Het huidige werk beschrijft de stappen voor het produceren van kant-en-klare qPCR voor T. cruzi DNA-detectie die vooraf op het reactievat kan worden geladen en gedurende enkele maanden in de koelkast kan worden bewaard.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Kant-en-klare qPCR voor detectie van DNA van Trypanosoma cruzi of andere pathogene organismen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Real-time PCR (qPCR) is een opmerkelijk gevoelige en nauwkeurige techniek die het mogelijk maakt om minieme hoeveelheden nucleïnezuurdoelen uit een groot aantal monsters te versterken. Het is op grote schaal gebruikt in vele onderzoeksgebieden en bereikte industriële toepassing op gebieden zoals menselijke diagnostiek en selectie van eigenschappen in gewassen van genetisch gemodificeerde organismen (GMO) gewassen. QPCR is echter geen foutbestendige techniek. Het mengen van alle reagentia in een enkele mastermix die vervolgens op 96 putten van een gewone qPCR-plaat wordt verdeeld, kan leiden tot fouten van de operator, zoals onjuiste menging van reagentia of onnauwkeurige afgifte in de putten. Hier wordt een techniek gepresenteerd die gelificatie wordt genoemd, waarbij het grootste deel van het water in de hoofdmix wordt vervangen door reagentia die een sol-gelmengsel vormen wanneer het aan een vacuüm wordt onderworpen. Als gevolg hiervan worden qPCR-reagentia effectief bewaard gedurende een paar weken bij kamertemperatuur of een paar maanden bij 2-8 oC. Details over het bereiden van elke oplossing worden hier weergegeven, samen met het verwachte aspect van een gelified reactie die is ontworpen om T. cruzi-satelliet-DNA (satDNA) te detecteren. Een soortgelijke procedure kan worden toegepast om andere organismen te detecteren. Het starten van een gelified qPCR-run is net zo eenvoudig als het verwijderen van de plaat uit de koelkast, het toevoegen van de monsters aan hun respectieve putten en het starten van de run, waardoor de insteltijd van een volledige plaatreactie wordt verkort tot de tijd die nodig is om de monsters te laden. Bovendien kunnen gelified PCR-reacties worden geproduceerd en gecontroleerd op kwaliteit in batches, waardoor tijd wordt bespaard en veelvoorkomende fouten van de operator worden vermeden tijdens het uitvoeren van routinematige PCR-reacties.
Inleiding
De ziekte van Chagas werd ontdekt in het begin van de20e eeuw in landelijke regio's van Brazilië, waar armoede wijdverspreid was 1,2. Zelfs vandaag de dag is de ziekte nog steeds verbonden met sociale en economische determinanten van gezondheid in Amerika. De ziekte van Chagas is bifasisch en bestaat uit een acute en een chronische fase. Het wordt veroorzaakt door infectie door de Trypanosoma cruzi-parasiet, overgedragen door insectenvectoren, bloedtransfusies via een aangeboren route of orale inname van besmet voedsel 3,4.
De diagnose van de ziekte van Chagas kan worden gemaakt door de observatie van klinische symptomen (met name het Romaña-teken), bloeduitstrijkjesmicroscopie, serologie en moleculaire tests zoals real-time PCR (qPCR) of isothermische amplificatie 4,5,6,7,8,9. Klinische symptomen en bloeduitstrijkjesmicroscopie worden gebruikt in vermoedelijke gevallen van acute infecties, terwijl de zoektocht naar antilichamen wordt gebruikt als screeningsinstrument bij asymptomatische patiënten. Vanwege de gevoeligheid en specificiteit is voorgesteld dat qPCR wordt gebruikt als een monitoringinstrument voor chronische patiënten, voor acute patiënten die een behandeling ondergaan waarbij de parasietbelasting in het bloed wordt gemeten, en als een surrogaatmarker van therapeutisch falen 6,8,10,11,12 . Hoewel gevoeliger en specifieker dan momenteel beschikbare tests, wordt qPCR effectief voorkomen dat het bekend staat als diagnostische hulpmiddelen in kansarme regio's over de hele wereld vanwege de vereiste van vriestemperaturen voor transport en opslag 13,14,15.
Om dit obstakel te omzeilen, zijn conserveringstechnieken zoals lyofilisatie en gelificatie onderzocht16,17. Hoewel lyofilisatie jarenlang conservatie biedt, vereist het speciaal gemaakte reagentia zonder de aanwezigheid van glycerol, dat vaak wordt gebruikt voor enzymstabilisatie / -behoud18. Hoewel al maanden is aangetoond dat gelificatie conservatie biedt, maakt het het gebruik van reguliere reagentia mogelijk19. De gelificatieoplossing bestaat uit vier componenten, elk met specifieke rollen in het proces: de suikers trehalose en melezitose beschermen de biomoleculen tijdens het uitdrogingsproces door vrije watermoleculen in de oplossing te verminderen, glycogeen produceert een bredere beschermende matrix en het aminozuur lysine wordt gebruikt als een vrije radicalenvanger om de oxiderende reacties tussen de carboxyl van het biomolecuul te remmen, amino- en fosfaatgroepen. Deze componenten definiëren een sol-gelmengsel dat het verlies van de tertiaire of quaternaire structuur tijdens het uitdrogingsproces voorkomt, waardoor de activiteit van de biomoleculen bij rehydratatie wordt gehandhaafd19. Eenmaal gestabiliseerd in de reactiebuizen, kunnen de reacties enkele maanden worden bewaard bij 2-8 °C of enkele weken bij 21-23 °C in plaats van de normale -20 °C. Deze aanpak is al opgenomen in tests die zijn ontworpen om ziekten zoals de ziekte van Chagas, malaria, leishmaniasis, tuberculose en cyclosporiasis 13,14,15,20 te helpen diagnosticeren.
Het huidige werk beschrijft alle stappen om de vereiste oplossingen voor de gelificatieprocedure voor te bereiden, de valkuilen in het proces en het verwachte laatste aspect van een kant-en-klare gelified qPCR in stroken met acht buizen. Hetzelfde protocol kan worden aangepast voor enkele buizen of 96-well platen. Ten slotte zal de detectie van T. cruzi DNA worden getoond als een controlerun.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van stamoplossingen en gelificatiemengsel
OPMERKING: Er worden vier stamoplossingen bereid (400 mg/ml melezitose, 400 mg/ml trehalose, 0,75 mg/ml lysine en 200 mg/ml glycogeen) en gemengd volgens de verhouding in tabel 1 om het gelificatiemengsel te produceren. Hoewel het protocol 10 ml productie van voorraadoplossingen beschrijft, kan het worden aangepast voor lagere of hogere volumes.
- Melezitose oplossing
- Weeg 4 g melezitose in een plastic buis van 15 ml, voeg 6 ml nucleasevrij water toe en vortex op de maximale snelheid van het instrument totdat het poeder is opgelost.
OPMERKING: Er kan meer water worden toegevoegd om de oplosbaarheid te vergemakkelijken, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het uiteindelijke volume niet wordt overschreden (zie hieronder). - Vul het uiteindelijke volume aan tot 10 ml met nucleasevrij water. Etiketteer en bewaar bij 2-8 °C gedurende maximaal 6 maanden.
- Weeg 4 g melezitose in een plastic buis van 15 ml, voeg 6 ml nucleasevrij water toe en vortex op de maximale snelheid van het instrument totdat het poeder is opgelost.
- Trehalose oplossing
- Weeg 4 g trehalose in een plastic buis van 15 ml, voeg 6 ml nucleasevrij water toe en vortex op de maximale snelheid van het instrument totdat het poeder is opgelost.
OPMERKING: Er kan meer water worden toegevoegd om de oplosbaarheid te vergemakkelijken, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het uiteindelijke volume niet wordt overschreden (zie hieronder). - Vul het volume aan tot 10 ml met nucleasevrij water en filter de oplossing door een filter van 0,2 μm. Etiketteer en bewaar bij 2-8 °C gedurende maximaal 6 maanden.
- Weeg 4 g trehalose in een plastic buis van 15 ml, voeg 6 ml nucleasevrij water toe en vortex op de maximale snelheid van het instrument totdat het poeder is opgelost.
- Glycogeenoplossing
- Weeg 2 g glycogeen in een plastic buis van 15 ml, voeg 6 ml nucleasevrij water toe en vortex op de maximale snelheid van het instrument totdat het poeder is opgelost.
OPMERKING: Er kan meer water worden toegevoegd om de oplosbaarheid te vergemakkelijken, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het uiteindelijke volume niet wordt overschreden (zie hieronder). - Houd de oplossing gedurende 8-12 uur in rust bij 2-8 °C, omdat de oplosbaarheid van glycogeen veel bubbels produceert (figuur 1). Vul het volume aan tot 10 ml met nucleasevrij water. Etiketteer en bewaar bij 2-8 °C gedurende maximaal 6 maanden.
- Weeg 2 g glycogeen in een plastic buis van 15 ml, voeg 6 ml nucleasevrij water toe en vortex op de maximale snelheid van het instrument totdat het poeder is opgelost.
- Lysine oplossing
- Weeg 7,5 mg lysine in een plastic buis van 15 ml, voeg 6 ml nucleasevrij water toe. Vortex op de maximale snelheid van het instrument totdat het poeder is opgelost.
OPMERKING: Er kan meer water worden toegevoegd om de oplosbaarheid te vergemakkelijken, waarbij ervoor wordt gezorgd dat het uiteindelijke volume niet wordt overschreden (zie hieronder). - Vul het volume aan tot 10 ml met nucleasevrij water en filter de oplossing door een filter van 0,2 μm. Breng de oplossing over in een amberkleurige kolf of bescherm deze tegen licht. Etiketteer en bewaar bij 2-8 °C graden gedurende maximaal 6 maanden.
- Weeg 7,5 mg lysine in een plastic buis van 15 ml, voeg 6 ml nucleasevrij water toe. Vortex op de maximale snelheid van het instrument totdat het poeder is opgelost.
- Gelificatie mengsel (GM)
- Meng in een plastic buis van 50 ml de volumes van voorraadoplossingen volgens tabel 1.
- Meng de reagentia door tien end-to-end inversies van de buis.
OPMERKING: Er is geen filtratiestap nodig als deze stap wordt uitgevoerd in een laminaire stromingsveiligheidskap. Als deze stap niet in een schone omgeving wordt uitgevoerd, filtert u de oplossing door een filter van 0,2 μm voordat u deze overbrengt naar een oranje kolf. - Breng de oplossing over in een amberkleurige kolf of bescherm deze tegen licht. Etiketteren en bewaren bij 2-8 °C gedurende maximaal 3 maanden.
OPMERKING: Als kwaliteitscontrolestap voor het bereiden van het gelificatiemengsel, moet u ervoor zorgen dat de gemeten pH-, geleidbaarheids- en dichtheidswaarden binnen de volgende bereiken liggen: pH 5,55-6,66; geleidbaarheid 0,630-0,757 mS/cm; en dichtheid 1,08-1,11 g/cm3. Alle metingen moeten bij 25 °C worden uitgevoerd.
2. Bereiding van qPCR master mix voor gelificatie
OPMERKING: In deze stap wordt de qPCR-mastermix voor gelificatie voorbereid. Daarom wordt er geen water aan de mix toegevoegd, maar wordt het gelificatiemengsel toegevoegd (tabel 2).
- Ontdooi de reagentia in een gekoelde container. Meng de reagentia in een buis van 1,5 ml volgens tabel 2. Een voorbeeld van een reactie met een eindvolume van 25 μL met 5 μL DNA-monster wordt hier getoond.
OPMERKING: Het DNA-monster wordt in deze stap niet aan het mengsel toegevoegd; het wordt hier uitsluitend gebruikt om de uiteindelijke volumes van elk reagens van het qPCR-mastermengsel te berekenen. DNA-monsters moeten vlak voor aanvang van de run worden toegevoegd (zie stap 4 hieronder).
3. Gelificatie van de reagentia op de reactievaten
- Vermenigvuldig de in tabel 2 vermelde volumes op passende wijze voor de bereiding van een strip met acht buizen of een plaat met 96 putten.
- Pipetteer 18,5 μL van het in tabel 2 weergegeven gelificatiemastermengsel op elk reactieputje.
OPMERKING: Dit volume vertegenwoordigt de volumes oligonucleotidemengsel, PCR-buffer en gelificatiemengsel die voor één reactie worden gebruikt (volgens tabel 2) en varieert afhankelijk van de concentratie van de reagentia en het volume dat nodig is voor één reactie. Het uiteindelijke volume in de gelificatiemastermix verschilt van het volume in een gewone mastermix omdat er geen water wordt toegevoegd. - Plaats de buizen/plaat in de warmtegeleidende ondersteuning (bijv. aluminium) in de vacuümoven.
OPMERKING: De warmtegeleidende ondersteuning is optioneel. De bediener moet ervoor zorgen dat de bodem van de buizen in contact komt met de vacuümovenplank om een snel thermisch evenwicht mogelijk te maken. - Plaats een bentoniet kleizak voor elke twee 96-well platen.
OPMERKING: Bentoniet kleizakken worden gebruikt om het verwijderde water uit de gelificatiemastermix te absorberen door het drukverschil dat door het vacuüm wordt uitgeoefend. Bentoniet kleizakken bleken niet nodig te zijn voor minder dan twee 96-well platen. - Onderwerp de buizen/plaat met de gelificatiemastermix aan drie vacuümcycli (30 ± 5 mBar) van elk 30 min, afgewisseld met vacuümafgifte totdat de atmosferische druk is bereikt (900-930 mBar), onder gecontroleerde temperatuur (30 °C ± 1 °C) (figuur 2).
OPMERKING: Het instrument maakt gebruik van software om de parameters te regelen en een voorbeeld van de cyclus wordt weergegeven in figuur 2. De gebruiker moet het profiel voor de uitvoering maken, met vermelding van de gekozen parameters. - Wanneer de cyclus is voltooid, controleert u de buizen/platen op een goede gelificatie van de reagentia door ervoor te zorgen dat het volume zichtbaar wordt verminderd (figuur 3) en dat de vloeistoffen niet bewegen bij het tikken op de buizen/platen met de vingers.
OPMERKING: Als er geen gelificatie zou optreden, zou de oplossing op de buiswanden spatten wanneer buizen worden afgetapt (figuur 3). - Sluit de buizen/platen af en bewaar ze bij 2-8 °C gedurende 8-12 uur voor gebruik.
4. Een gelified qPCR gebruiken
- Verwijder de buisstrip of -plaat uit de koelkast en open deze in een werkstation voor monstermanipulatie. Voeg 15 μL nucleasevrij water toe aan elk reactievat.
OPMERKING: Het volume gelified reagentia wordt beschouwd als ongeveer 5 μL. Samen met het DNA-monstervolume (zie hieronder) is het uiteindelijke reactievolume dus 25 μL. - Voeg 5 μL DNA-monster toe.
OPMERKING: Elke DNA-sjabloon van qPCR-kwaliteit kan worden gebruikt. In het huidige werk werd DNA geëxtraheerd uit 108T. cruzi epimastigoten (stam Dm28c) en werd het serieel verdund in een verhouding van 1:10 met behulp van TE-buffer. - Sluit de buizen/platen af en ga verder met de apparatuur van uw keuze. Voer het experiment uit en ga verder met regelmatige gegevensanalyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Drie van de reagentia die het gelificatiemengsel vormen, worden gemakkelijk opgelost bij krachtige vortexing. Glycogeen vereist echter zorgvuldige vortexing om ervoor te zorgen dat het poeder volledig is opgelost. Helaas produceert krachtig vortexen veel bellen, waardoor het moeilijk is om het werkelijke volume van de oplossing te bepalen (figuur 1A-B). Daarom is het essentieel om de glycogeenoplossing in de koelkast te laten rusten totdat het grootste deel ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De afgelopen jaren hebben de noodzaak benadrukt om meer gevoelige en specifieke technologieën te vinden om tropische en verwaarloosde ziekten te helpen diagnosticeren. Hoewel belangrijk voor epidemiologische controle, hebben parasitologische (optische microscopie) en serologische tests beperkingen, vooral met betrekking tot gevoeligheid en point-of-care toepasbaarheid. DNA-amplificatietechnieken zoals PCR, isothermische amplificatie en respectieve variaties worden al lang gebruikt in laboratoriumomgevingen, maar technolo...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Dankbetuigingen
De auteurs willen hun dank uitspreken aan Aline Burda Farias voor de technische assistentie met de vacuümoven, evenals aan de administratie van het Instituto de Biologia Molecular do Parana (IBMP, Curitiba, Brazilië) voor het verlenen van toegang tot de genoemde apparatuur. Dit werk werd gedeeltelijk gefinancierd door subsidie CNPq 445954/2020-5.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Bentonieteklei zakken (geactiveerd) | Embamat Global Packaging Solutions (Barcelona, Spanje) | 026157/STD | Niet te verwarren met silicagel pakketten |
| Glycogen | Amersham Bioscience | Cat# US16445 | |
| Lysine | Acros Organic | Cat# 365650250 | |
| Melezitoze | Sigma-Aldrich | Cat# 63620 | |
| Nuclease-vrij water | voorkeursleverancier | ||
| Oligonucleotiden | voorkeursleverancier | ||
| PCR mastermix | voorkeursleverancier of Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP, Curitiba, Brazilië) | Chagas NAT kit | |
| PCR thermocycler | voorkeursleverancier | ||
| Software voor vacuümoven | Memmert Gmbh | Celsius v10.0 | |
| Trehalose | Sigma-Aldrich | Cat# T9531 | |
| Trypanosoma cruzi DNA | van in huis gekweekte parasieten, of gekocht bij geaccrediteerde leveranciers zoals ATCC | ||
| Vacuümoven | Memmert Gmbh | VO-400 |
Referenties
- Lewinsohn, R. Carlos Chagas (1879-1934): the discovery of Trypanosoma cruzi and of American trypanosomiasis (foot-notes to the history of Chagas's disease). Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 73 (5), 513-523 (1979).
- Bern, C., et al. Evaluation and treatment of Chagas disease in the United States: A systematic review. The Journal of American Medical Association. 298 (18), 2171-2181 (2007).
- Pereira, K. S., et al. Chagas' disease as a foodborne illness. Journal of Food Protection. 72 (2), 441-446 (2009).
- Tanowitz, H. B., et al. Chagas' disease. Clinical Microbiology Reviews. 5 (4), 400-419 (1992).
- Rassi, A., Marin-Neto, J. A. Chagas disease. Lancet. 375 (9723), 1388-1402 (2010).
- Ramírez, J. C., et al. Analytical validation of quantitative real-time PCR methods for quantification of trypanosoma cruzi DNA in blood samples from chagas disease patients. The Journal of Molecular Diagnostics. 17 (5), 605-615 (2015).
- Rivero, R., et al. Rapid detection of Trypanosoma cruzi by colorimetric loop-mediated isothermal amplification (LAMP): A potential novel tool for the detection of congenital Chagas infection. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 89 (1), 26-28 (2017).
- Schijman, A. G. Molecular diagnosis of Trypanosoma cruzi. Acta Tropica. 184, 59-66 (2018).
- Besuschio, S. A., et al. Trypanosoma cruzi loop-mediated isothermal amplification (Trypanosoma cruzi Loopamp) kit for detection of congenital, acute and Chagas disease reactivation. Plos Neglected Tropical Diseases. 14 (8), 0008402(2020).
- Duffy, T., et al. Accurate real-time PCR strategy for monitoring bloodstream parasitic loads in chagas disease patients. Plos Neglected Tropical Diseases. 3 (4), (2009).
- Melo, M. F., et al. Usefulness of real time PCR to quantify parasite load in serum samples from chronic Chagas disease patients. Parasites & Vectors. 8 (1), 154(2015).
- Parrado, R., et al. Usefulness of serial blood sampling and PCR replicates for treatment monitoring of patients with chronic Chagas disease. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (2), 01191(2019).
- de Rampazzo, R. C. P., et al. A ready-to-use duplex qPCR to detect Leishmania infantum DNA in naturally infected dogs. Veterinary Parasitology. 246, 100-107 (2017).
- Rampazzo, R. C. P., et al. Proof of concept for a portable platform for molecular diagnosis of tropical diseases. The Journal of Molecular Diagnostics. 21 (5), 839-851 (2019).
- Costa, A. D. T., et al. Ready-to-use qPCR for detection of Cyclospora cayetanensis or Trypanosoma cruzi in food matrices. Food and Waterborne Parasitology. 22, 00111(2021).
- Sun, Y., et al. Pre-storage of gelified reagents in a lab-on-a-foil system for rapid nucleic acid analysis. Lab on a Chip. 13, 1509-1514 (2013).
- Kamau, E., et al. Sample-ready multiplex qPCR assay for detection of malaria. Malaria Journal. 13, 158(2014).
- Kasper, J. C., Winter, G., Friess, W. Recent advances and further challenges in lyophilization. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 85 (2), 162-169 (2013).
- Rosado, P. M. F. S., López, G. L., Seiz, A. M., Alberdi, M. M. Method for preparing stabilised reaction mixtures, which are totally or partially dried, comprising at least one enzyme, reaction mixtures and kits containing said mixtures. PubChem. , (2002).
- Ali, N., Bello, G. L., Rossetti, M. L. R., Krieger, M. A., Costa, A. D. T. Demonstration of a fast and easy sample-to-answer protocol for tuberculosis screening in point-of-care settings: A proof of concept study. PLoS One. 15 (12), 0242408(2020).
- Murphy, H. R., Lee, S., da Silva, A. J. Evaluation of an improved U.S. food and drug administration method for the detection of Cyclospora cayetanensis in produce using real-time PCR. Journal of Food Protection. 80 (7), 1133-1144 (2017).
- Iglesias, N., et al. Performance of a new gelled nested PCR test for the diagnosis of imported malaria: comparison with microscopy, rapid diagnostic test, and real-time PCR. Parasitology Research. 113 (7), 2587-2591 (2014).
- Alonso-Padilla, J., Gallego, M., Schijman, A. G., Gascon, J. Molecular diagnostics for Chagas disease: up to date and novel methodologies. Expert Review of Molecular Diagnostics. 17 (7), 699-710 (2017).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
