Dynamische monitoring van seroconversie met behulp van een multianalyt immunokraaltest voor Covid-19

Samenvatting

Dit artikel beschrijft een handige methode voor het gelijktijdig monitoren van dynamische veranderingen in antilichaamtiters voor twee immunoglobuline-isotypen (IgA, IgM of IgG) als gevolg van een immuunrespons op SARS-CoV-2-infectie of vaccinatie. Dit 'Multianalyte Covid-19 Immune Response Panel' maakt gebruik van drie indirecte immunoassays gebouwd op gecodeerde microsferen die worden gelezen met behulp van een flow-gebaseerde multiplexlezer met 'dual-channel' mogelijkheid.

Samenvatting

Multiplextechnologieën voor het gezamenlijk ondervragen van meerdere biomarkers bestaan al tientallen jaren; methoden om meerdere epitopen op dezelfde analyt te evalueren blijven echter beperkt. Dit rapport beschrijft de ontwikkeling en optimalisatie van een multiplexed immunobead assay voor serologisch testen van gemeenschappelijke immunoglobuline isotypes (bijv. IgA, IgM en IgG) geassocieerd met een immuunrespons op SARS-CoV-2 infectie of vaccinatie. Assays werden uitgevoerd met behulp van een flow-gebaseerde, multiplex fluorescerende lezer met dual-channel mogelijkheden. Optimalisaties gericht op de opnametijd van analyten, de concentratie van detectieantilichamen en de incubatietijd van detectieantilichamen. Analytische prestatiekenmerken van de test (bv. testbereik (inclusief onder- en bovengrenzen van kwantificering); en intra- en intertestprecisie) werden vastgesteld voor IgG/IgM of IgA/IgM serotype combinatie in tandem met behulp van de "dual channel" modus. Analytopnametijden van 30 minuten voor IgG, 60 minuten voor IgM en 120 minuten voor IgA waren geschikt voor de meeste toepassingen, waardoor een balans tussen testprestaties en doorvoer werd geboden. Optimale detectie antilichaam incubaties bij 4 μg /ml gedurende 30 minuten werd waargenomen en worden aanbevolen voor algemene toepassingen, gezien de algehele uitstekende precisie (procentuele variantiecoëfficiënt (% CV) ≤ 20%) en waargenomen gevoeligheidswaarden. Het dynamisch bereik voor het IgG-isotype besloeg verschillende ordes van grootte voor elke test (Spike S1, Nucleocapsid en Membrane glycoproteins), die robuuste titerevaluaties ondersteunt bij een verdunningsfactor van 1:500 voor klinische toepassingen. Ten slotte werd het geoptimaliseerde protocol toegepast op het monitoren van Spike S1-seroconversie voor proefpersonen (n = 4) die een SARS-CoV-2-vaccinregime voltooiden. Binnen dit cohort werden Spike S1 IgG-niveaus waargenomen om maximale titers te bereiken 14 dagen na toediening van de tweede dosis, bij een veel hogere (~ 40-voudige) signaalintensiteit dan IgM- of IgA-isotypen. Interessant is dat we zeer variabele Spike S1 IgG-titervervalsnelheden waarnamen die grotendeels afhankelijk waren van de proefpersoon, wat het onderwerp zal zijn van toekomstige studies.

Inleiding

Gelijktijdige meting van meerdere ziektegerelateerde biomarkers in biologische monsters maakt beschrijvende en voorspellende inzichten in pathologische processen mogelijk. Hoewel conventionele immunologische procedures met één analyt, zoals enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's), de hoeksteen zijn geweest van kwantitatieve analyses in zowel klinische als onderzoeksomgevingen, kunnen deze technieken aanzienlijke beperkingen hebben met betrekking tot de doorvoer, de hoeveelheid specimen die nodig is voor elke meting en de kosteneffectiviteit die de studie van meerdere biologische elementen die vaak met elkaar verweven zijn gedurende het ziekteverloop sterk beperken¹ . Microsphere-gebaseerde multiplexing-technologie is een onmisbaar platform geworden voor zowel diagnostische als onderzoeksfaciliteiten vanwege de mogelijkheid om assays te combineren om de laboratoriumdoorvoer te verbeteren, monsterschaarste te verminderen en repetitieve tests te verminderen om kostenbesparingen te maximaliseren 1,2,3,4. Onlangs is een verdere uitbreiding van deze multiplexing-kracht geïntroduceerd met instrumenten die over dual-reporter-mogelijkheden beschikken. De dual-reporter-functie implementeert twee fluorescerende kanalen voor detectie, waardoor een andere dimensie van multiplexing wordt geleverd, waardoor de detectie van meerdere epitopen op dezelfde analyt mogelijk is.

Ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is de ziekteverwekker die verantwoordelijk is voor de huidige coronavirusziekte 2019 (COVID-19) pandemie⁵. Hoewel RT-PCR-testen cruciaal zijn voor infectiebevestiging aan het begin van het ziekteverloop, zijn serologische onderzoeken van antilichaamtiters noodzakelijk gebleken voor de nauwkeurige en volledige kritiek van individuen met betrekking tot een eerdere blootstelling of herstel; een reactie op immunisatie; en/of een evaluatie van de werkzaamheid van de Covid-19-vaccinatie ^6,7.

Dit rapport schetst methoden voor het meten van seroconversie voor meerdere SARS-CoV-2 virale antigenen die gebruik maken van een flow-based, multiplex reader dual-reporting systeem. In het bijzonder wordt gelijktijdige detectie van twee antilichaamsubtypen (geconfigureerd als IgG / IgM of IgA / IgM) voor een 3-plex SARS-CoV-2-antigenenpaneel dat assays bevat voor Spike S1, Nucleocapsid en Membrane (aka Matrix) glycoproteïnen, beschreven. Deze aanpak biedt een ideale onderneming voor het vastleggen van longitudinale seroconversie en draagt bij aan een waardevol hulpmiddel in het arsenaal tegen de Covid-19-pandemie.

Protocol

Alle proefpersonen werden ingeschreven met schriftelijke geïnformeerde toestemming met volledige goedkeuring van de Institutional Review Board (IRB) van Rush University Medical Center onder protocol ORA 20101207 met alle institutionele richtlijnen voor ethisch onderzoeksgedrag in acht genomen. Bloed werd verzameld via conventionele flebotomie in lavendel vacutainers (K₂EDTA) en verwerkt met aanbevolen protocollen. Het resulterende plasma werd gearchiveerd bij -80 °C totdat beoordelingen werden uitgevoerd.

1. Bereiding van antigeen-geconjugeerde microsferen

1. Selecteer drie verschillende injectieflacons met magnetische microsferen met unieke kraalgebieden, waarbij de kraal-ID en partij-informatie voor elke gebruikte injectieflacon worden geregistreerd.
   OPMERKING: De volgende stappen worden gevolgd voor elk afzonderlijk microsfeergebied. Microsferen zijn lichtgevoelig en moeten worden beschermd tegen langdurige blootstelling aan licht. Let tijdens wasstappen op dat je de microsferen niet verstoort. Als u gestoord bent, laat dan een tweede scheiding van 60 s toe.
2. Vortex de microsfeervoorraad voor 60 s en sonicate gedurende 5 minuten voorafgaand aan gebruik om geaggregeerde kralen te dissociëren.
3. Breng 1,0 x 10⁶ kralen over naar een 1,5 ml eiwitarm bindende microcentrifugebuizen.
4. Steek de buis in een magnetische separator en laat scheiding gedurende 60 s plaatsvinden. Met de buis nog in de magnetische separator, verwijdert u voorzichtig het supernatant zonder de kraalkorrel te verstoren.
5. Verwijder de buis uit de magnetische afscheider, resuspenseer de kralen met 100 μL HPLC-water en vortex gedurende 30 s. Plaats de buis terug in de magnetische separator gedurende 60 s en verwijder vervolgens het supernatant. Herhaal dit wasprotocol twee keer.
6. Verwijder de buis uit de magnetische afscheider en resuspenseer de gewassen microsferen in 90 μL van 100 mM monobasisch natriumfosfaat, pH 6,2 (activeringsbuffer) door vortex gedurende 30 s.
7. Voeg 10 μL 50 mg/ml Sulfo-NHS (verdund met activeringsbuffer) toe aan de microsferen en vortex voorzichtig gedurende 10 s. Voeg 10 μL 50 mg/ml EDC-oplossing (verdund met activeringsbuffer) en vortex voorzichtig toe gedurende 10 s. Incubeer microsferen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT) met een zachte vortex om de 10 minuten.
8. Herhaal wasstappen 1.4-1.5 met 50 mM MES, pH 5.0 (Koppelingsbuffer) in plaats van water van LC/MS-kwaliteit voor in totaal twee wasbeurten.
9. Verwijder de buis uit de magnetische separator en resuspendeer de kralen met 100 μL koppelingsbuffer door vortex gedurende 30 s, onmiddellijk gevolgd door de toevoeging van de gewenste hoeveelheid eiwit.
10. Breng het totale volume op 150 μL met koppelingsbuffer. Meng de koppelingsreactie per vortex gedurende 30 s en incubeer gedurende 2 uur door rotatie bij RT.
    OPMERKING: Voor de hierin gedefinieerde testen werden conjugaties uitgevoerd met de volgende eiwitconcentraties: Spike S1: 5 μg; Nucleoside: 5 μg; Membraan: 12,5 μg.
11. Herhaal wasstap 1.4 met Phosphate Buffered Saline (PBS)-1% Goat Serum Albumin, 0,01% Polysorbate-20 (Quench Buffer) in plaats van LC/MS-grade water voor een totaal van twee wasbeurten. Resuspendeer de gewassen microsferen in 100 μL Quench Buffer met 0,05% natriumazide door vortex gedurende 30 s.
    OPMERKING: Laat de kralen ten minste 6 uur volledig doven voordat u doorgaat met een andere procedure.
12. Tel het aantal herstelde microsferen met behulp van een geautomatiseerde celteller of een hemocytometer. Noteer de waargenomen kraalconcentratie.
13. Koel de gekoppelde microsferen in het donker op 4 °C.

2. Procedures

1. Testprestaties (basisprotocol)
   1. Resuspendeer de gekoppelde microsferen door vortex gedurende 30 s en soniceer gedurende ~ 60-90 s.
   2. Verwijder de vereiste hoeveelheid van elk kraalcolloïde uit de betreffende buis en combineer de kralencolloïden in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml.
   3. Steek de buis in een magnetische afscheider en laat de scheiding gedurende 60 seconden plaatsvinden. Met de buis nog in de magnetische separator, verwijdert u voorzichtig het supernatant zonder de kraalkorrel te verstoren.
   4. Verwijder de kralen uit de separator, resuspeneer de kralen met 100 μL PBS-1% runderserumalbumine, 0,01% polysorbaat-20 (assaybuffer) en vortex gedurende 30 s. Plaats de buis in een magnetische separator en laat 60 s scheiden. Herhaal dit wasprotocol (d.w.z. stappen 2.1.3-2.1.4) tweemaal
   5. Pas de concentratie van het 3-plex werkende microsfeermengsel aan door een geschikt volume assaybuffer toe te voegen om een uiteindelijke concentratie van 100 microsferen per 1 μL voor elk doelwit te genereren.
   6. Aliquot 12,5 μL van het in stap 2.1.5 bereide microsfeermengsel in elke put van een 384-well plaat of 25 μL in elke put van een 96-well plaat.
   7. Verdun de plasma-/serummonsters 500-voudig in Assay Buffer. Bereid standaardmonsters volgens de gewenste titratie.
   8. Voeg 12,5 μL assaybuffer toe als blanco monster en voeg elk van het verdunde monster of de standaard toe aan elke aangewezen put van een monsterplaat met 384 putten of 25 μL van het blanco, verdunde monster of de standaard in elke put van een monsterplaat met 96 putten.
   9. Bedek de plaat met een aluminium afdichting of folie en incubeer gedurende 1 uur bij RT op een platenschudder ingesteld op 700 rpm.
      OPMERKING: Schematisch voor de verdunningscurven is opgenomen in tabel 1.
   10. Bereid een oplossing van anti-humane detectieantistoffen (secundaire antilichaamoplossingen) bij 4 μg/ml met assaybuffer zoals gespecificeerd in stap 2.1.11.
   11. Bereid Geit-anti-humane IgM, geconjugeerd met Super Bright 436 (SB) / Goat-anti-human IgA, Phycoerythrin (PE) Conjugaat detectie antilichamen bij 4 μg / ml; of Goat-anti-human IgM, SB Conjugate/Goat-anti-human IgG, PE Conjugate detecties antilichamen bij 4 μg/ml.
       OPMERKING: Voor een plaatformaat met 384 putten is 12,5 μL/put van de bereide secundaire antilichaamoplossing vereist en voor een plaatformaat met 96 putten is 25 μL/put vereist.
   12. Plaats de plaat op een magnetische afscheider, was snel en keer met kracht om over een biohazard-container om vloeistof uit de putten te verwijderen. Met de plaat nog steeds omgekeerd, tik je de plaat krachtig tegen een dikke wad papier.
   13. Was elk putje met 100 μL Assay Buffer en verwijder de vloeistof door krachtige inversie over een biohazard container, zoals eerder beschreven. Herhaal deze stappen (2.1.12-2.1.13) voor een totaal van twee wasbeurten. Gooi alle gebruikte plakken papier weg in een biohazard-container.
   14. Voeg 12,5 μL van de secundaire antilichaamwerkoplossing toe aan elk putje van een 384-well plaat of 25 μL aan elke put van een 96-well plaat. Bedek de plaat met een aluminium afdichting of folie en incubeer gedurende 30 minuten bij RT op een platenschudder ingesteld op 700 rpm.
   15. Herhaal de wasstappen 2.1.12-2.1.13
   16. Voeg 75 μL assaybuffer toe aan elke put van een 384-well plaat of 100 μL in elke put van een 96-well plaat. Bedek de plaat met een aluminium afdichting of folie en incubeer gedurende 5 minuten bij RT op een platenschudder ingesteld op 700 rpm.
   17. Analyseer 60 μL via de instrumentanalysator volgens de systeemhandleiding.
2. Optimalisatie van de incubatietijd voor het vastleggen van specimens
   1. Voer de stappen in paragraaf 2.1 uit met een incubatietijd van 30 min, 60 min en 120 min in stap 2.1.9.
      OPMERKING: Incubaties kunnen worden uitgevoerd met afzonderlijke platen of door te pauzeren bij stap 2.1.6 tot het tijdstip om door te gaan naar stap 2.1.9. om de gewenste incubatietijden te bereiken.
   2. Ga verder met de plaataflezing op de analysator met behulp van 60 μL van het testmengsel volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
3. Optimalisatie van secundaire antilichaamconcentratie
   1. Voer deze procedure uit zoals beschreven in punt 2.1, met uitzondering van de eindconcentraties van reagentia in de secundaire oplossing voor het werken van antilichamen (bereid in stap 2.1.10-2.1.11), als volgt gewijzigd:
      Geiten-anti-mens (of konijn) IgM, SB-geconjugeerde detectie antilichamen bij 8, 4, 2, 1 en 0,5 μg/ml.
      Geiten-anti-mens (of konijn) IgA, PE-geconjugeerde detectie antilichamen bij 8, 4, 2, 1 en 0,5 μg/ml.
      Geiten-anti-mens (of konijn) IgG, PE-geconjugeerde detectie antilichamen bij 8, 4, 2, 1 en 0,5 μg/ml.
      Goat-anti-human (of konijn) IgG, PE-conjugaat/Goat-anti-human (of konijn) IgM, SB-geconjugeerde detectie antilichamen bij 8, 4, 2, 1 en 0,5 μg/ml.
      Goat-anti-human (of konijn) IgA, PE-conjugaat/Goat-anti-human (of konijn) IgM, SB-geconjugeerde detectie antilichamen bij 8, 4, 2, 1 en 0,5 μg/ml.
   2. Ga verder met de plaataflezing op de analysator met behulp van 60 μL van het testmengsel volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
4. Optimalisatie van de incubatietijd van secundaire antilichamen
   1. Voer deze procedure uit zoals beschreven in rubriek 2.1 met 15 minuten, 30 minuten, 60 minuten en 120 minuten incubatietijd zoals gedefinieerd in stap 2.1.14.
   2. Ga verder met de plaataflezing op de analysator met behulp van 60 μL van het testmengsel volgens de aanbevelingen van de fabrikant.
5. Evaluatie van proefnemingsmonsters met geoptimaliseerde dual-channel assays
   1. Verzamel plasmamonsters (n = 4) op dagen -21, -11, -1/0, +14, +28, +60, +90 en +120 met betrekking tot de voltooiing van de toediening van het Covid-19-vaccin (d.w.z. tweede dosis).
      OPMERKING: Dag 0 vertegenwoordigt het tijdstip waarop de vaccinatie is voltooid.
   2. Voer alle testen uit met behulp van het basisprotocol (paragraaf 2.1.) als een IgG/IgM- of IgA/IgM-dual-channel assay.
   3. Normaliseer de resultaten tot de maximale waargenomen mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) waarde voor elke specifieke immunoglobuline en assay.

Resultaten

Typische testresultaten en prestatie-evaluaties
Immunobead-assays bieden gewoonlijk een sigmoïdale curve wanneer ze worden geëvalueerd over verschillende (log) ordes van grootte, zoals geïllustreerd in elk van de panelen in figuur 1. De gebruiker moet experimenteel het optimale concentratiebereik voor elke analyt in de multiplex definiëren om het volledige kwantificeringsbereik te bepalen, waarbij hij ervoor moet zorgen dat de extremen (gebieden die de ondergrens van kwantificering [LLOQ] of bovengrens van kwantificering [ULOQ] naderen) niet te veel bemonsteren. Het werkelijke bereik dat nodig is voor een test wordt echter bepaald door de verdeling van de doelanalyten in een biologische matrix (d.w.z. de 'onbekenden') bij een bepaalde verdunningsfactor. Verder, hoewel standaardcurven meestal worden geïnterpreteerd via lineaire regressie met een 4- of 5-parametrisch fit-algoritme, biedt het lineaire deel van een bepaalde curve meestal het grootste vertrouwen in kwantitatieve nauwkeurigheid met een lineair (y = mx + b) kwantificeringsmodel. Het afstemmen van de kalibratiecurve op de waargenomen waarden voor een onbekende bij een bepaalde verdunningsfactor moet het doel zijn bij de ontwikkeling van kwantitatieve tests.

In dit verband werd een 7-punts standaardcurve op basis van een 1:5 seriële verdunningsreeks geëvalueerd voor elk van Spike S1-, Nucleocapsid- en membraanantistoffen die variëren tussen 1 μg/ml en 0,000064 μg/ml voor Spike S1 en Nucleocapsid en 5 μg/ml en 0,00032 μg/ml voor membraan, zoals weergegeven in figuur 1. De ondergrens van detectie (LLOD) voor elke test werd gedefinieerd als de laagste analytconcentratie die een signaal opleverde dat te onderscheiden was van de achtergrond. LLOD kan worden geïdentificeerd door de eerder beschreven vergelijking ^8,9, LLOD = LoB + 1.645 (_{SD-monster met lage concentratie}). LoB is de ondergrens van blanco, en het is de "schijnbare" concentratie van analyt die wordt geproduceerd uit de blanco wanneer een nulwaarde wordt verwacht, en het kan worden vastgesteld met behulp van deze vergelijking LoB = Mean_blank + 1.645 (SD_blank)⁸. Op basis van deze methode varieerden de MFI-waarden voor de Spike S1-test van 134,38 tot 20191,2, waarbij 134,38 MFI 0,00024 μg / ml vertegenwoordigde en werd gedefinieerd als de LLOD. Voor de membraantest was het praktische MFI-bereik 52,24 tot 4764,9, met 52,24 MFI berekend op 0,004885 μg / ml en toegewezen als de LLOD. Het MFI-bereik voor de Nucleocapsid-test was 517,9 tot 19666,34, met 517,9 gespecificeerd als 0,00024 μg / ml, wat de LLOD was. De bovengrens van detectie (ULOD) wordt gedefinieerd als de concentratie van analyt waarna de verandering in MFI niet langer lineair is en de signaalrespons verzadigd is. Opgemerkt moet worden dat het volledige sigmoïdale karakter van deze curven niet waarneembaar is voor de geteste normen, met uitzondering van de Nucleocapsid-curve. Gezien de waargenomen MFI-waarden voor alle tot nu toe geteste onbekenden (bij een verdunning van 1:500) liggen ze echter binnen het gepresenteerde curvebereik voor elke analyt en kunnen ze gemakkelijk worden gekwantificeerd met behulp van een 4- of 5-parametrische fit via lineaire regressie.

Testprecisie
Intra-assay precisie: Vier replica's van assays werden uitgevoerd op dezelfde plaat om de assayprecisie te beoordelen, berekend als de %CV, of het quotiënt van de standaarddeviatie en het gemiddelde vermenigvuldigd met 100. Voor deze tabellen zijn standaardpunten 2 en 5 geselecteerd, met waarden die in tabel 2 zijn gecatalogiseerd. De typische aanvaardbare bovengrensdrempel voor %CV-waarden is ≤20%, die voor deze gegevens werd waargenomen, met uitzondering van die voor standaard 2 van membraan IgG, die waarschijnlijk het gevolg is van achtergrondniveaus en kan worden gecorrigeerd door afgelegen waarden te elimineren (gegevens niet weergegeven). Opgemerkt moet worden dat een schijnbare instabiliteit om de waarde te lezen werd waargenomen voor membraantests waarbij de MFI-waarden < 200 waren, meestal in het geval van IgA- en IgM-isotypen.

Inter-assay precisie: Drie verschillende partijen kralensets werden voorbereid voor elke assay en getest, zoals gedefinieerd voor Intra-assay precisie (hierboven en zoals te zien in Figuur 1). De variabiliteit tussen de tests werd beoordeeld door de %CV te berekenen op basis van de gemiddelde resultaten voor elk van de drie partijen, zoals weergegeven in tabel 3. Nogmaals, de bovengrensdrempel voor een acceptabel %CV is vastgesteld op ≤20%, die bestaat voor alle geteste omstandigheden (met een vergelijkbaar effect met standaard 2 van Membraan IgG, zoals hierboven te zien is). Opgemerkt moet worden dat batch-to-batch variabiliteit in netto MFI-waarden vaak wordt waargenomen binnen meerdere batches van dezelfde immunoreagentia tijdens de ontwikkeling van aangepaste assays. Het gebruik van een kalibratiecurve die is samengesteld uit een commercieel verkregen anti-target antilichaam (bijv. konijn anti-Spike S1) gevolgd door een anti-soort detectieantilichaam kan consistentie in de analyseresultaten opleveren en vergelijkingen tussen meerdere batches op verschillende tijdstippen mogelijk maken.

Inter-assay precisie met menselijke monsters: De evaluatie van inter-assay precisie werd herhaald met menselijke plasmamonsters (n = 5) verzameld binnen een maand na de eerste gemelde symptomen voor een SARS-CoV-2 infectie; bereikt met drie verschillende batches van assays (d.w.z. verschillende preparaten van de kralensets). Deze resultaten zijn weergegeven in tabel 4 en tonen precisie met een %CV-waarde met de typische bovengrenswaarde van ≤20%. De gemiddelde %CV-waarden voor de Spike S1-, Nucleocapsid- en Membraan IgG-titers werden berekend op respectievelijk 9,9% (bereik 2,6%-18%), 11,0% (bereik 3,5% -24,4%) en 7,6% (bereik 3,2% -12,9%). Soortgelijke waarnemingen werden gedaan met de IgM- en IgA-titers van deze drie analyten, die allemaal %CV-waarden <20% leverden. De enige uitzondering hierop waren Subject 5 IgM-titers voor het membraaneiwit, dat vervolgens als uitschieter werd uitgesloten. De precisiewaarden voor de evaluaties van de menselijke proefpersonen komen overeen met die hierboven voor de konijnenantistoffen, wat suggereert dat deze testen gemakkelijk opnieuw kunnen worden geconfigureerd om titers van de antigenen in meerdere soorten te evalueren met weinig impact op de testprecisie. Zoals hierboven vermeld, was er een schijnbare instabiliteit om waarden te lezen die werden waargenomen voor membraantests waarbij de MFI-waarden < 200 waren, meestal in het geval van IgA- en IgM-isotypen.

Optimalisatie van de concentratie van primaire antilichamen
De 'vangsttijd' van de analyt werd geëvalueerd met de antigeen-geconjugeerde kralen en de antilichamen in de plasmamonsters of in de normen werden getest door de lengte van de primaire incubatie te wijzigen (30 min, 1 h, 2 h en 4 h). Het verschil in de gemiddelde MFI wordt weergegeven als het quotiënt van een specifieke incubatie en de maximale incubatietijd, %Max. genoemd, in figuur 2, tussen een incubatietijd van 30 minuten (minimale duur) en een incubatietijd van 4 uur (maximale duur). Waarden na 120 minuten waren optimaal voor IgG-titers voor de Spike S1,het membraan en de Nucleocapsid-antilichamen, wat wijst op een snel-primaire antilichaambindingskinetiek, waardoor flexibiliteit mogelijk is om de testdoorvoer te verhogen. Er werd echter een langzamere kinetiek waargenomen voor de IgA- en IgM-isotypen (gegevens niet getoond), wat piekopnameniveaus op het 4-uurstijdstip aantoont, zoals weergegeven in figuur 2. Over het algemeen is er een balans tussen het benaderen van de verzadiging van de test en de praktische tijdsbesteding voor het uitvoeren van elke test tijdens de productie (om de doorvoer te maximaliseren). Hiermee werden geschikte signalen voor kwantitatieve doeleinden bij minimale incubatietijden van 30 min voor IgG, 60 min voor IgM en 120 min voor IgA waargenomen in deze bevindingen.

Optimalisatie van de concentratie van secundaire antilichamen
Vijf concentraties secundaire antilichamen (geiten-anti-humaan IgG, PE-geconjugeerd; geiten-anti-humaan IgA, PE-geconjugeerd; geiten-anti-humaan IgM, SB-geconjugeerd) werden getest (0,5, 1, 2, 4 en 8 μg / ml). Alle antilichamen onthulden een breed bereik van het signaal, zonder duidelijke signaalverzadiging in welke toestand dan ook, waardoor een lineaire meting voor een van de concentraties werd gegarandeerd. Als voorbeeld, het gemiddelde signaal gegenereerd door de Spike S1-test met behulp van geiten-anti-humane IgM, SB-geconjugeerd op 0,5 μg / ml was 13,2% van de MFI gegenereerd uit het maximale signaal (8 μg / ml), terwijl MFI gegenereerd uit 4 μg / ml 73,3% was van de MFI gemanifesteerd bij het maximale signaal. Details van het bereik van signalen van de andere Spike S1-antilichaamisotypen, de membraanantistoffen en de nucleocapside-antilichamen zijn opgenomen in tabel 5 en figuur 3. Praktisch gezien wordt de primaire impact tussen de optimale secundaire antilichaamconcentratie en de eerder vermelde 4 μg/ml secundaire antilichaamconcentratie weerspiegeld in termen van testgevoeligheid en testkosten. Dat wil zeggen, een secundaire antilichaamconcentratie van 8 μg / ml kan wenselijk zijn voor toepassing met lage antilichaamtiters of lage hoeveelheden waardevol monster, maar de kosten die gepaard gaan met deze testen zouden aanzienlijk hoger zijn dan het gebruik van de eerder gedefinieerde concentratie van 4 μg / ml. Omgekeerd zouden gevallen waarin hoge antilichaamtiters moesten worden waargenomen (zoals personen die Covid-19-vaccinaties hebben meegemaakt of met niet-beperkende hoeveelheden sera) een kosten-batenvoordeel zien door de toepassing van de lagere hoeveelheden secundaire antilichamen (bijv. 1 μg / ml).

Optimalisatie van secundaire antilichaamincubatie
De mogelijke invloed van de duur van de secundaire antilichaamincubatie werd ook onderzocht door de lengte van de incubatie te wijzigen (15, 30, 60 en 120 min). Over het algemeen was het verschil in de gemiddelde MFI zoals gepresenteerd als het quotiënt van een specifieke incubatie en de maximale incubatietijd, %Max, tussen een incubatie van 15 minuten (minimale duur) en een incubatie van 120 minuten (maximale duur) niet groter dan 30%, 55% en 50% voor respectievelijk de Spike S1,het membraan en de Nucleocapsid-antilichamen, wat wijst op een snelle kinetische stap in secundaire antilichaambinding en een middel om de testdoorvoer te verhogen. Tabel 6 bevat details over signaalveranderingen voor alle incubatietijden. Illustraties van de waargenomen signalen van verschillende incubaties van deze analyse zijn weergegeven in figuur 4.

Dual-channel prestaties en specificiteit
Voor elke analyt werd een enkele reporterindeling uitgevoerd (alleen IgG-PE, alleen IgA-PE of alleen IgM-SB) vergeleken met het signaal dat voor dezelfde analyt werd gegenereerd wanneer deze werd uitgevoerd in een dual-reporter-indeling (bijvoorbeeld Spike S1 alleen IgG-PE versus Spike S1 IgG-PE in combinatie met Spike S1 IgM-SB in de dual-reporter-indeling). Assayprecisie (uitgedrukt als %CV) voor de signalen die in de twee formaten werden gecreëerd, werden gebruikt om de relatie in de bevindingen van dit experiment te analyseren. De %CV-waarden van de Spike S1-testen waren respectievelijk 6,19%, 16,4% en 23% voor IgM, IgG en IgA. Voor de membraantest waren de %CV-waarden 3,3%, 7,9% en 16,4% voor respectievelijk IgM, IgG en IgA. Ten slotte leverde de Nucleocapsid-test %CV-waarden op van respectievelijk 8,7%, 10,3% en 24,2% voor IgM, IgG en IgA. De precisiewaarden die zijn waargenomen voor de IgM- en IgA-isotypen suggereren dat een langere incubatietijd superieure testresultaten kan opleveren vanwege de bekende bindingkinetische verschillen tussen deze klassen immunoglobulinen. Figuur 4 toont de overeenkomst tussen de formaten van verschillende concentraties secundaire antilichamen.

Om de specificiteit van reporterkanalen te bevestigen, werd één reporterkanaal in één keer getest, terwijl het andere kanaal als leegkanaal werd toegewezen om te informeren naar het niet-specifieke signaal (bloedingseffect). Deze bevindingen wijzen erop dat er sprake is van een verwaarloosbare kruissignaalverontreiniging tussen de twee reporterkanalen, gezien de hoge specificiteit over het hele spectrum van omstandigheden. Deze bevindingen zijn geïllustreerd in figuur 5. Over het algemeen zagen we een interferentie van 6,45% over kanaal 1 naar kanaal 2. Toen echter rekening werd gehouden met de omvang van de signalen, zagen we de volgende potentiële interferentieniveaus in de dual reporter-modus: Spike IgG / IgM op 71,98%, Spike IgA / IgM op 28,11%; Membraan IgG/ IgM bij 7,41%, Membraan IgA/ IgM bij 134,61%; en Nucleocapsid IgG/ IgM op 146,03%, Nucleocapsid IgA/ IgM op 112,13%. In de gespecificeerde configuratie zou dit een meting van Spike IgM vereisen in combinatie met het IgA-isotype, Membraan IgM met het IgM-isotype en nucleocapsidemetingen die niet in een tweekanaalsformaat worden uitgevoerd. Deze bevinding kan een verkenning van de inversie van de etiketteringsstrategie vereisen, waarbij IgA en IgG worden gemeten in kanaal 2 en IgM in kanaal 1.

Evaluatie van seroconversiegebeurtenissen na Covid-19-vaccinatie
Seroconversie werd bij vier proefpersonen gecontroleerd na beoordeling van IgA, IgM en IgG met de Spike S1-test op tijdstippen variërend van pre-vaccinatie tot vier maanden na voltooiing van de Covid-19-vaccinatiereeks. Metingen werden uitgevoerd in dual channel-modus (IgG / IgM en IgA / IgM, met IgM-waarden gemiddeld). Alle proefpersonen kregen het vaccin als een 2-fase immunisatie, volgens de standaardpraktijk, met een interval van 21 dagen tussen de eerste en tweede dosis. Plots van de immuunrespons van elke proefpersoon zijn weergegeven in figuur 6A-C. Immuunresponswaarden voor de nucleocapside- en membraanantigenen werden waargenomen op achtergrondniveaus voor alle geëvalueerde immunoglobulinen (gegevens niet getoond), wat consistent was met de proefpersonen die geen gedocumenteerde eerdere SARS-CoV-2-infectie hadden in de tijd voorafgaand aan vaccinatie. Over het algemeen waren de waargenomen Spike S1 IgA- en IgM-waarden ongeveer 40 keer lager dan de IgG-isotypetiters, waarbij piektiters al na 14 dagen voor zowel IgM- als IgG-isotypen werden bereikt en het IgA-isotype piektiters bereikte tussen het moment van de tweede dosis (dag 0) en 14 dagen na de tweede dosis, afhankelijk van het onderwerp. Met name de Spike S1 IgG-titers beginnen te rotten in de loop van de vier maanden na voltooiing van de vaccinatie met een zeer variabele snelheid, op een onderwerpafhankelijke manier.

Figuur 1: Representatieve 3-plex standaardcurven. Representatieve standaardcurven voor de drie analyten; gepresenteerd als een 7-punts, 1:5 seriële verdunningscurve beginnend bij (A) 1 μg/ml voor Spike S1, (B) 5 μg/ml voor membraan en (C) 1 μg/ml voor nucleopolisden en antilichamen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Optimalisatie van de incubatietijd van primair antilichaam/monster: Het gemiddelde MFI-signaal dat wordt geproduceerd uit verschillende incubatietijden van primaire antilichamen/monsters (antilichaamvangst), variërend van 30 minuten tot 4 uur voor normen 1-7 (zoals aangegeven in tabel 1). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Optimalisatie van de secundaire antilichaamconcentratie en dual-channel prestaties. Curven illustreren de gemiddelde MFI (genormaliseerd tot de hoogste geregistreerde waarde in de serie) geproduceerd uit geteste secundaire antilichaamconcentraties, variërend van 0,5-8 μg / ml. Elke instantie werd zowel als een single- als dual-channel assay uitgevoerd om verschillen in het experimentele formaat te waarderen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Secundaire antilichamen incubatietijd optimalisatie, dual-channel formaat. Representatieve plots van waargenomen MFI-waarden (genormaliseerd tot de hoogste geregistreerde waarde in de reeks) met betrekking tot het tijdstip van incubatie met secundaire antilichamen. Experimenten werden uitgevoerd als dual-channel assays als (A-C) IgA/IgM of (D-F) IgG/IgM combinaties. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Specificiteitsbeoordelingen voor dual-channel assays. Testresultaten van het dual-channel assay-formaat met een van elke combinatie aangewezen als de blanco om het gebrek aan cross-channel fluorescerend of interferentie te illustreren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Illustratie van seroconversie na Covid-19 vaccinatie. Percelen die de relatieve titers illustreren van (A) IgG, (B) IgM en (C) IgA-antilichamen voor het Spike S1-antigeen in de loop van Covid-19-vaccinatie (Pre-vaccinatie - 4 maanden na voltooiing); de tijd wordt weergegeven in dagen ten opzichte van de voltooiing van de vaccinatiereeks; algemene punten van de toediening van het vaccin zijn aangegeven (rode lijnen). Experimenten werden uitgevoerd in dual channel modus, zoals beschreven in het Protocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Standaard nummer	Verdunningsreeks	Anti-Spike S1 of N (μg/ml)	Anti-Membraan (μg/ml)
Blanco	Blanco	-	-
1	SOA7 1:1	1	5
2	SOA6 1:5	0.2	1
3	SOA5 1:25	0.04	0.2
4	SOA4 1:125	0.008	0.04
5	SOA3 1:625	0.0016	0.008
6	SOA2 1:3125	0.00032	0.0016
7	SOA1 1:15625	0.000064	0.00032

Tabel 1: Verdunningsreeks voor standaardcurven: Tabel met verdunningsfactoren die zijn gebruikt voor de standaardcurven voor het IgG-serotype; gepresenteerd als een 7-punts, 1:5 seriële verdunningscurve vanaf 1 μg/ml voor α-Spike S1 en α-Nucleocapsid en 5 μg/ml voor α-membraanantistoffen.

Analyt	Monster	Rep 1	Rep 2	Rep 3	Rep 4	Ave	Sd	%CV
Spike S1	SOA2	369.4	356.9	295.2	271.5	323.3	47.4	14.6
	SOA5	3869.1	3437	3970.2	4240.7	3879.3	334	8.6
Membraan	SOA2	40.6	37.7	49.9	27.8	39	9.1	23.3
	SOA5	733.2	731.3	724	678.1	716.7	26	3.6
Nucleocapside	SOA2	1746.7	1790.8	1577.3	1664.8	1694.9	94.2	5.6
	SOA5	15598.1	14735.5	18369.5	17408.5	16527.9	1657.7	10

Tabel 2: Intra-assay precisie: Procentuele variantiecoëfficiënt (%CV) berekend uit vier replicaties van standaard antilichaammengsels bij standaard 2 (STD2) en standaard 5 (STD5) met een enkele testbatch in hetzelfde experiment. De waarden voor replicaties en gemiddelden vertegenwoordigen de waargenomen MFI-waarden.

Analyt	Monster	Partij 1	Partij 2	Partij3	Ave	Sd	%CV
Spike S1	SOA2	383.2	424.4	379.9	395.8	24.8	6.3
	SOA5	5639.7	6062.5	6384.3	6028.8	373.4	6.2
Membraan	SOA2	39.1	58.5	59.1	52.2	11.4	21.8
	SOA5	732.3	941.4	701.1	791.6	130.7	16.5
Nucleocapside	SOA2	1342.6	1621	1718.2	1560.6	195	12.5
	SOA5	13543.9	14843.2	17883.4	15423.5	2227.2	14.4

Tabel 3: Intertestprecisie met standaardmonsters: Procentuele variantiecoëfficiënt (%CV) berekend uit drie verschillende batches van assays, geëvalueerd bij standaard 2 en standaard 5 in hetzelfde experiment. De waarden voor replicaties en gemiddelden vertegenwoordigen de waargenomen MFI-waarden.

		IgG-PE		IgM-SB		IgA-PE
		Ave. MFI	%CV	Ave. MFI	%CV	Ave. MFI	%CV
Spike S1	Onderwerp 1	8002.3	17.7	1949.5	1.3	2045.8	5.5
	Onderwerp 2	19155.8	7.3	918.6	4.1	1684.5	3.9
	Onderwerp 3	17865.6	18.0	549.4	3.8	961.3	8.1
	Onderwerp 4	11901.1	2.6	1603	4.8	8736.4	5.5
	Onderwerp 5	9801.8	4.0	1014.1	3.0	2747.6	9.3
Nucleocapside	Onderwerp 1	15097.8	11.3	1049.7	9.9	5276.5	3.9
	Onderwerp 2	15204.3	12.1	265.9	5.2	6761.3	11.9
	Onderwerp 3	18471.7	24.4	329.1	4.5	14308	2.9
	Onderwerp 4	16424.7	3.5	2418.1	0.1	4234.7	4.2
	Onderwerp 5	13344.9	3.6	225.6	10.0	13436.5	9.7
Membraan	Onderwerp 1	514.6	8.6	180.6	14.0	141.2	9.8
	Onderwerp 2	196.8	5.2	57	20.7	55.5	13.0
	Onderwerp 3	553.7	12.9	54.5	21.2	191.2	18.6
	Onderwerp 4	377.9	3.2	68.1	22.1	62	2.3
	Onderwerp 5	325.4	8.2	11.4	91.6	74.6	20.8

Tabel 4: Intertestprecisie met menselijke monsters: Gemiddelde procentuele variantiecoëfficiënt (%CV) berekend uit drie batches van testen getest met plasmamonsters (verdund 500-voudig) van vijf menselijke proefpersonen met SARS-CoV-2-infecties.

		Spike S1		Membraan		Nucleocapside
	μg/ml	Ave. MFI	% Max.	Ave. MFI	% Max.	Ave. MFI	% Max.
Igm	0.5	186	13.2	32	25.2	132.7	13.6
	1	304.2	21.6	45.8	36	194.4	19.9
	2	664.5	47.2	78.8	61.9	458.2	47
	4	1032.1	73.3	101.3	79.6	707.8	72.6
	8	1407.1	100	127.2	100	975	100
IgG	0.5	809.7	4.9	27.5	15	1355.6	6.3
	1	1696.9	10.2	40.6	22.2	2782.1	13
	2	4543.8	27.3	68.3	37.3	6661.2	31.2
	4	10003.5	60	110.7	60.5	12605.6	59
	8	16662.8	100	182.9	100	21360.6	100
IgA	0.5	797.4	19.3	31.1	47.2	2056.5	16.1
	1	1529.5	37	41.4	62.8	3869	30.4
	2	2261.3	54.7	48.6	73.3	6648.9	52.2
	4	2320.4	56.2	48.3	73.2	6548.1	51.4
	8	4132.2	100	65.9	100	12744.8	100

Tabel 5: Optimalisatie van de secundaire antilichaamconcentratie: Het gemiddelde MFI-signaal geproduceerd uit verschillende concentraties secundaire antilichamen, variërend van 0,5 μg / ml tot 8 μg / ml. De waarde van elk signaal wordt ook weergegeven als een percentage van het signaal bij 8 μg / ml ("Max.") om de relatieve signaalmagnitude aan te tonen.

		Spike S1		Membraan		Nucleocapside
	Incubatietijd (min.)	Ave. MFI	% Max.	Ave. MFI	% Max.	Ave. MFI	% Max.
Igm	15	1185	72.2	40.4	48.9	609.5	53.3
	30	1416.6	86.3	58.4	70.7	894.2	78.2
	60	1324.8	80.7	73.6	89.1	945.6	82.7
	120	1641.2	100	82.6	100	1143.2	100
IgG	15	12917.6	80.5	244.4	44.9	15429.8	80.8
	30	14915.4	92.9	434.7	79.9	18797	98.5
	60	15340.3	95.6	421.4	77.5	18694.4	97.9
	120	16050.3	100	544	100	19085.8	100
IgA	15	3141.9	78.2	75	66.8	9103	86.6
	30	3569.1	88.8	83.9	74.8	9563.8	91
	60	3539.1	88	86	76.6	9555.7	90.9
	120	4020	100	112.2	100	10512.9	100

Tabel 6: Optimalisatie van de incubatietijd van secundaire antilichamen: Het gemiddelde MFI-signaal geproduceerd uit verschillende incubatietijden van secundaire antilichamen, variërend van 15 min tot 120 min. De waarde van elk signaal wordt ook weergegeven als een percentage van het signaal op 120 min ("Max.") om de relatieve signaalmagnitude aan te tonen.

Discussie

De waardering van een immuunrespons op SARS-CoV-2-blootstelling, in combinatie met RT-PCR-gebaseerde surveillance van de infectiestatus, is goed beschreven als een recept om het verloop van herstel van Covid-19 te verduidelijken, om te dienen als een middel om herstellend plasma met potentiële therapeutische waarde te identificeren, en om infectiepercentages op populatieschaal te onderzoeken^10,11. Verschillende voorbeelden van het begrijpen van seroconversie bij menselijke proefpersonen zijn eiwit (antigeen) arrays¹², immunoblots¹³, snelle immunochromatografische constructen¹⁴ en enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA's)15,16,17. Elk van deze bovengenoemde technieken kan meerdere immunoglobuline-isotypen afzonderlijk beoordelen met kleine wijzigingen. Deze procedures kunnen echter niet praktisch worden hergebruikt om parallelle analyse van meerdere isotypen mogelijk te maken, zoals gepresenteerd in dit manuscript, waarbij kosten- en doorvoerfactoren worden weergegeven als beperkingen voor hun administratie op een populatiegebaseerde teststrategie. Verschillende van deze toepassingen bieden ook de mogelijkheid om niveaus van meerdere antigenen parallel te concomteren, hetzij zoals gepresenteerd of in gewijzigde formaten, zoals een multiplex ELISA^18,19. Ten slotte biedt het immunobead-platform de mogelijkheid om niveaus van meerdere antigenen parallel^20,21 te evalueren, maar is beperkt tot een enkel epitoop (d.w.z. immunoglobuline-isotype) per test, tenzij echter het recente instrument met 'dual-channel' testmogelijkheden wordt gebruikt.

In dit rapport worden protocollen opgesomd die de betrouwbare meting van meerdere epitopen in een immunokraantest vaststellen met behulp van het instrument in de 'dual-channel' modus in een casestudy van seroconversie van Covid-19-gevaccineerde personen. De methode toonde een uitstekende precisie (%CV-waarden meestal <20%) met behulp van handmatige testontwerpen die kunnen worden verbeterd met de integratie van geautomatiseerde laboratoriumsystemen. Testgevoeligheid en dynamisch bereik voor alle geselecteerde analyten en epitopen waren geschikt voor routine-evaluaties. Hoewel het ontbreken van in de handel verkrijgbare anti-antigeen IgA- en IgM-immunoreagentia de kwantificering tot het IgG-isotype beperkte, sluit een dergelijke beperking niet uit dat semikwantitatieve beoordelingen of beoordelingen met betrekking tot een specifiek specimen als kalibrant^22,23 kunnen worden aangeboden.

De gevalideerde immunokraantest werd toegewezen om seroconversie te onderzoeken in een cohort van personen die zijn geïmmuniseerd met het Covid-19-vaccin. In tegenstelling tot andere vergelijkbare platforms, maakt de familie van instrumentatie de prospectie van seroconversie mogelijk bij honderden personen per dag in een handmatige workflow en duizenden per dag in een geautomatiseerd schema. Over het algemeen bevestigen deze bevindingen dat de 'dual-channel'-benadering voldoende gevoeligheid heeft voor de beschrijving van meerdere epitopen parallel voor de identieke assay en levensvatbaar is in een multianalytische context. Een verschil in gevoeligheden voor kanaal 1 en kanaal 2, zoals uitgevoerd met respectievelijk fycoerythrin en Super Bright 436 fluoroforen, kan het ontwerp van een specifiek experiment rechtvaardigen om ervoor te zorgen dat levensvatbare analytische resultaten worden verkregen voor een bepaald experiment. Dat wil zeggen, de reservering van kanaal 1 voor epitopen of analyten met een lagere prevalentie kan nodig zijn om een dynamisch bereik van de test te behouden dat de waargenomen waarden van onbekenden omvat. Afgezien van deze overweging was het ontwerp van de test duidelijk en zou het gemakkelijk toegankelijk moeten zijn voor laboratoria met beperkte analytische mogelijkheden. Zeker, deze overweging moet worden gewogen bij het overwegen van kanaal 1 tot kanaal 2 interferentie, zoals we opmerkten voor figuur 5, waarbij interferentie van isotypen met een hogere abundantie misleidende analytische fouten kan veroorzaken voor degenen in een veel lagere abundantie wanneer gemeten in een dual-channel formaat. Dit potentieel voor interferentie met situaties met zeer verschillende analytconcentraties kan een aanzienlijke beperking van de aanpak vormen als het niet correct wordt behandeld in de ontwerpfase van de test.

Tot slot werd een methode gepresenteerd om snel antilichaamtiters te meten van de belangrijkste immunoglobuline-isotypen geassocieerd met een immuunrespons op Covid-19-infectie of vaccinatie. Het toepassen van deze aanpak op een longitudinale manier om seroconversie te beoordelen, kan inzichten opleveren die beter kunnen worden gebruikt om het verloop van de ziekte te beheren en / of te volgen of, afwisselend, toekomstige Covid-19-boostervaccinprogramma's te begeleiden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
384-well black side polystyrene microtiter plates	Thermo Fisher	12-565-346
Activation buffer (0.1 M NaH2PO4, pH 6.2)	Prepared in house
Assay buffer (PBS, 1% Bovine Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)	Prepared in house
Bovine Serum Albumin, heat shock fraction	MilliporeSigma	A-7888-50G
Coupling buffer (50 mM MES, pH 5.0)	Prepared in house
COVID 19 M Coronavirus Recombinant Matrix Protein (6xHis tag)	MyBioSource	MBS8574735
Disposable pipette tips
EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimide hydrochloride)	Thermo Fisher	PIA35391
Goat Albumin, Fraction V Powder	MilliporeSigma	A2514-1G
IgA Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal	Thermo Fisher	OB205009
IgG Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal	Thermo Fisher	OB204009
IgG Goat anti-Rabbit, R-PE, Polyclonal	Thermo Fisher	OB403009
IgM Goat anti-Human, R-PE, Polyclonal	Thermo Fisher	OB202009
IgM Mouse anti-Human, SB 436, Clone SA-DA4	Thermo Fisher	62999842
Instrument Analyzer	Luminex Corp.	INTELLIFLEX-RUO
Low-Bind microcentrifuge tubes (1.5 mL)	Thermo Fisher	13-698-794
MagPlex-C Microspheres, Region XXX	Luminex Corp.	MC10XXX-01
MES hydrate (2-(N-Morpholino) ethane sulfonic acid hydrate)	MilliporeSigma	M2933
Microplate aluminum sealing tape	Thermo Fisher	07-200-683
Polysorbate-20	Thermo Fisher	BP337-500
Quality Biological Inc. PBS, pH 7.2	Thermo Fisher	50-751-7328
Quench buffer (PBS, 1% Goat Serum Albumin, 0.01% Polysorbate-20)	Prepared in house
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Protein (His tag)	Sino Biologicals	40588-V08B
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (S1 Subunit, His tag)	Sino Biologicals	40591-V08H
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD Antibody, Rabbit pAb	Sino Biologicals	40592-T62
SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Nucleocapsid Antibody, Rabbit mAb	Sino Biologicals	40588-R0004
SARS-CoV-2 (COVID-19) Membrane Antibody (IN), Rabbit pAb	ProSci	10-516
Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)	Thermo Fisher	PIA39269
Wash Buffer (PBS, 0.01% Polysorbate-20)	Prepared in house
Water, LC/MS grade	Thermo Fisher	W-64