de laterale circumflex femorale slagader (LCFA) en proxim.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Hoewel muis hindlimb ischemie het meest gebruikte preklinische model is om neovascularisatie in PAD en CLTI te bestuderen, is er een significante variatie in de ernst en het herstel van ischemie, afhankelijk van de specifieke muisstam die wordt gebruikt en de plaats, het aantal en de methode van arteriële verstoring. De combinatie van ligatie van de femorale slagader en IP-toediening van L-NAME kan op betrouwbare wijze hindlimb gangreen induceren bij FVB-muizen11. Dezelfde behandeling resulteert i.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidies aan Z-J L en OC V van de National Institutes of Health [R01HL149452 en VITA (NHLBl-CSB-HV-2017-01-JS)]. We bedanken ook de Microscopie en Imaging Facility van het Miami Project to Cure Paralysis aan de University of Miami School of Medicine voor het bieden van toegang tot hun beeldanalyse- en verwerkingssoftware.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Binder clips (small) | Kantoorartikelenwinkel | ||
| Buprenorfine (langdurig vrijgevend) | |||
| Butterfly naald (25 G met Luer-Lok) | VWR | 10148-584 | |
| Confocale laser-scanning microscoop | Leica | TCS SP5 | |
| DiI (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchloraat) | Invitrogen | D282 | |
| Elektrocauterisatie-apparaat | Gemini Cautery System | 5917 | |
| Ethanol (100%) | VWR | 89370-084 | |
| Fiji (ImageJ) software | NIH | Gebruikte versie 2.1.0. Gratis download, geen licentie vereist. | |
| Schuimbiopsiekussentjes | Fisher Scientific | 22-038-221 | |
| Formaline (neutraal gebufferd, 10%) | VWR | 89370-094 | |
| FVB muizen | Jackson Laboratory | 001800 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| HCl (1 M) | Sigma-Aldrich | 13-1700 | |
| Imaris software | Oxford Instruments | Gebruikte versie 9.6.0. | |
| Isofluraan | Pivetal | NDC 46066-755-04 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Ketamine | |||
| L-NAME (Nω-Nitro-L-arginine methylester hydrochloride) | Sigma-Aldrich | N5751 | |
| Laser Doppler perfusie beeldvormer | MoorLDI | moorLDI2-HIR | Gebruikte moorLDI V5 software. |
| Microscoopglaasjes (25 x 75 x 1 mm) | VWR | 48311-703 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldrich | S7907 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S8282 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8263 | |
| Naalden (27 G) | BD | 305109 | |
| Povidon-jood staafje (10%) | Medline | MDS093901ZZ | |
| Chirurgische instrumenten | Roboz Surgical | Fijne pincetten, naaldvoerder, veerschaar en hemostaat worden aanbevolen. | |
| Naad (5-0 absorbeerbaar) | DemeTECH | G275017B0P | |
| Spuiten (10 mL) | BD | 305482 | |
| Drieweg stopkranen | Cole-Parmer | 19406-49 | |
| Vascular Analysis Plugin | Gratis download, geen licentie vereist. Zie referentie: Elfarnawany (2015). | ||
| Xylazin |
Referenties
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2020 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 141 (9), 139(2020).
- Duff, S., Mafilios, M. S., Bhounsule, P., Hasegawa, J. T. The burden of ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
