Massaspectrometrische karakterisering van neuropeptiden biedt sequentie-, kwantificerings- en lokalisatie-informatie. Deze geoptimaliseerde workflow is niet alleen nuttig voor neuropeptidestudies, maar ook voor andere endogene peptiden. De protocollen die hier worden verstrekt, beschrijven monstervoorbereiding, MS-acquisitie, MS-analyse en databasegeneratie van neuropeptiden met behulp van LC-ESI-MS, MALDI-MS-spotting en MALDI-MS-beeldvorming.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Veelzijdig massaspectrometrisch onderzoek van neuropeptiden in Callinectes sapidus
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Neuropeptiden zijn signaalmoleculen die bijna alle fysiologische en gedragsprocessen reguleren, zoals ontwikkeling, reproductie, voedselinname en reactie op externe stressoren. Toch blijven de biochemische mechanismen en volledige aanvulling van neuropeptiden en hun functionele rollen slecht begrepen. De karakterisering van deze endogene peptiden wordt belemmerd door de immense diversiteit binnen deze klasse van signaalmoleculen. Bovendien zijn neuropeptiden bioactief bij concentraties die 100x - 1000x lager zijn dan die van neurotransmitters en zijn ze vatbaar voor enzymatische afbraak na synaptische afgifte. Massaspectrometrie (MS) is een zeer gevoelig analytisch hulpmiddel dat analyten kan identificeren, kwantificeren en lokaliseren zonder uitgebreide a priori kennis. Het is zeer geschikt voor het wereldwijd profileren van neuropeptiden en het helpen bij de ontdekking van nieuwe peptiden. Vanwege de lage abundantie en hoge chemische diversiteit van deze klasse van peptiden, zijn verschillende monstervoorbereidingsmethoden, MS-acquisitieparameters en data-analysestrategieën aangepast van proteomics-technieken om optimale neuropeptidekarakterisering mogelijk te maken. Hier worden methoden beschreven voor het isoleren van neuropeptiden uit complexe biologische weefsels voor sequentiekarakterisering, kwantificering en lokalisatie met behulp van vloeistofchromatografie (LC) -MS en matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) - MS. Een protocol voor het voorbereiden van een neuropeptide database van de blauwe krab, Callinectes sapidus, een organisme zonder uitgebreide genomische informatie, is opgenomen. Deze workflows kunnen worden aangepast om andere klassen van endogene peptiden in verschillende soorten te bestuderen met behulp van een verscheidenheid aan instrumenten.
Inleiding
Het zenuwstelsel is complex en vereist een netwerk van neuronen om signalen door een organisme te verzenden. Het zenuwstelsel coördineert sensorische informatie en biologische respons. De ingewikkelde en ingewikkelde interacties die betrokken zijn bij signaaloverdracht vereisen veel verschillende signaalmoleculen zoals neurotransmitters, steroïden en neuropeptiden. Omdat neuropeptiden de meest diverse en krachtige signaalmoleculen zijn die een sleutelrol spelen bij het activeren van fysiologische reacties op stress en andere stimuli, is het van belang om hun specifieke rol in deze fysiologische processen te bepalen. Neuropeptidefunctie is gerelateerd aan hun aminozuur....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle beschreven weefselmonsters werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Wisconsin-Madison.
1. LC-ESI-MS analyse van neuropeptiden
- Neuropeptide extractie en ontzouting
- Bereid voorafgaand aan weefselverwerving aangezuurde methanol (acMeOH) (90:9:1 MeOH:water:azijnzuur) voor zoals beschreven in16.
- Verzamel hersenweefsel van het schaaldier17 en gebruik een tang om onmiddellijk één weefsel elk in een buis van 0,6 ml met 20 μL acMeOH te plaatsen.
OPMERKING: Weefseldissectieprotocollen variëren sterk voor verschi....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De workflow voor monstervoorbereiding en MS-analyse is weergegeven in figuur 1. Na de dissectie van neuronaal weefsel worden homogenisatie, extractie en ontzouting uitgevoerd om neuropeptidemonsters te zuiveren. Als isotopische labelgebaseerde kwantificering gewenst is, worden monsters vervolgens gelabeld en opnieuw ontzout. Het resulterende monster wordt geanalyseerd door middel van LC-MS / MS voor neuropeptide-identificatie en kwantificering.
Neuropeptiden geïde.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De nauwkeurige identificatie, kwantificering en lokalisatie van neuropeptiden en endogene peptiden in het zenuwstelsel zijn cruciaal voor het begrijpen van hun functie23,24. Massaspectrometrie is een krachtige techniek waarmee dit alles kan worden bereikt, zelfs in organismen zonder een volledig gesequenced genoom. Het vermogen van dit protocol om neuropeptiden te detecteren, kwantificeren en lokaliseren uit weefsel verzameld van C. sapidus door een comb.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd ondersteund door de National Science Foundation (CHE-1710140 en CHE-2108223) en de National Institutes of Health (NIH) door middel van subsidie R01DK071801. A.P. werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health, onder de Ruth L. Kirschstein National Research Service Award van het National Heart Lung and Blood Institute aan het University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936). L.L. wil graag nih-subsidies R56 MH110215, S10RR029531 en S10OD025084 erkennen, evenals financieringssteun van een Vilas D....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Chemicals, Reagents, en verbruiksartikelen | |||
| 2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrix | Supelco | 39319 | |
| Azijnzuur | Fisher Chemical | A38S-500 | |
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A955-500 | |
| Ammoniumbicarbonaat | Sigma-Aldrich | 9830 | |
| Boraan pyridine | Sigma-Aldrich | 179752 | |
| Bruker peptide calibratiemix | Bruker Daltonics | NC9846988 | |
| Capillair | Polymicro | 1068150019 | om nanoflow kolom te maken (75 µm binnendiameter x 360 µm buitendiameter) |
| Cryostat cup | Sigma-Aldrich | E6032 | elke cup of mal zou moeten werken |
| Microcentrifugebuisjes | Eppendorf | 30108434 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Formaldehyde - D2 | Sigma-Aldrich | 492620 | |
| Formic acid Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A117-50 | |
| Gelatine | Difco | 214340 | plaats in waterbad van 37 °C om te smelten |
| Hydrofobe barrièrepen | Vector Labs | 15553953 | |
| Indium tinoxide (ITO)-gecoate glasplaatjes | Delta Technologies | CB-90IN-S107 | 25 mm x 75 mm x 0.8 mm (breedte x lengte x dikte) |
| LC-MS-vial | Thermo | TFMSCERT5000-30LVW | |
| Methanol Optima LC/MS Grade | Fisher Chemical | A456-500 | |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | P7793 | Hydrofobe film |
| pH-indicator strips | Supelco | 109450 | |
| Rode fosforclusters | Sigma-Aldrich | 343242 | |
| Omgekeerde fase C18-materiaal | Waters | 186002350 | handmatig gepakt in nanoflow kolom |
| Wite-out pen | BIC | 150810 | |
| ZipTip | Millipore | Z720070 | |
| Instrumenten en gereedschappen | |||
| Automatisch matrixsproeiersysteem- M5 | HTX Technologies, LLC | ||
| Centrifuge - 5424 R | Eppendorf | 05-401-205 | |
| Cryostat- HM 550 | Thermo Fisher Scientific | 956564A | |
| Droogmiddel | Drierite | 2088701 | |
| Pincet | WPI | 501764 | |
| MALDI roestvrijstalen doelplaat | Bruker Daltonics | 8280781 | |
| Pipet-Lite XLS | Rainin | 17014391 | 200 µL |
| Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | IQLAAEGAAPFALGMBDK | |
| RapifleX MALDI-TOF/TOF | Bruker Daltonics | ||
| SpeedVac - SVC100 | Savant | SVC-100D | |
| Ultrasoonreiniger | Bransonic | 2510R-MTH | voor sonicatie |
| Ultrasoon homogenisator | Fisher Scientific | FB120110 | FB120 Sonic Dismembrator met CL-18 sonde |
| Vacuumpomp- Alcatel 2008 A | Ideal Vacuum Products | P10976 | uiteindelijke druk = 1 x 10-4 Torr |
| Vortex Mixer | Corning | 6775 | |
| Waterbad (37C) - Isotemp 110 | Fisher Scientific | 15-460-10 | |
| Data-analysesoftware | |||
| Expasy | https://web.expasy.org/translate/ | ||
| FlexAnalysis | Bruker Daltonics | ||
| FlexControl | Bruker Daltonics | ||
| FlexImaging | Bruker Daltonics | ||
| PEAKS Studio | Bioinformatics Solutions, Inc. | ||
| SCiLS Lab | https://scils.de/ | ||
| SignalP 5.0 | https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0 | ||
| tBLASTn | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_ PROGRAMS=tblastn&PAGE_ TYPE=BlastSearch&SHOW_ DEFAULTS=on&LINK_LOC =blasthome |
Referenties
- Hökfelt, T., et al. Neuropeptides - an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
- Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
- Nässel, D. R., Ekström, ....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
