Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Veelzijdig massaspectrometrisch onderzoek van neuropeptiden in Callinectes sapidus

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63322

⸱

31 mei 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Wisconsin-Madison, 2School of Pharmacy, University of Wisconsin-Madison

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Massaspectrometrische karakterisering van neuropeptiden biedt sequentie-, kwantificerings- en lokalisatie-informatie. Deze geoptimaliseerde workflow is niet alleen nuttig voor neuropeptidestudies, maar ook voor andere endogene peptiden. De protocollen die hier worden verstrekt, beschrijven monstervoorbereiding, MS-acquisitie, MS-analyse en databasegeneratie van neuropeptiden met behulp van LC-ESI-MS, MALDI-MS-spotting en MALDI-MS-beeldvorming.

Samenvatting

Neuropeptiden zijn signaalmoleculen die bijna alle fysiologische en gedragsprocessen reguleren, zoals ontwikkeling, reproductie, voedselinname en reactie op externe stressoren. Toch blijven de biochemische mechanismen en volledige aanvulling van neuropeptiden en hun functionele rollen slecht begrepen. De karakterisering van deze endogene peptiden wordt belemmerd door de immense diversiteit binnen deze klasse van signaalmoleculen. Bovendien zijn neuropeptiden bioactief bij concentraties die 100x - 1000x lager zijn dan die van neurotransmitters en zijn ze vatbaar voor enzymatische afbraak na synaptische afgifte. Massaspectrometrie (MS) is een zeer gevoelig analytisch hulpmiddel dat analyten kan identificeren, kwantificeren en lokaliseren zonder uitgebreide a priori kennis. Het is zeer geschikt voor het wereldwijd profileren van neuropeptiden en het helpen bij de ontdekking van nieuwe peptiden. Vanwege de lage abundantie en hoge chemische diversiteit van deze klasse van peptiden, zijn verschillende monstervoorbereidingsmethoden, MS-acquisitieparameters en data-analysestrategieën aangepast van proteomics-technieken om optimale neuropeptidekarakterisering mogelijk te maken. Hier worden methoden beschreven voor het isoleren van neuropeptiden uit complexe biologische weefsels voor sequentiekarakterisering, kwantificering en lokalisatie met behulp van vloeistofchromatografie (LC) -MS en matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie (MALDI) - MS. Een protocol voor het voorbereiden van een neuropeptide database van de blauwe krab, Callinectes sapidus, een organisme zonder uitgebreide genomische informatie, is opgenomen. Deze workflows kunnen worden aangepast om andere klassen van endogene peptiden in verschillende soorten te bestuderen met behulp van een verscheidenheid aan instrumenten.

Inleiding

Het zenuwstelsel is complex en vereist een netwerk van neuronen om signalen door een organisme te verzenden. Het zenuwstelsel coördineert sensorische informatie en biologische respons. De ingewikkelde en ingewikkelde interacties die betrokken zijn bij signaaloverdracht vereisen veel verschillende signaalmoleculen zoals neurotransmitters, steroïden en neuropeptiden. Omdat neuropeptiden de meest diverse en krachtige signaalmoleculen zijn die een sleutelrol spelen bij het activeren van fysiologische reacties op stress en andere stimuli, is het van belang om hun specifieke rol in deze fysiologische processen te bepalen. Neuropeptidefunctie is gerelateerd aan hun aminozuurstructuur, die mobiliteit, receptorinteractie en affiniteit bepaalt1. Technieken zoals histochemie, wat belangrijk is omdat neuropeptiden kunnen worden gesynthetiseerd, opgeslagen en vrijgegeven in verschillende regio's van het weefsel, en elektrofysiologie zijn gebruikt om neuropeptidestructuur en -functie 2,3,4 te onderzoeken, maar deze methoden worden beperkt door doorvoer en specificiteit om de enorme sequentiediversiteit van neuropeptiden op te lossen.

Massaspectrometrie (MS) maakt de high throughput analyse van neuropeptide structuur en abundantie mogelijk. Dit kan worden uitgevoerd door middel van verschillende MS-technieken, meestal vloeistofchromatografie-elektrospray-ionisatie MS (LC-ESI-MS)5 en matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie MS (MALDI-MS)6. Met behulp van zeer nauwkeurige massametingen en MS-fragmentatie biedt MS de mogelijkheid om aminozuursequentie en posttranslationele modificatie (PTM) status toe te wijzen aan neuropeptiden uit complexe mengsels zonder a priori kennis om te helpen bij het vaststellen van hun functie 7,8. Naast kwalitatieve informatie maakt MS kwantitatieve informatie van neuropeptiden mogelijk door middel van labelvrije kwantificering (LFQ) of labelgebaseerde methoden zoals isotopische of isobare etikettering9. De belangrijkste voordelen van LFQ zijn de eenvoud, lage analysekosten en verminderde monstervoorbereidingsstappen die monsterverlies kunnen minimaliseren. De nadelen van LFQ omvatten echter hogere instrumenttijdkosten, omdat het meerdere technische replicaties vereist om kwantitatieve fouten van run-to-run variabiliteit aan te pakken. Dit leidt ook tot een verminderd vermogen om kleine variaties nauwkeurig te kwantificeren. Labelgebaseerde methoden worden onderworpen aan minder systematische variatie omdat meerdere monsters differentieel kunnen worden gelabeld met behulp van een verscheidenheid aan stabiele isotopen, gecombineerd in één monster en tegelijkertijd geanalyseerd door massaspectrometrie. Dit verhoogt ook de doorvoer, hoewel isotopische etiketten tijdrovend en kostbaar kunnen zijn om te synthetiseren of te kopen. De spectrale complexiteit van full scan mass spectra (MS1) neemt ook toe naarmate multiplexing toeneemt, waardoor het aantal unieke neuropeptiden dat kan worden gefragmenteerd en daarom kan worden geïdentificeerd, afneemt. Omgekeerd verhoogt isobare etikettering de spectrale complexiteit op MS1-niveau niet, hoewel het uitdagingen introduceert voor analyten met een lage abundantie, zoals neuropeptiden. Aangezien isobare kwantificering wordt uitgevoerd op het niveau van fragmentionenmassaspectra (MS2), kunnen neuropeptiden met een lage abundantie mogelijk niet worden gekwantificeerd omdat meer overvloedige matrixcomponenten kunnen worden geselecteerd voor fragmentatie en de geselecteerde mogelijk niet hoog genoeg abundantie hebben om te worden gekwantificeerd. Met isotopische etikettering kan kwantificering worden uitgevoerd op elk geïdentificeerd peptide.

Naast identificatie en kwantificering kan lokalisatie-informatie door MS worden verkregen via MALDI-MS imaging (MALDI-MSI)10. Door een laser over een monsteroppervlak te rasteren, kunnen MS-spectra worden gecompileerd tot een heatmapbeeld voor elke m/z-waarde . Het in kaart brengen van de intensiteit van het transiënte neuropeptidesignaal in verschillende regio's in verschillende omstandigheden kan waardevolle informatie opleveren voor functiebepaling11. Lokalisatie van neuropeptiden is vooral belangrijk omdat de neuropeptidefunctie kan verschillen afhankelijk van locatie12.

Neuropeptiden worden in vivo in een lagere abundantie aangetroffen dan andere signaalmoleculen, zoals neurotransmitters, en vereisen dus gevoelige methoden voor detectie13. Dit kan worden bereikt door het verwijderen van matrixcomponenten met een hogere abundantie, zoals lipiden11,14. Aanvullende overwegingen voor de analyse van neuropeptiden moeten worden gemaakt in vergelijking met gewone proteomics-workflows, vooral omdat de meeste neuropeptidomische analyses enzymatische spijsvertering weglaten. Dit beperkt software-opties voor neuropeptidegegevensanalyse, omdat de meeste zijn gebouwd met algoritmen op basis van proteomics-gegevens en eiwitmatches op basis van peptidedetectie. Veel software zoals PEAKS15 is echter meer geschikt voor neuropeptide-analyse vanwege hun de novo sequencing-mogelijkheden. Verschillende factoren moeten worden overwogen voor de analyse van neuropeptiden, beginnend bij extractiemethode tot MS-gegevensanalyse.

De hier beschreven protocollen omvatten methoden voor monstervoorbereiding en dimethylisotopische etikettering, gegevensverzameling en gegevensanalyse van neuropeptiden door LC-ESI-MS, MALDI-MS en MALDI-MSI. Door middel van representatieve resultaten van verschillende experimenten wordt het nut en het vermogen van deze methoden om neuropeptiden van blauwe krabben, Callinectes sapidus, te identificeren, kwantificeren en lokaliseren, aangetoond. Om het zenuwstelsel beter te begrijpen, worden vaak modelsystemen gebruikt. Veel organismen hebben geen volledig gesequenced genoom beschikbaar, wat uitgebreide neuropeptide-ontdekking op peptideniveau voorkomt. Om deze uitdaging te verminderen, is een protocol opgenomen voor het identificeren van nieuwe neuropeptiden en transcriptoommining om databases voor organismen te genereren zonder volledige genoominformatie. Alle protocollen die hier worden gepresenteerd, kunnen worden geoptimaliseerd voor neuropeptidemonsters van elke soort, evenals worden toegepast voor de analyse van endogene peptiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle beschreven weefselmonsters werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Wisconsin-Madison.

1. LC-ESI-MS analyse van neuropeptiden

  1. Neuropeptide extractie en ontzouting
    1. Bereid voorafgaand aan weefselverwerving aangezuurde methanol (acMeOH) (90:9:1 MeOH:water:azijnzuur) voor zoals beschreven in16.
    2. Verzamel hersenweefsel van het schaaldier17 en gebruik een tang om onmiddellijk één weefsel elk in een buis van 0,6 ml met 20 μL acMeOH te plaatsen.
      OPMERKING: Weefseldissectieprotocollen variëren sterk voor verschillende dieren en verschillende weefseltypen. De lezer wordt verwezen naar protocol17 voor een gedetailleerde beschrijving van het ontleden van hersenweefsel en meerdere andere weefseltypen van het schaaldier. Monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C tot gebruik (idealiter binnen 6 maanden). De beschreven volumes worden gebruikt voor een enkel brein van Callinectes sapidus. Volumes moeten worden geschaald voor weefselgrootte. Weefsel kan onmiddellijk worden ingevroren zonder oplosmiddel, hoewel dit niet wordt aanbevolen omdat endogene proteolytische enzymen niet worden geremd en actief blijven, hoewel in een langzamer tempo wanneer het koud is.
    3. Voeg 150 μL acMeOH toe aan het monster. Stel de totale ultrasoonapparaattijd in op 24 s, pulstijd op 8 s, pauzetijd op 15 s en amplitude op 50% op een ultrasone homogenisator en homogeniseer de monsters op ijs.
      OPMERKING: Er zijn verschillende homogenisatiesystemen beschikbaar. Pas de instellingen en omstandigheden aan op basis van het type monster en de apparatuur.
    4. Centrifugeer het monster bij 4 °C bij 20.000 x g gedurende 20 minuten. Pipetteer met een pipet het supernatant in een buis en droog het in een vacuümconcentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) bij ongeveer 35 °C.
      OPMERKING: De gedroogde monsters kunnen worden bewaard bij -80 °C tot gebruik (idealiter binnen 6 maanden). Het verwarmen van de vacuümconcentrator moet met de nodige voorzichtigheid worden uitgevoerd. Hoewel hitte de droogtijd verkort, moet het monster onmiddellijk uit de concentrator worden verwijderd nadat alle vloeistof is verdampt om de afbraak van peptiden te minimaliseren. Om dit te voorkomen, kan verwarming worden weggelaten uit deze en alle volgende stappen.
    5. Reconstitueer voor ontzouting het geëxtraheerde weefselmonster in 20 μL van 0,1% mierenzuur (FA), vortexput en soniceer gedurende 1 minuut in een waterbad bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Er zijn verschillende ontzoutingsmaterialen beschikbaar. Pas de oplossingen en volumes aan op basis van de harsidentiteit en de hoeveelheid neuropeptiden. De totale hoeveelheid peptide kan worden geschat met behulp van een commerciële kwantificeringstest voor peptiden (zie Tabel met materialen).
    6. Breng 0,5 μL monster aan op een pH-strip om te bevestigen dat de pH < 4. Als de pH hoger is, voegt u 1 μL aliquots van 10% FA toe totdat de pH < 4.
    7. Volg het protocol van de fabrikant voor het ontzouten van18. Bereid een bevochtigingsoplossing met 100 μL 50% acetonitril (ACN), equilibratieoplossing met 100 μL 0,1% FA, wasoplossing met 100 μL 0,1% FA en elutieoplossingen met 20 μL 25% ACN/0,1% FA, 20 μL 50% ACN/0,1% FA en 20 μL 75% ACN/0,1% FA.
    8. Verkrijg een ontzoutingstip van 10 μL met C18-hars (zie Tabel met materialen).
    9. Plaats de ontzoutingstip op een pipet van 20 μL die is ingesteld op 15 μL. Zodra de ontzoutingstip nat is, voorkomt u dat er lucht doorheen gaat door de pipet ingedrukt te houden wanneer deze uit de oplossing is totdat deze wordt weggegooid.
    10. Zuig de tip 3x aan met bevochtigingsoplossing en 3x met equilibratie-oplossing. Zuig 10x in het monster op, gevolgd door 3x wassen in wasoplossing, waarbij elke wasbeurt wordt weggegooid. Eluteer door 10x in elk van de elutie-oplossingen te zuigen om de ACN te verhogen.
      OPMERKING: Elutiefracties kunnen gescheiden of gecombineerd worden voor verdere analyses.
    11. Gooi de gebruikte ontzoutingstip weg en droog de geëlueerde neuropeptiden in een vacuümconcentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) bij ongeveer 35 °C.
      OPMERKING: Dit kan worden bewaard bij -80 °C tot gebruik (idealiter binnen 6 maanden).
  2. Isotopische etikettering van neuropeptiden in weefselextract
    OPMERKING: Deze stap is optioneel en wordt alleen gebruikt wanneer kwantificering gewenst is.
    1. Bereid de 2-plex isotopische dimethyletiketteringsoplossing in een zuurkast: 1% CH2OH2 (13,5 μL bouillon 37 gewichts-/gewichtspercentage (wt. %) in wateroplossing in 486,5 μL water), 1% CH2OD2 (25 μL bouillon 20 wt. % oplossing in 475 μL water) en 0,03 M borane pyridine (3,75 μL voorraad 8 M oplossing in 996,25 μL water).
      LET OP: Formaldehyde is giftig, dus alle oplossingen moeten in een geventileerde kap worden bewaard. Draag handschoenen, een laboratoriumjas, oogbescherming en ondoordringbaar schoeisel. Contactlenzen mogen niet worden gedragen bij het werken met dit materiaal.
      OPMERKING: Er zijn verschillende isotopische reagentia; selecteer de juiste op basis van het voorbeeldtype en het aantal gewenste etiketteringskanalen.
    2. Los ruw neuropeptide-extract op in 10 μL water en soniceer gedurende 10 minuten.
    3. Voeg 10 μL van een andere isotopische formaldehyde-oplossing (d.w.z. CH2OH2, CH2OD2, enz.) toe aan elke verschillende experimentele toestand die kwantitatief moet worden gemeten. Vortex om goed te mengen en centrifugeer elk monster kort op 2.000 x g.
    4. Voeg 10 μL 0,03 M boraanpyridine toe aan elke monsterbuis. Vortex om goed te mengen en centrifugeer elk monster kort op 2.000 x g.
    5. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 37 °C in een waterbad.
    6. Verwijder de monsters uit het waterbad en voeg 10 μL ammoniumbicarbonaat van 100 mM toe. Vortex om goed te mengen en centrifugeer elk monster kort op 2.000 x g.
    7. Combineer de gelabelde monsters voor één 2-plex monster en droog de neuropeptiden in een vacuümconcentrator (266 x g, 1 x 10-4 Torr) bij ongeveer 35 °C.
    8. Desalt de gelabelde neuropeptiden door stappen 1.1.5 - 1.1.10 opnieuw uit te voeren en bewaar ze totdat ze klaar zijn voor gegevensverzameling.
  3. Data-acquisitie
    1. Reconstitueer de gedroogde ontzoute neuropeptiden in 12 μL van 3% ACN/0,1% FA, vortexput, soniceer in 37 °C waterbad gedurende 1 minuut en centrifugeer kort bij 2.000 x g. Breng elk monster over in injectieflacons met automatische monsters.
      OPMERKING: Pas het monstervolume aan op basis van de neuropeptidehoeveelheid tot een concentratie van ~ 1 μg peptide per μL. De totale hoeveelheid peptide kan worden geschat met behulp van een commerciële kwantificeringstest voor peptiden (zie Tabel met materialen).
    2. Gebruik een autosampler om 1 μL monster in een nano-LC-MS/MS-instrument met hoge resolutie te injecteren (zie Materiaaltabel).
    3. Gebruik een ongeveer 15 cm lange omgekeerde fase (RP) C18-kolom (zie Materiaaltabel) voor het uitvoeren van het monster met 0,1% FA in water als mobiele fase A en 0,1% FA in ACN als mobiele fase B. Voer de monsters uit met een gradiënt van 3% - 95% van B met een snelheid van 300 nL / min gedurende meer dan 11 minuten.
    4. Gebruik voor het MS-instrument dat hier wordt gebruikt, algemene MS-omstandigheden van 2,00 kV voor sproeispanning en 275 °C voor capillaire temperatuur.
    5. Verkrijg MS-spectra in het bereik van 200 - 2.000 m / z met een resolutie van 60.000, automatische versterkingsregeling (AGC) van 1 x 106 en maximale ioninjectietijd (IT) van 150 ms.
    6. Selecteer de 15 meest intense ionen (minimale intensiteit van 3,2 x 104) voor hcd-fragmentatie (higher-energy collision dissociation) met een genormaliseerde botsingsenergie van 30, isolatievenster van 2,0 m/z, resolutie van 15.000, een AGC-doel van 2 x 105 en een maximale IT van 250 ms.
    7. Stel een dynamisch uitsluitingsvenster van 30 s in. Sluit ionen met een lading van 1 of ≥ 8 en ionen met niet-herkende ladingstoestanden uit.
  4. Neuropeptide identificatie en kwantificering
    OPMERKING: Veel software voor het zoeken naar databases en kwantificering van peptiden (zowel open-source als commercieel) zijn beschikbaar. Hier wordt gebruik gemaakt van PEAKS Studio (proteomics software)15 .
    1. Voer databasezoekopdrachten uit met behulp van de stappen die worden beschreven in 1.4.2 - 1.4.6.
    2. Maak een nieuw project en voeg de LC-MS-gegevens toe door Geen te selecteren voor het enzym, Orbitrap voor het instrument, HCD voor het fragment en gegevensafhankelijke acquisitie (DDA) voor acquisitie.
      OPMERKING: Selecteer de juiste parameters op basis van parameters voor gegevensverzameling.
    3. Selecteer Identificaties en selecteer Correct Precursor [DDA] en Alleen massa.
    4. Selecteer Database Search en stel een fouttolerantie in van 20,0 ppm met behulp van mono-isotopische massa voor precursormassa en 0,02 Da voor fragmentionenmassa, Geen voor enzymtype, Niet-specifiek voor verteermodus, 100 voor maximale gemiste splitsingen en de volgende variabele PTM's met de maximaal toegestane variabele PTM per peptide van 3: Amidatie, Oxidatie (M), Pyro-glu van E, en Pyro-glu van Q.
    5. Selecteer de Neuropeptide Database, schat false discovery rate (FDR) met decoy-fusion.
      OPMERKING: De massatolerantiefout moet worden aangepast aan de verzamelde gegevens. Gebruik de juiste database voor het voorbeeldtype. Wanneer er geen enzym is geselecteerd, heeft de parameter max missed cleavages geen invloed op de zoekopdracht. Een groot aantal gemiste splitsingen is echter vereist als de software de niet-gespecificeerde digest-modus niet als optie heeft.
    6. Als labelvrije kwantificering gewenst is, selecteert u Kwantificering, selecteert u Labelvrij en stelt u een fouttolerantie van 20,0 ppm en een retentietijdtolerantie van 1,0 minuten in.
    7. Voer precursorionkwantificering uit als stap 1.2 voor isotopische etikettering is uitgevoerd.
      1. Selecteer Kwantificering, selecteer Precursor Ion Quantification, gebruik een retentietijdbereik van 1,0 min en gebruik een FDR-drempel van 1%.
      2. Selecteer een vooraf ingestelde of aangepaste kwantificeringsmethode in het vervolgkeuzemenu Methode selecteren .
      3. Als u een nieuwe aangepaste methode wilt maken, klikt u op > Configuratie > Methode Label Q > Nieuw. Geef de nieuwe methode een naam en selecteer Precursor Ion Quantification voor Methodetype. Selecteer Rij toevoegen en selecteer wijziging in de lijst PTM-opties.
      4. Voeg de LC-MS-gegevens toe en selecteer Referentieconditie om de modificatie op neuropeptiden te zijn van de controleconditie van het experiment.
    8. Evalueer de zoekresultaten zoals beschreven in stappen 1.4.9 - 1.4.11.
    9. Filter de resultaten door het overzichtstabblad voor peptiden en eiwitten met -10lgP ≥ 20, selecteer ≥ 1 uniek peptide en selecteer het vakje met het label Met significante peptiden.
    10. Evalueer de zoekresultaten van de database waarbij Protein.csv neuropeptide-identificaties vertegenwoordigt en Peptide.csv neuropeptidefragmentidentificaties vertegenwoordigt.
    11. Inspecteer de databasezoekopdracht op eiwit- en peptidescores, massanauwkeurigheid en sequentiedekking.
      OPMERKING: Elke databasezoeksoftware maakt gebruik van unieke scoringsalgoritmen en moet mogelijk dienovereenkomstig worden geëvalueerd. Identificaties kunnen worden geëvalueerd door de waargenomen spectra handmatig te inspecteren op geïdentificeerde peptiden die de volledige fragmentionenreeks bevatten.

2. MALDI-MS spotting analyse van neuropeptiden

  1. Monstervoorbereiding
    1. Volg stap 1.1 of stap 1.1 - 1.2 als kwantificering gewenst is, met uitzondering van stap 1.2.8 (ontzouting na isotopische etikettering is niet vereist voorafgaand aan MALDI-MS-analyse).
    2. Reconstitueer de gedroogde ontzoute neuropeptiden in 5 μL van 0,1% FA, vortexput, soniceer gedurende 1 minuut in een waterbad van 37 °C en centrifugeer kort bij 2.000 x g.
    3. Voor het spotten van neuropeptiden in schaaldierweefsels, bereid 150 mg / ml 2,5-dihydroxybenzoëzuur (DHB) in 50% methanol (MeOH) / 0,1% FA (v / v) als de matrix.
    4. Pipetteer een monsterdruppel van 3 μL op een hydrofobe film (zie Materiaaltabel) en pipetteer 3 μL van de matrix rechtstreeks op de monsterdruppel. Pipetteer op en neer om te mengen.
    5. Pipet 1 μL van het 1:1 monster: matrixmengsel in een put van de MALDI roestvrijstalen doelplaat. Gebruik de pipetpunt om elk mengsel goed uit te spreiden over de randen van het monster. Het monster moet de randen van de putgravure raken om een gelijkmatige verdeling te vergemakkelijken (figuur 4A).
    6. Spot 1 μL van 1:1 kalibrant:matrixmengsel (commerciële of aangepaste kalibratiemix, polymeermaterialen (d.w.z. rode fosfor opgelost in MeOH) of gemeenschappelijke matrixclusterionen)12 in een put in de buurt van het monster.
      OPMERKING: Rode fosfor hoeft niet te worden gemengd met matrix voordat het wordt opgemerkt.
  2. Data-acquisitie
    1. Plaats de doelplaat met gedroogde monstervlekken in het MALDI Tandem Time-of-Flight (TOF/TOF)-instrument (zie Materiaaltabel).
    2. Stel voor dhb-matrix het laservermogen in op 95%, selecteer automatische optimale detectorversterking en smart - complete sample sample carrier bewegingsmodus. Verkrijg MS-spectra in het bereik van 200 - 3200 m / z en voeg meerdere spectra van elke plek samen om de neuropeptide signaal-ruisverhouding te verhogen.
      OPMERKING: Optimaliseer het percentage laservermogen, detectorversterking en selecteer de juiste bewegingsmodus voor monsterdragers, zodat elke acquisitie ongeveer de hele plek bestrijkt en volgende acquisities niet naar de vorige posities gaan.
    3. Kalibreer het instrument.
      OPMERKING: Pas het massabereik aan om het gewenste neuropeptidebereik te omvatten.
  3. Data-analyse
    1. Open het MALDI-MS-bestand in data-analysesoftware (zie Tabel met materialen) en klik op Baseline Subtracction voor de software die hier wordt gebruikt.
    2. Voer piekselectie uit door op Massalijst zoeken te klikken. Als er te weinig pieken zijn, bewerkt u de massalijst handmatig door Massalijst bewerken te selecteren en klikt u op pieken in het spectrum om ze aan de massalijst toe te voegen.
    3. Voer nauwkeurige massamatching uit door de massalijst te vergelijken met de neuropeptidedatabase met [M + H] + m / z-waarden (± fout van 200 ppm). 
      OPMERKING: Gemeenschappelijke zoutadducten, zoals [M + K]+, [M +Na] + en [M + NH4]+, moeten ook worden opgenomen in de nauwkeurige lijst met doelen voor massamatching.
    4. Om de geïdentificeerde pieken te verifiëren, genereert u een lijst met m/z van belang en voert u MS/MS-experimenten uit.

3. MALDI-MS beeldvormingsanalyse van neuropeptiden

  1. Monstervoorbereiding
    OPMERKING: Insluit- en sectiestappen zijn niet nodig voor weefsels die te dun zijn om te worden gesneden.
    1. Vul een halve cryostaatbeker met gelatine (37 °C, 100 mg/ml in gedeïoniseerd water) en laat het stollen bij kamertemperatuur. Houd overgebleven vloeibare gelatine warm in een waterbad van 37 °C.
    2. Verzamel het gewenste neuronale weefsel van het dier en gebruik een tang om het weefsel onmiddellijk gedurende 1 s in een buis van 0,6 ml met gedeïoniseerd water te dopen.
      OPMERKING: Raadpleeg stap 1.1.2 OPMERKING voor neuronale weefseldissectie.
    3. Leg het weefsel op de vaste gelatine en vul de rest van de cryostaatbeker met vloeibare gelatine. Gebruik een tang om het weefsel te positioneren.
    4. Plaats de cryostaatbeker op een plat oppervlak en vries in met droogijs.
      OPMERKING: Bewaar monsters bij -80 °C tot gebruik (idealiter binnen 6 maanden).
    5. Voor de sectiebereiding scheidt u het met gelatine ingebedde monster van de cryostaatvorm door de vorm weg te snijden.
    6. Monteer het ingebedde weefsel op een cryostaat-klauwplaat door een druppel gedeïoniseerd water van 1 ml op de klauwplaat te pipetteren en het ingebedde weefsel onmiddellijk op de druppel te drukken.
    7. Eenmaal bevroren, pipetteer meer gedeïoniseerd water rond het weefsel om het verder aan de klauwplaat vast te zetten. Voer deze stappen uit in de cryostaatbox (zie Materialentabel) die is ingesteld op -20 °C.
    8. Snijd het weefsel op een geschatte dikte van één cel (8-20 μm afhankelijk van het monstertype) en ontdooi monteer elke sectie op een met indiumtinoxide (ITO) gecoate glasplaat door een kant van de dia in de buurt van de sectie te plaatsen en een vinger aan de andere kant van de dia te plaatsen om het glas langzaam te verwarmen en de sectie aan de dia te laten kleven.
      OPMERKING: Weefselsecties kunnen ook worden ontdooid door een rand van de gelatine op te pakken met een pincet (gekoeld tot -20 °C), deze op de ito-gecoate glasplaat te plaatsen en een vinger aan de andere kant van de dia te plaatsen om het glas langzaam op te warmen en het gedeelte aan de dia te laten kleven.
    9. Zoek het monster dat als kalibrant moet worden gebruikt (zie stap 2.1.6 voor kalibrantopties) door met een hydrofobe pen een kleine cirkel in de buurt van het weefselgedeelte te tekenen en de kalibrant binnen de cirkel te spotten.
    10. Markeer elke hoek van de dia met een white-outpen met een kleine vorm met scherpe randen (d.w.z. x) die als leerpunten moet worden gebruikt.
    11. Plaats de glasplaat in de MALDI-diaadapterplaat en maak een optische beeldscan met hoge resolutie (≥2400 DPI) met behulp van een scanner.
    12. Spuitmatrix op het weefselgedeelte met behulp van een geautomatiseerde sproeier (zie Tabel met materialen voor details en instructies van de sproeier).
    13. Gebruik voor MSI van neuropeptiden in schaaldierweefsels 40 mg / ml DHB in 50% methanol / 0,1% FA (v / v) als matrix, stel de mondstuktemperatuur in op 80 ° C, snelheid op 1.250 mm / min, stroomsnelheid op 0,1 ml / min, aantal passages op 12 en 30 s tussen elke pas voor de automatische sproeier.
  2. Data-acquisitie
    1. Plaats de volledig gedroogde doelplaat met op ontdooi gemonteerde weefselsecties die met de matrix zijn besproeid.
    2. Stel de parameters van het MS-beeldvormingsacquisitiebestand zo in dat de laserdiameter kleiner is dan de rasterstapgrootte.
    3. Laad de gescande optische afbeelding en kalibreer de monsterplaat met behulp van de x teach-punten. Definieer de weefselgebieden van belang die iets groter moeten worden gemeten dan de werkelijke weefselsectie om ook gebieden op te nemen die alleen matrix bevatten.
    4. Kalibreer het instrument en verkrijg spectra in het bereik van 200 - 3200 m/z. Pas het massabereik aan om het gewenste neuropeptidebereik te omvatten.
  3. Data-analyse
    1. Als u gegevens wilt verwerken, importeert u de MS-beeldvormingsdataset in de gewenste software, selecteert u een basislijnverwijderingsalgoritme en normaliseert u gegevens met behulp van het totale aantal ionen.
      OPMERKING: Selectie van verschillende normalisatie-algoritmen, zoals mediaan, RMS-waarde (root mean square) of de intensiteit van een referentie m/z-waarde , zal waarschijnlijk de ruimtelijke verdeling van veel m/z-waarden veranderen. Kies het normalisatiealgoritme dat het meest geschikt is voor gewenste analyten.
    2. Om een afbeelding te genereren voor elke m/z-waarde uit een theoretische pieklijst, uploadt u een csv-bestand (comma-separated values) met neuropeptide [M+H]+, [M+Na]+, [M+NH4]+, enz. Verkrijg m/z-waarden door op Bestand te klikken > > pieklijst importeren. Geef de pieklijst een naam.
    3. Om de juiste ppm-foutdrempel te schatten, identificeert u eerst handmatig een neuropeptidepiek in het MS-spectrum en vergelijkt u deze met de theoretische massa van het neuropeptide. Bereken de ppm-fout en klik op Bestand > Bestandseigenschappen > intervalbreedte en invoer ppm-fout.
    4. Selecteer de pieklijst in het vervolgkeuzemenu en klik op M/z-afbeeldingen maken voor elk interval van de pieklijst.
    5. Sla elke m/z-afbeelding op door op Screenshot van elke m/z-afbeelding opslaan te klikken.
      OPMERKING: Vermeende neuropeptide-identificatie kan worden uitgevoerd door m / z-afbeeldingen te identificeren waarbij het analytsignaal alleen in het weefsel is gelokaliseerd en niet in de omringende matrix.
    6. Om de piekidentiteit te verifiëren, genereert u een lijst met interessante m/z's en voert u MS/MS-experimenten uit.

4. Het ontdekken van nieuwe vermeende neuropeptiden met behulp van de novo sequencing

  1. Voer stappen 1.4.2 - 1.4.5 uit.
  2. Exporteer de novo alleen peptiden.csv uit PEAKS-software met een gemiddelde lokale betrouwbaarheid (ALC) score van ≥ 75.
    OPMERKING: Er is veel software beschikbaar om de novo sequencing uit te voeren, elk met zijn eigen scoringsalgoritmen en moet dienovereenkomstig worden geëvalueerd.
  3. Zoek in de peptidelijst naar bekende sequentiemotieven die wijzen op neuropeptiden die behoren tot specifieke neuropeptidefamilies19.
    OPMERKING: Hoewel motieven over het algemeen goed bewaard blijven tussen soorten, moeten de gezochte motieven worden geselecteerd met inachtneming van het monsterorganisme.

5. Transcriptoommijnbouw voor voorspelde neuropeptidesequenties

OPMERKING: Deze stap is optioneel en wordt alleen gebruikt om toe te voegen aan een bestaande neuropeptidedatabase of een nieuwe neuropeptidedatabase te bouwen.

  1. Kies een bekende preprohormoon aminozuursequentie van belang en gebruik tBLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_PROGRAMS=tblastn&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&LINK
    _LOC=blasthome) om de preprohormone volgorde van zoekopdrachten te doorzoeken op databases zoals nr/nt, Refseq_genomes, EST en TSA.
    OPMERKING: Als u querysequenties wilt zoeken tegen eiwitdatabase, gebruikt u BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&BLAST_PROGRAMS=blastp&PAGE
    _TYPE=BlastSearch&SHOW_DEFAULTS=on&BLAST
    _SPEC=&LINK_LOC=blasttab&LAST_PAGE=tblastn).
    1. Selecteer het doelorganisme (belasting-id) en wijzig de parameters van het algoritme Drempel verwachten in 1000 om uitlijningen met een lage score op te nemen.
    2. Voer het BLAST-programma uit en controleer vervolgens de resultaten op hoge homologiescores tussen query- en onderwerpsequenties die significante uitlijningen produceren. Sla fasta-bestand met nucleotidesequentie op.
      OPMERKING: Als er meerdere subjectsequenties zijn met vergelijkbare homologiescores, voer dan een MAFFT-uitlijning uit om putatieve sequenties20,21 te verkleinen.
  2. Vertaal preprohormoon nucleotide sequentie in preprohormoon peptide sequenties met behulp van Expasy Translate tool (https://web.expasy.org/translate/). Selecteer voor C. sapidus Invertebrate Mitochondrial voor genetische code.
  3. Controleer op signaalpeptidesequentie en prohormoonsplitsingsplaatsen in de peptidesequenties met behulp van SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP).
    OPMERKING: Homologie aan bekende preprohormoonverwerkingsschema's kan ook worden gebruikt om prohormoonsplitsingsplaatsen te identificeren. Mogelijke posttranslationele modificaties voor signaalpeptiden kunnen indien gewenst worden voorspeld. Sulfinator (https://web.expasy.org/sulfinator/) kan worden gebruikt om de sulfateringstoestand van tyrosineresiduen te voorspellen. DiANNA (http://clavius.bc.edu/~clotelab/DiANNA/) kan worden gebruikt om disulfidebindingsconnectiviteit te voorspellen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De workflow voor monstervoorbereiding en MS-analyse is weergegeven in figuur 1. Na de dissectie van neuronaal weefsel worden homogenisatie, extractie en ontzouting uitgevoerd om neuropeptidemonsters te zuiveren. Als isotopische labelgebaseerde kwantificering gewenst is, worden monsters vervolgens gelabeld en opnieuw ontzout. Het resulterende monster wordt geanalyseerd door middel van LC-MS / MS voor neuropeptide-identificatie en kwantificering.

Neuropeptiden geïde...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De nauwkeurige identificatie, kwantificering en lokalisatie van neuropeptiden en endogene peptiden in het zenuwstelsel zijn cruciaal voor het begrijpen van hun functie23,24. Massaspectrometrie is een krachtige techniek waarmee dit alles kan worden bereikt, zelfs in organismen zonder een volledig gesequenced genoom. Het vermogen van dit protocol om neuropeptiden te detecteren, kwantificeren en lokaliseren uit weefsel verzameld van C. sapidus door een comb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door de National Science Foundation (CHE-1710140 en CHE-2108223) en de National Institutes of Health (NIH) door middel van subsidie R01DK071801. A.P. werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH Chemistry-Biology Interface Training Grant (T32 GM008505). N.V.Q. werd gedeeltelijk ondersteund door de National Institutes of Health, onder de Ruth L. Kirschstein National Research Service Award van het National Heart Lung and Blood Institute aan het University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (T32 HL007936). L.L. wil graag nih-subsidies R56 MH110215, S10RR029531 en S10OD025084 erkennen, evenals financieringssteun van een Vilas Distinguished Achievement Professorship en Charles Melbourne Johnson Professorship met financiering verstrekt door de Wisconsin Alumni Research Foundation en university of Wisconsin-Madison School of Pharmacy.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Chemicals, Reagents, en verbruiksartikelen
2,5-Dihydroxybenzoic acid (DHB) matrixSupelco39319
AzijnzuurFisher ChemicalA38S-500
Acetonitrile Optima LC/MS gradeFisher ChemicalA955-500
AmmoniumbicarbonaatSigma-Aldrich9830
Boraan pyridineSigma-Aldrich179752
Bruker peptide calibratiemixBruker DaltonicsNC9846988
CapillairPolymicro1068150019om nanoflow kolom te maken (75 µm binnendiameter x 360 µm buitendiameter)
Cryostat cupSigma-AldrichE6032elke cup of mal zou moeten werken
 MicrocentrifugebuisjesEppendorf30108434
FormaldehydeSigma-Aldrich252549
Formaldehyde - D2Sigma-Aldrich492620
Formic acid Optima LC/MS gradeFisher ChemicalA117-50
GelatineDifco214340plaats in waterbad van 37 °C om te smelten
Hydrofobe barrièrepenVector Labs15553953
Indium tinoxide (ITO)-gecoate glasplaatjesDelta TechnologiesCB-90IN-S10725 mm x 75 mm x 0.8 mm (breedte x lengte x dikte)
LC-MS-vialThermoTFMSCERT5000-30LVW
Methanol Optima LC/MS GradeFisher ChemicalA456-500
ParafilmSigma-AldrichP7793Hydrofobe film
pH-indicator stripsSupelco109450
Rode fosforclustersSigma-Aldrich343242
Omgekeerde fase C18-materiaalWaters186002350handmatig gepakt in nanoflow kolom
Wite-out penBIC150810
ZipTipMilliporeZ720070
Instrumenten en gereedschappen
Automatisch matrixsproeiersysteem- M5HTX Technologies, LLC
Centrifuge - 5424 REppendorf05-401-205
Cryostat- HM 550Thermo Fisher Scientific956564A
DroogmiddelDrierite2088701
PincetWPI501764
MALDI roestvrijstalen doelplaatBruker Daltonics8280781
Pipet-Lite XLSRainin17014391200 µL
Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-OrbitrapThermo Fisher ScientificIQLAAEGAAPFALGMBDK
RapifleX MALDI-TOF/TOFBruker Daltonics
SpeedVac - SVC100SavantSVC-100D
UltrasoonreinigerBransonic2510R-MTHvoor sonicatie
Ultrasoon homogenisatorFisher ScientificFB120110FB120 Sonic Dismembrator met CL-18 sonde
Vacuumpomp- Alcatel 2008 AIdeal Vacuum ProductsP10976uiteindelijke druk = 1 x 10-4 Torr
Vortex MixerCorning6775
Waterbad (37C) - Isotemp 110Fisher Scientific15-460-10
Data-analysesoftware
Expasyhttps://web.expasy.org/translate/
FlexAnalysisBruker Daltonics
FlexControlBruker Daltonics
FlexImagingBruker Daltonics
PEAKS StudioBioinformatics Solutions, Inc.
SCiLS Labhttps://scils.de/
SignalP 5.0https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0
tBLASTnhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST_
PROGRAMS=tblastn&PAGE_
TYPE=BlastSearch&SHOW_
DEFAULTS=on&LINK_LOC
=blasthome

Referenties

  1. Hökfelt, T., et al. Neuropeptides - an overview. Neuropharmacology. 39 (8), 1337-1356 (2000).
  2. Radhakrishnan, V., Henry, J. L. Electrophysiology of neuropeptides in the sensory spinal cord. Progress in Brain Research. 104, 175-195 (1995).
  3. Nässel, D. R., Ekström, P. Detection of neuropeptides by immunocytochemistry. Methods in Molecular Biology. 72, clifton, N.J. 71-101 (1997).
  4. Martins, J., et al. Activation of Neuropeptide Y Receptors Modulates Retinal Ganglion Cell Physiology and Exerts Neuroprotective Actions In Vitro. ASN Neuro. 7 (4), 1759091415598292(2015).
  5. Racaityte, K., Lutz, E. S. M., Unger, K. K., Lubda, D., Boos, K. S. Analysis of neuropeptide Y and its metabolites by high-performance liquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry and integrated sample clean-up with a novel restricted-access sulphonic acid cation exchanger. Journal of Chromatography. A. 890 (1), 135-144 (2000).
  6. Salisbury, J. P., et al. A rapid MALDI-TOF mass spectrometry workflow for Drosophila melanogaster differential neuropeptidomics. Molecular Brain. 6, 60(2013).
  7. Schmerberg, C. M., Li, L. Function-driven discovery of neuropeptides with mass spectrometry-based tools. Protein and Peptide Letters. 20 (6), 681-694 (2013).
  8. Lee, J. E. Neuropeptidomics: Mass Spectrometry-Based Identification and Quantitation of Neuropeptides. Genomics & Informatics. 14 (1), 12-19 (2016).
  9. Sauer, C. S., Phetsanthad, A., Riusech, O. L., Li, L. Developing mass spectrometry for the quantitative analysis of neuropeptides. Expert Review of Proteomics. 18 (7), 607-621 (2021).
  10. Pratavieira, M., et al. MALDI Imaging Analysis of Neuropeptides in Africanized Honeybee ( Apis mellifera) Brain: Effect of Aggressiveness. Journal of Proteome Research. 17 (7), 2358-2369 (2018).
  11. Buchberger, A. R., Vu, N. Q., Johnson, J., DeLaney, K., Li, L. A Simple and Effective Sample Preparation Strategy for MALDI-MS Imaging of Neuropeptide Changes in the Crustacean Brain Due to Hypoxia and Hypercapnia Stress. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (5), 1058-1065 (2020).
  12. Vu, N. Q., DeLaney, K., Li, L. Neuropeptidomics: Improvements in Mass Spectrometry Imaging Analysis and Recent Advancements. Current Protein & Peptide Science. 22 (2), 158-169 (2021).
  13. Li, L., Sweedler, J. V. Peptides in the brain: mass spectrometry-based measurement approaches and challenges. Annual Review of Analytical Chemistry (Palo Alto, Calif). 1, 451-483 (2008).
  14. Li, N., et al. Sequential Precipitation and Delipidation Enables Efficient Enrichment of Low-Molecular Weight Proteins and Peptides from Human Plasma. Journal of Proteome Research. 19 (8), 3340-3351 (2020).
  15. Zhang, J., et al. PEAKS DB: de novo sequencing assisted database search for sensitive and accurate peptide identification. Molecular & Cellular Proteomics : MCP. 11 (4), (2012).
  16. Sturm, R. M., Greer, T., Woodards, N., Gemperline, E., Li, L. Mass spectrometric evaluation of neuropeptidomic profiles upon heat stabilization treatment of neuroendocrine tissues in crustaceans. Journal of Proteome Research. 12 (2), 743-752 (2013).
  17. Gutierrez, G. J., Grashow, R. G. Cancer borealis stomatogastric nervous system dissection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (25), e1207(2009).
  18. Sample Preparation for Mass Spectrometry. Merck. , Available from: http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737 (2021).
  19. DeLaney, K., et al. PRESnovo: Prescreening Prior to de novo Sequencing to Improve Accuracy and Sensitivity of Neuropeptide Identification. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 31 (7), 1358-1371 (2020).
  20. Oleisky, E. R., Stanhope, M. E., Hull, J. J., Christie, A. E., Dickinson, P. S. Differential neuropeptide modulation of premotor and motor neurons in the lobster cardiac ganglion. Journal of Neurophysiology. 124 (4), 1241-1256 (2020).
  21. Ma, M., et al. Combining in silico transcriptome mining and biological mass spectrometry for neuropeptide discovery in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei. Peptides. 31 (1), 27-43 (2010).
  22. Christie, A. E., Stemmler, E. A., Dickinson, P. S. Crustacean neuropeptides. Cellular and Molecular Life Sciences : CMLS. 67 (24), 4135-4169 (2010).
  23. DeLaney, K., et al. New techniques, applications and perspectives in neuropeptide research. The Journal of Experimental Biology. 221, Pt 3 (2018).
  24. Habenstein, J., et al. Transcriptomic, peptidomic, and mass spectrometry imaging analysis of the brain in the ant Cataglyphis nodus. Journal of Neurochemistry. 158 (2), 391-412 (2021).
  25. Maes, K., et al. Improved sensitivity of the nano ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric analysis of low-concentrated neuropeptides by reducing aspecific adsorption and optimizing the injection solvent. Journal of Chromatography. A. 1360, 217-228 (2014).
  26. Li, G., et al. Nanosecond photochemically promoted click chemistry for enhanced neuropeptide visualization and rapid protein labeling. Nature Communications. 10 (1), 4697(2019).
  27. Corbière, A., et al. Strategies for the Identification of Bioactive Neuropeptides in Vertebrates. Frontiers in Neuroscience. 13, 948(2019).
  28. Chen, R., Ma, M., Hui, L., Zhang, J., Li, L. Measurement of neuropeptides in crustacean hemolymph via MALDI mass spectrometry. Journal of American Society for Mass Spectrometry. 20 (4), 708-718 (2009).
  29. Fridjonsdottir, E., Nilsson, A., Wadensten, H., Andrén, P. E. Brain Tissue Sample Stabilization and Extraction Strategies for Neuropeptidomics. Peptidomics: Methods and Strategies. , Springer Protocols. New York,NY. 41-49 (2018).
  30. Buchberger, A. R., DeLaney, K., Johnson, J., Li, L. Mass Spectrometry Imaging: A Review of Emerging Advancements and Future Insights. Analytical Chemistry. 90 (1), 240-265 (2018).
  31. Phetsanthad, A., et al. Recent advances in mass spectrometry analysis of neuropeptides. Mass Spectrometry Reviews. , 21734(2021).
  32. Pérez-Cova, M., Bedia, C., Stoll, D. R., Tauler, R., Jaumot, J. MSroi: A pre-processing tool for mass spectrometry-based studies. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 215, 104333(2021).
  33. Christie, A. E., Chi, M. Prediction of the neuropeptidomes of members of the Astacidea (Crustacea, Decapoda) using publicly accessible transcriptome shotgun assembly (TSA) sequence data. General and Comparative Endocrinology. 224, 38-60 (2015).
  34. Livnat, I., et al. A d-Amino Acid-Containing Neuropeptide Discovery Funnel. Analytical Chemistry. 88 (23), 11868-11876 (2016).
  35. Lehrer, R. I., Ganz, T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. Ciba Foundation Symposium. 171, 276-290 (1992).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Karakterisering van neuropeptidenmassaspectrometrieendogene peptidenMALDI-MSvloeistofchromatografie-MSpeptidekwantificeringweefselextractiebiomarkerontdekkingde novo sequencing
Veelzijdig massaspectrometrisch onderzoek van neuropeptiden in Callinectes sapidus
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.