Kwantificering van de zwermmotiliteit van het bacteriële oppervlak op gradiëntplaten van inductoren

Summary

Hier beschrijven we het gebruik van inducergradiëntplaten om bacteriële zwermmotiliteit te evalueren en tegelijkertijd meerdere concentratieresponsen te verkrijgen.

Abstract

Bacteriële zwermmotiliteit is een veel voorkomend microbiologisch fenotype dat bacteriële gemeenschappen gebruiken om over semisolide oppervlakken te migreren. Bij onderzoeken naar geïnduceerde zwermmotiliteit kan de specifieke concentratie van een inductor mogelijk geen gebeurtenissen melden die zich voordoen binnen het optimale concentratiebereik om de gewenste reacties van een soort uit te lokken. Semisolide platen met meerdere concentraties worden vaak gebruikt om de respons binnen een inductorconcentratiebereik te onderzoeken. Afzonderlijke halfvaste platen verhogen echter de variaties in de gemiddelde viscositeit en het vochtgehalte in elke plaat als gevolg van de niet-uniforme stollingstijd.

Dit artikel beschrijft een eenstapsmethode om tegelijkertijd de zwermmotiliteit van het oppervlak te testen op een enkele gradiëntplaat, waarbij de isometrisch gerangschikte testputten de gelijktijdige verwerving van multiconcentratieresponsen mogelijk maken. In het huidige werk werd de oppervlaktezwerm van Escherichia coli K12 en Pseudomonas aeruginosa PAO1 geëvalueerd als reactie op een concentratiegradiënt van inductoren zoals resveratrol en arabinose. Periodiek werden de zwermmorfologieën in beeld gebracht met behulp van een beeldvormingssysteem om het hele oppervlaktezwermproces vast te leggen.

De kwantitatieve meting van de zwermmorfologieën werd verkregen met behulp van ImageJ-software, die analyseerbare informatie van het zwermgebied verschafte. Dit artikel presenteert een eenvoudige gradiënt zwermplaatmethode die kwalitatieve en kwantitatieve informatie biedt over de effecten van de inductoren op oppervlaktezwermen, die kan worden uitgebreid om de effecten van andere inductoren op een breder scala van beweeglijke bacteriesoorten te bestuderen.

Introduction

Bacteriële zwermmotiliteit verwijst naar de collectieve migratie van bacteriële cellen over het oppervlak van een stof. Naast semisolide agarplaten die speciaal in het laboratorium zijn ^bereid1, wordt dit fenotype ook waargenomen op sommige zachte substraten zoals dierlijke ^weefsels2, gehydrateerde ^{oppervlakken3} en plantenwortels4. Hoewel een halfvast oppervlak wordt beschouwd als een van de fundamentele voorwaarden voor bacteriële zwermen, hebben sommige soorten ook een energierijk medium nodig om hun zwermmotiliteit te ^{ondersteunen5}. Flagellarotatie drijft zowel zwemmende als zwermende motiliteit-zwemmen beschrijft de eencellige motiliteit in een vloeibare omgeving, terwijl zwermen de synchrone beweging is van een microbiële populatie over semisolide oppervlakken.

Substraatviscositeit beïnvloedt bacteriële motiliteit; studies van pathogene microben, zoals Helicobacter pylori, hebben aangetoond dat de beweeglijkheid van de ziekteverwekker verandert afhankelijk van de viscositeit van de mucinelaag, die wordt beïnvloed door omgevingsverzuring in de menselijke ^gastheer6. Om deze omgevingen te repliceren, beperken eerdere studies met een agarconcentratie van meer dan 0,3% (w / v) de bacteriële zwemmotiliteit om een geleidelijke verschuiving naar oppervlaktezwermen te bewerkstelligen. Het gebruik van een agarconcentratie van meer dan 1% (w/v) voorkomt de zwermmotiliteit van veel ^soorten7. De koloniepatronen die op het oppervlak worden gevormd, zijn divers, waaronder featureless ^mat8, bull's ^eye9, dendrieten10 en ^vortex11.

Hoewel de relevantie van dergelijke patronen onduidelijk blijft, lijken die patronen afhankelijk te zijn van omgevings- en chemische ^signalen12. Omgevingssignalen hebben betrekking op verschillende aspecten, waaronder temperatuur, zoutgehalte, licht en pH, terwijl chemische signalen de aanwezigheid van microbiële quorumdetectiemoleculen, biochemische bijproducten en voedingsstoffen omvatten. Auto-induceer quorum sensing signaling molecules zoals AHL (N-hexanoyl-L homoserine lacton) kunnen oppervlaktezwermen beïnvloeden door de productie van oppervlakteactieve ^stof13,14 te reguleren. Resveratrol, een fytoalexineverbinding, zou bacteriële zwermmotiliteit kunnen ^beperken15.

In het huidige werk onderzoeken we het effect van gradiëntconcentraties van resveratrol op de wild-type Escherichia coli K12-stam en onderzoeken we arabinose-induceerbare zwermmotiliteit van gemanipuleerde E. coli K12-YdeH- en Pseudomonas aeruginosa PAO1-YdeH-soorten. De productie van het YdeH-enzym wordt geïnduceerd door arabinose via de araBAD-promotor, wat resulteert in cellulaire c-di-GMP-verstoring en de bacteriële zwermmotiliteit ^{beïnvloedt16,17}. Dit induceerbare zwermgedrag wordt bestudeerd met behulp van arabinose gradiënt zwermplaten met E. coli K12-YdeH en P. aeruginosa PAO1-YdeH stammen.

De gradiëntzwermplaten worden bereid door achtereenvolgens dubbellaags medium te stollen (figuur 1B). De onderste laag bestaat uit het medium dat met de inductor is toegevoegd en aan één kant van een gestut petrischaaltje wordt gegoten. Na de stolling van de onderste laag wordt de petrischaal teruggebracht naar een plat oppervlak, waar de bovenste laag met het medium zonder de inductor vanaf de andere kant van de plaat wordt toegevoegd. Nadat de zwermplaten volledig zijn gestold, worden isometrisch gerangschikte houderputten geproduceerd door gaten op de zwermplaten te boren volgens een vaste lay-out (figuur 1C) of door de putten te bedrukken met behulp van een 3D-geprint model van het plaatdeksel met haringen tijdens het medium uithardingsproces (aanvullende figuur S1). Een gelbeeldvormingssysteem wordt gebruikt om de zwermende morfologieën op verschillende tijdstippen vast te leggen (figuur 2). Analyse van oppervlaktezwermen met behulp van ImageJ-software (aanvullende figuur S2) levert kwantitatieve resultaten op van het oppervlaktezwermproces (figuur 3).

Daarom stellen we een eenvoudige methode voor om de oppervlaktezwermmotiliteit te testen binnen een concentratiebereik van inductoren. Deze methode kan worden gebruikt om meerdere concentratieresponsen van andere inductoren te testen door de inductor in het medium van de onderste laag te mengen en kan worden toegepast op andere beweeglijke soorten (bijv. Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Proteus mirabilis, Yersinia enterocolitica). Deze aanpak zou betrouwbare kwalitatieve en kwantitatieve resultaten kunnen opleveren voor het screenen van een enkele chemische inductor, en afzonderlijke platen kunnen worden gebruikt om meer chemische inductoren te evalueren.

Protocol

1. Bereiding van gradiënt zwermplaten

1. Bereiding van zwermmedium
   OPMERKING: Zie de discussiesectie voor een korte vergelijking van verschillende mediumviscositeiten; In dit protocol werd 0,7% (w/v) agarconcentratie van zwermmedium gebruikt.
   1. Bereid Lysogeny bouillon (LB) poeder met agar in twee conische kolven; elke kolf bevat 2 g trypton, 2 g natriumchloride, 1 g gistextract en 1,4 g agar. Voeg dubbel gedestilleerd water (_ddH2O) toe en roer de suspensie met een magnetische roerstaaf. Pas het uiteindelijke volume aan op 200 ml door extra _ddH2O toe te voegen.
   2. Autoclaaf de oplossing bij 121 °C gedurende 20 minuten. Gebruik een luchtdoorlatende dop of flesafdichtingsfolie met een ventilatieopening.
      OPMERKING: Agar zal oplossen wanneer het in de autoclaaf wordt verwarmd.
   3. Wanneer de temperatuur daalt tot 65 °C, mengt u de oplossing om homogeniteit te garanderen en brengt u het medium over naar een incubator of waterbad van 65 °C voor kortdurend gebruik.
2. Voorbereiding van bodemlaag zwerm medium
   OPMERKING: Het medium van de onderste laag is het mengsel van zwermmedium en inductorvoorraadoplossingen. De formulering van inductorgradiënt zwermplaten is weergegeven in tabel 1.
   1. Bereid een 100 mM resveratrol stockoplossing door 114,12 mg gelyofiliseerd resveratrolpoeder op te lossen in 5 ml dimethylsulfoxide (DMSO) en bewaar de oplossing bij -20 °C.
   2. Bereid een 20% (w / v) arabinose stockoplossing door 6 g arabinosepoeder op te lossen in 30 ml _ddH2O; wacht 10-15 minuten om de arabinose te laten oplossen; en bewaar de oplossing bij kamertemperatuur.
   3. Haal het medium uit de incubator van 65 °C en plaats het op kamertemperatuur; laat het zwermmedium afkoelen totdat de Erlenmeyer koel genoeg is om vast te houden (~50 °C). Plaats het zwermmedium niet gedurende lange perioden op kamertemperatuur, omdat dit de stolling van agar zal veroorzaken.
   4. Voeg het vereiste volume van de inductorvoorraadoplossing toe aan het zwermmedium bij 50 °C (tabel 1). Gebruik een pipet om de inductoroplossing af te geven in plaats van deze te gieten. Draai zachtjes om de inductor te mengen met het zwermmedium.
      OPMERKING: Deze stap is voor inductoren die niet kunnen worden geautoclaveerd. Pas op dat u geen bubbels in het medium introduceert.
3. Bereiding van dubbellaagse gradiënt zwermplaten
   OPMERKING: Het medium van de bovenste laag is LB-medium met 0,7% (w / v) agar.
   1. Etiketteer 13 vierkante petrischalen van 13 x 13 cm met inductornaam en spanningen en plaats de schalen over de rand van de deksels (figuur 1B).
   2. Voeg 40 ml warm medium op de bodemlaag (50 °C) toe met behulp van een pipet van 50 ml of een centrifugebuis van 50 ml.
      OPMERKING: Als alternatief is voor vierkante petrischalen van 13 x 13 cm 40 ml onderlaag en medium van de bovenste laag geschikt; voor vierkante petrischalen van 10 x 10 cm is een onderlaag van 25 ml en medium in de bovenste laag geschikt.
   3. Laat het medium van de onderste laag 1 uur onbedekt uitharden in een laminaire stromingskap. Verstoor vierkante petrischalen niet terwijl het medium stolt.
      OPMERKING: Tijdens het uitharden van de onderste laag moet zwermmedium zonder inductoren worden bewaard in een incubator of waterbad van 65 °C.
   4. Zodra de onderste laag volledig is gestold, verwijdert u de deksels en legt u de vierkante petrischalen in een laminaire stroomkap.
   5. Voeg 40 ml warm medium van de bovenste laag (50 °C) toe met een pipet van 50 ml of een centrifugebuis van 50 ml.
      OPMERKING: Het medium van de bovenste laag bevat geen inductoren.
   6. Laat de dubbellaagse platen op het tafelblad afgedekt en ongestoord gedurende 1 uur uitharden. Bewaar de bereide borden bij 4 °C gedurende maximaal 24 uur.
      OPMERKING: Langere uithardingstijden zouden het vochtgehalte verminderen en de zwermmotiliteit beperken.

2. Groei van E. coli K12 en P. aeruginosa PAO1

1. Bereid 500 ml LB-medium door 5 g trypton, 5 g NaCl en 2,5 g gistextract toe te voegen aan _ddH2O en vul de oplossing aan tot 500 ml. Autoclaaf de oplossing gedurende 20 minuten in vloeibare cyclus bij 121 °C en bewaar deze bij 4 °C.
2. Bereid 100 ml 1,5% (w/v) LB-agar medium door 1 g trypton, 1 g NaCl, 0,5 g gistextract en 1,5 g agar toe te voegen aan _ddH2O en vul de oplossing aan tot 100 ml. Autoclaaf de oplossing gedurende 20 minuten op vloeistofcyclus bij 121 °C. Breng het medium over in een waterbad van 50 °C om te voorkomen dat de agar stolt.
3. Wanneer de LB-agar medium kolf comfortabel vast te houden is, voeg dan 20 ml LB-agar medium toe aan een petrischaaltje (10 cm in diameter) met behulp van een pipet van 25 ml. Laat de plaat een nacht op kamertemperatuur staan en bewaar de LB-agarplaat bij 4 °C.
4. Inventariseer culturen die zijn opgeslagen bij -80 °C, streak E. coli K12, E. coli K12-YdeH, P. aeruginosa PAO1 en P. aeruginosa PAO1-YdeH-stammen op LB-agar Petrischalen met behulp van wegwerpinentingslussen. Incubeer de petrischaaltjes 's nachts omgekeerd bij 37 °C.
5. Kies enkele kolonies voor verschillende stammen uit de petrischalen, ent elke kolonie in 5 ml LB-medium en incubeer de cultuur bij 37 ° C in een laboratorium orbitale shaker ingesteld op 220 tpm.
6. Wanneer de kweekdichtheid _OD600nm ~ 1.0 bereikt, verwijdert u de cultuur uit de shaker en plaatst u deze op kamertemperatuur. Pas de cultuurdichtheid aan op _OD600nm = 1.0, zoals beschreven in stap 3.2.1.

3. Inenting en incubatie van gradiënt zwermplaten

1. Voorbereiding van inentingsputten
   OPMERKING: 3D-printdekselmodellen die in staat zijn om putten te genereren die door een standaardafstand worden gescheiden, kunnen worden gebruikt in plaats van de hieronder beschreven methode (aanvullende figuur S1).
   1. Markeer de putposities op A4-papier in figuur 1C. Stel drie testconcentraties in één vierkante petrischaal met twee of drie replicaties.
   2. Plaats het gemarkeerde A4-papier onder een gestolde verloopplaat. Duw de bredere zijde van een pipetpunt van 100 μL in het halfvaste mediumoppervlak op de gemarkeerde positie. Druk op de pipetpunt totdat deze de onderkant van het medium van de bovenste laag bereikt.
   3. Wanneer de punt de onderkant raakt, oefent u geen verticale kracht uit op de punt; draai de punt voorzichtig om de inhoud van de cilindrische put te isoleren.
   4. Beweeg de pipetpunten horizontaal over een zeer kleine afstand om luchtstroom in de smalle plaats mogelijk te maken. Druk met de wijsvinger op de punt om de gasstroom in de punt te blokkeren terwijl u de pipet vasthoudt met de duim en middelvinger.
   5. Trek de punt verticaal naar buiten, houd de put in de punt terwijl je hem eruit trekt.
      OPMERKING: Als de inhoud van de put wegglijdt, oefen dan iets meer druk uit met de wijsvinger om de punt volledig af te sluiten.
   6. Herhaal stap 3.1.2 tot en met 3.1.5 in elke gemarkeerde positie. Dek de zwermplaat af voor inenting.
2. Gradiëntplaatinenting en incubatie
   1. Pas de nachtelijke groeicultuurdichtheid aan op _OD600nm = 1,0.
   2. Pipetteer 80 μL van de nachtelijke groeicultuur in elke put. Mors de bacteriecultuur niet buiten de putten.
   3. Wikkel de platen in met afdichtfolie. Voor langdurige observatie (3-5 dagen), wikkel de platen met steriele laboratoriumrubbertape.
      OPMERKING: Rubbertape zal minder snel breken.
   4. Plaats een bekerglas gevuld met _ddH2O in de incubator om de luchtvochtigheid in de incubator te behouden. Incubeer de gradiënt zwermplaten bij 37 °C.
      OPMERKING: Incubeer de zwermplaten niet ondersteboven; hierdoor zal de bacteriekweek uit de putten lekken.
   5. Stel je de zwermplaat direct na inenting voor en noteer dit als het 0 uur-tijdspunt.

4. Beeldvorming bacteriële oppervlakte zwermen

1. Haal de zwermplaten elke 12 uur één voor één uit de couveuse, houd de plaat horizontaal vast en plaats ze in het gelbeeldvormingssysteem (zie de tabel met materialen).
   OPMERKING: Laat geen vingerafdrukken achter op het oppervlak van platen; houd de zijkant van de zwermplaat met schone handschoenen vast.
2. Selecteer de gelbeeldvormingsmodus ; stel de zwermplaat bloot aan wit licht; en pas de brandpuntsafstand aan om het duidelijkste zicht op zwermen te geven.
   OPMERKING: Gebruik dezelfde brandpuntsafstand voor alle platen in een bepaalde batch.
3. Verbeter de helderheid van de zwermen voor duidelijke waarneming door de belichtingstijd aan te passen tot 300 ms. Pas de drempel aan om interferentie van het achtergrondlicht tot een minimum te beperken.
   OPMERKING: De drempel wordt aangepast op de bedieningsinterface van het gelbeeldvormingssysteem. Verhoog de waarden aan de linkerkant om interferentie van achtergrondlicht te minimaliseren; verlaag de waarden aan de rechterkant om de helderheid van de zwermen te verbeteren. In dit protocol ligt de regio meestal tussen de 6.000 en 50.000.
4. Sla het afbeeldingsbestand op voor verdere analyse. Noteer de beeldtijd, het type inductor, de gradiëntoriëntatie en de spanningen in een .txt bestand.

5. Kwantificeer het zwermgebied met behulp van ImageJ-software

1. Importeer het afbeeldingsbestand dat is verkregen met behulp van het gelbeeldvormingssysteem.
2. Stel de schaalbalk in met behulp van ImageJ-software en pas deze toe op alle afbeeldingen.
   1. Maak een lijnsegment dat de lengte van het bord markeert door op het lijngereedschap te klikken.
   2. Klik op | analyseren Stel Schaal in om het venster Schaal instellen te openen.
   3. Typ de werkelijke lengte in Bekende afstand en Lengte-eenheid.
      OPMERKING: Omdat in dit werk vierkante petrischalen van 13 x 13 cm werden gebruikt, is de werkelijke lengte '130' en de lengte-eenheid 'mm'.
   4. Vink het vakje Algemeen aan.
   5. Voeg een schaalbalk in door te klikken op | analyseren Gereedschap | Schaalbalk, typ Breedte in mm, Hoogte in pixels, Tekengrootte en selecteer Kleur, Achtergrond en Locatie in het vervolgkeuzemenu. U kunt ook Vetgedrukte tekst, Tekst verbergen, Schreeflettertype en Overlay kiezen door de selectievakjes aan te vinken.
      OPMERKING: De keuze van deze parameters wordt bepaald door gebruikers en de eigenschappen van de afbeeldingen. In dit protocol werd Breedte in mm ingesteld op 25, Hoogte in pixels op 20, Lettergrootte op 80 en de schaalbalk werd in de rechterbenedenhoek geplaatst door Locatie | Rechtsonder. Andere parameters kunnen door de gebruiker worden gekozen.
3. Klik op | Schaduwen om de scherpte van het beeld te verbeteren, met name de grenzen (aanvullende figuur S2A). Klik op | Verwerken Batch om afbeeldingen te verwerken.
   OPMERKING: Het doel van deze stap is om een nauwkeurigere grensafbakening te bieden.
   1. Verwerk een afbeelding als referentie door te klikken op Proces | Schaduwen | Zuid.
   2. Klik op | Batch | Macro om het venster Batchproces te openen. Zoek naar de volgende opdrachten die in het venster worden weergegeven:
      run("Zuid");
      run("Opslaan");
      sluiten();
   3. Typ het mapadres van de oorspronkelijke afbeeldingen en het adres van het uitvoerbestand door te klikken op Verwerken in het venster Batchproces .
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om afbeeldingen met schaduwen naar een andere map te exporteren en een kopie van de originele afbeeldingen te behouden.
4. Gebruik het gereedschap Toverstaf (overtrekken) om zwermen afzonderlijk te selecteren en de tolerantie aan te passen (dubbelklik op het gereedschap Staaf (overtrekken) totdat de gegenereerde lijn correct op de zwermgrens past (aanvullende afbeelding S2B).
   OPMERKING: Klik eerst op Wand (overtrek) gereedschap en selecteer een zwerm op één afbeelding. Als de grenzen niet correct zijn weergegeven, dubbelklikt u op het gereedschap Toverstaf (overtrekken) om de vensters van het gereedschap Staaf te openen, waar de tolerantie kan worden aangepast.
5. Klik op | analyseren Meting om de oppervlaktewaarde te exporteren.
6. Herhaal stap 5.1.1-5.1.5 totdat alle zwermen zijn gemeten, sla de resultaten op in een .csv bestand voor verdere analyse.

Results

De workflow bestaande uit de voorbereiding van gradiëntzwermplaten, inenting en incubatie wordt weergegeven in figuur 1B. Om gradiëntgezwommen platen te genereren, wordt het medium van de onderste laag in gestutte schotels gegoten op ~ 4,3 ° van het horizontale vlak (aanvullende figuur S3), gevolgd door het gieten van het medium van de bovenste laag nadat de onderste laag volledig is gestold. De samenstelling van het dubbellaagse medium is weergegeven in tabel 1

Discussion

Onderzoek naar bacteriële zwermmotiliteit op semisolide gradiëntplaten kan een uitdagende taak zijn18,19,20, omdat het meerdere factoren omvat, zoals substraatviscositeit, vochtigheid en mediumcomponenten. Onder deze factoren speelt de agarconcentratie een beslissende rol bij het bepalen van microbiële terugkeer naar zwemmende of zwermmotiliteit. Naarmate de agarconcentratie toeneemt van 0,3% (w/v) naar 1% (w/v), zal de bacterië...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agar	Sigma-Aldrich	V900500	500 g
Ampicillin	Solarbio	A8180	25 g, ≥ 85% (GC)
Centrifuge tube	Corning	430790	15 mL
Cryogenic vial	Corning	430488	2 mL
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Aladdin	D103272	AR, > 99% (GC)
L(+)-Arabinose	Aladdin	A106195	98% (GC), 500 g
Petri dishes	Bkman	B-SLPYM90-15	Kunststof petrischalen,rond,90 mm x 15 mm
Resveratrol	Aladdin	R107315	99% (GC), 25 g
Sodium chloride	Macklin	S805275	AR, 99,5% (GC), 500 g
Vierkante petrischalen	Bkman	B-SLPYM130F	Kunststof petrischalen, vierkant, 13 mm x 13 mm
Tryptone	Thermo Scientific Oxoid	LP0042	500 g
Gistextract	Thermo Scientific Oxoid	LP0021	500 g
Uitrustingen
Biochemische incubator	Blue pard	LRH-70
Tanon 5200multi beeldvormingssysteem	Tanon	5200CE
Thermostaat waterbad	Jinghong	DK-S28