Methodenartikel

Onderzoek naar mitochondriaal energiemetabolisme van enkelvoudige 3D-microtissue-sferoïden met behulp van extracellulaire fluxanalyse

DOI:

10.3791/63346

⸱

3 februari 2022

 ,  ,  ,  , 
1School of Biosciences, University of Birmingham, 2Nanomedicine, Drug Delivery & Nanotoxicology Lab, School of Pharmacy, University of Birmingham, 3Mitochondrial Profiling Centre, University of Birmingham

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze protocollen zullen gebruikers helpen bij het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme in 3D-kankercellijn-afgeleide sferoïden met behulp van Seahorse extracellulaire fluxanalyse.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Driedimensionale (3D) cellulaire aggregaten, sferoïden genoemd, zijn de afgelopen jaren de voorhoede geworden van in vitro celkweek. In tegenstelling tot het kweken van cellen als tweedimensionale, eencellige monolagen (2D-cultuur), bevordert, reguleert en ondersteunt sferoïde celcultuur fysiologische cellulaire architectuur en kenmerken die in vivo bestaan, waaronder de expressie van extracellulaire matrixeiwitten, celsignalering, genexpressie, eiwitproductie, differentiatie en proliferatie. Het belang van 3D-cultuur is erkend in vele onderzoeksgebieden, waaronder oncologie, diabetes, stamcelbiologie en tissue engineering. In het afgelopen decennium zijn verbeterde methoden ontwikkeld om sferoïden te produceren en hun metabole functie en lot te beoordelen.

Extracellulaire flux (XF) analyzers zijn gebruikt om de mitochondriale functie in 3D-microtissues zoals sferoïden te onderzoeken met behulp van een XF24 eilandje capture plate of een XFe96 spheroid microplaat. Verschillende protocollen en de optimalisatie van het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme in sferoïden met behulp van XF-technologie zijn echter niet in detail beschreven. Dit artikel biedt gedetailleerde protocollen voor het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme in enkele 3D-sferoïden met behulp van sferoïde microplaten met de XFe96 XF-analyzer. Met behulp van verschillende kankercellijnen is aangetoond dat XF-technologie in staat is om onderscheid te maken tussen cellulaire ademhaling in 3D-sferoïden van niet alleen verschillende groottes, maar ook verschillende volumes, celnummers, DNA-inhoud en type.

De optimale mitochondriale effectorverbindingsconcentraties van oligomycine, BAM15, rotenon en antimycine A worden gebruikt om specifieke parameters van mitochondriaal energiemetabolisme in 3D-sferoïden te onderzoeken. Dit artikel bespreekt ook methoden om gegevens verkregen uit sferoïden te normaliseren en behandelt vele overwegingen die moeten worden overwogen bij het verkennen van sferoïdemetabolisme met behulp van XF-technologie. Dit protocol zal helpen bij het stimuleren van onderzoek in geavanceerde in vitro sferoïde modellen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vooruitgang in in vitro modellen in biologisch onderzoek is de afgelopen 20 jaar snel vooruitgegaan. Dergelijke modellen omvatten nu organ-on-a-chip-modaliteiten, organoïden en 3D-microtissue-sferoïden, die allemaal een gemeenschappelijke focus zijn geworden om de translatie tussen in vitro en in vivo studies te verbeteren. Het gebruik van geavanceerde in vitro modellen, met name sferoïden, omvat verschillende onderzoeksgebieden, waaronder tissue engineering, stamcelonderzoek, kanker en ziektebiologie 1,2,3,4,5,6,7, en veiligheidstests, waaronder genetische toxicologie 8,9,10, nanomaterialen toxicologie11, 12,13,14, en drug veiligheid en werkzaamheid testen 8,15,16,17,18,19.

Normale celmorfologie is van cruciaal belang voor biologisch fenotype en activiteit. Het kweken van cellen tot 3D-microtissue-sferoïden stelt cellen in staat om een morfologie, fenotypische functie en architectuur aan te nemen, meer verwant aan die waargenomen in vivo , maar moeilijk te vangen met klassieke monolayer celkweektechnieken. Zowel in vivo als in vitro wordt de cellulaire functie direct beïnvloed door de cellulaire micro-omgeving, die niet beperkt is tot cellulaire communicatie en programmering (bijv. Cel-cel junctie formaties, mogelijkheden om celniches te vormen); celblootstelling aan hormonen en groeifactoren in de directe omgeving (bijv. cellulaire cytokineblootstelling als onderdeel van een ontstekingsreactie); samenstelling van fysische en chemische matrices (bijvoorbeeld of cellen worden gekweekt in stijf weefselkweekplastic of een elastische weefselomgeving); en vooral, hoe het cellulaire metabolisme wordt beïnvloed door voeding en toegang tot zuurstof, evenals de verwerking van metabole afvalproducten zoals melkzuur.

Metabole fluxanalyse is een krachtige manier om het cellulaire metabolisme binnen gedefinieerde in vitro systemen te onderzoeken. In het bijzonder maakt XF-technologie de analyse mogelijk van levende, real-time veranderingen in cellulaire bio-energetica van intacte cellen en weefsels. Gezien het feit dat veel intracellulaire metabole gebeurtenissen plaatsvinden binnen de orde van seconden tot minuten, zijn real-time functionele benaderingen van het grootste belang voor het begrijpen van real-time veranderingen in cellulaire metabole flux in intacte cellen en weefsels in vitro.

Dit artikel bevat protocollen voor het cultiveren van van kanker afgeleide cellijnen A549 (longadenocarcinoom), HepG2 / C3A (hepatocellulair carcinoom), MCF-7 (borstadenocarcinoom) en SK-OV-3 (ovarieel adenocarcinoom) als in vitro 3D-sferoïde modellen met behulp van gedwongen aggregatiebenaderingen (figuur 1). Het beschrijft ook in detail hoe mitochondriaal energiemetabolisme van enkele 3D-sferoïden kan worden onderzocht met behulp van de Agilent XFe96 XF-analyzer, (ii) wijst op manieren om XF-assays te optimaliseren met behulp van enkele 3D-sferoïden, en (iii) bespreekt belangrijke overwegingen en beperkingen van het onderzoeken van het 3D-sferoïdemetabolisme met behulp van deze aanpak. Het belangrijkste is dat dit artikel beschrijft hoe datasets worden verzameld die de berekening van zuurstofverbruik (OCR) mogelijk maken om oxidatieve fosforylering en dus mitochondriale functie in cellulaire sferoïden te bepalen. Hoewel niet geanalyseerd voor dit protocol, is extracellulaire verzuringssnelheid (ECAR) een andere parameter die wordt gemeten naast OCR-gegevens in XF-experimenten. ECAR wordt echter vaak slecht of onjuist geïnterpreteerd uit XF-datasets. We geven commentaar op de beperkingen van het berekenen van ECAR volgens basisbenaderingen van de technologiefabrikant.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
Figuur 1: Grafische workflow voor de generatie van cellulaire sferoïden, extracellulaire fluxanalyse en downstream assays. Vier kankercellijnen werden selectief gekweekt als monolagen (A), losgemaakt van weefselkweekkolven en gezaaid in ultralage 96-well microplaten om sferoïden (B) te vormen. A549 longcarcinoom, HepG2/C3A levercarcinoom, SK-OV-3 ovarieel adenocarcinoom en MCF-7 borstcarcinoomcellen werden gezaaid op 1 × 103-8 × 103 cellen/put en groeiden tot 7 dagen om enkele sferoïden te vormen en de sferoïde zaaidichtheid en teelttijd te optimaliseren door continue observatie en planimetrische metingen. Eenmaal gevormd, werden enkele sferoïden gewassen in een serumvrij XF-medium en zorgvuldig gezaaid in sferoïde assay-microplaten, voorgecoat met poly-D-lysine (C). Sferoïden werden onderworpen aan extracellulaire fluxanalyse met behulp van de XFe96-analyzer met behulp van verschillende protocollen om aan te pakken: (1) optimale sferoïde grootte voor basale mitochondriale ademhalingsrespons; (2) geoptimaliseerde titratie van mitochondriale respiratoire remmers; (3) optimalisatie van de plaatsing van sferoïden in microplaatputten. (D) Post XF-analyses, fasecontrastmicroscopie en sferoïde DNA-kwantificering werden gebruikt voor gegevensnormalisatie en andere downstream in vitro assays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Teelt van kankercellijnen als 3D in vitro sferoïden

CellijnBeschrijvingCultuurmediumBron
A549Longcarcinoom cellijnRPMI 1640Europese collectie van geauthenticeerde celculturen (ECACC)
Natriumpyruvaat (1 mM)
Penicilline- Streptomycine - (100 U / ml – 100 mg / ml)
10 % (v/v) FBS
HepG2/C3AHepatisch carcinoom cellijn, een klonale afgeleide van de ouder HepG2 cellijnDmemAmerican Tissue Culture Collectie (ATCC)
Penicilline- Streptomycine - (100 U / ml – 100 mg / ml)
10 % (v/v) FBS
Mcf7Borst adenocarcinoom cellijnRPMI 1640Europese collectie van geauthenticeerde celculturen (ECACC)
Natriumpyruvaat (1 mM)
Penicilline- Streptomycine - (100 U / ml – 100 mg / ml)
10 % (v/v) FBS
SK-OV-3Ovariële adenocarcinoom cellijnRPMI 1640Europese collectie van geauthenticeerde celculturen (ECACC)
Natriumpyruvaat (1 mM)
Penicilline- Streptomycine - (100 U / ml – 100 mg / ml)
10 % (v/v) FBS
BestanddeelRPMI-testmedium (50 ml eindvolume)
Basis mediumAgilent Seahorse XF RPMI, pH 7,4
Glucose (1 M steriele voorraad)11 mM (0,55 ml voorraadoplossing)
L-glutamine (200 mM steriele voorraad)2 mM (0,5 ml voorraadoplossing)
Natriumpyruvaat (100 mM steriele bouillon)1 mM (0,5 ml voorraadoplossing)

Tabel 1: Kanker cellijn media en XF media composities.

  1. Kweek alle cellijnen met behulp van de standaard aseptische weefselkweektechniek en bevestig dat ze vrij zijn van mycoplasma met behulp van een geschikte testkit.
  2. Kweek de cellijnen in T75 weefselkweekkolven of gelijkwaardig, met behulp van het aanbevolen medium (tabel 1). Kweek de cellijnen tot 65-80% samenvloeiing en passeer ze regelmatig tot een maximum van 25 passages.
  3. Spoel de celkweekkolven tweemaal af in dulbecco's gemodificeerde fosfaat gebufferde zoutoplossing (DBPS).
  4. Maak de cellen los van de kolven met 3 ml van het celdissociatiereagens (zie de materiaaltabel) gedurende 5 minuten bij 37 °C en bevestig het losmaken door microscopie.
  5. Aspirateer de losgemaakte celsuspensie voorzichtig om een eencellige suspensie te garanderen en deactiveer het celdissociatiereagens met 7 ml volledig weefselkweekmedium.
  6. Verzamel de cellen door centrifugeren op 300 × g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg en resuspenseer de cellen in volledig medium.
  7. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer of een geautomatiseerde celteller en titreer tot de gewenste celdichtheid die nodig is voor het zaaien.
    OPMERKING: Om een volledige 96-well plaat te zaaien op 100 μL / put op 4 × 103 cellen / put, moeten cellen worden getitreerd tot 4 × 104 cellen / ml in een aanbevolen volume van 12 ml.
  8. Decanteer de celsuspensie in een steriel reservoir en doseer 100 μL van de celsuspensie in elke put van een celafstotende microplaat met behulp van een meerkanaals pipettor.
    OPMERKING: Alleen de binnenste 60 putten van een microplaat moeten worden gezaaid en de rest gevuld met DPBS. Dit vormt een verdampingsbarrière, zorgt voor sferoïde homogeniteit over de plaat en minimaliseert de effecten van de plaatrand.
  9. Centrifugeer sferoïde microplaten op 300 × g gedurende 15 minuten om de cellen in losse aggregaten te dwingen.
  10. Incubeer de platen bij 37 °C, 5% CO2 gedurende minimaal 3 dagen om sferoïdevorming te garanderen.
  11. Voer fasecontrastmicroscopie uit met behulp van gestandaardiseerde laboratoriumpraktijken om de groei van sferoïden te volgen. Vul het celkweekmedium om de 3 dagen of twee keer per week aan door een halfvolume mediumuitwisseling uit te voeren.

2. Onderzoek van mitochondriaal energiemetabolisme van enkele sferoïden met behulp van extracellulaire flux (XF) -technologie

  1. Assay voorbereiding (een dag van tevoren)
    1. Controleer de levensvatbaarheid van sferoïden met behulp van een omgekeerde lichtmicroscoop met fasecontrast bij 4x vergroting om een intacte sferoïde structuur, morfologie en algehele uniformiteit tussen monsters te garanderen.
    2. Hydrateer de sensorcartridge.
      1. Aliquot ~20 ml van het kalibrant in een conische buis.
      2. Plaats de conische buis met het kalibrant een nacht in een incubator met uitzondering van37 °C die geen CO 2 is.
      3. Verwijder de inhoud uit de testkit.
      4. Verwijder de sensorcartridge van de nutsplaat en plaats deze ondersteboven op het werkblad naast de nutsplaat.
      5. Pipetteer 200 μL steriele ddH2O in elk putje van de sensorcartridge met behulp van een meerkanaals P300-pipet.
      6. Plaats de sensorcartridge bovenop de gebruiksplaat.
      7. Controleer of het waterniveau in elke put hoog genoeg is om de sensorsondes onder te dompelen.
      8. Breng de geassembleerde sensorcartridge over naar een niet-CO2-incubator van 37 °C en laat deze een nacht staan.
        OPMERKING: Deze stap kan 12-72 uur voor aanvang van de test worden uitgevoerd.
  2. Coat sferoïde assay microplaat
    1. Voeg met behulp van aseptische technieken 30 μL/put steriele Poly-D-Lysine (0,1 mg/ml) oplossing toe aan de sferoïde microplaat en incubeer deze gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
    2. Haal de oplossing uit elk putje van de sferoïde microplaat, keer de plaat om en tik deze stevig op tissuepapier om eventuele restoplossing te verwijderen.
    3. Was de plaat twee keer met 200 μL/putje steriel ddH2O.
    4. Na de laatste wasbeurt keert u de microplaat om en tikt u deze stevig op tissuepapier om eventueel restwater te verwijderen.
    5. Laat de plaat 30 minuten aan de lucht drogen voordat u deze gebruikt of bewaart bij 4 °C voor toekomstig gebruik.
      OPMERKING: De sferoïde testmicroplaat moet worden bedekt met een moleculaire lijm om ervoor te zorgen dat de sferoïden aan de onderkant van de microplaat worden bevestigd. Zonder een moleculaire lijm kunnen sferoïden losraken en de testresultaten verstoren. Andere moleculaire lijmen kunnen ook worden gebruikt als alternatief voor Poly-D-Lysine voor het voorcoaten van platen. Voorgecoate platen kunnen bij 4 °C worden bewaard, maar moeten vóór het begin van de test op kamertemperatuur worden gebracht.
  3. Bereid XF Assay medium voor
    1. Bereid XF RPMI-medium, zoals beschreven in tabel 1, en steriel filter met een spuitfilter van 0,22 μm
  4. Testvoorbereiding (1 uur voorafgaand aan de test)
    1. Prewarm het aangevulde XF RPMI-testmedium voor tot 37 °C.
    2. Prewarm de gecoate sferoïde testmicroplaat in een niet-CO2 37 °C incubator of droog bad.
    3. Bereid de sensorcartridge voor.
      1. Haal de conische buis met het kalibrant en de sensorcartridge uit de luchtincubator.
      2. Verwijder de sensorcartridge van de gebruiksplaat en plaats deze ondersteboven op het werkoppervlak.
      3. Gebruik een P300 meerkanaals pipet om het water van de nutsplaat te zuigen en weg te gooien.
      4. Giet de kalibrantoplossing in een steriel reagensreservoir en voeg 200 μL/put van het voorgewarmde kalibrant toe aan de gebruiksplaat met behulp van een P300 meerkanaals pipet.
      5. Pak de sensorcartridge op en plaats deze terug op de nutsplaat, zodat de sensoren goed ondergedompeld zijn in het kalibrant.
      6. Breng de geassembleerde sensorcartridge terug in de niet-CO2 37 °C incubator totdat het klaar is om de poortinjectieoplossingen te laden.
  5. Was de sferoïden met het testmedium.
    1. Verwijder de sferoïde kweekplaat uit de 37 °C, 5% CO2 incubator en observeer de sferoïden onder de microscoop om hun integriteit te waarborgen voorafgaand aan de sferoïde transfer stappen.
    2. Laad alle putten van de sferoïde plaat met 180 μL/putje voorgewarmd testmedium, inclusief eventuele achtergrondcorrectieputten.
    3. Vul een petrischaaltje van 7 cm gedeeltelijk met 3 ml van het testmedium.
    4. Breng met behulp van een meerkanaals pipet geladen met brede opening pipetpunten de sferoïden over van de 96-well kweekplaat in petrischalen van 7 cm door de pipettor op een aspiratievolume van 10-50 μL te zetten.
  6. Zaadsferoïden in de voorgecoate sferoïde assay microplaat.
    1. Breng met behulp van een dissectiemicroscoop en een lichtbakapparaat de sferoïden over van de petrischaal naar de sferoïde testmicroplaat zoals hieronder beschreven.
      1. Stel het volume van een eenkanaals pipettor uitgerust met een brede pipetpunt van de opening in op 20 μL en aspirateer voorzichtig een enkele sferoïde. Plaats de punt direct in het midden van elke put van de sferoïde assay microplaat en laat de zwaartekracht een enkele sferoïde in het midden van elke put elueren, d.w.z. verdrijft geen medium uit de pipetpunt en laat capillaire actie de sferoïde uit de pipetpunt trekken. Om de elutie te bevestigen, kan de inhoud van de pipettor onder de microscoop worden teruggestort in de petrischaal van 7 cm.
        OPMERKING: Zwaartekrachtelutie van een enkele sferoïde duurt meestal 15-30 s, afhankelijk van de grootte / dichtheid van de sferoïde. Gedurende deze tijd mag de pipettor niet worden verwijderd. Eventuele achtergrondcorrectieputten moeten vrij zijn van sferoïden en alleen testmedium bevatten. Bevestig onder de microscoop de positie van elke sferoïde. Elke sferoïde moet idealiter in het midden van elke put worden geplaatst.
      2. Zodra alle sferoïden op de sferoïde assay-microplaat zijn overgebracht, brengt u de plaat over naar een niet-CO2-incubator bij 37 °C gedurende minimaal 1 uur voorafgaand aan de test.

3. Bereiding en laden van verbindingen in de sensorcartridge voor XF-assays

Injectie strategieCompound (Poort)XFe96 microwell startvolume (μL)Gewenste eindputconcentratiePoortvolume (μL)Final XFe96 microwell volume na injectie (μL)Concentratie van de werkvoorraad
1Oligomycine (A)1803 lug/ml2020030 μg/ml
Rotenon (B)2002 μM2022022 μM
Antimycine A (B)2002 μM2022022 μM
2BAM15 (A)1805 μM2020050 μM
Rotenon (B)2002 μM2022022 μM
Antimycine A (B)2002 μM2022022 μM

Tabel 2: Mitochondriale samengestelde concentraties voor het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme van enkele 3D-sferoïden met behulp van de XFe96 Analyzer.

  1. Bereid de concentraties van de werkvoorraden van elke verbinding voor zoals vermeld in tabel 2 met behulp van volledig aangevuld, voorgewarmd XF RPMI-testmedium.
  2. Oriënteer de cartridgeplaat (gekoppeld aan de nutsplaat) kolomgewijs, 1-12 van links naar rechts.
  3. Als u een laadgeleider gebruikt, plaatst u deze bovenop de cartridgeplaat volgens de putlaadprocedure, bijvoorbeeld als poort A eerst wordt geladen, zorg er dan voor dat A zichtbaar is in de linkerbovenhoek van de geleider.
  4. Breng de werkoplossing van elke verbinding over in een geschikt reservoir en doseer met behulp van een gekalibreerde P100 meerkanaals pipet 20 μL in alle overeenkomstige poorten. Herhaal dit voor elke verbinding in de resterende poorten.
    OPMERKING: Als er geen poorten op de sensorcartridgeplaat worden gebruikt, kunnen deze leeg worden gelaten of worden gevuld met een testmedium. Als alleen een selectie van een specifieke poortletter wordt gebruikt, zorg er dan voor dat de andere poorten die overeenkomen met die letter zijn geladen met een testmedium; anders wordt lucht in de put geïnjecteerd, waardoor de resultaten in die putten in gevaar komen.
  5. Verwijder na het laden van de poort de plaatlaadgeleiders (indien gebruikt) en bereid de analysator voor op het laden van de sensorcartridge.
    OPMERKING: Als de test niet onmiddellijk na het laden van de poorten wordt uitgevoerd, plaatst u het deksel terug op de sensorcartridge en plaatst u de plaat terug in de 37 °C-luchtincubator totdat deze klaar is om in de machine te worden geladen.

4. Testontwerp, injectiestrategieën en data-acquisitie

  1. Het uitvoeren van de test
    1. Schakel de analyzer in en sluit deze aan op de controller (computer).
      OPMERKING: Dit kan worden geverifieerd door de verbindingsstatus van het instrument in het widgetpaneel van de Wave Controller-software.
    2. Navigeer naar de sjablonenpagina in de WAVE-software, zoek het testsjabloonbestand voor het experiment en dubbelklik om het te openen.
      OPMERKING: Als de testsjabloon niet wordt weergegeven in de weergave Sjablonen , importeert u het sjabloonbestand in de sjabloonmap vanaf een gedeeld netwerkstation of USB-flashstation.
    3. Als u de test wilt starten, klikt u op het tabblad Assay uitvoeren .
      OPMERKING: Als de groepsdefinities correct zijn toegewezen binnen de plaatkaart, is de test klaar om te worden uitgevoerd zoals aangegeven door het groene vinkje aan de rechterkant van de pagina. In dit stadium kan eventuele aanvullende informatie worden ingevoerd op de pagina met de samenvatting van de test of op de pagina die leeg is gelaten; ga verder met de volgende stap. Vanwege de vertraagde penetratie van mitochondriale modulatoren in 3D-microtissue-sferoïden (figuur 2), gebruikt u de in tabel 3 beschreven meetprotocolinformatie.
MeetperiodeInjectienummer en poortMeetgegevensDuur van de periode (h:min:s)
CalibratieNiet van toepassingXF-analysatoren voeren deze kalibratie altijd uit om ervoor te zorgen dat de metingen nauwkeurig zijn00:20:00 (dit is een gemiddelde en kan variëren tussen machines)
EquillibratieNiet van toepassingEquilibratie vindt plaats na kalibratie en wordt aanbevolen.00:10:00
BasaalNiet van toepassingCycli = 500:30:00
Mix = 3:00
Wachten = 0:00
Meten = 3:00
Oligomycine / BAM15Injectie 1 (poort A)Cycli = 1001:00:00
Mix = 3:00
Wachten = 0:00
Meten = 3:00
Rotenon + antimycine AInjectie 2 (poort B)Cycli = 1001:00:00
Mix = 3:00
Wachten = 0:00
Meten = 3:00
Totale tijd:03:00:00

Tabel 3: Protocolopstelling voor het onderzoeken van mitochondriaal energiemetabolisme van enkele 3D-sferoïden met behulp van de XFe96 Analyzer.

  1. Klik op Uitvoeren starten om het dialoogvenster Locatie opslaan weer te geven.
  2. Voer de opslaglocatie voor het resultatenbestand in en plaats de geassembleerde sensorcartridge op de thermische lade die verschijnt vanuit de deur aan de zijkant van de analysator. Wacht tot de thermische lade automatisch wordt geopend en het scherm het bericht Load Calibrant Utility Plate weergeeft. Voordat u de aanwijzingen op het scherm volgt, moet u ervoor zorgen dat i) de sensorcartridge goed op de utility-plaat past, ii) het deksel van de sensorcartridge wordt verwijderd en iii) de sensorcartridge correct op de gebruiksplaat is gericht.
  3. Volg de opdrachten op het scherm om de kalibratie van de sensorcartridge te starten.
    OPMERKING: De tijd die nodig is om de kalibratie te voltooien is ongeveer 10-20 minuten (voor testen bij 37 °C).
  4. Na de kalibratie van de sensorcartridge laadt u de sferoïde microplaat in de analysator door de instructies op het scherm op de Wave Controller te volgen om de evenwichtsstap van 12 minuten te starten.
    OPMERKING: Groene vakjes met witte vinkjes geven een 'goede' kalibratie voor die put aan. Als putten geen 'goede' kalibratie bieden, worden ze aangegeven met een rood vak en een wit kruis. Dergelijke putten moeten worden genoteerd en uitgesloten van elke analyse nadat de test is voltooid met behulp van het tabblad modificatietest .
  5. Wacht tot de analysator automatisch begint met het verkrijgen van nulmetingen nadat de machine de equilibratiestap heeft voltooid (zoals beschreven in het instrumentprotocol).
  6. Volg de opdrachten op het scherm op de WAVE-controller om het experiment te voltooien.
    OPMERKING: Zodra de sferoïde microplaat uit de analysator is verwijderd, gooit u de sensorcartridge weg en legt u de sferoïdeplaat opzij voor verdere analyse indien nodig (bijv. dubbelstrengs (ds) DNA-kwantificering). Als de microplaat niet nodig is voor verdere analyse, kan deze samen met de sensorcartridge worden weggegooid.
  7. Wacht tot het testdialoogvenster wordt weergegeven en bekijk de resultaten of keer terug naar de sjablonenweergave .

5. Datanormalisatie- en analysestrategieën - post-assay normalisatie en downstream assays (optionele stappen)

  1. Datanormalisatie
    1. Om sferoïde gegevens te normaliseren, raadpleegt u de reeks protocollen die relevant zijn voor gegevensnormalisatiestrategieën voor het berekenen van de grootte en het volume van sferoïden en het kwantificeren van dsDNA in sferoïde assays. Deze zijn opgenomen als aanvullende bestanden; zie Aanvullend dossier 1 en Aanvullend dossier 2.
  2. Data-analyse
    1. Als u gegevens wilt exporteren naar een van de geautomatiseerde analysegeneratoren, volgt u de opdrachten voor gegevensexport op de WAVE-controller en selecteert u de exportgenerator die overeenkomt met het testtype. U kunt ook het gegevensbestand exporteren en uploaden naar Seahorse Analytics.
      OPMERKING: Het nadeel van rapportgeneratoren en Seahorse-analyses is dat gegevensanalyse beperkt is tot hoe de XF-test is ontworpen en niet toestaat dat gemiddelden worden genomen over meetcycli. Handmatige export van datasets uit de instrumentsoftware maakt het mogelijk om de voorkeur van de gebruiker in dit opzicht te geven. Aangezien de injectiestrategie voor het beoordelen van mitochondriale ademhaling van 3D-sferoïden waarschijnlijk zal verschillen van die van een typische 'MitoStress'-test, is een reeks spreadsheetsjablonen ontwikkeld om deze datasets te helpen analyseren, specifiek voor 3D-celculturen en zal op verzoek worden verstrekt. Deze gegevenssjabloonbestanden bieden gegevens over de belangrijkste mitochondriale ademhalingsparameters die worden beschreven en uitgelegd in figuur 2.
    2. Als u de gegevens wilt analyseren, exporteert u de gegevens als een spreadsheetrapport vanuit de WAVE-controllersoftware en gebruikt u een onafhankelijke spreadsheetsjabloon voor analyse.

figure-protocol-2
Figuur 2: Schematische descriptoren voor parameters afgeleid van extracellulaire fluxgegevensanalyses. Afkorting: OCR = zuurstofverbruik. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Om goed gevormde, compacte sferoïden te verkrijgen, werd elke cellijn individueel geoptimaliseerd voor de zaaidichtheid en de duur van de teelt (figuur 3). A549, HepG2/C3A en SK-OV-3 cellijnen vormden aanvankelijk losse aggregaten die pas na 7 dagen in cultuur evolueerden naar ronde sferoïden met duidelijk gedefinieerde perimeters. Omgekeerd kunnen MCF-7-cellen binnen 3 dagen sferoïden vormen. Er was een duidelijke correlatie tussen de initiële celzaaidichtheid en het sferoïde volume na de k...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Belangrijkste bevindingen en outputs
Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol om het mitochondriale energiemetabolisme van enkele 3D-sferoïden te onderzoeken met behulp van een reeks van kanker afgeleide cellijnen met de XFe96 XF Analyzer. Een methode wordt ontwikkeld en beschreven voor de snelle teelt van A549, HepG2/ C3A, MCF7 en SK-OV-3 cellulaire sferoïden met behulp van celafstotende technologieën voor gedwongen aggregatie. Dit protocol behandelt veel overwegingen van het onderzoeken van het ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N.J.C werd ondersteund door een BBSRC MIBTP CASE Award met Sygnature Discovery Ltd (BB/M01116X/1, 1940003)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
A549ECACC #86012804Longkankercellijn
Agilent Seahorse XF RPMI Medium, pH 7.4Agilent Technologies Inc.103576-100XF-assaymedium met 1 mM HEPES, zonder fenol rood, natriumbicarbonaat, glucose, L-glutamine en natriumpyruvaat
Agilent Seahorse XFe96 Extracellular Flux AnalyzerAgilent Technologies Inc.-Instrument voor het meten van de snelheid van zuurstofopname in afzonderlijke sferoïden
Antimycine AMerck Life ScienceA8674Remmende stof voor mitochondriaal ademhalingscomplex III
BAM15TOCRIS bio-techne5737Mitochondriale protonofore ontkoppeler
Zwart-wandige microplaatGreiner Bio-One655076Voor op fluorescentie gebaseerde assays
CELLSTAR cell-repellent surface 96 U well microplatesGreiner Bio-One650970Microplates voor het genereren van sferoïden
CellTiter-Glo 3D Cell Viability AssayPromegaG9681Assay voor de bepaling van celviabiliteit in 3D microweefsel-sferoïden
Cultrex Poly-D-LysineR&D Systems a biotechne brand3439-100-01Moleculair celklevend materiaal voor het coaten van XFe96 sferische microplates om het hechten van sferoïden te vergemakkelijken
D-(+)-GlucoseMerck Life SciencesG8270Aanvulling voor celkweekgroei en XF-assaymedium
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco11885084Kweekmedium voor HepG2/C3A sferoïden
EVOS XL Core Imaging SystemThermo Fisher ScientificAMEX1000Phase-contrast beeldvormingsmicroscoop
EZ-PCR Mycoplasma testkitBiological Industries20-700-20Mycoplasma-screening in celcultures
FIJI Is Just Image JAnalyse van verzamelde beelden
Foetaal bovien serumMerck Life ScienceF7524Aanvulling voor celkweekmedium
HepG2/C3AATCC #CRL-10741Hepatisch kankercellijn, een klonale afgeleide van de ouder HepG2-cellijn
Lactate-GloPromegaJ5021Assay voor meting van lactaat in sferische kweekmedium
L-glutamine (200 mM oplossing)Merk Life SciencesG7513Aanvulling voor celkweekgroei en XF-assaymedium
M50 Stereo microscopeLeica MicrosystemsLEICAM50Stereo dissectiemicroscoop; gebruikt voor sferische handeling
MCF-7ECACC#86012803Borstkankercellijn
Oligomycine van Streptomyces diastatochromogenesMerck Life ScienceO4876ATP-synthase-remmer
Penicilline-StreptomycineGibco15140122Antibiotica toegevoegd aan celkweekmedium
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay KitInitrogenP7589Analyse van dsDNA in sferoïden
RotenonMerck Life ScienceR8875Mitochondriale ademhalingscomplex I-remmer
RPMI 1640Gibco21875091Kweekmedium voor A549, MCF7 en SK-OV-3 sferoïden
Seahorse AnalyticsAgilent Technologies Inc.Build 421https://seahorseanalytics.agilent.com
Seahorse XFe96 Spheroid FluxPakAgilent Technologies Inc.102905-100Elke Seahorse XFe96 Spheroid FluxPak bevat: 6 Seahorse XFe96 Spheroidal Microplates (102978-100), 6 XFe96 sensor cartridges en 1 fles Seahorse XF Calibrant Solution 500 mL (100840-000)
Serologische pipet: 5, 10 en 25 mLGreiner Bio-One606107; 607107; 760107Consumables voor celkweek
SK-OV-3ECACC #HTB-77Ovariekankercellijn
Natriumpyruvaat (100 mM oplossing)Merck Life ScienceS8636Aanvulling voor celkweekgroei en XF-assaymedium
T75 cm2 celkweekkolfGreiner Bio-One658175Behandelde flessen voor celkweek
TrypLExpressGibco12604-021Celdissociatiereagens
Wave controller softwareAgilent Technologies Inc.-
Tip met brede openingSTARLAB International GmbHE1011-8400Pipettips met brede opening voor sferische handeling

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Correa de Sampaio, P., et al. A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis. PLoS One. 7 (2), 30753(2012).
  2. Amann, A., et al. Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour-stroma interactions in non-small cell lung cancer cells. PLoS One. 9 (3), 92511(2014).
  3. Russell, S., Wojtkowiak, J., Neilson, A., Gillies, R. J. Metabolic profiling of healthy and cancerous tissues in 2D and 3D. Scientific Reports. 7 (1), 15285(2017).
  4. Zanoni, M., et al. 3D tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: a systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained. Scientific Reports. 6, 19103(2016).
  5. Song, Y., et al. Patient-derived multicellular tumor spheroids towards optimized treatment for patients with hepatocellular carcinoma. Journal of Experimental and Clinica Cancer Research. 37 (1), 109(2018).
  6. Courau, T., et al. Cocultures of human colorectal tumor spheroids with immune cells reveal the therapeutic potential of MICA/B and NKG2A targeting for cancer treatment. Journal for ImmunoTherapy of Cancer. 7 (1), 74(2019).
  7. Ivanova, E., et al. Use of ex vivo patient-derived tumor organotypic spheroids to identify combination therapies for HER2 mutant non-small cell lung cancer. Clinical Cancer Research. 26 (10), 2393-2403 (2020).
  8. Mandon, M., Huet, S., Dubreil, E., Fessard, V., Le Hegarat, L. Three-dimensional HepaRG spheroids as a liver model to study human genotoxicity in vitro with the single cell gel electrophoresis assay. Scientific Reports. 9 (1), 10548(2019).
  9. Stampar, M., et al. Hepatocellular carcinoma (HepG2/C3A) cell-based 3D model for genotoxicity testing of chemicals. Science of the Total Environment. 755, 143255(2020).
  10. Coltman, N. J., et al. Application of HepG2/C3A liver spheroids as a model system for genotoxicity studies. Toxicology Letters. 345, 34-45 (2021).
  11. Tchoryk, A., et al. Penetration and uptake of nanoparticles in 3D tumor spheroids. Bioconjugate Chemistry. 30 (5), 1371-1384 (2019).
  12. Leite, P. E. C., et al. Suitability of 3D human brain spheroid models to distinguish toxic effects of gold and poly-lactic acid nanoparticles to assess biocompatibility for brain drug delivery. Partical Fibre Toxicology. 16 (1), 22(2019).
  13. Elje, E., et al. Hepato(Geno)toxicity assessment of nanoparticles in a HepG2 liver spheroid model. Nanomaterials. 10 (3), 545(2020).
  14. Conway, G. E., et al. Adaptation of the in vitro micronucleus assay for genotoxicity testing using 3D liver models supporting longer-term exposure durations. Mutagenesis. 35 (4), 319-330 (2020).
  15. Wang, Z., et al. HepaRG culture in tethered spheroids as an in vitro three-dimensional model for drug safety screening. Journal of Applied Toxicology. 35 (8), 909-917 (2015).
  16. Proctor, W. R., et al. Utility of spherical human liver microtissues for prediction of clinical drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 91 (8), 2849-2863 (2017).
  17. Basharat, A., Rollison, H. E., Williams, D. P., Ivanov, D. P. HepG2 (C3A) spheroids show higher sensitivity compared to HepaRG spheroids for drug-induced liver injury (DILI). Toxicology and Applied Pharmacology. 408, 115279(2020).
  18. Benning, L., Peintner, A., Finkenzeller, G., Peintner, L. Automated spheroid generation, drug application and efficacy screening using a deep learning classification: a feasibility study. Scientific Reports. 10 (1), 11071(2020).
  19. Mittler, F., et al. High-content monitoring of drug effects in a 3D spheroid model. Frontiers in Oncology. 7, 293(2017).
  20. Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. The Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
  21. Benz, R., McLaughlin, S. The molecular mechanism of action of the proton ionophore FCCP (carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone). Biophysical Journal. 41 (3), 381-398 (1983).
  22. Kasianowicz, J., Benz, R., McLaughlin, S. The kinetic mechanism by which CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) transports protons across membranes. The Journal of Membrane Biology. 82 (2), 179-190 (1984).
  23. Kenwood, B. M., et al. Identification of a novel mitochondrial uncoupler that does not depolarize the plasma membrane. Molecular Metabolism. 3 (2), 114-123 (2013).
  24. Mitchell, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a chemi-osmotic type of mechanism. Nature. 191, 144-148 (1961).
  25. Alexopoulos, S. J., et al. Mitochondrial uncoupler BAM15 reverses diet-induced obesity and insulin resistance in mice. Nature Communications. 11 (1), 2397(2020).
  26. Chen, S. -Y., et al. Mitochondrial uncoupler SHC517 reverses obesity in mice without affecting food intake. Metabolism - Clinical and Experimental. 117, 154724(2021).
  27. Goedeke, L., Shulman, G. I. Therapeutic potential of mitochondrial uncouplers for the treatment of metabolic associated fatty liver disease and NASH. Molecular Metabolism. 46, 101178(2021).
  28. Hill, B. G., et al. Integration of cellular bioenergetics with mitochondrial quality control and autophagy. Biological chemistry. 393 (12), 1485-1512 (2012).
  29. Demine, S., Renard, P., Arnould, T. Mitochondrial uncoupling: a key controller of biological processes in physiology and diseases. Cells. 8 (8), 795(2019).
  30. Wang, J., et al. Uncoupling effect of F16 is responsible for its mitochondrial toxicity and anticancer activity. Toxicological Sciences. 161 (2), 431-442 (2018).
  31. Tretter, L., Chinopoulos, C., Adam-Vizi, V. Plasma membrane depolarization and disturbed Na+ homeostasis induced by the protonophore carbonyl cyanide-p-trifluoromethoxyphenyl-hydrazon in isolated nerve terminals. Molecular Pharmacology. 53 (4), 734-741 (1998).
  32. Connop, B. P., Thies, R. L., Beyreuther, K., Ida, N., Reiner, P. B. Novel effects of FCCP [carbonyl cyanide p-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone] on amyloid precursor protein processing. Journal of neurochemistry. 72 (4), 1457-1465 (1999).
  33. Stöckl, P., et al. Partial uncoupling of oxidative phosphorylation induces premature senescence in human fibroblasts and yeast mother cells. Free Radical Biology and Medicine. 43 (6), 947-958 (2007).
  34. Firsov, A. M., et al. Protonophoric action of BAM15 on planar bilayers, liposomes, mitochondria, bacteria and neurons. Bioelectrochemistry. 137, 107673(2021).
  35. Dranka, B. P., Hill, B. G., Darley-Usmar, V. M. Mitochondrial reserve capacity in endothelial cells: The impact of nitric oxide and reactive oxygen species. Free Radical Biology and Medicine. 48 (7), 905-914 (2010).
  36. Eilenberger, C., Rothbauer, M., Ehmoser, E. K., Ertl, P., Kupcu, S. Effect of spheroidal age on sorafenib diffusivity and toxicity in a 3D HepG2 spheroid model. Scientific Reports. 9 (1), 4863(2019).
  37. vanden Brand, D., Veelken, C., Massuger, L., Brock, R. Penetration in 3D tumor spheroids and explants: Adding a further dimension to the structure-activity relationship of cell-penetrating peptides. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (6), 1342-1349 (2018).
  38. Niora, M., et al. Head-to-head comparison of the penetration efficiency of lipid-based nanoparticles into tumor spheroids. ACS Omega. 5 (33), 21162-21171 (2020).
  39. Millard, M., et al. Drug delivery to solid tumors: the predictive value of the multicellular tumor spheroid model for nanomedicine screening. International Journal of Nanomedicine. 12, 7993-8007 (2017).
  40. Ruas, J. S., et al. Underestimation of the maximal capacity of the mitochondrial electron transport system in oligomycin-treated cells. PLoS One. 11 (3), 0150967(2016).
  41. Benton, G., DeGray, G., Kleinman, H. K., George, J., Arnaoutova, I. In vitro microtumors provide a physiologically predictive tool for breast cancer therapeutic screening. PLoS One. 10 (4), 0123312(2015).
  42. Hirpara, J., et al. Metabolic reprogramming of oncogene-addicted cancer cells to OXPHOS as a mechanism of drug resistance. Redox Biology. 25, 101076(2019).
  43. Ware, M. J., et al. Generation of homogenous three-dimensional pancreatic cancer cell spheroids using an improved hanging drop technique. Tissue Engineering. Part C, Methods. 22 (4), 312-321 (2016).
  44. Song, Y., et al. TGF-β-independent CTGF induction regulates cell adhesion mediated drug resistance by increasing collagen I in HCC. Oncotarget. 8 (13), 21650-21662 (2017).
  45. Wrzesinski, K., et al. HepG2/C3A 3D spheroids exhibit stable physiological functionality for at least 24 days after recovering from trypsinisation. Toxicology Research. 2 (3), 163-172 (2013).
  46. Gaskell, H., et al. Characterization of a functional C3A liver spheroid model. Toxicology Research. 5 (4), 1053-1065 (2016).
  47. Takahashi, Y., et al. 3D spheroid cultures improve the metabolic gene expression profiles of HepaRG cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00208(2015).
  48. Hendriks, D. F. G., Puigvert, L. F., Messner, S., Mortiz, W., Ingelman-Sundberg, M. Hepatic 3D spheroid models for the detection and study of compounds with cholestatic liability. Scientific Reports. 6, 35434(2016).
  49. Leung, B. M., Lesher-Perez, S. C., Matsuoka, T., Moraes, C., Takayama, S. Media additives to promote spheroid circularity and compactness in hanging drop platform. Biomaterials Science. 3 (2), 336-344 (2015).
  50. Cavo, M., et al. A synergic approach to enhance long-term culture and manipulation of MiaPaCa-2 pancreatic cancer spheroids. Scientific Reports. 10 (1), 10192(2020).
  51. Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Recent Results in Cancer Research. 95, 1-23 (1984).
  52. Costa, E. C., Gaspar, V. M., Coutinho, P., Correia, I. J. Optimization of liquid overlay technique to formulate heterogenic 3D co-cultures models. Biotechnology and Bioengineering. 111 (8), 1672-1685 (2014).
  53. Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
  54. Zhang, X. D., et al. The use of strictly standardized mean difference for hit selection in primary RNA interference high-throughput screening experiments. Journal of Biomolecular Screening. 12 (4), 497-509 (2007).
  55. Yepez, V. A., et al. OCR-Stats: Robust estimation and statistical testing of mitochondrial respiration activities using Seahorse XF Analyzer. PLoS One. 13 (7), 0199938(2018).
  56. Silva, L. P., et al. Measurement of DNA concentration as a normalization strategy for metabolomic data from adherent cell lines. Analytical Chemistry. 85 (20), 9536-9542 (2013).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis
Posted by JoVE Editors on 3/11/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Exploring Mitochondrial Energy Metabolism of Single 3D Microtissue Spheroids using Extracellular Flux Analysis. The Representative Results section was updated.

Figure 5 was updated from:

Oxygen consumption rate (OCR) graphs with oligomycin effects on A549, HepG2/C3A, MCF-7, SK-OV-3 cells.
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

to:

Oligomycin effect on OCR in cancer cell lines; comparison graph; metabolic activity analysis.
Figure 5: Single or sequential injection of mitochondrial respiratory compounds. Cancer-cell-derived spheroids of MCF-7, HEPG2/C3A, SK-OV-3, and A549 were placed into wells of an XFe96 spheroid microplate in XF RPMI and probed for OCR using the Agilent Seahorse XFe96 analyzer. OCR was measured 5x, after which 2 µg/mL oligomycin (injection Port A: green trace) or 5 µM BAM15 (injection Port A: blue trace or injection port B: green trace) to inhibit the mitochondrial ATP synthase and determine maximal respiratory capacity, respectively. Kinetic OCR data are expressed as % basal (A-D). Maximal respiratory capacity (OCRmax) was calculated as a factor of basal OCR by the equation: OCRmax = OCRBAM15 / OCRbasal. OCRmax was obtained from OCR averages across measurement cycles 8-10 post BAM15 injection with (green bars) and without (blue bars) oligomycin. Data are averages ± SEM from 3-8 individual well replicates across the spheroid assay microplate. Abbreviations: OCR = oxygen consumption rate. Please click here to view a larger version of this figure.

Trefwoorden

3D sfero dkweeksfero d microplatenzuurstofconsumptiesnelheidkankercelsfero denXF Analyzerbasale mitochondriale respiratiesfero dlevensvatbaarheidpoly D lysine coating

Gerelateerde artikelen