Verschuivingen op neuron-glia-circuit visualiseren met de calciumbeeldvormingstechniek

Samenvatting

Celcalciumbeeldvorming is een veelzijdige methodologie om dynamische signalering van individuele cellen te bestuderen, op gemengde populaties in cultuur of zelfs op ontwaakte dieren, gebaseerd op de expressie van calciumdoorlatende kanalen / receptoren die unieke functionele handtekeningen geven.

Samenvatting

Hier rapporteren we over selectieve in vitro modellen van circuits op basis van glia (astrocyten, oligodendrocyten en microglia) en /of neuronen uit perifere (dorsale wortelganglia) en centrale weefsels (cortex, subventriculaire zone, organoïde) die dynamisch worden bestudeerd in termen van calciumverschuivingen. Het model dat is gekozen om de resultaten te illustreren is het netvlies, een eenvoudig weefsel met complexe cellulaire interacties. Calcium is een universele boodschapper die betrokken is bij de meeste belangrijke cellulaire rollen. We leggen in een stapsgewijs protocol uit hoe retinale neuron-gliacellen in cultuur kunnen worden voorbereid en geëvalueerd, waarbij calciumverschuivingen worden voorgesteld. In dit model onderscheiden we neuronen van glia op basis van hun selectieve respons op KCl en ATP. Calciumdoorlatende receptoren en kanalen worden selectief tot expressie gebracht in verschillende compartimenten. Om calciumreacties te analyseren, gebruiken we ratiometrische fluorescerende matrijzen zoals Fura-2. Deze sonde kwantificeert de vrije ^Ca2+ concentratie op basis van ^Ca2+-vrije en ^Ca2+-gebonden vormen, met twee verschillende pieken, gebaseerd op de fluorescentie-intensiteit die op twee golflengten wordt waargenomen.

Inleiding

Vanwege de universele eigenschappen van calcium als tweede boodschapper, is dit ion betrokken bij een groot aantal signaleringsactiviteiten: gentranscriptie, geboorte en dood, proliferatie, migratie en differentiatie, synaptische transmissie en plasticiteit. Vandaar dat een methode die in staat is om de calciumactivatiedynamiek met getrouwheid en behendigheid te volgen, een manier zou bieden om unieke ruimtelijk-temporele reacties te observeren. Een dergelijke methode is de cellulaire calciumbeeldvormingstechniek, die calciumverschuivingen functionele gegevens correleert met specifieke celfenotypen op basis van hun verschillende reacties.

<....

Protocol

Alle experimenten met dieren werden goedgekeurd door en uitgevoerd volgens de richtlijnen van de Institutional Animal Care and Use Committee van de Federal University of Rio de Janeiro, volgens de "Principles of Laboratory Animal Care" (NIH, Bethesda, VS); vergunningsnummer IBCCF-035 voor bevruchte White Leghorn kippeneieren.

1. Bereiding van oplossingen

1. Krebs-oplossing bereiden: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM _MgCl2, 2,5 mM _CaCl2, 6 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 7,4, 373 mOsm).
2. Bereid zoutoplossingbuffer voor (^Ca2+ en ^Mg2+ vrije oplossing - CMF): 76,55 g/L NaCl, ....

Resultaten

Hier gebruikten we netvliescellen in cultuur van embryonale dag 8-kuikens om te onderzoeken hoe neuronen en glia signaleren in termen van calciumverschuivingen. Culturen werden in wezen bereid zoals ^{beschreven15,19} als gemengde neuron-gliacellen (met een dichtheid van ≥ 1 x ¹⁰⁶ cel/schotel) in een stadium van 7 dagen in vitro (figuur 1A). Als alternatief, verrijkte neuronale cellen bereid in lage dichtheid (5 x ¹⁰⁵

Discussie

We hebben het netvliesweefsel gebruikt om aan te tonen dat calciumresponsen gemedieerd door KCl of ATP duidelijk zijn gecompartimenteerd in respectievelijk neuronale en gliale responsen (figuur 1). Hoewel sommige gegevens in de literatuur impliceren dat P2X7-receptoren tot expressie komen in neuronen, die neuronale activiteit en synaptische neurotransmitterafgifte ^reguleren20, betwijfelen andere auteurs het bestaan van neuronale P2X7-receptoren. Inderdaad, de huidige .......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
15 mm coverslip	Paul Marienfeld GmbH & Co. KG	111550	Cell suport
510 nm long-pass filter	Carl Zeiss
ATP	Sigma	A1852
B-27 Supplement	Gibco	17504044	Suplement
CaCl2	Sigma-Aldrich	C8106
CoolSNAP digitale camera	Roper Scientific, Trenton, NJ
D-(+)-Glucose	Neon	1466
DMEM/ F-12	Gibco	12400-24	Cell cultuur medium
Excel Software	Microsoft
Fetal Calf Serum	Sigma-Aldrich	F9665	Suplement
Fluorescentie Microscoop	Axiovert 200; Carl Zeiss	B 40-080
Fura-2 AM	Molecular Probes	F1221	Ratiometrische Ca2+ indicator
Gentamicine Sulfaat	Calbiochem	1405-41-0	antibiotica
HEPES	Sigma	H4034
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Lambda DG-4 apparaat	Sutter Instrument, Novato, CA	DG-4PLUS/OF30
Laminine	Gibco	23017-015	Help bij celhechting
Metafluor software	Universal Imaging Corp. West Chester, PA
MgCl2	Sigma	M4880
Na2HPO4	Vetec	129
NaCl	Isofar	310
NaHCO3	Vetec	306
PH3 platform	Warner Instruments, Hamden, CT	64-0286
Pluronic F-127	Molecular Probes	P6866	Niet-ionogene, oppervlakte-actieve stof
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P8920	Help bij celhechting
Trypsine-EDTA 0,25%	Gibco	25200056	Dissociatie enzym