In Vitro en In Vivo methoden om Megakaryopoëse te onderzoeken

François Lanza; Christian Gachet; Anita Eckly

doi:10.3791/63286

Methodenartikel

In Vitro en In Vivo methoden om Megakaryopoëse te onderzoeken

704 weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63286

⸱

17 november 2021

François Lanza¹ , Christian Gachet¹ , Anita Eckly¹

¹Université de Strasbourg, INSERM, EFS Grand Est, BPPS UMR-S 1255, FMTS, F-67065 Strasbourg, France

In dit artikel

Samenvatting

BESPROKEN ARTIKELEN:

1. Pongerard, A., Mallo, L., Gachet, C., Lanza, F., Strassel, C. Leukodepletion filters-derived CD34+ cellen als celbron om de differentiatie van megakaryocyten en de vorming van bloedplaatjes te bestuderen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62499 (2021).

2. Kimmerlin, Q., Tavian, M., Gachet, C., Lanza, F., Brouard, N. Isolatie van muis-megakaryocyten-progenitors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62498 (2021).

3. Boscher, J., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. Megakaryocytencultuur in een 3D methylcellulose-gebaseerde hydrogel om celrijping te verbeteren en de impact van stijfheid en beperking te bestuderen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62511 (2021).

4. Scandola, C., Lanza, F., Gachet, C., Eckly, A. In situ exploratie van murine megakaryopoëse met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171) e62494 (2021).

5. Guinard, I., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C., Eckly, A. Dynamiek van de vorming van proplatetten van verse beenmerg-explantaten van muizen. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62501 (2021).

6. Bornert, A., Pertuy, F., Gachet, C., Lanza, F., Léon, C. In vivo twee-foton beeldvorming van megakaryocyten en proplatetten in het muisschedelbeenmerg. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (171), e62515 (2021)

Redactioneel

Trombocytin bloedcellen zijn kleine, anucleaire bloedcellen, essentieel voor hemostase, die afkomstig zijn van megakaryocyten (MK's) in het beenmerg (BM). Tijdens hun differentiatie van hematopoëtische stamcellen ontwikkelen MK's zich tot gigantische cellen in een complex proces van differentiatie en rijping dat polyploïdisatie en cytoplasmatische rijping omvat. In de laatste ontwikkelingsfase, wanneer MK's in contact zijn met endotheelcellen, bereiken ze hun volwassen stadium en steken lange cytoplasmatische uitsteeksels, zogenaamde proplateletten, uit in bloedvaten, die vervolgens fragmenteren om trombocyten in de bloedbaan te vormen¹^,². De mechanismen die de rijping van MK en de transendotheliale vorming van proplateletten reguleren, zijn nog onvoldoende begrepen. Het doel van deze verzameling is om complementaire methoden samen te brengen die zullen bijdragen aan een beter begrip van de biologie van MK's in vitro en in vivo.

In vitro expansie en differentiatie van MK's wordt veel gebruikt om de mechanismen die ten grondslag liggen aan de biogenesis van bloedplaatjes te bestuderen. In het protocol van Pongerard et al. beschrijven de auteurs een gestandaardiseerd kweekprotocol voor de differentiatie van MK's uit humane CD34⁺ hematopoëtische progenitors. Ze benadrukken vooral dat leukocytenfilters die beschikbaar zijn in bloedcentra een uitzonderlijke bron zijn voor het verzamelen van CD34⁺ cellen. Hun artikel bevat verschillende essentiële richtlijnen over hoe CD34⁺ cellen te extraheren, hoe de zuiverheid ervan te beoordelen en de belangrijkheid van hun zaadintensiteit. De auteurs stellen ook een gekalibreerde pipetmethode voor, vijf keer achtereenvolgens, om functionele bloedplaatjes efficiënt vrij te geven. Interessante toepassingen van deze methode zijn de mogelijkheid om farmacologische verbindingen te evalueren of om genetisch CD34⁺ cellen te manipuleren met behulp van een CRISPR-Cas9 genoombewerkingsmethode³^,⁴. Voor muizenstudies presenteren Kimmerlin et al. een celsorteerstrategie om MK-progenitors in voldoende aantallen te zuiveren die compatibel zijn met moleculaire en cellulaire assays. De auteurs bespreken de voordelen van het gebruik van de iliacale kam als een bron van beenmerg dat een groot aantal hematopoëtische progenitors bevat en van het uitvoeren van een twee-stappen magnetische depletie van ongewenste cellen vóór celsortering met behulp van een combinatie van celoppervlaktemarkers. Een groot voordeel van deze methode is de vermindering van het aantal dieren dat nodig is om hoog gezuiverde MK-progenitors te verkrijgen, wat bijvoorbeeld interessant kan zijn voor onderzoekers die de hiërarchie en differentiatie van hematopoëtische progenitors bestuderen. In deze context beschrijven Boscher et al. een methode om progenitors te kweken in een 3D-medium bestaande uit 2% methylcellulose om de in vivo omgeving beter te imiteren. In feite hebben deze auteurs eerder aangetoond dat MK's die in een 3D-hydrogel zijn gekweekt een grotere rijpingstoestand en een grotere capaciteit om progenitors te vormen bereiken in vergelijking met die die in een vloeibaar medium zijn gekweekt⁵. Kritische stappen worden in dit protocol gemarkeerd, zoals het juiste volume methylcellulose om een optimale mediumstijfheid te verkrijgen, het aantal cellen dat equivalent zou moeten zijn in elke experimentele conditie, en het risico op besmetting. Voor functionele verificatie van het rijpingsniveau leggen de auteurs uit hoe de in gel gekweekte cellen op de derde dag van de kweek in vloeibaar medium moeten worden gesuspendeerd en hoe de cellen voor toekomstige analyse moeten worden gefixeerd door immunokleuring, flowcytometrie of elektronenmicroscopie. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) is de voorkeursbeeldvormingsbenadering om een hoge resolutie ultrastructuur van MK's te leveren. Hier delen Scandola et al. een protocol om de ultrastructuur van MK's in hun natuurlijke BM-omgeving te analyseren en om hun celdichtheid te kwantificeren en de verschillende rijpingsstadia te scoren. De auteurs gebruiken TEM om de cellulaire gebeurtenissen te analyseren die optreden wanneer MK's met de sinusoidale wand interageren, zoals hun korte invasieve podosome-achtige uitsteeksels die het endotheel penetreren⁶. Een beperking van de methode is dat de initiële fase van MK-betrokkenheid niet kan worden geanalyseerd vanwege het ontbreken van specifieke ultrastructurele kenmerken van deze onrijpe cellen. Zoals opgemerkt, heeft deze beeldvormingsbenadering het voordeel dat kleine BM-monsters worden gebruikt, waardoor meerdere studies met een enkele muis mogelijk zijn. Als voorbeeld kunnen de andere beenmergmonsters worden gebruikt voor de beenmerg explanttechniek die in deze verzameling door Guinard et al. wordt gepresenteerd om de dynamische extensie van proplateletten van MK's te bestuderen. Het sterkste punt van deze methode ligt in het gebruik van MK's die zich in het beenmerg hebben ontwikkeld, waardoor mogelijke verkeerde interpretaties als gevolg van artefacten van celdifferentiatie in cultuur worden vermeden. Dit is eerder gedocumenteerd bij muizen met MK-beperkte MYH9 inactivatie, waarbij divergente resultaten werden gevonden in vitro en ex vivo⁷. De auteurs benadrukken ook de eenvoudige, reproduceerbare en snelle aard van deze aanpak. Een interessante opmerking van hun protocol is de mogelijkheid om microscopen uitgerust met navigatiesoftware te gebruiken om het volgen/kwantificeren van MK's die proplateletten uitsteken te vergemakkelijken. Een complementaire methode van het explantmodel is de twee-foton beeldvorming van MK's in de muizenschedel. Het unieke van deze techniek is de mogelijkheid om in vivo het dynamische gedrag van fluorescent gelabelde MK's in het beenmerg te bestuderen en de extensie van proplateletten te visualiseren. Dit protocol heeft het voordeel dat het minimaal invasief is, met beperkte chirurgische ingrepen, waardoor ontstekingsreacties worden vermeden die naar verluidt van invloed zijn op de vorming van proplateletten. Zoals Bornert et al. opmerken, is een beperking van deze methode de smalle diepte

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door ARMESA (Association de Recherche et Développement en Médecine et Santé Publique), de Europese Unie via het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO) en door Grant ANR-17-CE14-Megaplatprod aan H.d.S en ANR-18-CE14-PlatForMechanics aan C.L.

Referenties

Boscher, J., et al. Blood platelet formation at a glance. Journal of Cell Science. 133 (20), 244731(2020).
Machlus, K. R., Italiano, J. E. The incredible journey: From megakaryocyte development to platelet formation. The Journal of Cell Biology. 201 (6), 785-796 (2013).
Strassel, C., et al. Aryl hydrocarbon receptor-dependent enrichment of a megakaryocytic precursor with a high potential to produce proplatelets. Blood. 127 (18), 2231-2240 (2016).
Montenont, E., et al. CRISPR-edited megakaryocytes for rapid screening of platelet gene functions. Blood Advances. 5 (9), 2362-2374 (2021).
Aguilar, A., et al. Importance of environmental stiffness for megakaryocyte differentiation and proplatelet formation. Blood. 128 (16), 2022-2032 (2016).
Eckly, A., et al. Megakaryocytes use in vivo podosome-like structures working collectively to penetrate the endothelial barrier of bone marrow sinusoids. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (11), 2987-3001 (2020).
Eckly, A., et al. Proplatelet formation deficit and megakaryocyte death contribute to thrombocytopenia in Myh9 knockout mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (10), 2243-2251 (2010).
Bornert, A., et al. Cytoskeletal-based mechanisms differently regulate in vivo and in vitro proplatelet formation. Haematologica. 106 (5), 1368-1380 (2021).
Strassel, C., Gachet, C., Lanza, F. On the way to in vitro platelet production. Transfusion Clinique et Biologique. 25 (3), 220-227 (2018).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Megakaryocyte Differentiation Platelet Formation CD34+ Cells Mouse Megakaryocyte Progenitors 3D Methylcellulose-based Hydrogel Cell Maturation Murine Megakaryopoiesis Transmission Electron Microscopy Proplatelet Formation Dynamics Two-photon Imaging Bone Marrow Explants