High-throughput RNA-interferentie (RNAi) screening met behulp van een pool van lentivirale shRNA's kan een hulpmiddel zijn om therapeutisch relevante synthetische dodelijke doelwitten bij maligniteiten te detecteren. We bieden een gepoolde shRNA-screeningsbenadering om de epigenetische effectoren bij acute myeloïde leukemie (AML) te onderzoeken.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gepoolde shRNA-bibliotheekscreening om factoren te identificeren die een fenotype van medicijnresistentie moduleren
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Het begrijpen van klinisch relevante drivermechanismen van verworven chemoresistentie is cruciaal voor het ophelderen van manieren om resistentie te omzeilen en de overleving te verbeteren bij patiënten met acute myeloïde leukemie (AML). Een klein deel van de leukemische cellen die chemotherapie overleven, hebben een geschikte epigenetische toestand om chemotherapeutische belediging te tolereren. Verdere blootstelling aan chemotherapie stelt deze medicijn persistercellen in staat om een vaste epigenetische toestand te bereiken, wat leidt tot veranderde genexpressie, wat resulteert in de proliferatie van deze medicijnresistente populaties en uiteindelijk terugval of refractaire ziekte. Daarom is het identificeren van epigenetische modulaties die de overleving van medicijnresistente leukemische cellen noodzakelijk maken, van cruciaal belang. We beschrijven een protocol om epigenetische modulatoren te identificeren die resistentie tegen het nucleoside analoge cytarabine (AraC) bemiddelen met behulp van gepoolde shRNA-bibliotheekscreening in een verworven cytarabine-resistente AML-cellijn. De bibliotheek bestaat uit 5.485 shRNA-constructies gericht op 407 menselijke epigenetische factoren, die epigenetische factorscreening met hoge doorvoer mogelijk maken.
Inleiding
Therapeutische opties bij acute myeloïde leukemie (AML) zijn de afgelopen vijf decennia onveranderd gebleven, met cytarabine (AraC) en anthracyclines als hoeksteen voor de behandeling van de ziekte. Een van de uitdagingen voor het succes van AML-therapie is de resistentie van leukemische stamcellen tegen chemotherapie, wat leidt tot terugval van de ziekte 1,2. Epigenetische regulatie speelt een vitale rol in de pathogenese van kanker en resistentie tegen geneesmiddelen, en verschillende epigenetische factoren zijn naar voren gekomen als veelbelovende therapeutische doelen 3,4,5. Epigenetische regulerende mechanismen beïnvloeden proliferatie en overleving bij continue blootstelling aan chemotherapeutische geneesmiddelen. Studies in niet-hematologische maligniteiten hebben gemeld dat een klein deel van de cellen die het geneesmiddeleffect overwinnen verschillende epigenetische modificaties ondergaan, wat resulteert in de overleving van die cellen 6,7. De rol van epigenetische factoren bij het bemiddelen van verworven resistentie tegen cytarabine in AML is echter niet onderzocht.
High-throughput screening is een benadering van geneesmiddelenontdekking die in de loop van de tijd wereldwijd aan belang heeft gewonnen en in verschillende aspecten een standaardmethode is geworden om potentiële doelen in cellulaire mechanismen, voor routeprofilering en op moleculair niveaute identificeren 8,9. Het concept van synthetische letaliteit omvat de interactie tussen twee genen waarbij de verstoring van een van beide genen alleen levensvatbaar is, maar van beide genen tegelijkertijd resulteert in het verlies van levensvatbaarheid10. Het benutten van synthetische letaliteit bij de behandeling van kanker kan helpen bij het identificeren en mechanistisch karakteriseren van robuuste synthetische dodelijke genetische interacties11. We hebben een combinatorische benadering van high-throughput shRNA-screening met synthetische letaliteit aangenomen om de epigenetische factoren te identificeren die verantwoordelijk zijn voor verworven cytarabineresistentie in AML.
Van acute leukemieën gedreven door chromosomale translocatie van het gemengde-afstammingsleukemiegen (MLL of KMT2A) is bekend dat ze geassocieerd zijn met een slechte overleving bij patiënten. De resulterende chimere producten van MLL-genherschikkingen, d.w.z. MLL-fusie-eiwitten (MLL-FPs), kunnen hematopoëtische stam- / voorlopercellen (HSPC's) transformeren in leukemische blasten met de betrokkenheid van meerdere epigenetische factoren. Deze epigenetische regulatoren vormen een ingewikkeld netwerk dat het onderhoud van het leukemieprogramma dicteert en daarom potentiële therapeutische doelen kan vormen. In deze context gebruikten we de MV4-11 cellijn (met het MLL-fusiegen MLL-AF4 met de FLT3-ITD-mutatie; aangeduid als MV4-11 P) om de verworven cytarabine-resistente cellijn te ontwikkelen, aangeduid als MV4-11 AraC R. De cellijn werd blootgesteld aan toenemende doses cytarabine met intermitterend herstel van de medicamenteuze behandeling, bekend als een drugsvakantie. De half-maximale remmende concentratie (IC50) werd beoordeeld met behulp van een in vitro cytotoxiciteitstest.
We gebruikten de gepoolde epigenetische shRNA-bibliotheek (zie Tabel met materialen) aangedreven door de hEF1a-promotor met een pZIP lentiviral backbone. Deze bibliotheek bestaat uit shRNA's die zich richten op 407 epigenetische factoren. Elke factor heeft 5-24 shRNA's, met een totaal van 5.485 shRNA's, waaronder vijf niet-gerichte controle-shRNA's. De gemodificeerde "UltrmiR" miR-30 scaffold is geoptimaliseerd voor efficiënte primaire shRNA biogenese en expressie12,13.
De contouren van dit experiment zijn geïllustreerd in figuur 1A. Het huidige protocol richt zich op RNAi-screening met behulp van de epigenetische factor shRNA-bibliotheek in de MV4-11 AraC R-cellijn (figuur 1B), een suspensiecellijn. Dit protocol kan worden gebruikt om elke gerichte bibliotheek in elke medicijnresistente cellijn naar keuze te screenen. Opgemerkt moet worden dat het transductieprotocol anders zal zijn voor adherente cellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Volg de richtlijnen van het Institutional Biosafety Committee (IBSC) en gebruik de juiste faciliteit om lentivirus (BSL-2) te behandelen. Het personeel moet naar behoren worden opgeleid in de behandeling en verwijdering van lentivirus. Dit protocol volgt de bioveiligheidsrichtlijnen van Christian Medical College, Vellore.
1. Selectie van de krachtigste promotor om persistente en langdurige expressie van de shRNA's te verkrijgen
OPMERKING: Het is essentieel om een transductie-experiment uit te voeren met behulp van lentivirale vectoren met verschillende promotors die fluorescentie-eiwitten tot expressie brengen om de promotor te identificeren die een stabiele en langdurige expressie van shRNA's in de cellijn biedt die voor het experiment is geselecteerd. De meest gebruikte promotors voor dit doel zijn hEF1α (humane rekfactor 1α), hCMV (humaan cytomegalovirus) en SSFV (spleen focus-forming virus) promotors die groene fluorescentie-eiwit (GFP) tot expressie brengen (Figuur 2A).
- Voer het aantal cellen uit met de methode trypan blue exclusion. Suspensie van de MV4-11 AraC R-cellen in 10% RPMI-medium (RPMI met 10% FBS aangevuld met 100 U/ml penicilline en 100 U/ml streptomycine) met 8 μg/ml polybreen. Zaad 1 x 106 cellen in 1,5 ml medium/put van een zes-put plaat in drievoud.
- Voeg verschillende volumes geconcentreerde lentivirussen (bijvoorbeeld 10 μL, 20 μL en 40 μL, afhankelijk van de titer van de lentivirussen) toe aan elke put. Draai de plaat voorzichtig om de inhoud te mengen.
- Voer spinfectie uit door centrifugering bij 920 x g bij 37 °C gedurende 90 minuten.
- Incubeer de platen onmiddellijk in een CO2-incubator (5% CO2 bij 37 °C).
- Observeer de GFP-expressie na 48 uur onder een fluorescentiemicroscoop om een succesvolle transductie te garanderen.
- Kwantificeer de GFP-expressie door flowcytometrie na 72 uur om de transductie-efficiëntie te evalueren.
- Kweek de cellen gedurende in totaal 2 weken en controleer de GFP-expressie periodiek door middel van flowcytometrie. De vermindering van de GFP-expressie gemeten door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit en het percentage GFP+ cellen duiden op promotoruitschakeling.
- Sorteer de GFP+ cellen op de 10e dag en kweek de cellen gedurende 1 week na sortering. Controleer de GFP-expressie regelmatig tijdens de cultuur.
- Gebruik de niet-vertaalde cellen om de poort in te stellen. Een populatie voorbij de schaal van 1 x10 1 naar rechts op de x-as wordt beschouwd als een positieve populatie voor GFP.
- Kies de promotor die een aanhoudende expressie van GFP vertoont in de langdurige kweek van de cellen.
2. Voorbereiding van gepoolde lentiviral humane epigenetische factor shRNA bibliotheek
- Kweek 293T-cellen (bij een laag passagegetal met een goede proliferatiesnelheid) in drie 10 cm celkweekschalen met 8 ml 10% DMEM-medium (DMEM met 10% FBS met 100 E/ml penicilline en 100 U/ml streptomycine) in elke plaat.
- Zodra de cellen 60% confluentie bereiken, vervangt u het medium door een volledig medium.
- Bereid het transfectiemengsel (zoals beschreven in tabel 1) dat serumvrij medium, lentivirale verpakking (psPAX2) en envelopplasmide (pMD2.G), gepoolde bibliotheekplasmiden en ten slotte het transfectiereagens bevat.
- Tik op het mengsel om het goed te mengen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Voeg het transfectiemengsel toe aan de 293T-cellen en meng voorzichtig door de platen te draaien. Incubeer de platen in een CO2 incubator (5% CO2 bij 37 °C). Vervang het medium na 24 uur.
- Controleer na 48 uur op GFP-expressie onder een fluorescentiemicroscoop om een hoge transfectie-efficiëntie in de 293T-cellen te garanderen.
- Verzamel de virussupernatanten na 48 h, 60 h en 72 h en bewaar ze bij 4 °C. Voeg vers medium (8 ml) toe op elk tijdstip na het verzamelen van het virus.
- Pool de virussupernatanten. Het totale volume van de gepoolde virussen zal zijn: ~ 8 ml / plaat x 3 collecties = ~ 24 ml / plaat; ~24 ml/plaat x 3 platen = ~72 ml uit 3 platen.
- Filter de gepoolde virussen met het filter van 0,4 μm.
- Voor het verkrijgen van een hoge titer van virussen, concentreer de gepoolde virussen door ultracentrifugatie. Breng het gefilterde virussupernatant over in twee 70 Ti-buizen (32 ml/buis) en centrifugeer gedurende 2 uur bij 18.000x g met langzame versnelling en vertraging. Gebruik een rotor en centrifuge voorgekoeld tot 4 °C.
- Haal de buisjes voorzichtig uit de centrifuge en verwijder het supernatant volledig.
- Gebruik een micropipette om de pellet voorzichtig te resuspenderen in 400 μL DMEM (zonder FBS en antibiotica). Incubeer 1 uur op het ijs en meng de pellets uit beide buizen.
- Vul de virussen aan en bevries bij −80 °C.
OPMERKING: De buizen en virussen moeten tijdens stap 2.10.-2.13 op ijs worden gehouden. Vermijd schuimen terwijl u het virus resuspendeert met het gewone medium. Het medium moet op 4 °C worden gehouden. - Bereken de concentratie (x) van het virus zoals hieronder:
Totaal volume vóór concentratie = 72 ml (72.000 μl)
Volume na concentratie = 400 μL
De concentratie = 72.000/400= 180x
3. Schatting van de transductie-efficiëntie van lentivirussen
- Transduceer 293T-cellen met het geconcentreerde virus in verschillende volumes (2 μL, 4 μL, 8 μL) om de succesvolle bereiding van lentivirussen te bevestigen.
OPMERKING: Als geconcentreerde virussen een hoge transductie-efficiëntie vertonen (>50%) in kleine volumes (1-2 μL), is het raadzaam om het geconcentreerde virus in de gewenste hoeveelheden (100x tot 75x) te verdunnen. - Verdun het geconcentreerde virus tot 100x met DMEM (zonder FBS en antibiotica) om titratie-experimenten uit te voeren in de MV4-11 AraC R-cellijn.
- Zaad 1 x 106 cellen (MV4-11 AraC R cellijn in 1,5 ml 10% RPMI medium met 8 μg/ml polybreen) in één put van een zes-well plaat. Bereid vier putten voor op transduceren met verschillende volumes virussen.
- Voeg vier verschillende volumes (bijvoorbeeld 1 μL, 1,5 μL, 2 μL en 2,5 μL) van 100x virussen toe.
- Voer spinfectie uit door centrifugering van de plaat bij 920 x g gedurende 90 minuten bij 37 °C.
- Meet na 72 uur het percentage GFP+-cellen door middel van flowcytometrie.
- Bepaal het volume van de virussen om 30% transductie-efficiëntie te verkrijgen. Deze lage transductie-efficiëntie moet zorgen voor één shRNA-integratie per cel.
4. Transductie van gepoolde epigenetische shRNA-bibliotheek in de medicijnresistente cellijn
- Handhaaf de doelcellijn MV4-11 AraC R op een dichtheid van 0,5 x 106 cellen /ml. Zorg ervoor dat de cellen zich in de exponentiële groeifase in de cultuur bevinden.
- Bereken het aantal cellen dat voor het experiment moet worden genomen, zoals hieronder op basis van het aantal virale integranten.
Aantal cellen dat nodig is voor transductie = 5.485 (aantal shRNA's) × 500 (vouw shRNA-representatie) / 0,25 (MOI) = 10.982.000 ~ 11 x 106 cellen - Resuspend 1,1 x 107 cellen in 16 ml van 10% RPMI medium.
- Voeg polybreen (8 μg/ml) toe en meng goed. Voeg vervolgens het vereiste volume virussen toe om 30% transductie-efficiëntie te verkrijgen zoals berekend in de vorige sectie.
- Zaai alle cellen op een zes-well plaat met een dichtheid van 1 x 106 cellen / 1,5 ml van 10% RPMI medium per put.
- Centrifugeer de plaat gedurende 90 min bij 920 x g bij 37 °C.
- Incubeer de plaat een nacht in een CO2-incubator (5% CO2 bij 37 °C).
- Vervang na 24 uur het medium en breng de getransduceerde cellen over in een T-75 kolf.
- Controleer na 48 uur de GFP onder een fluorescentiemicroscoop om een succesvolle transductie te garanderen.
- Kwantificeer na 72 uur het percentage GFP+-cellen door middel van flowcytometrie.
5. Verrijking van GFP-positieve cellen
OPMERKING: Breid de getransduceerde cellen uit door ze te kweken met een dichtheid van 0,5 x 106 cellen / ml gedurende 5-7 dagen. Deze cellen zijn een gemengde populatie van getransduceerde en niet-getransduceerde, geselecteerd op basis van GFP door sortering, zoals vermeld in de volgende stap.
- Voer stroomsortering uit van GFP+ getransduceerde cellen met de stroomsorteerinstellingen ingesteld als hoge zuiverheid en lage opbrengst. Gebruik de niet-vertaalde cellen om de poort in te stellen. Een populatie van meer dan 1 x 102 naar rechts wordt beschouwd als een positieve populatie.
- Verzamel de gesorteerde cellen in 5% RPMI (RPMI met 5% FBS aangevuld met 100 U/ml penicilline en 100 U/ml streptomycine).
- Kweek de gesorteerde cellen in een 10% RPMI-medium.
- Voer na 72 uur de schatting na het sorteren uit van het percentage GFP+-cellen om >95% sorteerefficiëntie te garanderen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u ~ 3-5 x 106 GFP-positieve cellen verkrijgt na het sorteren om 450x tot ~ 500x representatie van de shRNA-bibliotheek te verkrijgen.
6. Dropout screening om epigenetische factoren te identificeren die resistentie tegen geneesmiddelen bemiddelen
- Kweek de shRNA-bibliotheek getransduceerde cellen in 10% RPMI gedurende maximaal 5 dagen. Cryopreserveer de getransduceerde cellen voor toekomstige experimenten, indien nodig, vóór de medicamenteuze behandeling.
- Centrifugeer 1 x 107 cellen in duplicaten bij 280 x g gedurende 5 min bij 25 °C. Gooi het supernatant weg en bewaar de pellets bij −80 °C. Deze monsters zullen dienen als de referentie voor de epigenetische shRNA-bibliotheek.
- Kweek de resterende getransduceerde cellen als duplicaten (R1 en R2), elk onderhouden op een celtelling die een 500x weergave van de bibliotheek biedt.
- Behandel een van de duplicaten met het medicijn (10 μM cytarabine) (R2) en de andere zonder de medicamenteuze behandeling (R1).
- Vervang het medium voor de kolven met en zonder het medicijn om de 72 uur. Herhaal de mediumverandering 3x voor een cumulatieve blootstelling aan geneesmiddelen van 9 dagen.
- Controleer na 9 dagen medicamenteuze behandeling de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van de trypan blue exclusion-methode.
- Centrifugeer de resterende cellen bij 280 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspend de cellen in steriel PBS en was de cellen. Centrifugeer bij 280 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatant weg en bewaar de pellets bij −80 °C voor DNA-extractie.
7. Versterking van de geïntegreerde shRNA's door PCR
- Extract DNA uit de getransduceerde uitgangscellen (T) (stap 6.2.) en de cellen behandeld met het geneesmiddel (R2) en onbehandeld met het geneesmiddel (R1).
- Controleer de concentratie van het monster met behulp van een fluorometer.
- Bereken de hoeveelheid DNA die nodig is voor PCR zoals hieronder:
5.485 (nr. van shRNA's) × 500 (shRNA-representatie) × 1 x 6,6−12 (g/diploïde genoom) = 15 μg DNA - Onderwerp de monsters aan de eerste ronde PCR.
OPMERKING: Het PCR-reactiemengsel is weergegeven in tabel 2 met de omstandigheden van de thermische cycler. Nadere bijzonderheden over de primers zijn opgenomen in aanvullende tabel 1. - Stel meerdere reacties in met 850 ng DNA per buis (voor een totaal van 43 reacties).
OPMERKING: De eerste ronde van PCR versterkt de flankerende gebieden van het shRNA, wat resulteert in een amplicongrootte van 397 bp. - Bundel de PCR-producten en zuiver de PCR-producten met behulp van 3-4 kolommen van een standaard gel / PCR-zuiveringskit.
OPMERKING: Details zijn opgenomen in tabel 3. - Eluteer het product in 50 μL buffer van elke kolom en bundel de elueren.
- Kwantificeer het DNA en bewaar het bij −20 °C.
OPMERKING: De reagentia zijn in tabel 4 in tabel aangegeven met de omstandigheden van de thermische cycler. De tweede ronde PCR maakt gebruik van de primers met de INDEX-sequentie die nodig is voor multiplexing in NGS in een singleflow-cel. Elk voorbeeld moet dus worden getagd met een andere index. Primersequenties zijn opgenomen in aanvullende tabel 1. - Stel vier reacties in met 500 ng van het primaire PCR-product in een totaal reactievolume van 50 μL voor elk monster en de negatieve controle.
- Laad het hele product voor elektroforese met 2% TBE agarose gel en bevestig de bandgrootte met behulp van een moleculaire ladder van 1 kb. De grootte van het amplicon is 399 bp.
- Visualiseer de PCR-producten op het geldocumentatiesysteem.
- Snijd de specifieke band weg en zuiver met behulp van een gelzuiveringskit.
OPMERKING: Berekeningen voor zuivering met de kit zijn opgenomen in tabel 3. - Elulaat in een eindvolume van 30 μL elutiebuffer. De geschatte concentratie van elk eluent zal ongeveer 80-90 ng/μL zijn met een totaal volume van 30 μL.
8. Next-generation sequencing en data-analyse
- Volg het gelgezuiverde product vanaf stap 7.13. op een sequencer van de volgende generatie (bijv. Illumina) om de afgelezen telling voor de uitgeputte shRNA's te verkrijgen.
- Trim de adapterreeksen van de gegenereerde FastQ-reads met behulp van de Fastx-toolkit (versie 0.7).
- Lijn de gefilterde reads uit op referentiesequenties met behulp van een Bowtie-aligner met de parameter van het toestaan van twee mismatches. Zorg ervoor dat de leeslengte na het trimmen van de adapter ongeveer 21 bp is.
- Laad de bestanden met behulp van het programma Samtools (versie 1.9). Gebruik de optie Flagstat en bereken het uitlijningsoverzicht.
- Laad de bijgesneden fastQ-bestanden in CRISPRCloud2 (CC2) -software (https://crispr.nrihub.org/) samen met de referentie shRNA-sequenties in de vorm van FASTA-bestanden en voer de analyse uit volgens de instructies.
- Klik op de link Analyse starten in de CC2.
- Selecteer het schermtype als Overlevings- en uitvalschermen. Stel het aantal groepen in en typ de naam voor elke groep.
- Upload de referentiebibliotheek in FASTA-bestandsindeling. De geüploade gegevens worden verwerkt. Klik op de uitvoer-URL om de resultaten te verkrijgen.
OPMERKING: Deze software maakt gebruik van een bèta-binomiaal model met een gemodificeerde Student's t-test om verschillen in sgRNA / shRNA-niveaus te meten, gevolgd door Fisher's gecombineerde waarschijnlijkheidstest om de significantie op genniveau te schatten. Het berekent de geschatte totale log 2-voudige veranderingen (Log2Fc) van shRNA's voor de epigenetische factoren tussen de behandelde (verrijkte / uitgeputte) en de onbehandelde monsters (baseline) met "p-waarden" en "FDR-waarden."
- Zorg ervoor dat de FDR-waarde "Negatief" is voor een uitvalscherm en "Positief" voor een overlevingsscherm.
OPMERKING: CC2 is een analyseplatform voor het tellen van de reads en het berekenen van de vouwrepresentatie (verrijking of uitputting) van shRNA's tussen monsters. - Identificeer de aanzienlijk verrijkte en uitgeputte shRNA's (FDR <0,05) uit de CC2-resultaten.
OPMERKING: Er zijn 5-24 shRNA's tegen elke factor. Controleer de FDR-waarden voor elk van de shRNA's; overweeg de FDR, die <0,01 is, en neem een gemiddelde voor de geselecteerde shRNA's. Denk aan de top 40 hits. Plot de grafiek voor de geselecteerde factoren op basis van Log2Fc- of FDR-negatieve waarden. Zorg ervoor dat de niet-gerichte shRNA's ook significante FDR-waarden hebben om de authenticiteit van de gegevens te garanderen, aangezien ze dienen als controle-shRNA's.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De algemene screeningsworkflow is weergegeven in figuur 1A. In vitro cytotoxiciteit van de MV4-11 AraC R (48 h) onthulde dat de IC50 tot cytarabine in de MV4-11 AraC R hoger was dan de MV4-11 P (figuur 1B). Deze cellijn werd in de studie gebruikt als model voor het screenen van de epigenetische factoren die verantwoordelijk zijn voor cytarabineresistentie.
Figuur 2A toont de geli...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
RNA-interferentie (RNAi) wordt veel gebruikt voor functionele genomicastudies, waaronder siRNA- en shRNA-screening. Het voordeel van shRNA is dat ze kunnen worden opgenomen in plasmidevectoren en kunnen worden geïntegreerd in genomisch DNA, wat resulteert in stabiele expressie en dus langdurigere knockdown van het doelmRNA. Een gepoolde shRNA-bibliotheekscreening is robuust en kosteneffectief in vergelijking met de conventionele arrayed screens (siRNA). Het identificeren van de essentialiteit van een specifieke klasse ei...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten en niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie wordt gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie van het Department of Biotechnology BT / PR8742 / AGR / 36/773/2013 aan SRV; en Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 en Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 to P.B. RVS en P.B. worden ondersteund door respectievelijk Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 en IA/S/15/1/501842. S.D. wordt ondersteund door de CSIR-UGC fellowship, en S.I. wordt ondersteund door een ICMR senior research fellowship. We bedanken Abhirup Bagchi, Sandya Rani en het personeel van de CSCR Flow Cytometry Core Facility voor hun hulp. We bedanken ook MedGenome Inc. voor het helpen met de high-throughput sequencing en data-analyse.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
Referenties
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441(2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P. Synthetic lethality and cancer. Nature Reviews Genetics. 18 (10), 613-623 (2017).
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
