Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Registratie van calciumtransiënten in de neuromusculaire overgang van de muis met een hoge temporele resolutie met behulp van confocale microscopie

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63308

⸱

1 december 2021

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Biophysics of Synaptic Processes, Kazan Institute of Biochemistry and Biophysics, FRC Kazan Scientific Center of RAS, 2Department of Radiophotonics and Microwave Technologies, Kazan National Research Technical University named after A.N. Tupolev, 3Department of Normal Physiology, Kazan State Medical University

In dit artikel

Samenvatting

Het protocol beschrijft de methode om een fluorescerende calciumkleurstof door de gesneden zenuw in de motorische zenuwuiteinden van de muis te laden. Daarnaast wordt een unieke methode gepresenteerd voor het registreren van snelle calciumtransiënten in de perifere zenuwuiteinden met behulp van confocale microscopie.

Samenvatting

Schatting van het presynaptische calciumgehalte is een belangrijke taak bij het bestuderen van synaptische transmissie, omdat de invoer van calcium in de presynaptische cel een cascade van gebeurtenissen veroorzaakt die leiden tot de afgifte van neurotransmitters. Bovendien bemiddelen veranderingen in presynaptische calciumspiegels de activiteit van veel intracellulaire eiwitten en spelen ze een belangrijke rol in synaptische plasticiteit. Het bestuderen van calciumsignalering is ook belangrijk voor het vinden van manieren om neurodegeneratieve ziekten te behandelen. De neuromusculaire junctie is een geschikt model voor het bestuderen van synaptische plasticiteit, omdat het slechts één type neurotransmitter heeft. Dit artikel beschrijft de methode voor het laden van een calciumgevoelige kleurstof door de gesneden zenuwbundel in de motorische zenuwuiteinden van de muizen. Deze methode maakt het mogelijk om alle parameters met betrekking tot intracellulaire calciumveranderingen te schatten, zoals het basale calciumgehalte en de calciumtransiënt. Aangezien de instroom van calcium uit de buitenkant van de cel in de zenuwklemmen en de binding / ontkoppeling ervan aan de calciumgevoelige kleurstof binnen het bereik van enkele milliseconden plaatsvinden, is een snel beeldvormingssysteem vereist om deze gebeurtenissen te registreren. Inderdaad, hogesnelheidscamera's worden vaak gebruikt voor de registratie van snelle calciumveranderingen, maar ze hebben parameters met een lage beeldresolutie. Het hier gepresenteerde protocol voor het registreren van calciumtransiënt maakt een extreem goede ruimtelijk-temporele resolutie mogelijk die wordt geboden door confocale microscopie.

Inleiding

Het probleem van het meten van snelle calciumgolven in prikkelbare cellen is een van de belangrijkste en meest uitdagende aspecten van het bestuderen van signaaloverdracht in het centrale en perifere zenuwstelsel. Calciumionen spelen een belangrijke rol bij het activeren van de afgifte van neurotransmitters, synaptische plasticiteit en modulatie van de activiteit van verschillende intracellulaire eiwitten 1,2,3,4,5. Het bestuderen van calciumsignalering is ook belangrijk voor het vinden van manieren om neurodegeneratieve ziekten te behandelen6. Om veranderingen in de calciumspiegels te meten, worden vaak fluorescerende calciumgevoelige kleurstoffen gebruikt en worden veranderingen in hun fluorescentieniveau geanalyseerd 7,8,9.

Het laden van calciumkleurstoffen in cellen kan op verschillende manieren worden bereikt. Overwegend worden celpermeante kleurstoffen gebruikt10,11. In een dergelijk geval is het echter niet alleen moeilijk om de concentratie van een kleurstof in de cel te regelen, maar het is ook moeilijk om doelcellen te selecteren om te laden. Deze methode is niet van toepassing op het bestuderen van perifere zenuwuiteinden, omdat de kleurstof postsynaptische cellen binnendringt. In plaats daarvan zijn celondoorlatende kleurstoffen meer geschikt voor dergelijke preparaten. In dit geval worden de kleurstoffen aan de cellen geleverd door micro-injectie of via een patchpipet 12,13,14. Er is ook een methode om door een zenuwstomp te laden. De laatste methode is het meest geschikt voor neuromusculaire junctiepreparaten 15,16,17,18,19,20. Het maakt het mogelijk om kleuring uit te voeren voor alleen cellen van belang. Hoewel deze methode geen nauwkeurige evaluatie geeft van de concentratie van de kleurstof in de doelcel, kan de concentratie ongeveer worden geschat door het fluorescentieniveau van de cellen in rust in oplossingen te vergelijken met een bekende concentratie calcium21. In deze studie wordt een wijziging van deze methode toegepast op synapsen van zoogdieren gepresenteerd.

Calciuminvoer tijdens de depolariserende fase van het actiepotentiaal is een snel proces, vooral in de neuromusculaire overgang; daarom is voor de registratie ervan geschikte apparatuur vereist1. Een recente studie met behulp van een spanningsgevoelige fluorescerende kleurstof toonde aan dat de duur van de actiepotentiaal in de perifere synaps van een muis ongeveer 300 μs22 is. Calciumtransiënt, geëvalueerd met behulp van calciumgevoelige kleurstoffen in de perifere synapsen van de kikker, heeft een langere duur: de stijgingstijd is ongeveer 2-6 ms en de vervaltijd is ongeveer 30-90 ms, afhankelijk van de gebruikte calciumkleurstof23,24. Om snelle processen te meten met behulp van fluorescerende kleurstoffen, worden over het algemeen CCD- of CMOS-camera's gebruikt, met snelle en gevoelige CCD-matrices. Deze camera's hebben echter het nadeel van een lage resolutie, beperkt door de grootte van de gevoelige elementen van de matrix 25,26,27,28. De snelste camera's met voldoende gevoeligheid om zowel actiepotentialen als calciumtransiënten vast te leggen als reactie op laagfrequente stimulatie van cellen hebben een scanfrequentie van 2.000 Hz en een matrix met een afmeting van 80 x 8029. Om signalen met een hogere ruimtelijke resolutie te verkrijgen, wordt confocale microscopie gebruikt, vooral als het nodig is om enkele volumetrische veranderingen in het signaal 30,31,32 te beoordelen. Maar er moet rekening mee worden gehouden dat confocale microscopie een hoge scansnelheid heeft in de lijnscanmodus, maar er zijn nog steeds aanzienlijke beperkingen op de snelheid van opnames van snelle processen bij het bouwen van een ruimtelijk beeld33. Er zijn confocale microscopen op basis van roterende Nipkow-schijven (spleetscanmicroscopie) en Multipoint-Array Scanners, die een hogere scansnelheid hebben. Tegelijkertijd zijn ze inferieur aan de klassieke confocale microscopen in confocale beeldfiltering (pinholes crosstalk voor microscopen met een Nipkow-schijf)32,34,35. Confocale beeldvorming met resonantiescanning kan ook een hoge spatio-temporele resolutie bieden die vereist is voor hoge temporele metingen36. Houd er echter rekening mee dat de registratie van zwakke fluorescentieresponsen bij een hoge scansnelheid bij gebruik van resonantiescanners zeer gevoelige detectoren vereist, zoals hybride detectoren36.

Dit artikel presenteert een methode voor het verhogen van de temporele resolutie van signalen die zijn opgenomen met de Laser Scanning Confocal Microscopy (LSCM) met behoud van de ruimtelijke resolutie37. De huidige methode is een doorontwikkeling van de eerder beschreven methoden en overgezet naar het LSCM-platform 38,39,40. Deze aanpak vereist geen veranderingen in de microscoophardware en is gebaseerd op de toepassing van een algoritme voor het opnemen van periodiek opgeroepen fluorescentiesignalen met een tijdverschuiving ten opzichte van het moment van stimulatie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Experimenten werden uitgevoerd op geïsoleerde zenuw-spierpreparaten van levator auris longus (m. LAL) van de muizen BALB/C (20-23 g, 2-3 maanden oud)41. De experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen voor het gebruik van proefdieren van de Kazan Federal University en de Kazan Medical University, in overeenstemming met de NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Het experimentele protocol voldeed aan de eisen van richtlijn 86/609/EEG van de Raad van de Europese Gemeenschappen en werd goedgekeurd door de ethische commissie van de Medische Universiteit van Kazan.

1. Voorbereiding van de Ringer's en Filing oplossingen

  1. Bereid de Ringer's oplossing voor zoogdierspier door de volgende ingrediënten te mengen: NaCl (137 mM), KCl (5 mM), CaCl2 (2 mM), MgCl2 (1 mM), NaH2PO4 (1 mM), NaHCO3 (11,9 mM) en glucose (11 mM). Borrel door de oplossing met 95% O2 en 5% CO2 en pas de pH aan op 7,2-7,4 door indien nodig HCl/NaOH toe te voegen.
  2. Bereid de oplossing voor het laden van verf voor.
    1. Bereid HEPES (10 mM) oplossing met pH in het bereik van 7,2-7,4. 500 μg commerciële kleurstof wordt geleverd in een injectieflacon van 500 μL. Los de kleurstof op in 14 μL van de HEPES-oplossing om een kleurstofconcentratie van 30 mM te verkrijgen. Goed schudden en centrifugeren tot het helemaal is opgelost.
    2. Verdun de oplossing van ca2+ indicator met HEPES-oplossing tot 1 mM concentratie. Bewaar het in een vriezer (-20 °C) en vermijd blootstelling aan licht.

2. Procedure voor het laden van verf

OPMERKING: De procedure voor het laden van kleurstof wordt uitgevoerd volgens het protocol voor het laden door de zenuwstomp, aangepast van de eerder gepubliceerde protocollen 19,42,43,44,45,46.

  1. Dissecteer LAL-spier volgens de dissectieprocedure voor dit preparaat zoals beschreven in de eerder gepubliceerde protocollen 47,48.
    1. Bevestig het weefsel licht uitgerekt (niet meer dan 30% van de oorspronkelijke lengte) in de met elastomeer gecoate petrischaal met fijne roestvrijstalen pinnen en voeg Ringer's oplossing toe totdat de spier volledig bedekt is.
      OPMERKING: De petrischaal is voorgevuld met elastomeer volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
  2. Bereid de vulpipet voor
    1. Bereid met behulp van een micropipettetrekker (zie Materiaaltabel) een micropipette met een fijne punt die zo scherp mogelijk is voor de intracellulaire opnames. Gebruik haarvaten zonder interne filamenten (1,5 mm in buitendiameter en 0,86 of 1,10 mm in binnendiameter).
    2. Breek de micropipettepunt af na het scoren van de taps toelopende met een schuurmiddel, waardoor de punt open blijft tot ongeveer 100 μm in diameter. Poets de punt naar beneden om te beperken wanneer de inwendige diameter krimpt van >80 μm tot 12-13 μm. Bevestig een siliconen buis aan de ene kant van de vulpipet en een spuit (zonder naald) aan de andere kant.
  3. Zoek onder een stereomicroscoop de plaats waar de zenuwstam verandert in afzonderlijke zenuwtakken. Plaats de vulpipet met de gemonteerde buis en de spuit met wax op de petrischaal. Beweeg de pipetpunt totdat deze boven de zenuw staat.
  4. Snijd met een fijne schaar de zenuw dicht bij de spiervezel, waardoor een klein stukje van de zenuwstomp ongeveer 1 mm lang blijft. Zuig de zenuwstomp voorzichtig samen met wat Ringer's oplossing, zonder deze te knijpen, in de punt van de vulpipet. Verwijder de siliconen buis uit de vulpipet.
  5. Teken een bepaalde hoeveelheid van de kleurstoflaadoplossing (~ 0,3 μL) met behulp van een spuit met een lange gloeidraad. Dit volume komt overeen met ongeveer 3 cm van de gloeidraad.
    OPMERKING: In eerste instantie is het noodzakelijk om een gloeidraad te maken van een pipetpunt met een volume van 10 μL door aan het vuur te trekken met behulp van een alcohollamp of een gasbrander.
  6. Steek de gloeidraadpunt met laadoplossing voorzichtig in de vulpipet. Laat het mengsel direct los op de zenuwstomp. Incubeer het preparaat bij kamertemperatuur in het donker gedurende 30 minuten.
  7. Spoel daarna het preparaat af met verse Ringer-oplossing en incubeer bij 25 °C gedurende maximaal 2 uur in een glazen bekerglas met 50 ml (of meer) Ringer's oplossing (bereiding moet worden bedekt met de oplossing). Gedurende deze tijd zal de kleurstof de synapsen bereiken.

3. Video-opname met confocale microscopie

OPMERKING: Registratie van calciumtransiënten wordt uitgevoerd met een laserscan confocale microscoop (LSCM) (zie Materiaaltabel). Om snelle calciumtransiënten te registreren, werd een origineel protocol gebruikt dat opnames van signalen met een voldoende ruimtelijke en temporele resolutie mogelijk maakte. De methode is grondig beschreven in de publicatie van Arkhipov et al37. De microscoop was uitgerust met een 20x waterdompelobjectief (1,00 NA). De 488 nm laserlijn werd gedempt tot 10% intensiteit en emissiefluorescentie werd verzameld van 503 tot 558 nm.

  1. Monteer het preparaat in de met siliciumelastomeer gecoate experimentele kamer en bevestig het, enigszins uitgerekt, met een set stalen micronaalden. Spoel het preparaat uitgebreid af met Ringer's oplossing.
    OPMERKING: Een eenvoudige op maat gemaakte perfusie-experimentele kamer gemaakt van organisch glas met de bodem van de kamer bedekt met een elastomeer (bereid in overeenstemming met de instructies van de fabrikant; zie Tabel van materialen) werd gebruikt. De kamer heeft een oplossingstoevoerbuis. De oplossing wordt weggepompt via een naald van een spuit, gemonteerd op een magnetische houder (zie Materiaaltabel). Als experimentele kamer kon een petrischaal worden gebruikt (zoals degene die wordt gebruikt voor incubatie van het preparaat), maar met bevestigde toevoer- en zuigbuizen.
  2. Installeer een zuigelektrode die zal worden gebruikt om de zenuw te stimuleren.
    OPMERKING: De constructie van de elektrode is vergelijkbaar met wat werd gepubliceerd in het artikel uit 2015 van Kazakov et al49. Plaats en bevestig de elektrode door naast het bad te harsen. Beweeg de punt dicht bij de zenuwstomp en aspirateer deze in de elektrode.
  3. Monteer de voorbereidingskamer op het microscooppodium en plaats de inlaat- en uitlaatfittingen in de kamer.
  4. Om het preparaat te doordrenken, gebruikt u een eenvoudig zwaartekrachtstroomgestuurd systeem. Schakel de perfusiezuigpomp in om de overtollige oplossing te verwijderen.
  5. Steek de stimulerende zuigelektrode in een elektrische stimulator en zorg ervoor dat er spiersamentrekkingen optreden na prikkels. Zie rubriek 3.9-3.12 voor stimulatieomstandigheden en opname.
  6. Vul het perfusiesysteem met de Ringer-oplossing met d-tubocurarine (10 μM).
    OPMERKING: Deze oplossing helpt spiersamentrekkingen te voorkomen. D-tubocurarine of alfa-bungarotoxine-specifieke blokkers van nicotine-acetylcholinereceptoren op het postsynaptische membraan zouden spiercontracties geheel of gedeeltelijk blokkeren50. Ook voor het voorkomen van spiercontracties kunnen specifieke blokkers van postsynaptische natriumkanalen zoals μ-conotoxine GIIIB worden gebruikt51.
  7. Schakel de perfusie-zuigpomp in en start de perfusie van het preparaat met de Ringer-oplossing die d-tubocurarine bevat.
  8. Stel de beeldparameters in de LSCM-software als volgt in.
    1. Kies in de LSCM-software (LAS AF; zie Materiaaltabel) de optie Elektrofysiologie.
      OPMERKING: In deze modus, wanneer een afbeelding op het tijdstip wordt vastgelegd, wordt een synchronisatiepuls naar de stimulator gestuurd met behulp van de triggerbox. Dit lokt actiepotentiaalgeneratie uit in het preparaat (figuur 1; stimulatoreenheid).
    2. Selecteer Acquisitiemodus. Om de stimulator te activeren met behulp van de microscoopsynchronisatiepuls, selecteert u in de instellingen van het menu Taak de Triggerinstellingen . Stel het veld Trigger Out On Frame in op het out1-kanaal .
    3. Gebruik de volgende instellingen: Scanmodus: XYT, Scanfrequentie: 1400 Hz, Zoomfactor: 6,1, Pinhole: volledig open. Zorg ervoor dat de sequentiële trans-passing Bidirectionele X-modus is ingeschakeld.
    4. Stel een minimumtijd in om een frame te vormen op 52 ms en frames die moeten worden verzameld in een ONBEWERKTE video met 20 frames.
      OPMERKING: Met deze instellingen kunt u afbeeldingen vastleggen met een resolutie van 128 x 128 pixels terwijl elke 52 ms één frame wordt gemaakt.
    5. Stel de excitatiegolflengte van de argonlaser in op 488 nm met 8% van het uitgangsvermogen.

figure-protocol-1
Figuur 1: Het schema van de experimentele opstelling. 1. Laser Scanning Confocale Microscoop (LSCM). 2. Synchronisatie module van LSCM (trigger box). 3. Stimulator. 4. Isolatie-eenheid. 5. Het biologische monster. 6. Zuigelektrode voor elektrische stimulatie van zenuwen. 7. Perfusiesystemen (7a: perfusaatreservoir, 7b: druppelaar, 7c: stroomregelaar, 7d: vacuümkolf). Pijlen wijzen naar de voortplantingsrichting van de synchronisatiepuls. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Druk op de livemodusknop om over te schakelen naar de livemodus, wat helpt om een voorbeeld te krijgen van zenuwaansluitingen die met de kleurstof zijn geladen.

figure-protocol-2
Figuur 2: Muizenzenuw en terminals geladen met de Ca2+ indicator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Stimulatie-eenheid
    OPMERKING: In dit werk werd de stimulator gebruikt die in het artikel van Land et al.52 wordt beschreven. Dit apparaat maakt het mogelijk om temporele parameters van stimulatie in te stellen via de MatLab-software.
    1. Maak een nieuw bestand, plak de code uit het bovengenoemde artikel in het MatLab-codevenster en sla het bestand op. Klik op Uitvoeren, zodat een venster met stimulatieparameters verschijnt. Stel de vertragingstijd en -duur van de stimulus in.
      OPMERKING: De vertraging bepaalt de temporele resolutie van het gereconstitueerde fluorescentiesignaal. De elektrische puls van 0,2 ms wordt vertraagd en vervolgens naar de isolatie-eenheid gestuurd. Deze laatste vormt de amplitude en polariteit van de stimulerende puls en isoleert het biologische object elektrisch van het opnameapparaat.
    2. Om de zenuw te stimuleren, selecteert u de supramaximale amplitude van de stimulerende impuls (25% -50% groter dan de maximale stimulatie-intensiteit die nodig is om alle zenuwvezels te activeren).
      OPMERKING: De gepresenteerde methode is gebaseerd op een speciaal algoritme voor opnames van enkele snelle fluorescerende signalen met behulp van LSCM met de geminimaliseerde sweep. Bij elke stap van het ontwikkelde algoritme wordt het opgenomen fluorescerende signaal verschoven van het vorige met een tijdsinterval dat korter is dan de microscoopveeg. De waarde van tijdverschuivingen bepaalt de temporele resolutie van het vereiste signaal. Het aantal stappen (verschuivingen) in het algoritme is afhankelijk van de vereiste temporele resolutie en de oorspronkelijke temporele resolutie. Met deze registratiemethode wordt de stimulatie van het preparaat uitgevoerd met een frequentie van 0,25 Hz.
  2. Zoek in de Live-modus naar de ROI en verkrijg de beste focus. Voer de software voor gegevensverzameling uit.
  3. Verschuif de vertraging op de stimulator met 2 ms minder ten opzichte van de vorige waarde en voer de software voor gegevensverzameling uit.
  4. Herhaal stap 3.11 26 keer om 26 sequenties te verkrijgen, waarbij elke sequentie met 2 ms is verschoven ten opzichte van de vorige.

4. Videoverwerking

OPMERKING: Een reeks videobeelden verkregen door de confocale microscoop wordt geëxporteerd in het TIFF-formaat met de gratis software LAS X (zie Tabel van materialen). Deze serie is opgedeeld in frames en geëxporteerd naar een map. Voor het genereren van de beeldreeks met een hogere tijdresolutie werd de ImageJ-software gebruikt, die een open initiële code heeft voor de analyse en verwerking van de gegevens. Het algoritme van de signalenverwerking wordt schematisch weergegeven in figuur 3.

figure-protocol-3
Figuur 3: Schema voor het compileren van een videobestand met hoge resolutie (2 ms op frame) uit originele videobestanden met een lage temporele resolutie (52 ms op frame). De originele videobestanden en de bijbehorende signalen zijn zwart, magenta en groen gekleurd. Het gecompileerde videobestand en het resulterende signaal zijn rood gekleurd. Het schema aan de rechterkant, regel voor regel, toont de videobeelden verkregen met een confocale microscoop. Aan de linkerkant veranderen de overeenkomstige signalen van fluorescentie van de geselecteerde ROI. De bovenste lijn wordt frame voor frame gevormd uit de ontvangen frames volgens het schema. Het resultaat is een videobeeld dat bestaat uit de gehele array van frames zodat er een vertragingstijd is van 2 ms tussen frames in plaats van 52 ms. Elke lijn komt overeen met een verschuiving van het stimulatiesignaal door (n - 1) * t, waarbij t tijdverschuiving is (2 ms) en n het aantal shift-iteraties. k geeft het aantal frames in de originele videobestanden aan (regels 2-4) en is afhankelijk van de duur van het opgenomen signaal. In dit geval, om een signaal met een duur van 1 s te registreren, is het noodzakelijk om k = 20 (52 ms * 20 = 1040 ms) te selecteren. t0 is de vereiste vertraging vóór stimulatie. Om het aantal shift-iteraties n te berekenen, moet de initiële temporele resolutie tussen frames (52 ms) worden gedeeld door de vereiste temporele resolutie (2 ms). In dit geval is n = 26, wat overeenkomt met 26 geregistreerde sweeps. Als gevolg van de uitgevoerde manipulaties wordt een videobeeld verkregen dat bestaat uit n * k = 520 frames. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Voer LAS X-software uit. Open het project dat is gemaakt tijdens het uitvoeren van het experiment. Klik op Exporteren en vervolgens op Opslaan als om frames in .tiff indeling in de doelmap op te slaan.
  2. Voer de ImageJ-software uit. Klik op Bestand > > afbeeldingsreeks importeren.
  3. Kies in het venster Afbeeldingsreeks openen de doelmap en open het eerste frame.
  4. Stel in het venster Volgorde-opties in het veld Startafbeelding het framenummer in op 1 voor het eerste frame. Stel in het veld Increment de waarde in die gelijk is aan het aantal frames in de eerste signaalopname (20 voor dit geval) en klik op OK.
  5. Om het gegenereerde bestand met gestikte eerste frames in een aparte map op te slaan, klikt u op Bestand > > map opslaan.
  6. Herhaal stap 4.3-4.5 voor de volgende 19 frames. Stel in het venster Volgordeopties het bijbehorende framenummer in het veld Startafbeelding in.
  7. Om de volledige video met een hoge resolutie te genereren, voegt u alle frames samen. Klik hiervoor op Bestand > > afbeeldingsvolgorde importeren en selecteer 1 in de velden Startafbeelding en Toename . Het resultaat is de uiteindelijke video met een verhoogde temporele resolutie. Sla het bestand op in .tiff of een ander geschikt formaat.

5. Video-analyse

OPMERKING: Selecteer in ImageJ ROI en achtergrond. Achtergrond aftrekken van ROI. Gegevens worden weergegeven als de verhouding (ΔF / F0 - 1) * 100%, waarbij F0 de intensiteit van fluorescentie in rust is en ΔF de intensiteit van fluorescentie tijdens stimulatie.

  1. Klik op Afbeelding > > > Stack Sorter. Klik vervolgens op Analysis > Tools > ROI Manager.
  2. Sleep het .tiff bestand dat is opgeslagen in stap 4.7 naar het ImageJ-venster. Vouw de afbeelding uit voor een betere weergave. Om de beeldvisualisatie te verbeteren, klikt u op Afbeelding > > Helderheid/contrast aanpassen > Auto. Deze stap heeft geen invloed op de gegevens.
  3. Stel de achtergrond dicht bij de zenuwterminal in door ROI te tekenen. Voeg het toe aan de ROI-manager. Bereken de achtergrond door op Meer > Multi Measure te klikken. Kopieer gemiddelde waarden, plak in het spreadsheetprogramma en bereken het gemiddelde.
  4. Trek de berekende gemiddelde waarde af van de stapels door op Proces > hoofd- > Aftrekken te klikken. Voer de waarde in.
  5. Teken ROI rond een zenuwterminal via een veelhoeklijn. Voeg het toe aan de ROI-manager.
  6. Meet de intensiteit van de zenuwterminal: Klik op Meer > Multi Measure. Kopieer gemiddelde waarden en plak ze in het Spreadsheet-programma.
  7. Bereken de gemiddelde offset van signalen.
    OPMERKING: Gebruik de overeenkomstige punten, afhankelijk van de vertragingstijd vóór de stimulatie. Met deze stap wordt de F0-waarde vastgesteld die in latere berekeningen zal worden gebruikt.
  8. Deel de signaalwaarden door de gemiddelde offsetwaarde.
    OPMERKING: Na deze stap bevat het signaal niet de bijdrage van de achtergrond en ruwe fluorescentie aan de amplitudewaarden voor de geselecteerde ROI.
  9. Trek 1 af van de waarden die in stap 5.8 zijn verkregen en vermenigvuldig vervolgens met 100%.
  10. Zet een grafiek van Ca2+- transiënt en bereken de amplitude.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Na het laden van het preparaat met kleurstof volgens de gepresenteerde techniek, hadden de meeste synapsen dicht bij de zenuwstomp een voldoende fluorescentieniveau (zie figuur 2). Na het laden van de voorbereiding met de kleurstof en het toepassen van de beschreven methode van registratie en beeldverwerking, werden calciumtransiënten met de gewenste ruimtelijke en temporele resolutie verkregen (zie figuur 4). De calciumtransiënt is teruggewonnen met de voorgest...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De methode voor het laden van Ca2+-gevoelige kleurstof in zenuwuiteinden van muizen door de zenuwstomp en voor het registreren van een snelle calciumtransiënt met behulp van een confocale microscoop wordt in dit artikel gepresenteerd. Als gevolg van de implementatie van deze belastingsmethode hadden de meeste synapsen dicht bij de zenuwstomp een voldoende fluorescentieniveau om registratie van de binnenkomst van calcium in de zenuwuiteinden mogelijk te maken als reactie op laagfrequente stimulatie van de motor...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Fluorescentiestudies van dit werk werden uitgevoerd met de financiële steun van de Russian Science Foundation Grant (project nr. 19-15-00329). De methode werd ontwikkeld onder financiering van de overheidsopdracht voor FRC Kazan Scientific Center van RAS АААА-А18-118022790083-9. Het onderzoek werd ontwikkeld met behulp van de apparatuur van het Federal Research Center "Kazan Scientific Center of RAS". De auteurs willen Dr. Victor I. Ilyin bedanken voor het kritisch lezen van dit manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Capillary GlassClark Electromedical instruments, UKGC150-10
Confocal and multiphoton microscope system Leica TCS SP5 MPLeica Microsystems, Heidelberg, Germany
Flaming/Brown Micropipette Puller P 97Sutter Instrument, USAP-97
Flow regulatorKD Medical GmbH Hospital Products, GermanyKD REGVoorraadbare infuusset met Flow regulator
HEPESSigma-Aldrich, USAH0887100mL
Illumination system Leica CLS 150XLeica Microsystems, Germany
ImageJNational Institutes of Health, USAhttp://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Las AF softwareLeica Microsystems, Heidelberg, Germany
Las X softwareLeica Microsystems, Heidelberg, Germanyhttps://www.leica-microsystems.com/products/microscope-software/p/leica-las-x-ls/
Magnetic Holder with Suction TubingBIOSCIENCE TOOLS, USAMTH-S
Microspin FV 2400Biosan, LatviaBS-010201-AAA
Minutien PinsFine science tools, Canada26002-20
Multi-spin MSC 3000Biosan, LatviaBS-010205-AAN
Oregon Green 488 BAPTA-1 pentapotassium saltMolecular Probes, USAO6806500 μg
PipetteBiohit, Russia7202100.5-10 µL
Pipette tipBiohit, Russia78134910 µL
Plasticinelocal producer
Single-use hypodermic needlesBbraun100 Sterican0.4×40 mm
Spreadsheet programMicrosoft, USAMicrosoft Office Excel
Stereomicroscope, Leica M80Leica Microsystems, Germany
Suction electrodeKazakov A. SIMPLE SUCTION ELECTRODE FOR ELECTRIC STIMULATION OF BIOLOGICAL OBJECTS / A. Kazakov, M. Alexandrov, N. V. Zhilyakov et al. // International research journal. - 2015. - No. 9 (40) Part 3. - P. 13-16.http://research-journal.org/biology/prostoj-vsasyvayushhij-elektrod-dlya-elektricheskoj-stimulyacii-biologicheskix-obektov/
Sylgard 184 elastomerDow Corning, USA
Syringelocal producer0.5 mL
Syringelocal producer60 mL

Referenties

  1. Llinas, R., Steinberg, I. Z., Walton, K. Presynaptic calcium currents and their relation to synaptic transmission: voltage clamp study in squid giant synapse and theoretical model for the calcium gate. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 73 (8), 2918-2922 (1976).
  2. Augustine, G. J. How does calcium trigger neurotransmitter release. Current Opinion in Neurobiology. 11 (3), 320-326 (2001).
  3. Burnashev, N., Rozov, A. Presynaptic Ca2+ dynamics, Ca2+ buffers and synaptic efficacy. Cell Calcium. 37 (5), 489-495 (2005).
  4. Schneggenburger, R., Neher, E. Presynaptic calcium and control of vesicle fusion. Current Opinion in Neurobiology. 15 (3), 266-274 (2005).
  5. Pang, Z. P., Südhof, T. C. Cell biology of Ca2+-triggered exocytosis. Current Opinion in Cell Biology. 22 (4), 496-505 (2010).
  6. Leal, S. S., Gomes, C. M. Calcium dysregulation links ALS defective proteins and motor neuron selective vulnerability. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 225(2015).
  7. Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
  8. Tsien, R. Y. Fluorescent indicators of ion concentrations. Methods in Cell Biology. 30, 127-156 (1989).
  9. Adams, S. R. How calcium indicators work. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).
  10. Macleod, G. T. Topical application of indicators for calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 786-790 (2012).
  11. Regehr, W. G. Monitoring presynaptic calcium dynamics with membrane-permeant indicators. Imaging in Neuroscience and Development: A Laboratory Manual. , 307-314 (2005).
  12. Eilers, J., Konnerth, A. Dye loading with patch pipettes. Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (4), 5201(2009).
  13. Coleman, W. L., et al. Synapsin II and calcium regulate vesicle docking and the cross-talk between vesicle pools at the mouse motor terminals. Journal of Physiology. 586 (19), 4649-4673 (2008).
  14. Macleod, G. T. Direct injection of indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 797-801 (2012).
  15. Peng, Y. Y., Zucker, R. S. Release of LHRH is linearly related to the time integral of presynaptic Ca+ elevation above a threshold level in bullfrog sympathetic ganglia. Neuron. 10 (3), 465-473 (1993).
  16. Tsang, C. W., Elrick, D. B., Charlton, M. P. α-Latrotoxin releases calcium in frog motor nerve terminals. The Journal of Neuroscience. 20 (23), 8685-8692 (2000).
  17. Newman, Z., et al. Endocannabinoids mediate muscarine-induced synaptic depression at the vertebrate neuromuscular junction. The European Journal of Neuroscience. 25 (6), 1619-1630 (2007).
  18. Macleod, G. T. Forward-filling of dextran-conjugated indicators for calcium imaging at the drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (7), 791-796 (2012).
  19. Rossano, A. J., Macleod, G. T. Loading drosophila nerve terminals with calcium indicators. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (6), e250(2007).
  20. Wu, L. G., Betz, W. J. Nerve activity but not intracellular calcium determines the time course of endocytosis at the frog neuromuscular junction. Neuron. 17 (4), 769-779 (1996).
  21. Suzuki, S., et al. Ca2+ dynamics at the frog motor nerve terminal. Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 440 (3), 351-365 (2000).
  22. Ojala, K. S., et al. A high-affinity, partial antagonist effect of 3,4-diaminopyridine mediates action potential broadening and enhancement of transmitter release at NMJs. Journal of Biological Chemistry. 296, 100302(2021).
  23. Samigullin, D., et al. Estimation of presynaptic calcium currents and endogenous calcium buffers at the frog neuromuscular junction with two different calcium fluorescent dyes. Frontiers in Synaptic Neuroscience. 6, 29(2015).
  24. DiGregorio, D. A., Vergara, J. L. Localized detection of action potential-induced presynaptic calcium transients at a Xenopus neuromuscular junction. The Journal of Physiology. 505, 585-592 (1997).
  25. Bullen, A., Patel, S. S., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: I. High-resolution optical recording with voltage-sensitive dyes and ion indicators. Biophysical Journal. 73 (1), 477-491 (1997).
  26. Bullen, A., Saggau, P. High-speed, random-access fluorescence microscopy: II. Fast quantitative measurements with voltage-sensitive dyes. Biophysical Journal. 76 (4), 2272-2287 (1999).
  27. Bullen, A., Saggau, P. Optical recording from individual neurons in culture. Modern Techniques in Neuroscience Research. (4), 89-126 (1999).
  28. Bullen, A., Saggau, P. Indicators and optical configuration for simultaneous high-resolution recording of membrane potential and intracellular calcium using laser scanning microscopy. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 436 (5), 788-796 (1998).
  29. Redshirt Imaging. , Available from: http://www.redshirtimaging.com/redshirt_neuro/hardware_overview.htm (2021).
  30. Wilson, T. Optical aspects of confocal microscopy. Confocal Microscopy. , 93-141 (1990).
  31. Cox, G. Biological confocal microscopy. Materials Today. 5 (3), 34-41 (2002).
  32. Mukhitov, A., Arkhipova, S., Nikolsky, E. Modern Light Microscopy in Biological and Medical Research. Nauka. , Moscow. (2011).
  33. Mertz, J. Optical sectioning microscopy with planar or structured illumination. Nature Methods. 8 (10), 811-819 (2011).
  34. Webb, R. H. Confocal optical microscopy. Reports on Progress in Physics. 59 (3), 427-471 (1996).
  35. Toomre, D., Pawley, J. B. Disk-scanning confocal microscopy. Handbook of Biological Confocal Microscopy: Third Edition. , 221-238 (2006).
  36. Venkateswarlu, K., et al. Three-dimensional imaging and quantification of real-time cytosolic calcium oscillations in microglial cells cultured on electrospun matrices using laser scanning confocal microscopy. Biotechnology and Bioengineering. 117 (10), 3108-3123 (2020).
  37. Arkhipov, A. Y., Khaziev, E. F., Skorinkin, A. I., Bukharaeva, E. A., Samigullin, D. V. Enhancement of the temporal resolution of fluorescent signals acquired by the confocal microscope. Microscopy and Microanalysis. 26 (2), 204-210 (2020).
  38. Rama, S. Shift and mean algorithm for functional imaging with high spatio-temporal resolution. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  39. Chan, K. G., Streichan, S. J., Trinh, L. A., Liebling, M. Simultaneous temporal superresolution and denoising for cardiac fluorescence microscopy. IEEE Transactions on Computational Imaging. 2 (3), 348-358 (2016).
  40. Veeraraghavan, A., Reddy, D., Raskar, R. Coded strobing photography: compressive sensing of high speed periodic videos. IEEE Transactions on Pattern Analysis and Machine Intelligence. 33 (4), 671-686 (2011).
  41. Angaut-Petit, D., Molgo, J., Connold, A. L., Faille, L. The levator auris longus muscle of the mouse: A convenient preparation for studies of short- and long-term presynaptic effects of drugs or toxins. Neuroscience Letters. 82 (1), 83-88 (1987).
  42. Macleod, G. T. Calcium imaging at the Drosophila larval neuromuscular junction. Cold Spring Harbor Protocols. 7 (7), 758-766 (2012).
  43. Samigullin, D. V., Khaziev, E. F., Zhilyakov, N. V., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Loading a calcium dye into frog nerve endings through the nerve stump: calcium transient registration in the frog neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (125), e55122(2017).
  44. Samigullin, D. V., et al. Calcium transient registration in response to single stimulation and during train of pulses in mouse neuromuscular junction. BioNanoScience. 7 (1), 162-166 (2017).
  45. Luo, F., Dittrich, M., Stiles, J. R., Meriney, S. D. single-pixel optical fluctuation analysis of calcium channel function in active zones of motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 31 (31), 11268-11281 (2011).
  46. Luo, F., Dittrich, M., Cho, S., Stiles, J. R., Meriney, S. D. Transmitter release is evoked with low probability predominately by calcium flux through single channel openings at the frog neuromuscular junction. Journal of Neurophysiology. 113 (7), 2480-2489 (2015).
  47. Wright, M., Kim, A., Son, Y. -J. Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e3124(2011).
  48. Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator Auris Longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (135), e57482(2018).
  49. Kazakov, A., Alexandrov, M., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Samigullin, D. V. A simple suction electrode for electrical stimulation of biological objects. Meždunarodnyj naučno-issledovatel'skij žurnal (International Research Journal). 9 (40), 13-16 (2015).
  50. Bowman, W. C. Neuromuscular block. British Journal of Pharmacology. 147, 277-286 (2006).
  51. Hill, J. M., Alewood, P. F., Craik, D. J. Three-dimensional solution structure of µ-conotoxin GIIIB, a specific blocker of skeletal muscle sodium channels. Biochemistry. 35 (27), 8824-8835 (1996).
  52. Land, B. R., Johnson, B. R., Wyttenbach, R. A., Hoy, R. R. Tools for physiology labs: Inexpensive equipment for physiological stimulation. Journal of Undergraduate Neuroscience Education. 3 (1), 30-35 (2004).
  53. Samigullin, D. V., Zhilyakov, N. V., Khaziev, E. F., Bukharaeva, E. A., Nikolsky, E. E. Calcium transient and quantal release in mouse neuromuscular junction under extracellular calcium concentration change. BioNanoScience. 8 (4), 984-987 (2018).
  54. Khaziev, E., et al. acetylcholine-induced inhibition of presynaptic calcium signals and transmitter release in the frog neuromuscular junction. Frontiers in Physiology. 7, 621(2016).
  55. Zhilyakov, N., Arkhipov, A., Malomouzh, A., Samigullin, D. Activation of neuronal nicotinic receptors inhibits acetylcholine release in the neuromuscular junction by increasing ca2+ flux through cav1 channels. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 9031(2021).
  56. Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Optical measurement of presynaptic calcium currents. Biophysical Journal. 74 (3), 1549-1563 (1998).
  57. McArdle, J. J., et al. Advantages of the triangularis sterni muscle of the mouse for investigations of synaptic phenomena. Journal of Neuroscience Methods. 4 (2), 109-115 (1981).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Calciumsignaleringpresynaptisch calciumsynaptische transmissiekleurstoflaadtechniekmotorische zenuwuiteindenneurotransmittervrijgave
Registratie van calciumtransiënten in de neuromusculaire overgang van de muis met een hoge temporele resolutie met behulp van confocale microscopie
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.