Dit protocol beschrijft hoe fumarylacetoacetaat hydrolase domeinbevattend eiwit 1 (FAHD1) uit varkensnier en muizenlever kan worden geëxtraheerd. De vermelde methoden kunnen worden aangepast aan andere eiwitten van belang en worden gewijzigd voor andere weefsels.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Extractie en zuivering van FAHD1-eiwit uit varkensnier en muizenlever
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fumarylacetoacetaat hydrolase domeinbevattend eiwit 1 (FAHD1) is het eerste geïdentificeerde lid van de FAH-superfamilie in eukaryoten, handelend als oxaalacetaatdecarboxylase in mitochondriën. Dit artikel presenteert een reeks methoden voor de extractie en zuivering van FAHD1 uit varkensnier en muizenlever. Behandelde methoden zijn ionische uitwisselingschromatografie met snelle eiwitvloeistofchromatografie (FPLC), preparatieve en analytische gelfiltratie met FPLC en proteomische benaderingen. Na totale eiwitextractie werden ammoniumsulfaatprecipitatie en ionische uitwisselingschromatografie onderzocht en FAHD1 werd geëxtraheerd via een sequentiële strategie met behulp van ionische uitwisseling en grootte-uitsluitingschromatografie. Deze representatieve benadering kan worden aangepast aan andere eiwitten van belang (uitgedrukt in significante niveaus) en worden gewijzigd voor andere weefsels. Gezuiverd eiwit uit weefsel kan de ontwikkeling van hoogwaardige antilichamen en / of krachtige en specifieke farmacologische remmers ondersteunen.
Inleiding
Het eukaryote FAH-domeinbevattende eiwit 1 (FAHD1) werkt als bifunctioneel oxaalacetaat (OAA) decarboxylase (ODx)1 en acylpyruvaathydrolase (ApH)2. Het is gelokaliseerd in mitochondriën2 en behoort tot de brede FAH-superfamilie van enzymen 1,2,3,4,5,6. Hoewel de ApH-activiteit slechts van ondergeschikt belang is, is de ODx-activiteit van FAHD1 betrokken bij de regulatie van de TCA....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de institutionele richtlijnen. Varkensnier werd vers uit de plaatselijke supermarkt gehaald. Leverweefsels werden geoogst van C57BL6 wild-type muizen onderhouden aan het Instituut voor Biomedisch Verouderingsonderzoek aan de Universiteit van Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Oostenrijk onder toezicht van Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr, gedekt door ethische toestemming als projectleider uitgegeven in 2013 (BMWF-66.008/0007-II/3b/2013). Onderhoud en gebruik van de muizen voor het project vallen onder ethische toestemming nr. 2020-0.242.978 vanaf 5 mei 2020, uitgegeven door het Oostenrijkse ministerie van....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
FAHD1-eiwit werd geëxtraheerd uit varkensnieren en muizenlever met behulp van het gepresenteerde protocol. Voor muizenweefsel zijn meerdere organen nodig om meerdere μg te verkrijgen na de laatste zuiveringsstap. Om deze reden richt dit artikel zich op de extractie van FAHD1 uit varkensnieren, wat een veel voorbeeldiger experiment is. De extractie van FAHD1 uit de muizenlever wordt uitgevoerd om de moeilijkheden en mogelijke valkuilen van dit protocol te presenteren. Het wordt over het algemeen aanbevolen om organen te g.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Kritieke stappen in het protocol
Het volgen van gemeenschappelijke richtlijnen voor de omgang met eiwitten is essentieel, zoals werken op ijs en bij matige pH- en zoutcondities. Het gebruik van proteaseremmers is gunstig voor de methode, terwijl het gebruik van proteasoomremmers ten zeerste wordt aanbevolen. Het invriezen en ontdooien van het monster kan altijd leiden tot eiwitprecipitatie (ten minste gedeeltelijk), dus elk ontdooide aliquot van initieel eiwitlysaat (stap 2) moet continu worden verwer.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen tegenstrijdige financiële belangen.
Dankbetuigingen
De auteurs zijn erg dankbaar voor de technische assistentie van Ayse Öztürk en Eva Albertini. Muizen die werden gebruikt voor het genereren van leverweefsel werden onderhouden onder toezicht van Univ.-Doz. Dr. Pidder Jansen-Dürr (Instituut voor Biomedisch Verouderingsonderzoek aan de Universiteit van Innsbruck, Rennweg 10, 6020 Innsbruck, Oostenrijk).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.22 µm filter units | MERCK | SLGP033RS | Millex-HP, 0.22 µm, PES 33 mm, niet steriel |
| 0.45 µm filter units | MERCK | SLHP033NS | Millex-HP, 0.45 µm, PES 33 mm, niet steriel |
| 15 mL Falcon tubes | VWR | 734-0451 | centrifugaalbuizen |
| 50 mL Falcon tubes | VWR | 734-0448 | centrifugaalbuizen |
| 96-Well UV Microplate | Thermo-Fischer | 8404 | UV/VIS transparante platte bodem 96 well platen |
| Acrylamide/Bis Solution (40%, 29:1 ratio) | BIO-RAD | #1610147 | 40% acrylamide/bis-acrylamide, 29:1 (3,3% crosslinker) oplossing voor het gieten van polyacrylamide gels |
| ÄKTA FPLC system | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | - | gebruikmakend van het FPLC systeem van GE Healthcare; er bestaan verschillende aangepaste versies; dit werk gebruikte het "ÄKTA pure" systeem |
| Amicon Ultra-15, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC901024 | centrifugale filters voor eiwitverrijking; 10 kDa moleculair massa filter; 15 mL |
| Amicon Ultra-4, PLGC Ultracel-PL Membran, 10 kDa | MERCK | UFC801024 | centrifugale filters voor eiwitverrijking; 10 kDa moleculair massa filter; 4 mL |
| Ammonium sulfate powder | MERCK | A4418 | ammoniumsulfaat voor moleculaire biologie, ≥99,0% |
| Ammoniumpersulfat reagent grade, 98% | MERCK | 215589 | Katalysator voor acrylamide gel polymerisatie. |
| Coomassie Brilliant blue R 250 | MERCK | 1125530025 | Coomassie Brilliant blue R 250 (C.I. 42660) voor elektroforese Handelsmerk van Imperial Chemical Industries PLC. CAS 6104-59-2, pH 6,2 (10 g/l, H2O, 25 °C) |
| Dialysis tubing cellulose membrane | MERCK | D9277 | Cellulose membranen voor het uitwisselen van buffers via dialyse. |
| Eppendof tubes 1.5 mL | VWR | 525-1042 | microcentrifugale buisjes; geautoclaveerd |
| HiLoad 26/600 Superdex 75 pg | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 28989334 | HiLoad Superdex 75 pg voorgevulde kolommen zijn voor hoogwaardige scheiding van eiwitten door grootte-uitsluitingschromatografie |
| Immun-Blot PVDF Membrane | BIO-RAD | #1620177 | PVDF membranen zijn eiwitblot membranen geoptimaliseerd voor fluorescente en multiplex fluorescente toepassingen. |
| Mini Trans-Blot Electrophoretic Transfer Cell | BIO-RAD | #1703930 | Gebruik de Mini Trans-Blot Cell voor snel blotten van Mini-PROTEAN voorgevormde en handgemaakte gels. |
| Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels | BIO-RAD | #1658004 | 4-gel verticale elektroforese systeem, inclusief elektrodenassemblage, begeleidende draaimodule, tank, deksel met stroomkabels, mini cell buffer dam. |
| Mono Q 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516701 | Mono Q kolommen zijn sterke anion uitwisselingschromatografie kolommen voor eiwitanalyse of kleinschalige, hoge resolutie verfijning van eiwitten. |
| Mono S 10/100 GL | GE Healthcare Life Sciences / Cytiva | 17516901 | Mono S kolommen zijn sterke kation uitwisselingschromatografie kolommen voor eiwitanalyse of kleinschalige, hoge resolutie verfijning van eiwitten. |
| PageRuler Prestained Protein Ladder, 10 tot 180 kDa | Thermo-Fischer | 26616 | Een mengsel van 10 blauw-, oranje- en groen-gekleurde eiwitten (10 tot 180 kDa) voor gebruik als maatstaven in eiwitelektroforese (SDS-PAGE) en western blotting. |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo-Fischer | 23225 | Een tweecomponent, hoge precisie, detergent-compatibel eiwit assay voor het bepalen van de eiwitconcentratie. |
| Sonifier 250; Ultrasonic Cell Disruptor w/ Converter | Branson | - | Nieuwe modellen op https://www.emerson.com/documents/automation/brochure-sonifier-sfx250-sfx550-cell-disruptors-homogenizers-branson-en-us-168180.pdf |
| Swine Anti-Rabbit Immunoglobulins/HRP (affinity isolated) | Agilent Dako | P0399 | Het antilichaam gebruikt voor de konjugatie van paardenradenklaver reageert met konijn immunoglobulinen van alle klassen. |
| TEMED, 1,2-Bis(dimethylamino)ethane, TMEDA | MERCK | T9281 | TEMED (N,N,N′,N′-Tetramethylethyleendiamine) is een molecuul dat een snelle polymerisatie van polyacrylamide gels mogelijk maakt. |
| Tube Roller | - | - | Een algemene buisrotator roller; bijv. een nieuw model op https://labstac.com/de/Mixer/Roller/c/71 |
| Tube Rotator | - | - | Een algemene buisrotator wiel; bijv. een nieuw model op https://labstac.com/de/Tube-Roller/p/MT123 |
| ULTRA-TURRAX; T 25 digital | IKA | 0003725000 | Nieuwe modellen op https://www.ika.com/de/Produkte-Lab-Eq/Dispergierer-Dipergiergeraet-Homogenisierer-Homogenisator-csp-177/T-25-digital-ULTRA-TURRAX-cpdt-3725000/ |
Referenties
- Pircher, H., et al. Identification of FAH domain-containing protein 1 (FAHD1) as oxaloacetate decarboxylase. Journal of Biological Chemistry. 290 (11), 6755-6762 (2015).
- Pircher, H., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
