Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie van stabiel getransfecteerde melanoomcelklonen

1.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63371

⸱

4 augustus 2022

 ,  , 
1Department of Cell Pathology, Faculty of Biotechnology, University of Wrocław

In dit artikel

Samenvatting

Er wordt een protocol beschreven voor het isoleren van stabiel getransfecteerde melanoomcelklonen, met behulp van glazen cilinders. Wij richten ons op praktische adviezen die doorslaggevend kunnen zijn voor het succes van de gehele procedure.

Samenvatting

Celpopulaties met stabiele veranderingen in hun genomische informatie worden door wetenschappers veel gebruikt als onderzoeksmodel. Zij vereisen geen herhaalde celtransfectie aangezien het tot een heterogene celpopulatie en veranderlijke transfectieefficiency kan leiden, die reproduceerbaarheid beïnvloeden. Bovendien hebben ze de voorkeur voor grootschalige analyses. Het genereren van stabiele celklonen is nuttig voor een breed scala aan toepassingen, zoals onderzoek naar genfuncties en de productie van recombinante eiwitten. Er zijn een paar methoden om een homogene celpopulatie te verkrijgen bij initiële voorbijgaande transfectie. Hier beschrijven we de isolatie van eencellige klonen met glazen cilinders. Hoewel deze methode al enige tijd bekend is, zijn er een paar cruciale stappen, en het verwaarlozen ervan kan tot mislukking leiden. We hebben deze methode met succes gebruikt om klonen te verkrijgen die stabiel een eiwit van belang (POI) tot overexpressie brengen of met knock-out van een gen van belang (GOI). We beschrijven voorbereidingsstappen zoals de optimalisatie van het selecteren van geneesmiddelconcentraties, de voorbereiding van glazen cilinders en de validatie of de verkregen klonen de gewenste verandering in de expressie van de Indonesische overheid hebben door PCR, western blot-analyse, immunokleuring of gDNA-sequencing (afhankelijk van het type afgeleide klonen). We bespreken ook de fenotypische heterogeniteit van gevestigde cellijnen, aangezien dit een probleem kan zijn bij het verkrijgen van stabiele celklonen.

Inleiding

De stabiele transfectie van zoogdiercellen is een routinematig gebruikte methode in verscheidene toepassingen van de celcultuur, met inbegrip van kankeronderzoek. Het voordeel ten opzichte van voorbijgaande transfectie is dat het geïntroduceerde vreemde genetische materiaal niet verloren kan gaan als gevolg van omgevingsfactoren (bijv. celsamenvloeiing of replicatiestadium) en celdeling omdat het in het genoom van gastheer1 is geïntegreerd. De ontwikkeling van stabiel tot expressie gebrachte cellijnen kan moeizaam en uitdagend zijn, maar als een aanhoudende expressie van genen over een langere periode vereist is, is afleiding van stabiele cellijnen een voorkeursoptie. Het gemeenschappelijkste doel van transfectie is om de functies van een specifiek gen of genproduct door overproductie of downregulatie van zijn expressie te bestuderen. De productie van recombinante eiwitten en genetische therapieën vereist echter ook de introductie van vreemd genetisch materiaal in de cel2.

Een kloon wordt gedefinieerd als een celpopulatie die is afgeleid van één individuele cel. De isolatie van klonen van één cel is een cruciaal aspect van de celbiologie bij het bestuderen van cellen met genotypische en fenotypische variabiliteit. Voor het afleiden van celklonen worden drie belangrijke technieken gebruikt: de verdunningstechniek, de kloonringtechniek3 en de celsorteertechniek4. Elk heeft voor- en nadelen. We geven een gedetailleerde beschrijving van een methode voor het isoleren van melanoomcelklonen met behulp van de glascilindertechniek. Het voordeel van deze methode is dat de cellen een matige klonale groei vertonen uit celculturen met een lage dichtheid. Bovendien hebben de geselecteerde cellen al aangetoond dat ze zich kunnen vermenigvuldigen omdat ze al kolonies hebben gevormd5. Deze procedure houdt in dat getransfecteerde cellen spaarzaam worden gezaaid, maar niet bij het beperken van verdunning, in een groot vat en hen toestaan om uit te breiden en kolonies te vormen gedurende 2-3 weken in aanwezigheid van een selectief antibioticum. De afzonderlijke kolonies kunnen vervolgens worden geïsoleerd met behulp van glazen cilinders die over de kolonies worden geplaatst en met siliconenvet op het vat worden geplakt. Vervolgens worden cellen losgemaakt met trypsine en vervolgens overgebracht naar multiwell-platen voor verdere kweek in aanwezigheid van een selectief medium.

Er zijn een aantal onderzoeken die de isolatie van klonen beschrijven, maar we richten ons op het tonen van details zoals de grootte die klonen moeten hebben na 2 weken selectie, hoe de locatie van de klonen tijdens hun isolatie moet worden gemarkeerd en hoe een geschikte concentratie antibioticum voor de selectie moet worden gekozen. Wij richten ons op praktische adviezen die doorslaggevend kunnen zijn voor het succes van de gehele procedure. Het gepresenteerde protocol stelt ons in staat om binnen 2-4 weken stabiele celklonen te verkrijgen. De methode is gemakkelijk en goedkoop en vereist geen ingewikkelde apparatuur. We delen een techniek die ons in staat heeft gesteld om veel onderzoeksmodellen te verkrijgen, waaronder GSN KO-klonen 6,7,8.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Celsubcultuur en seeding voor optimalisatie van de geneesmiddelconcentratie

  1. Verwarm het celkweekmedium (in dit geval Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium met een verlaagde concentratie (1,5 g/l) van NaHCO3, 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS), 1% (v/v) L-glutamine en 1% (v/v) antibioticum-antimycoticum) en trypsineoplossing in een waterbad tot 37 °C.
  2. Zuig het celkweekmedium van de A735-cellen die in een T25-celkweekkolf groeien, op en gooi het weg. De cellijn wordt verkregen uit commerciële bronnen.
  3. Spoel het resterende celkweekmedium uit de cellen door de kolf te wassen met 1 ml trypsine of PBS-oplossing.
  4. Zuig de trypsine- of PBS-oplossing op en gooi deze uit de cellen.
  5. Voeg 1 ml trypsineoplossing toe aan de kolf en incubeer deze bij 37 °C. Observeer zorgvuldig het loslaten van de cellen met behulp van een omgekeerde microscoop.
  6. Stop de trypsine-activiteit door 3 ml vers volledig celkweekmedium toe te voegen en spoel de celkweekkolf ermee af wanneer de cellen loskomen.
  7. Breng de celsuspensie van de kolf over in een centrifugebuis van 15 ml.
  8. Centrifugeer de cellen bij 800 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  9. Aspiratie en gooi het bovenliggende weg.
  10. Resuspendeer de cellen in 1 ml van het verse celkweekmedium.
  11. Om de celdichtheid te berekenen, telt u de cellen met een automatische celteller of hemocytometer.
  12. Zaai het juiste aantal cellen in een kweekschaaltje van de juiste grootte.
    OPMERKING: In dit experiment werden 450.000 cellen van de A375-cellijn gezaaid in 2 ml van het celkweekmedium in een kweekschaaltje van 35 mm.

2. Optimalisatie van de geselecteerde geneesmiddelconcentratie

  1. Zoek het door de fabrikant aanbevolen concentratiebereik van het medicijn dat moet worden gebruikt om stabiele celklonen te selecteren.
    OPMERKING: Een selectiegen dat in een cel wordt geïntroduceerd door transfectie met een genetische vector voorziet de cel van weerstand tegen het selectiegeneesmiddel. Puromycine in een concentratie van 1 μg/ml werd gebruikt als selectiemarker om een stabiele expressie van de genetische vector te verkrijgen en niet-getransfecteerde cellen te elimineren.
  2. Zaai de cellen in de putjes van een plaat met 96 putjes om de volgende dag 50% samenvloeiing te bereiken. Bereid drie putjes voor voor elke geneesmiddelconcentratie en een onbehandelde controle. Zaad 10.000 cellen per putje. Het celnummer is afhankelijk van de cellijn die wordt gebruikt en moet empirisch worden bepaald.
  3. Bereid na 24 uur 10 verdunningen van het geneesmiddel in het volledige medium van de laagste naar de hoogste concentratie die door de fabrikant wordt aanbevolen en voeg deze toe aan de cellen.
    OPMERKING: In dit geval werd puromycine gebruikt. Het concentratiebereik was 0-10 μg/ml. Elke 3 dagen, of wanneer veel dode cellen in het medium worden waargenomen, verander dan naar vers medium.
  4. Observeer de cellen een week lang dagelijks en maak aantekeningen over hun samenvloeiing, proliferatie en dood ten opzichte van de controleplaat.
    OPMERKING: Een geschikte concentratie is een concentratie waarbij cellen stoppen met prolifereren en niet onmiddellijk celdood veroorzaken, maar alle behandelde cellen na 48-120 uur doden. Voor sommige combinaties van cellijnen en geneesmiddelen is er echter mogelijk geen fase waarin cellen stoppen met prolifereren, maar afsterven. In een dergelijke situatie zou de laagste concentratie van het geneesmiddel dat alle cellen doodt, geschikt zijn voor selectie.

3. Het zaaien en transfectie van de cel

  1. Zaai de cellen in een putje van een plaat met zes putjes.
    OPMERKING: Het uiteindelijke volume van de celsuspensie in het celkweekmedium moet 2,5 ml zijn. Voor dit experiment werden 450.000 cellen per putje gezaaid. Het aantal cellen moet empirisch worden bepaald, zodat hun samenvloeiing na 48 uur zaaien niet meer dan 90% kan bedragen.
  2. Kweek de cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 gedurende 24 uur.
    OPMERKING: De cellen werden gekweekt 24 h vóór transfectie. Nochtans, 48 uur na het zaaien, werd waargenomen dat de cellen efficiënter werden getransfecteerd.
  3. Zuig het celkweekmedium boven de cellen op en gooi het weg.
  4. Vervang het weggegooide medium door voorverwarmd antibioticavrij celkweekmedium (10% (v/v) FBS, glutamine-gesupplementeerde DMEM).
    OPMERKING: De noodzaak voor het veranderen van het medium van de celcultuur is toe te schrijven aan de verhoogde celpermeabiliteit die door sommige transfectiereagentia wordt veroorzaakt, die een verhoogde instroom van antibiotica in de cellen kunnen veroorzaken, resulterend in celdood.
  5. Verdunde transfectiereagentia in antibiotica- en serumvrije DMEM. Gebruik polyethyleenimine (PEI), op lipiden gebaseerd transfectieragens of elektroporatie. Voor celtransfectie gebruikt u 2 mg/ml polyethyleenimine-oplossing bij een gewichtsverhouding van 1:2.175 voor 4 μg DNA.
    OPMERKING: Als DNA-oplossing werd in het CRISPR/Cas9(D10A)-systeem een mengsel van twee plasmiden gebruikt met de volgende gRNA-sequenties: 5'ccgggccgtgcagcaccgtg3' en 5'atccagctgcacggtaaaga3'.
  6. Incubeer het transfectiemengsel 30 min bij RT.
  7. Na incubatie, voeg voorzichtig het transfectiemengsel druppelsgewijs toe aan de cellen die in de putjes van een zes-well plaat groeien.
  8. Kweek de cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 gedurende 2-6 uur.
  9. Verander het medium in het volledige celkweekmedium.
  10. Kweek de cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 gedurende de volgende 24 uur.

4. Generatie van celklonen

  1. Trypsiniseren en overbrengen van de getransfecteerde cellen in een kweekschaal met een diameter van 150 mm en een gegoten rooster van 20 mm volgens de instructies in sectie 1 van het protocol.
    OPMERKING: Vanwege het samensmelten van de cellen met elkaar in het geval van een hoge dichtheid, wordt aanbevolen om de cellen gelijkmatig over te brengen in twee celkweekschalen. Het raster op de cultuurschaal helpt bij het lokaliseren van klonen en het volgen van hun migratie. Op een gedrukt schaalplan kan men later de locatie van de klonen markeren (Figuur 1B). Bovendien zou het voor cellen die geen verwijdering van het medium en blootstelling aan lucht verdragen (met de dood/onomkeerbare schade tot gevolg), beter zijn om meer schalen met een kleiner oppervlak te gebruiken om minder kolonies uit één schaal te isoleren. Dit kan de tijd van blootstelling aan lucht tijdens kloonisolatie verkorten en de kans op celuitdroging verkleinen.
  2. Kweek de cellen bij 37 °C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 gedurende 24 uur.
  3. Verander het celkweekmedium in een medium dat een selectief antibioticum bevat.
    OPMERKING: Vanaf dit punt is het belangrijk om de cellen te kweken in aanwezigheid van een selectief antibioticum; Anders bestaat de kans dat het geïntegreerde transgen uit het gen wordt geknipt.
  4. Vervang het medium elke 3 dagen of wanneer er veel dode cellen in het medium zweven.
    OPMERKING: In dit experiment werden de cellen geïncubeerd met puromycine in een concentratie van 1 μg/ml. De selectiestap voor het klonen van cellen duurt ongeveer 2 weken. De vorming van klonen moet worden gevolgd door hun groei onder een omgekeerde microscoop te observeren, omdat ze niet mogen groeien en in contact mogen komen met naburige celklonen. Cellen van de ene kolonie kunnen niet worden verhinderd om te migreren en te groeien met een andere kolonie. Daarom is het belangrijk om de plaat te observeren op celmigratie van de klonen en de informatie hierover op het schaalplan te noteren.

5. De klonen kiezen voor isolatie

  1. Onderzoek de celkweekschaal op celklonen onder een omgekeerde microscoop met een 10x of 20x objectief.
    OPMERKING: De klonen bestaan uit ongeveer 500-30.000 cellen. Het hangt echter af van de gebruikte cellijn. Een bevredigende kolonie moet worden gescheiden van andere celkolonies en van gemiddelde grootte zijn, aangezien zeer grote en uitstekende klonen uit meer dan één cel kunnen ontstaan (Figuur 1B).
  2. Zoek een geschikte kolonie met behulp van de omgekeerde microscoop door de schaal zorgvuldig te onderzoeken en de gevonden klonen te beoordelen. Plaats de marker op de plaats van de geselecteerde kloon met de marker op het schaaltje eronder. Markeer tegelijkertijd de lokalisatie van de kolonie op het afgedrukte schaalplan (Figuur 1B).
    OPMERKING: Er moeten ongeveer 20-30 kolonies uit de schaal worden geselecteerd. Soms worden er minder celklonen verkregen, en ze moeten in dergelijke gevallen allemaal worden geïsoleerd.

6. Voorbereiding van glazen cilinders

  1. Voordat de klonen worden geïsoleerd, plaatst u de glazen cilinders (6,4 mm in diameter en 8 mm in hoogte) (Figuur 1C) in de eerste glazen petrischaal en autoclaveert u ze.
  2. Autoclaaf de tweede glazen petrischaal.
  3. Breng een dun laagje siliconenvet aan op de bodem van de tweede geautoclaveerde glazen petrischaal. Plaats de schaal onder een laminaire stromingskast en breng gedurende 30 minuten UV-licht aan om het siliconenvet te steriliseren.
    OPMERKING: Optioneel kan het siliconenvet worden geautoclaveerd.
  4. Dompel de geautoclaveerde cilinders onder in een met siliconen vet beklede petrischaal. Nu zijn ze klaar om de klonen te isoleren.
  5. Reinig na het isoleren van de klonen de cilinders volgens de regels die gelden voor het celmateriaal waarmee ze worden gehanteerd. Gebruik in het geval van genetische modificatie natriumhypochloriet voor sterilisatie.
  6. Was de cilinders een nacht met xyleen om ze te ontdoen van siliconenvet.
  7. Was de cilinders met gedeïoniseerd water onder een chemische kap om de xyleenoplossing te verwijderen.
  8. Leg de cilinders op een papieren handdoek en laat ze drogen.
  9. Bewaar de cilinders in een glazen petrischaaltje.
  10. Bereid de cilinders voor op het volgende gebruik, te beginnen bij punt 1 van deze handleiding.

7. Isolatie van klonen

  1. Bereid in elk putje een plaat met 24 putjes met 0,5 ml voorverwarmd volledig celkweekmedium.
  2. Was de getransfecteerde cellen die op een schaal van 150 mm groeien driemaal zorgvuldig met 15 ml warme, steriele PBS. Zuig de PBS voorzichtig op en gooi deze weg.
  3. Gebruik een steriel pincet om cilinders over te brengen die aan één kant vet bevatten. Druk op de cilinders op de bodem van een kweekschaal op de plaatsen van de gemarkeerde klonen om geïsoleerde putjes te creëren rond de groeiende kolonies van eencellige kloonoorsprong.
    NOTITIE: De cilinder moet goed aan de bodem blijven plakken om lekkage van vloeistof te voorkomen.
  4. Voeg 50 μL trypsineoplossing toe aan elke cilinder en incubeer gedurende enkele minuten. Pas op dat u de cellen niet enzymatisch beschadigt. Verwerk de kolonies één voor één. Vergeet niet om de pipetpunt voor elke cilinder te vervangen om de kolonies niet te besmetten met andere.
    OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de cellijn die wordt gebruikt en moet empirisch worden bepaald. De trypsine-oplossing kan op en neer worden gepipeteerd om de celloslating te vergemakkelijken. Bewaak de celloslating zorgvuldig met behulp van een omgekeerde microscoop. Stop na celloslating de trypsine-activiteit door 50 μL celkweekmedium aan elke cilinder toe te voegen.
  5. Breng onmiddellijk 100 μL van de celsuspensie over in het medium in een putje van een plaat met 24 putjes.
    OPMERKING: Hier werd de groei van de kloon voortgezet met een selectief antibioticum in een concentratie van 0,5 μg/ml.
  6. Volg de groei van de celklonen in de plaat met 24 putjes en wanneer ze 90% samenvloeiing bereiken, breng je ze over naar een plaat met zes putjes. Volg de instructies in sectie 1 van het protocol; verander alleen de volumes trypsine (0,5 ml) en het stopmedium (1,5 ml).
  7. Bewaak de celklonen die in een plaat met zes putjes groeien en wanneer ze samenvloeien, brengt u ze over naar de T12.5-celkweekkolf.
  8. Observeer celklonen in de T12.5-celkweekkolf, en wanneer ze samenvloeien, subcultuur en tel ze met een geschikte methode, zoals het gebruik van een geautomatiseerde celteller of hemocytometer. Vries de helft van de cellen in het medium in dat 70% volledig medium bevat met selectief antibioticum, 20% (v/v) FBS en 10% (v/v) DMSO. Zaai de rest van de cellen op dekglaasjes (12 mm x 12 mm) voor immunokleuring en in twee putjes van een plaat met zes putjes voor gDNA-isolatie en lysaatbereiding.
    OPMERKING: In het geval van de A375-cellijn, zaai 45.000 cellen per dekstrookje en 450.000 cellen per putje van een plaat met zes putjes.

8. Validatie van de gegenereerde celklonen

  1. Immunokleuring
    OPMERKING: Voer immunokleuring uit op de cellen om het expressieniveau van het betreffende eiwit (POI) te bepalen. Het is belangrijk om wildtype cellen of controleklonen tegelijkertijd te kleuren als controle om de expressieniveaus van de POI te kunnen vergelijken (Figuur 2A).
    1. Zuig het celkweekmedium op en gooi het weg.
    2. Was de cellen die op de dekglaasjes groeien drie keer met PBS.
    3. Fixeer de cellen door 0,5 ml 4% formaldehyde-oplossing aan elk putje toe te voegen en incubeer ze gedurende 20 minuten bij RT.
      OPMERKING: Verschillende antilichamen kunnen verschillende fixatiemethoden vereisen.
    4. Was de cellen twee keer met PBS.
    5. Om de cellen te permeabiliseren, incuberen de dekglaasjes in 0,1% Triton X-100 in PBS gedurende 5 minuten bij RT.
      OPMERKING: Verschillende antilichamen kunnen verschillende permeabilisatiemethoden vereisen.
    6. Was de dekglaasjes twee keer met PBS.
    7. Plaats de dekglaasjes in een kleurkamer9.
    8. Incubeer de dekglaasjes in 1% (m/v) BSA in 0,1% (v/v) Triton X-100 in PBS-oplossing gedurende 30 minuten bij RT om niet-specifieke binding van antilichamen te voorkomen.
    9. Verwijder de oplossing door het dekglaasje met de rand met een naald en een pincet op een stuk lignine te leggen.
    10. Bereid een kleuringsoplossing voor die bestaat uit primaire antilichamen in 1% (m/v) BSA en 0,1% (v/v) Triton X-100 in PBS. Druppel 30 μl oplossing op elk dekglaasje en incubeer deze gedurende 24 uur bij 4 °C in een vochtige vochtigheidskamer.
      OPMERKING: In dit experiment werd een anti-GSN-antilichaam van muizen in een verdunning van 1:200 gebruikt.
    11. Verwijder de oplossing door de dekglaasjes met de rand met een naald en een pincet op een stuk lignine te leggen. Leg de dekglaasjes in een bord met 24 putjes.
    12. Was de dekglaasjes drie keer met PBS gedurende 5 minuten bij RT.
    13. Bereid secundaire antilichamen en kleurstoffen in 1% (w/v) BSA en 0,1% (v/v) Triton X-100 in PBS-oplossing. Druppel 30 μL oplossing op elk dekglaasje en incubeer ze gedurende 1 uur bij RT in het donker.
      OPMERKING: Gebruik ezel anti-muis-fluorescerend gelabelde secundaire antilichamen 488 bij een verdunning van 1:200. Om F-actine en celkernen te detecteren, gebruikten we phalloidine-Alexa Fluor 568 bij een verdunning van 1:200 en Hoechst 33342 bij een verdunning van 1:1000.
    14. Verwijder de oplossing door de dekglaasjes met de rand met een naald en een pincet op een stuk lignine te leggen. Leg de dekglaasjes in een bord met 24 putjes.
    15. Was de dekglaasjes drie keer met PBS gedurende 5 minuten bij RT in het donker.
    16. Was de dekglaasjes een keer met gedeïoniseerd water.
    17. Monteer de dekglaasjes met behulp van montagemedium op microscoopglas.
    18. Visualiseer de celkleuring met behulp van een confocale microscoop om het niveau van de POI vast te stellen dat wordt uitgedrukt in afgeleide klonen (Figuur 2A).
  2. Western Blot-analyse
    OPMERKING: Om het ontbreken, verhoogde niveau of verlaagde niveau van POI-expressie in afgeleide klonen te bevestigen, voert u de western blot-analyse uit onder standaardomstandigheden10. Analyseer de wild-type cellen of controleer klonen tegelijkertijd (Figuren 2B,C).
    1. Was de cellen die in het putje van een plaat met zes putjes groeien drie keer met PBS.
    2. Oogst de cellen met behulp van een schraper tot een buffer naar keuze en draai voorzichtig gedurende 20 s. Voer drie cycli uit: invriezen (bij -80 °C) en ontdooien (bij 4 °C) van het monster.
      OPMERKING: Gebruik ofwel cytoskeletgebonden eiwitextractiebuffer [10 mM Tris-HCl pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA), 1 mM ethyleenglycol-bis (2-aminoethylether)-N,N,N',N'-tetraazijnzuur (EGTA), 1 mM NaF, 20 mM Na4P2O7, 2 mM Na3VO4, 1% (v/v) Triton X-100, 10% (v/v) glycerol, 0,1% (m/v) SDS, 0,5% natriumdeoxycholaat] of ureumbuffer [50 mM TRIS-HCl pH 7, 5% (w/v) SDS, 8,6% (w/v) sucrose, 74 mM ureum, 1 mM DTT], beide met toevoeging van 1:100 proteaseremmercocktail, 1:100 serinefosfataseremmer en 1:100 tyrosinefosfataseremmer.
    3. Centrifugeer de lysaten bij 12.000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    4. Bepaal de eiwitconcentratie in de monsters (bijv. door middel van een BCA-test).
      OPMERKING: De test is afhankelijk van de compatibiliteit met de buffersamenstelling.
    5. Om een western blot-analyse van de monsters uit te voeren, laadt u 30 μg eiwit in elk putje op polyacrylamidegel (7%-15%).
    6. Voer SDS-PAGE-elektroforese uit en breng de eiwitten over naar een nitrocellulosemembraan.
    7. Visualiseer het niveau van de POI-expressie door het membraan te kleuren met geschikte antilichamen (Figuren 2B,C).
      OPMERKING: Anti-GSN-antilichamen van muizen met een verdunning van 1:2000 en anti-GAPDH-antilichamen van muizen met een verdunning van 1:200 werden gebruikt. Zie onze papieren voor details 2,11. De belichtingstijd moet lang genoeg zijn om zwakke signalen niet over het hoofd te zien (Figuur 2C).
  3. gDNA-analyse
    OPMERKING: Na schatting van het POI-expressieniveau in afgeleide klonen door middel van microscopische en westerse blot-technieken, moet genomisch DNA worden geanalyseerd. Een vergelijking van de lengte van het PCR-reactieproduct op de gDNA-sjabloon van de verkregen klonen levert informatie op over de vraag of de sequentie van de Indonesische overheid is bewerkt (figuur 2D).
    1. Was de cellen die in het putje van een plaat met zes putjes groeien drie keer met PBS.
    2. Oogst de cellen met behulp van een schraper in 1 ml PBS.
    3. Centrifugeer de cellen bij 5000 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    4. Zuig de bovenstaande stoffen op en gooi ze weg.
      LET OP: Pellets kunnen enkele maanden worden bewaard bij -80 °C.
    5. Isoleer gDNA uit pellets van afgeleide klonen met behulp van een in de handel verkrijgbare gDNA-extractiekit.
    6. Ontwerp PCR-primers door ten minste 300 bp stroomopwaarts en stroomafwaarts van het gRNA-doelwit te gloeien op de CRISPR/Cas9-genbewerkingsplaats.
      LET OP: De volgende primers zijn gebruikt: Fwd: 5'gtgcagccaggatgagag3', Rev: 5'ccctgttactggtgcatc3'.
    7. Voer PCR-reacties uit met behulp van DNA Polymerase Master Mix volgens de instructies van de fabrikant.
      OPMERKING: De samenstelling van het PCR-reactiemengsel wordt weergegeven in tabel 1 en de instellingen van de thermocycler voor de PCR-reactie worden weergegeven in tabel 2.
    8. Analyseer PCR-producten in 1% of 2% (w/v) agarosegel in Tris-acetaat-EDTA-buffer (40 mM Tris pH 8,0, 20 mM azijnzuur, 1 mM EDTA).
    9. Vergelijk de ampliconlengte van het PCR-product van GSN KO-klonen met de PCR-productlengte van CTRL KO-klonen (203 bp; Figuur 2D).
  4. gDNA-sequencing
    1. Ontwerp PCR-primers door te gloeien naar de sequenties stroomopwaarts en stroomafwaarts van de sequenties die worden herkend door de gRNA's die zijn gecodeerd door CRISPR/Cas9 (D10A) plasmiden.
      OPMERKING: Ontwerp de primers als volgt: Fwd: 5'gatctcgagctcaagcttcgaattctgaacagtgcagacctttg3', Rev: 5'cgggtaccgtcgactgcagaattcaattcaccagaacaggactaggc3'.
    2. Voer PCR uit met behulp van High-Fidelity DNA-polymerase (een dergelijke analyse vereist een hoge nauwkeurigheid tijdens DNA-amplificatie) en gDNA als sjabloon.
      OPMERKING: De samenstelling van het PCR-reactiemengsel wordt weergegeven in tabel 3 en de instellingen van de thermocycler voor de PCR-reactie worden weergegeven in tabel 4.
    3. Lineariseer het plasmide met een restrictie-enzym op meerdere kloonplaatsen door gedurende 1 uur bij 37°C te incuberen.
      OPMERKING: De samenstelling van het restrictieve digestiereactiemengsel wordt weergegeven in tabel 5. Het maakt niet uit welk plasmide wordt gebruikt. pACGFP-C1 werd gelineariseerd met het EcoRI-enzym.
    4. Schat de concentratie van inserts en snijd het plasmide door middel van agarosegelelektroforese.
    5. Bereid DNA-assemblagereacties voor.
      OPMERKING: Een traditionele kloonmethode of een andere methode kan worden gebruikt.
    6. Transformeer competente bacteriën (bijv. door middel van een hitteschokprocedure)12.
    7. Isoleer plasmiden (bijv. van zes bacteriekolonies per construct volgens de instructies van de fabrikant of volgens het geciteerde protocol)13.
    8. Controleer of het inzetstuk met succes in het plasmide is gekloond en of de lengte geschikt is door restrictievertering en DNA-elektroforese.
      OPMERKING: Als de geselecteerde kolonies geen plasmide met een inzetstuk bevatten, moeten de plasmiden worden geïsoleerd uit latere bacteriekolonies.
    9. Bevestig genbewerking door plasmide-sequencing (Figuur 3).
      OPMERKING: Men zou ten minste twee verschillende resultaten van DNA-sequencing moeten verkrijgen voor elke afgeleide celkloon vanwege het bestaan van twee allelen van genen. Voor multiploïde cellijnen (groter dan 2 n) is het nodig om meer plasmiden te sequencen om de sequentie te verkrijgen van alle genkopieën in de cel die worden verkregen. Isoleer zoveel kolonies als nodig is totdat plasmiden met de gekloonde sequenties van alle kopieën van het gen zijn geïsoleerd. Men kan een in de handel verkrijgbare kit gebruiken om het aantal loci voor het bestudeerde gen te schatten.
    10. Vergelijk de gDNA-sequenties die zijn verkregen voor de GSN KO- en CTRL KO-klonen met behulp van een meervoudig sequentie-uitlijningsprogramma (Figuur 3).
ReagentiaVolume
DNA Polymerase Master Mix7,5 μl
Voorwaartse primer (10 μM)1,5 μl
Omgekeerde primer (10 μM)1,5 μl
Steriel water3,5 μl
gDNA1 μl met 10 ng gDNA

Tabel 1. Samenstelling van het PCR-reactiemengsel.

StappenTemperatuur [°C]Tijd [minuten: seconden]
19504:00
29500:30
35700:30
47200:45
5Ga naar 2, 35xX
67210:00
78∞

Tabel 2. Thermocycler-instellingen voor de PCR-reactie.

ReagentiaVolume
5 x High-Fidelity DNA-polymerasebuffer4 μl
dNTP's (10 mM)0,4 μl
Voorwaartse primer (10 μM)1 μl
Omgekeerde primer (10 μM)1 μl
Steriel water12,4 μl
gDNA1 μl met 10 ng gDNA
High-fidelity DNA-polymerase0,2 μl

Tabel 3. Samenstelling van het PCR-reactiemengsel.

StappenTemperatuur [°C]Tijd [minuten: seconden]
19800:30
29800:30
36100:30
47201:00
5Ga 35 keer naar stap 2X
67210:00
78∞

Tabel 4. Thermocycler-instellingen voor de PCR-reactie.

ReagentiaAantal
10 x buffer3 μl
Restrictie enzym1 μl
Steriel water20,7 μl
Plasmide5,3 μl met 5 μg DNA

Tabel 5. Samenstelling van het restrictieve digestiereactiemengsel.

9. Beoordeel de fenotypische heterogeniteit van de cellijn

  1. Voer immunokleuring van de cellen uit om het niveau van POI-expressie te bepalen.
  2. Maak foto's zonder vergroting met behulp van een 60x olie-onderdompelingslens in een confocale microscoop.
  3. Om de distributieverhouding van cellen met verschillende niveaus vast te stellen, gebruikt u de tool "over-/onderbelichting" die meestal beschikbaar is in de meeste microscopische beeldanalyseprogramma's. Behandel cellen die onderbelichte gebieden vertonen als cellen die de POI op een laag niveau produceren. Classificeer overbelichte cellen als cellen met een hoge POI-expressie en de overige cellen als cellen die POI op een gemiddeld niveau tot expressie brengen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Aan de hand van het gepresenteerde protocol geven we een gedetailleerde demonstratie van de isolatie van stabiel getransfecteerde melanoomcelklonen met de glazen cilindermethode (Figuur 1A). Onze studies hebben betrekking op de biologie van melanoomcellen en het meest voorkomende onderzoeksmodel dat we gebruiken is de aanhangende en zeer invasieve A375-melanoomlijn. Omdat ons onderzoek heeft aangetoond dat melanoomcellen in vergelijking met andere soorten ka...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We hebben een gedetailleerde beschrijving gegeven van de isolatie van stabiel getransfecteerde melanoomcelklonen met glazen cilinders. Het is belangrijk om controleklonen te verkrijgen bij het afleiden van klonen met veranderde expressie van genen, omdat de resultaten die worden verkregen voor de gerichte modificatieklonen altijd moeten worden vergeleken met de resultaten die zijn verkregen voor controles. Op deze manier kunnen we controleren of de transfectie zelf of de cultuur met een ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het National Center for Science, Polen (project #2016/22/E/NZ3/00654, gesubsidieerd aan AJM).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 ml centrifuge tubeGoogleLab ScientificG66010522
150 mm cell culturedish with 20 mm gridFalcon353025
24-wells plateVWR International10062-896
35 mm culture dishEppendorfEP0030700112
6-well plateEppendorfEP0030700113
96-well plateVWR International10062-900 
Acetic acid, 80% solutionChempur115687330
AgaroseProna-AboBLE500
Antibiotic-AntimycoticGibco15240062
anti-GAPDH antibodiesSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-47724
anti-GSN antibodies  - clone C20Santa Cruz Biotechnology Inc.,sc-6405
anti-GSN antibodies  - clone GS-2C4Sigma-AldrichG44896
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3294
Color Taq PCR Master Mix (2x)EurXE2525
Control Double Nickase PlasmidSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-437281
Coverslipsbionovo16283
Dako Mounting medium ClontechS3023
DMSO -  Dimethyl sulfoxideapplichemA3672,0250
DNA Purification Kit EurX3555-02
donkey anti- mouse-Alexa Fluor 488Invitrogen# A-21202
DTT - 1,4-DithiothreitolSigma-Aldrich10197777001
EcoRI Thermo Fisher ScientificFD0274
EDTA- ethylenediaminetetraacetic acid Poch (Pol-Aura)593280117
EGTA - ethylene glycol-bis(2-aminoethyl ether)- N,N,N’,N’-tetraacetic acid Sigma-AldrichE0396
FBS - Fetal Bovine Serum Gibco10270-106
Gelsolin CRISPR PlasmidsSanta Cruz Biotechnology Inc.,sc-401005-NIC
FormaldehydeSigma-AldrichP6148
GlycerolSigma-AldrichL-4909
high glucose Dulbecco’s modified Eagle’s medium with reduced concentration (1.5 g/l) of NaHCO3 Polish Academy of Science,Wrocfigure-materials-1aw, Poland11-500
Hoechst 33342 Thermo Fisher ScientificH3570
L-GlutamineGibco25030-024
Lignin BionovoB-0521
Lipofectamine 3000 Transfection Reagent InvitrogenL3000-008
Na3VO4Sigma-AldrichS6508
Na4P2O7Sigma-AldrichP8010
NaFSigma-Aldrich450022
NEBuilder Assembly Tool http://nebuilder.neb.com/#!/
pACGFP-C1 Clontech
PageRuler Prestained Protein LadderThermo Fisher Scientific 26616
Perfect 100 bp DNA ladderEurXE3134
phalloidin-Alexa Fluor 568InvitrogenA12380
Phosphatase Inhibitor Cocktail 2Sigma-AldrichP5726
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3Sigma-AldrichP0044
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase Thermo Fisher ScientificF530S
Pierce BCA Protein Assay Kit Thermo Fisher Scientific 23225
polyethylenimine (PEI)Sigma-Aldrich408727
protease inhibitor cocktailSigma-AldrichP8340
puromycinInviviGenant-pr
SDS - sodium dodecyl sulfate Sigma-AldrichL4509
silicone CX80 Polska
Sodium chloride - NaClChempur7647-14-5
sodium deoxycholateSigma-AldrichD6750259
sucrosePoch (Pol-Aura)PA-06-772090110
the glass cylinders Sigma-AldrichC3983-50EA
Tissue Culture Flask 25mLVWR International10062-868
Tissue-culture 75 cm2 flaskVWR10062-872
Trisma baseSigma-AldrichT1503
Triton X-100Sigma-AldrichX100
trypsin Polish Academy of Science,Wrocfigure-materials-2aw, Poland20-500
ureaSigma-Aldrich8656
xylene solutionChempur115208603

Referenties

  1. Recillas-Targa, F. Multiple strategies for gene transfer, expression, knockdown, and chromatin influence in mammalian cell lines and transgenic animals. Molecular Biotechnology. 34 (3), 337-354 (2006).
  2. Wurm, F. M. Production of recombinant protein therapeutics in cultivated mammalian cells. Nature Biotechnology. 22 (11), 1393-1398 (2004).
  3. McFarland, D. C. Preparation of pure cell cultures by cloning. Methods in Cell Science. 22 (1), 63-66 (2000).
  4. Mattanovich, D., Borth, N. Applications of cell sorting in biotechnology. Microbial Cell Factories. 5 (1), 1-11 (2006).
  5. Park, H. B., et al. Cell cloning-on-the-spot by using an attachable silicone cylinder. Biochemical and Biophysical Research Communications. 474 (4), 768-772 (2016).
  6. Malek, N., et al. Knockout of ACTB and ACTG1 with CRISPR/Cas9(D10A) technique shows that non-muscle β and γ actin are not equal in relation to human melanoma cells' motility and focal adhesion formation. International Journal of Molecular Sciences. 21 (8), 2746(2020).
  7. Malek, N., et al. The origin of the expressed retrotransposed gene ACTBL2 and its influence on human melanoma cells' motility and focal adhesion formation. Scientific Reports. 11 (1), 3329(2021).
  8. Mazurkiewicz, E., Nowak, D., Mazur, A. J. Gelsolin contributes to the motility of A375 melanoma cells and this activity is mediated by the fibrous extracellular matrix protein profile. Cells. 10 (8), 1848(2021).
  9. Mazurkiewicz, E., Mrówczyńska, E., Simiczyjew, A., Nowak, D., Mazur, A. J. A Fluorescent gelatin degradation assay to study melanoma breakdown of extracellular matrix. Methods in Molecular Biology. , Springer Science+Business Media, LLC, part of Springer Nature. 47-63 (2021).
  10. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. BioEssays. 76 (9), 4350-4354 (1979).
  11. Makowiecka, A., et al. Changes in biomechanical properties of A375 cells due to the silencing of TMSB4X expression are not directly correlated with alterations in their stemness features. Cells. 10 (4), 769(2021).
  12. Pope, B., Kent, H. M. High efficiency 5 min transformation of Escherichia coli. Nucleic Acids Research. 24 (3), 536-537 (1996).
  13. JoVE Science Education Database. Plasmid Purification: Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. JoVE. , Cambridge, MA. (2022).
  14. Mazur, A. J., et al. Gelsolin interacts with LamR, hnRNP U, nestin, Arp3 and in human melanoma cells as revealed by immunoprecipitation and mass spectrometry. European Journal of Cell Biology. 95 (1), 26-41 (2016).
  15. Litwin, M., et al. Gelsolin affects the migratory ability of human colon adenocarcinoma and melanoma cells. Life Sciences. 90 (21-22), 851-861 (2012).
  16. Feldt, J., et al. Structure, regulation and related diseases of the actin-binding protein gelsolin. Expert Reviews in Molecular Medicine. 20, 1-10 (2019).
  17. Chong, Z. X., Yeap, S. K., Ho, W. Y. Transfection types, methods and strategies: A technical review. PeerJ. 9, 1-37 (2021).
  18. Casden, N., Behar, O. An approach for accelerated isolation of genetically manipulated cell clones with reduced clonal variability. Journal of Cell Science. 132 (6), (2019).
  19. Nicosia, R. F., Villaschi, S., Smith, M. Isolation and characterization of vasoformative endothelial cells from the rat aorta. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 30 (6), 394-399 (1994).
  20. Li, D., et al. Generation of human lens epithelial-like cells from patient-specific induced pluripotent stem cells. Journal of Cellular Physiology. 231 (12), 2555-2562 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Stabiele celklonenisolatie van enkelvoudige cellenglascilindermethodegene knockouteiwit-overexpressiedrugselectieWestern blotPCR-analyseimmunokleuring

Dit artikel is gepubliceerd

Video binnenkort beschikbaar

Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.