Topische toepassing Bioassay om insecticide toxiciteit voor muggen en fruitvliegen te kwantificeren

Samenvatting

We beschrijven de methodologie en het belang van de actuele toepassing bioassay om de gevoeligheid voor insecticiden bij muggen en fruitvliegen te meten. De gepresenteerde test is high-throughput, maakt gebruik van insectenmassa - waardoor een massa-gerelativeerde letale dosis in plaats van concentratie kan worden berekend - en heeft waarschijnlijk een lagere variabiliteit dan andere vergelijkbare methoden.

Samenvatting

Het voortdurende gebruik van insecticiden voor de volksgezondheid en de landbouw heeft geleid tot wijdverspreide resistentie tegen insecticiden en het belemmeren van bestrijdingsmethoden. Insecticideresistentiebewaking van muggenpopulaties wordt meestal gedaan via Centers for Disease Control and Prevention (CDC) flesbioassays of buistests van de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO). Deze methoden kunnen echter resulteren in een hoge mate van variabiliteit in sterftegegevens als gevolg van variabel insecticidecontact met het insect, het relatief kleine aantal geteste organismen, uitgebreide variatie in massa tussen populaties en voortdurend veranderende omgevingsomstandigheden, wat leidt tot variabele uitkomsten. Dit artikel presenteert de actuele toepassing bioassay, aangepast als een fenotypische bioassay met hoge doorvoer voor zowel muggen als fruitvliegen, om grote aantallen insecten te testen langs een reeks insecticideconcentraties.

Deze test 1) zorgt voor een consistente behandeling en insecticide contact met elk organisme, 2) produceert zeer specifieke dosis-responscurven die rekening houden met verschillen in gemiddelde massa tussen stammen en geslachten (wat met name belangrijk is voor in het veld verzamelde organismen), en 3) maakt de berekening van statistisch rigoureuze mediane letale doses mogelijk (LD₅₀ ), die nodig zijn voor vergelijkingen van resistentieratio's - een alternatieve surveillancebenadering van diagnostische dosissterfte, die ook wordt gebruikt voor larvicideresistentiesurveillance. Deze test zal een aanvullend hulpmiddel zijn voor het nauwkeurig fenotyperen van muggenpopulaties en is, zoals geïllustreerd met behulp van fruitvliegen, gemakkelijk aan te passen voor gebruik met andere insecten. We beweren dat deze test zal helpen de kloof tussen genotypische en fenotypische insecticideresistentie bij meerdere insectensoorten te vullen.

Inleiding

Muggen zijn verantwoordelijk voor meer dan 700.000 sterfgevallen per jaar als gevolg van de ziekten die ze op mensen overbrengen, met meer dan de helft van die sterfgevallen als gevolg van malaria alleen^{al 1}. De belangrijkste preventieve methode tegen overdracht van malaria en andere door vectoren overgedragen ziekten is het gebruik van insecticiden, vaak in de vorm van langdurige insecticidenetten of binnenshuis-restsproeien². Insecticideresistentie is echter wijdverspreid onder muggen en andere insectenvectoren, evenals landbouwongedierte ^3,4. Om de weerstand effectief te beheersen, is bewaking van cruciaal belang⁵. Hiervoor zijn zeer nauwkeurige detectiemethoden met hoge doorvoerweerstand nodig. Momenteel zijn de meest wijdverspreide insecticideresistentiebewakingstools voor muggen de WHO-buistest⁶ en de CDC-flesbioassay⁷. Voor fruitvliegen is de residuele contacttoepassingsmethode (vergelijkbaar met de CDC-flesbioassay) een veelgebruikte insecticide bioassay ^8,9,10. De variabiliteit in gegevens van deze methoden is echter meestal hoog, met metingen van dezelfde laboratoriummumstam variërend van ~ 20-70% mortaliteit in CDC-flestests en 0-50% in WHO-buistests bij blootstelling aan subletale doseringen¹¹. Een dergelijke variatie is verrassend omdat de beperkte genetische variatie in de meeste laboratoriumstammen naar verwachting zal leiden tot een beperkte variatie in de gevoeligheid voor insecticiden in de populatie. Niettemin is er nog steeds een hoge mate van variatie waargenomen in de bioassay-resultaten.

Potentiële bronnen van deze variatie kunnen het gevolg zijn van heterogene blootstelling aan insecticiden tussen monsters binnen de bioassay als gevolg van indirecte blootstelling aan insecticiden via het oppervlak, heterogene milieueffecten, normale biologische variatie tussen individuen van hetzelfde genotype en variatie in de massa van specimens van dezelfde populatie¹² . Een zelden gebruikte methode met een hogere repliceerbaarheid is de topische toepassing bioassay. In deze test wordt het insecticide rechtstreeks toegepast op elk insect^13,14, waardoor de factor van heterogene blootstelling van verschillende monsters binnen dezelfde test wordt verwijderd. Vanwege de trage doorvoer van deze methode wordt deze echter niet routinematig gebruikt als een insecticide gevoeligheidsbewakingsinstrument voor muggenpopulaties. Dit artikel presenteert een aangepast protocol voor de topische toepassingsbioassay dat blootstellingen met een hogere doorvoer mogelijk maakt en tegelijkertijd corrigeert voor variatie in insectenmassa, een parameter die correleert met veranderingen in de gevoeligheid voor insecticiden¹². Een vermindering van lawaai en massa-geassocieerde variatie in sterftegegevens door variabele blootstelling aan insecticiden zou een nauwkeurigere technische weerstandsbewaking mogelijk maken^11,15. Dergelijke gegevens kunnen worden gebruikt om fenotypische resistentie nauwkeuriger te associëren met genetische markers, fitnessparameters en / of vectorcompetentie. Daarnaast laten we zien hoe deze test gemakkelijk kan worden aangepast aan andere insectensoorten door gebruik te maken van de actuele toepassing bioassay op fruitvliegen, een kleinere insectensoort.

De belangrijkste beperking van de bovengenoemde restcontacttoepassingen is dat de blootstelling aan insecticiden binnen dezelfde test van monster tot monster kan variëren. In het geval van CDC-flesbioassays en de contactmethode kan de blootstelling aan insecticiden variëren tussen replicaties van dezelfde test. De insecten worden blootgesteld aan insecticide dat ofwel wordt gedistribueerd aan de binnenkant van een glazen fles (CDC-fles bioassay en contactmethode) of op geïmpregneerd papier (WHO-buistest). De concentratie van insecticide op beide oppervlakken (glas en papier) is bekend en vooraf bepaald door het screenen van verschillende soorten van bekende genotypen. De hoeveelheid die beschikbaar is om mogelijk door het insect te worden geabsorbeerd, kan echter sterk variëren, afhankelijk van het gebruikte oppervlak, de bestanddelen van het insecticidemengsel en hoe homogeen het insecticide over het oppervlaktemateriaal is verdeeld^16,17. In de CDC-flesbioassay is de insecticidecoating aan de binnenkant van de fles afhankelijk van de procedures die door elk laboratorium en elke gebruiker worden gebruikt. In de WHO-buistest worden de met insecticide behandelde papieren centraal geproduceerd en dus hoogstwaarschijnlijk vrij homogeen in laboratoria. In de WHO-buistest stelt de blootstellingsbuis monsters echter in staat om te landen en te rusten op niet-insecticide-blootgesteld metaalgaas, wat leidt tot mogelijke heterogene blootstelling aan insecticiden tussen de monsters binnen elke test. De werkelijke hoeveelheid insecticide die via elke methode door monsters wordt opgepikt en geabsorbeerd, moet nog worden onderzocht¹⁸.

Bovendien worden de CDC-flesbioassay, WHO-buistest en contactmethode het meest gebruikt als drempeltests die slechts één vooraf bepaalde insecticideconcentratie testen. Deze aanpak kan de aanwezigheid van weerstand nauwkeurig detecteren en is waardevol voor weerstandsbewaking (vooral wanneer weerstand zich verspreidt). Drempeltests kunnen echter de sterkte van de weerstand niet kwantificeren, wat meer voorspellend zou kunnen zijn voor de effectiviteit van interventie-instrumenten. Als meerdere insecticideconcentraties worden gebruikt met deze methoden, kunnen ze worden gebruikt als intensiteitstests. Intensiteitstests voor de CDC-flesbioassay en de WHO-buistest zijn geïntroduceerd door 5x en 10x de vooraf bepaalde discriminerende doseringen te testen om deze kloof in surveillance aan te pakken ^6,19. Hoewel ze meer mogelijkheden bieden om onderscheid te maken tussen resistente populaties, bieden 3-5 (vooraf bepaalde) doseringen een beperkte resolutie om dodelijke concentraties te berekenen. Bovendien worden muggen van verschillende groottes gebruikt in dergelijke testen. Toch is de massa belangrijk om te meten, omdat grotere exemplaren mogelijk een hogere dosis nodig hebben om te worden gedood, omdat de effectieve dosis per massa-eenheid veel lager zal zijn dan die van een kleiner organisme¹². Het berekenen van een massagerelativeerde letale dosis (hoeveelheid insecticide per insectenmassa) zou een nuttiger metriek zijn dan de meer gebruikelijke dodelijke concentratie (bijv. Hoeveelheid insecticide per oppervlak) omdat het rekening houdt met de variatie van insectenmassa tussen geslachten, populaties en genotypen. Dergelijke gegevens zouden helpen de kloof tussen genotypische en fenotypische resistentie binnen het laboratorium en het veld te dichten en zouden ook een eenvoudige manier kunnen bieden om de benodigde toepassingsconcentratie te berekenen voor de behandeling van een populatie insecten met een bekende gemiddelde massa.

Het gebruik van massa-gerelativeerde dodelijke doseringen die 50% van de monsters doden (LD₅₀) bevat ook verschillende andere voordelen. De beoordeling van de toxiciteit van een specifieke verbinding in mg/kg (= ng/mg) is standaard in de toxicologie voor mens en dier¹⁴ en LD_50-waarden zijn te vinden op veiligheidsinformatiebladen. Dodelijke doseringen maken ook directe vergelijking van toxiciteit mogelijk tussen verschillende chemicaliën voor een bepaalde soort of dezelfde chemische stof voor verschillende soorten²⁰, evenals hoogwaardige evaluatie van nieuwe insecticiden en chemicaliën¹³. Bovendien kan de LD₅₀ zinvollere en nauwkeurigere resistentieverhoudingen bieden dan die afgeleid van diagnostische dosissterfteresultaten, wat kan resulteren in een overschatting van het resistentieniveau dat aanwezig is in een populatie. Daarom zou deze test geschikt zijn voor routinematige surveillanceprogramma's door strengere resistentiemonitoring te bieden op basis van massagerelativeerde letale doses afgeleid van meer monsters dan aanbevolen voor andere bioassays²¹.

De topische toepassingsmethode is gebruikt bij de bewaking van de gevoeligheid van insecticiden voor muggen en vliegen als alternatief voor de standaard insecticide gevoeligheidsbioassays wanneer resistentie al bekend is of wordt vermoed^22,23, evenals voor bewaking bij sommige plaaginsecten²⁴ om resistentieprofielen en intrinsieke toxiciteit van insecticiden nauwkeuriger te beoordelen²¹ . In topische toepassing bioassays, wordt het insecticide toegepast op elk organisme, wat resulteert in minimale variatie in blootstelling aan insecticiden. Dit artikel presenteert een licht aangepaste en verbeterde methode die het mogelijk maakt om blootstelling aan insecticiden toe te passen op een groot aantal insecten in een korte periode, terwijl ook wordt gecontroleerd op insectenmassa²². Deze methode met een hogere doorvoer en een goede repliceerbaarheid zou een nuttig aanvullend hulpmiddel kunnen zijn voor routinematige bewaking van de gevoeligheid voor insecticiden.

Protocol

OPMERKING: Insecticiden kunnen gevaren voor mens, dier en milieu veroorzaken²⁵. Voorzichtigheid, training en persoonlijke beschermingsmiddelen worden ten zeerste aanbevolen. Zorg ervoor dat u de veiligheidsinformatiebladen voor alle gebruikte insecticiden en oplosmiddelen volgt.

1. Achterste exemplaren

1. Achterste 3-5 dagen oude volwassen muggen.
   OPMERKING: Het onderstaande protocol weerspiegelt de voorwaarden voor de Aedes aegypti-teelt , in nauwe navolging van de richtlijnen van de Voedsel- en Landbouworganisatie van de Verenigde Naties²⁶.
   1. Achtermuggen van alle levensfasen bij 27 ± 1 °C en 75 ± 5% relatieve vochtigheid met 12:12 uur licht en donker fietsen.
   2. Broed de muggeneieren uit door ze onder te dompelen in gedeïoniseerd water en gist²⁶ toe te voegen, of plaats de ondergedompelde eieren gedurende 30 minuten in een vacuümkamer.
      OPMERKING: Beide methoden verlagen het zuurstofgehalte in het water en verhogen het uitkomen²⁷.
   3. Voer de pas uitgekomen larven visvoer (of een gelijkwaardig dieet zoals gemalen kattenbrokken) in trays en houd de larvale dichtheid zo gelijk mogelijk tussen trays, omdat de larvale dichtheid de ontwikkeling¹² beïnvloedt (bijv. 200-250 larven per tray met in totaal 1,5 L water).
   4. Voer de larven om de andere dag totdat ze het popstadium bereiken (ongeveer 7-10 dagen), waardoor de hoeveelheid voedsel naar behoefte toeneemt.
      OPMERKING: Wanneer te weinig gevoerd, zal de larvale groei worden belemmerd en kunnen de larven elkaar opeten. Wanneer ze te veel worden gevoerd, kunnen de larven sterven, waardoor het water vies wordt.
   5. Zodra poppen zich ontwikkelen, breng ze dagelijks over naar een waterbak in volwassen muggenkooien en zorg voor 10% sucrose-oplossing ad libitum.
   6. Noteer de eerste dag van volwassen opkomst. Verwijder de resterende poppen uit de kooi 2 dagen nadat de opkomst begint.
      OPMERKING: Mannelijke muggen komen sneller tevoorschijn. Let op de opkomst van mannetjes en vrouwtjes afzonderlijk en zorg ervoor dat er voldoende mannetjes en vrouwtjes beschikbaar zijn voor elke test.
   7. Wacht 3 dagen na het verwijderen van de poppen om 3-5 dagen oude muggen te bereiken voor het testen.
2. Achterste fruitvliegjes (losjes volgens protocollen van de Universiteit van Zürich²⁸).
   1. Drosophila-stammen in voorraadflessen op 23 ± 1 °C en 60 ± 5% relatieve vochtigheid met 12:12 uur licht en donker fietsen.
      OPMERKING: Drosophila-voorraadflessen moeten 75 ml van een standaard vliegmedium bevatten, dat eerst als een vloeistof in de bodem van de flessen wordt gegoten en vervolgens een nacht wordt laten stollen.
   2. Breng kolonies om de twee weken over naar nieuwe voorraadflessen met vers voedsel om overbevolking en schimmelgroei te voorkomen. Om dit te doen, sla vliegen neer met behulp van een handbediende koolstofdioxide (CO₂) dispenser, breng de verdoofde vliegen over op een weegpapier op een ijspak of koeltafel en borstel de vliegen in een verse voorraadfles met behulp van een verfkwast met fijne punt. Zorg ervoor dat u de flessen tijdens dit proces op hun zijkant houdt om te voorkomen dat vliegen in het voedsel vallen en verdrinken.

2. Bereid insecticide formuleringen voor met behulp van de gravimetrische benadering

1. Maak de eerste stamoplossing volgens de gravimetrische benadering met behulp van een analytische schaal met een nauwkeurigheid van 0,1 mg in een zuurkast.
   OPMERKING: De gravimetrische benadering gebruikt massa om de hoeveelheden toegevoegd insecticide en oplosmiddel te meten. De standaardpraktijk (volumetrische benadering) vereist een analytische schaal om de hoeveelheid (vast) insecticide te meten die wordt toegevoegd wanneer de eerste stamoplossing wordt bereid; de hoeveelheid toegevoegd oplosmiddel en alle volgende verdunningen worden echter alleen gemeten aan de hand van het volume. De gravimetrische benadering heeft een hogere nauwkeurigheid en heeft daarom de voorkeur.
   1. Bepaal de beoogde insecticideconcentratie en het doelvolume (maximaal 10 ml wordt aanbevolen bij gebruik van 15 ml conische buizen om morsen te voorkomen bij opslag in een vriezer) voor de eerste stamoplossing en bereken hoeveel insecticide actief ingrediënt (AI) moet worden toegevoegd met Eq (1):
        (1)
   2. Bereid een opslagbuis voor (15 ml conische buis aanbevolen voor grotere volumes, 1,5 ml microcentrifuge schroefdopbuizen aanbevolen voor volumes van 1 ml of minder) en etiketteer met insecticide en oplosmiddelnaam, doelconcentratie en bereidingsdatum. Plaats de buis en het deksel op de weegschaal in een rek of houder en laat de weegschaal trillen.
   3. Weeg de gewenste hoeveelheid vast of vloeibaar insecticide AI af, bepaald vanaf stap 2.1.1. (bijv. deltamethrin dat wordt gebruikt voor de representatieve gegevens) in de buis en noteer de massa.
   4. Gebruik de schaal en voeg het gewenste volume oplosmiddel (gelijk aan het doelvolume) toe aan de buis, sluit het deksel onmiddellijk en noteer de massa. Sluit het deksel van de buis onmiddellijk na het toevoegen van het oplosmiddel (hier gebruikte aceton) om verdamping te voorkomen en meng de oplossing.
   5. Noteer de kamertemperatuur. Sommige oplosmiddelen, zoals aceton, kunnen aanzienlijke veranderingen in volume (en dus dichtheid) hebben, afhankelijk van de temperatuur.
   6. Als u de tube onmiddellijk bewaart, wikkelt u het deksel van de buis in parafilm (om verdamping te verminderen), plaatst u het in een buizenrek/houder (om rechtop te blijven staan en lekken te voorkomen), dek het af in folie (om UV-blootstelling te voorkomen), plaats het in een hersluitbare plastic zak (om verdamping te verminderen) en plaats de zak in een vriezer van -20 °C. Als het deksel niet onmiddellijk wordt opgeslagen, zorg er dan voor dat het deksel is bevestigd en dek af met folie of een lichtbeveiligde container.
   7. Bereken de werkelijke concentratie van de stamoplossing (mg/ml) door de massa toegevoegd insecticide AI te delen door het volume toegevoegd oplosmiddel (en het volume insecticide toegevoegd indien in vloeibare vorm). Om het volume van het toegevoegde oplosmiddel (of vloeibaar insecticide) te berekenen, deelt u de toegevoegde massa door de bekende dichtheid die geschikt is voor de geregistreerde temperatuur.
   8. Bereken de dichtheid (g/ml) van de stamoplossing door de totale toegevoegde massa (insecticide en oplosmiddel) te delen door het totale toegevoegde volume (oplosmiddel en insecticide, indien in vloeibare vorm). Zie stap 2.1.7 voor het omzetten van vloeibare massa in volume.
2. Verdun de initiële stamoplossing serieel via 10% verdunningen. Gebruik indien nodig deze seriële verdunningen om een initiële dosis-responscurve te maken om het doelbereik van insecticideconcentraties voor de bioassay te identificeren.
   1. Bereken het volume insecticide stockoplossing en het oplosmiddel dat aan elke buis moet worden toegevoegd (bijv. 1 ml insecticide stockoplossing verdund in 9 ml oplosmiddel voor een verdunning van 10 ml van 10% van de vorige concentratie).
   2. Vortex de stamoplossing voor 10 s. Gebruik een voorgelabelde eerste verdunningsbuis op de weegschaal. Voeg het vereiste volume stockoplossing toe aan de eerste verdunningsbuis met behulp van een pipet. Sluit onmiddellijk het deksel van beide buizen en noteer de massa in de eerste verdunningsbuis.
   3. Tarra de eerste verdunningsbuis opnieuw en voeg het vereiste volume oplosmiddel toe. Sluit het deksel onmiddellijk, noteer de massa van het toegevoegde oplosmiddel en draai de eerste verdunning gedurende 10 s.
   4. Herhaal stap 2.2.2 en 2.2.3 voor de resterende verdunningen.
   5. Bewaar alle verdunningen zoals hierboven beschreven in stap 2.1.6.
   6. Bereken de werkelijke concentraties van de verdunningen door stap 2.1.7 te volgen.
   7. Bereken de dichtheid van elke insecticideverdunning door de totale toegevoegde massa (insecticideoplossing en oplosmiddel) te delen door het totale toegevoegde volume (insecticide-oplossing en oplosmiddel). Gebruik voor elke seriële verdunning de dichtheid van de vorige insecticidevoorraadverdunning om de dichtheid van de nieuwe verdunning te berekenen volgens Eq (2):
      (2)
3. Optioneel: Maak insecticideverdunningen met kleinere stappen door seriële verdunning.
   1. Selecteer de concentraties en volumes van elke nieuwe oplossing die moet worden gemaakt met behulp van een dosis-responscurve van de initiële seriële verdunningen, eerdere onderzoeken of gepubliceerde literatuur.
      OPMERKING: Gekozen concentraties moeten resulteren in een sterftebereik van 0-100%, met een minimum van drie concentraties uit dit bereik om Probit-analyse mogelijk te maken.
   2. Gebruik de seriële verdunningen als stamoplossingen om elke nieuwe verdunning te maken en volg stap 2.2 om de nieuwe verdunningen tussen de 10-voudige verdunningen te maken.
4. Optioneel: Aliquot de insecticide-oplossing. Als grotere volumes van de insecticide-oplossingen worden gemaakt, moet u de oplossingen in schroefdopbuizen van 1,5 ml stoppen om verontreiniging, verdamping en degradatie van de stamoplossingen door frequente hantering en blootstelling aan licht te voorkomen.
   1. Aliquot de oplossingen, beginnend bij de laagste concentratie en werken naar de hoogste concentratie om potentiële besmetting te verminderen. Meng elke stamoplossing door 10 s te vortexen voordat u het gewenste volume (bijv. 0,5 ml) opent en pipettert in een voorgelabelde schroefdopbuis.
   2. Bewaar de aliquots in een lichtbestendige verpakking in een vriezer van -20 °C.
      OPMERKING: Het wordt aanbevolen om aliquots regelmatig (maandelijks) te vervangen door kleine nieuwe aliquots die rechtstreeks uit de verdunningen van het pesticide worden gehaald. Dit beperkt de kans dat verontreiniging wordt overgedragen naar andere experimenten of veranderingen als gevolg van verdamping of UV-degradatie terwijl de monsters op de bank worden gebruikt. Het protocol kan hier worden gepauzeerd en zelfs jaren later opnieuw worden opgestart, zolang de insecticide-oplossingen op de juiste manier worden bewaard (zie stap 2.1.6) en in de vriezer van -20 °C worden bewaard.
5. Gebruik een permanente markeerstift om de meniscus te markeren voordat u deze opbergt om de verdamping van oplosmiddelen te controleren. Bij het verwijderen van insecticide-oplossing om aliquots te maken, markeert u de meniscus elke keer dat de oplossing wordt verwijderd.

3. Bereid actuele toepassing bioassay werkruimte voor

OPMERKING: Het wordt aanbevolen om te werken in een benchtop insectenbehandelingstent voor het gemakkelijker vangen van ontsnappende muggen of vliegen. Zie aanvullende figuur S1 voor afbeeldingen van een insectenbehandelingstent.

1. Verwijder de benodigde insecticide-oplossingen uit de vriezer, vortex onmiddellijk en plaats ze in een lichtbestendige container bij kamertemperatuur om de insecticiden voor gebruik tot kamertemperatuur te laten opwarmen.
   OPMERKING: Insecticide AI's kunnen bij koelere temperaturen van het oplosmiddel scheiden. Bovendien verandert het acetonvolume met de temperatuur, wat de toegepaste insecticidedosis kan veranderen. Het mengen van de oplossingen en ze laten opwarmen tot kamertemperatuur helpt consistentie te garanderen bij het gebruik van de insecticide-oplossingen.
2. Vermeld alle benodigde gereedschappen en materialen voor de actuele toepassingstest in de insectenbehandelingstent zoals vermeld in de tabel met materialen.
3. Reinig het vat en de naald van de spuit met aceton van analytische kwaliteit door 5 wasbeurten per aceton aliquot te voltooien. Maak dit compleet met 5 losse aliquots voor een totaal van 25 wasbeurten. Zie aanvullende figuur S2 voor onderdelen van spuiten en repeaterpipetisten.
   1. Zet 5 microcentrifugebuizen uit met elk 0,5 ml aceton.
   2. Vul het vat van de spuit met 0,025 ml aceton uit de eerste buis en duw de aceton vervolgens in een afvalcontainer door snel op de zuiger te drukken. Herhaal dit nog vier keer om in totaal vijf acetonwassingen van dezelfde aceton aliquot te voltooien. Vul vervolgens de spuitcilinder volledig met lucht en verdrijft de lucht en mogelijke acetonresten in de afvalcontainer. Herhaal dit nog twee keer om drie "wasbeurten" met lucht te voltooien.
   3. Herhaal stap 3.3.2 voor de resterende 4 buisjes aceton.
   4. Maak een luchtvak in de loop tussen de zuiger van de spuit en de bovenkant van de naald door de zuiger iets omhoog te trekken in de loop (~ 5 mm).
      OPMERKING: Deze luchtzak beschermt de zuiger tegen contact met de insecticide-oplossingen en vermindert de overdracht van insecticiden.
   5. Zet de spuit opzij totdat deze klaar is voor gebruik voor plaatselijke toepassing.
4. Maak een sleutel met de toe te passen doses en wijs willekeurige ID's toe na willekeurige cijfer- of lettergeneratoren (zie Aanvullend bestand 1).
5. Label de plastic bekers met de willekeurige ID voor blinde sterftebeoordeling.
   OPMERKING: Indien nodig kan het protocol hier worden gepauzeerd en op een latere dag en tijd opnieuw worden opgestart. Als er meer dan een paar uur verstrijken tijdens het pauzeren, wordt het aangemoedigd om stap 3.3 te herhalen om ervoor te zorgen dat de spuit schoon is en om de insecticide-oplossingen terug in de vriezer te plaatsen tot ongeveer een uur voordat de insecten worden gedoseerd en vervolgens stap 3.1 te herhalen.

4. Bereid monsters voor op de actuele bioassay. Zie figuur 1 voor een procedureel overzicht

1. Sorteer en weeg de muggen
   1. Gebruik een aspirator aangedreven door zuigkracht van inademing, aspirateer het gewenste aantal 3-5 dagen oude volwassen muggen die nodig zijn voor de test, inclusief een overmaat om rekening te houden met beschadigde personen. Breng de muggen over in een conische buis (maximaal 100 muggen per buis) door de punt van de aspirator in de buis te plaatsen met katoen om de punt gewikkeld en adem voorzichtig uit en tik op de aspirator. Gebruik het katoen om de buis te sluiten wanneer de aspiratorpunt wordt verwijderd en deed vervolgens met het deksel. Vermijd het vullen van de aspirator en buizen met te veel muggen tegelijk, omdat dit extra stress op de muggen toevoegt en de dood kan veroorzaken.
   2. Sla de muggen kort neer in de buizen door ze minimaal 10 minuten op 4 °C te plaatsen of onder ijs in een ijsbak te begraven.
      OPMERKING: Muggen kunnen enkele uren bij 2 ° C worden gehouden met minimale sterfte²⁹; het is echter het beste om de duur waarvoor de muggen op ijs zijn te minimaliseren om mogelijke negatieve effecten te verminderen.
   3. Breng de neergeslagen muggen over naar de insectenbehandelingstent en tip de muggen voorzichtig op een plastic bakje (bijv. Petrischaaltje) dat op het ijs is geplaatst. Giet slechts ongeveer 50 muggen tegelijk om ervoor te zorgen dat elk de koele bak eronder raakt en neergeslagen blijft.
   4. Sorteer de muggen op geslacht door ze voorzichtig op te pakken bij de poot (of vleugels) met een tang en plaats elk geslacht in een aparte beker. Tel het aantal muggen van elk geslacht tijdens het sorteren en stop wanneer het gewenste aantal is bereikt. Verwijder tijdens het sorteren alle muggen die gewond zijn (bijvoorbeeld ontbrekende poten) of extra groot zijn (bijvoorbeeld abnormaal vergrote buik) of klein (gemakkelijk te onderscheiden met het blote oog als kleiner dan de gemiddelde muggengrootte van die populatie).
      OPMERKING: Het hanteren van de muggen door de aanhangsels vermindert structurele schade aan hun zachte primaire lichamen (bijv. Buik).
   5. Noteer het gewicht van elke kop muggen met behulp van een analytische schaal met een precisie van 0,1 mg.
      1. Plaats een lege beker met een petrischaaltje als deksel op de weegschaal en laat de weegschaal tarra. Giet de muggen in de container, plaats het deksel erop en plaats de container op de schaal.
      2. Noteer het gecombineerde gewicht en het aantal specimens op het scoreblad (zie Aanvullend dossier 2). Plaats de beker met exemplaren onmiddellijk terug op ijs om ze geïmmobiliseerd te houden.
      3. Herhaal de stappen 4.1.5.1-4.1.5.2 totdat alle kopjes monsters zijn gewogen.
   6. Verdeel de voorbereide muggen in groepen van 20-25 in afzonderlijke kopjes op ijs met de willekeurige ID's. Probeer bij het overbrengen van muggen stress en fysieke schade veroorzaakt door de tang te verminderen. Idealiter pak je de muggen slechts 1-2 keer op met een tang: één keer voor sorteren /wegen en een mogelijke tweede keer voor overdracht naar de experimentele bekers.
      OPMERKING: Een ideaal aantal muggen per kopje is 20-25, wat genoeg is voor een herhaling, redelijk is om de mortaliteit te beoordelen en niet mag resulteren in door dichtheid veroorzaakte stress / dood in de beker.
2. Sorteer en weeg de fruitvliegjes
   1. Verdoof de vliegen met CO₂ gedurende 7 s.
      OPMERKING: Als vliegen langer dan 7 s worden blootgesteld aan CO₂ , kunnen ze moeite hebben met kruipen en vliegen wanneer ze³⁰ wakker worden.
   2. Giet de vliegen op een ijspak gewikkeld in bankpapier en gebruik een verfkwast met fijne punt om de mannetjes en vrouwtjes te scheiden en te tellen.
   3. Gebruik de kwast om de gekozen vliegen voorzichtig op te pakken en in een schone, lege voorraadfles te plaatsen. Kies gelijke aantallen mannelijke en vrouwelijke fruitvliegen (bijv. 15 mannetjes en 15 vrouwtjes) en label de voorraadflessen met de soortnaam en het totaal van de fruitvlieg (bijv. Canton-S, 30 vliegen).
      OPMERKING: Het is belangrijk om gelijke aantallen vrouwelijke en mannelijke fruitvliegen te hebben, omdat mannelijke fruitvliegen verhoogde agressie jegens elkaar kunnen ervaren nadat ze uit de aanwezigheid van vrouwtjes^{zijn verwijderd 31}. Daarom, om niet-insecticide sterfte of verwondingen te voorkomen, is het het beste om gelijke aantallen mannetjes en vrouwtjes te hebben (of mannelijke fruitvliegen volledig weg te laten).
   4. Noteer het gewicht van elke fles fruitvliegjes met behulp van een analytische weegschaal.
      1. Plaats een lege injectieflacon (gelabeld met een willekeurige ID, zie stap 3.4) met een petrischaaltje als deksel op de weegschaal en laat de weegschaal trillen.
         OPMERKING: Glazen injectieflacons worden aanbevolen voor gebruik met fruitvliegjes omdat ze de statische elektriciteit aanzienlijk verminderen.
      2. Verdood de fles fruitvliegjes die overeenkomen met de willekeurige ID van de injectieflacon met BEHULP VAN CO₂ gedurende 7 s.
      3. Giet de fruitvliegjes op weegpapier en gebruik het papier als trechter om de vliegen in de flacon te brengen. Leg het deksel van de petrischaal op de flacon met fruitvliegjes en plaats deze op de weegschaal.
      4. Noteer het gecombineerde gewicht en het aantal exemplaren op het scoreblad en plaats de flacon met fruitvliegen onmiddellijk in een bak met ijs, met het deksel er nog bovenop om te voorkomen dat de vliegen ontsnappen.
      5. Herhaal stap 4.2.4.1-4.2.4.4 voor elke fles fruitvliegjes.
3. Wanneer de bovenstaande stappen zijn voltooid, gaat u onmiddellijk verder met de volgende sectie.

5. Dosismonsters

1. Laad de spuit met de juiste insecticideconcentratie. Begin met de minst geconcentreerde dosis en werk toe naar de meest geconcentreerde dosis met elke groep organismen. Om verspilling te voorkomen, laadt u de spuit alleen met het benodigde volume insecticide plus een aanbevolen extra 2 μL.
2. Kantel de monsters op weegpapier(en) die bovenop een bakje op het ijs zijn geplaatst. Scheid de monsters die dicht bij elkaar staan met behulp van een schone, insecticidevrije verfkwast of wattenstaafje om gemakkelijk toegang te krijgen tot elk monster voor dosering. Gebruik voor muggen de verfkwast ook om ervoor te zorgen dat elk exemplaar op hun dorsum ligt en hun ventrale oppervlak naar boven is gericht.
3. Breng met behulp van de spuit één druppel insecticide-oplossing (of aceton voor de controle) aan op de ventrale thorax en het buikgebied voor muggen en de dorsum voor fruitvliegen. Breng een druppel van 0,2 μL aan (waarvoor een spuit van 10 μL nodig is) voor kleinere insecten zoals fruitvliegen en een druppel van 0,5 μL (waarvoor een spuit van 25 μL nodig is) voor muggen.
   OPMERKING: De gevoeligheid voor insecticiden verschilt niet significant tussen primaire lichaamsdelen (zoals het hoofd, de thorax en de buik) in vergelijking met aanhangsels (zoals vleugels, benen of proboscis)³². Daarom hoeft de toedieningsplaats niet exact te zijn zolang de dosisdruppel op het primaire lichaam wordt aangebracht. De ventrale thorax en het buikgebied worden gekozen voor muggen omdat ze vaak op hun dorsale kant liggen wanneer ze worden neergeslagen, terwijl de dorsum wordt gekozen voor fruitvliegen omdat ze vaak op hun ventrale kant liggen wanneer ze worden neergeslagen. Deze verminderde specificiteit van de toedieningsplaats helpt de doorvoer van deze methode te verhogen.
4. Giet de monsters onmiddellijk terug in de gelabelde plastic beker en bedek de beker met gaas en een elastiekje. Plaats de beker in een bakje en noteer op de beker alle exemplaren die tijdens dit proces zijn gedood, beschadigd of ontsnapt (om ze uit te sluiten in de definitieve telling van exemplaren in die beker). Noteer voor de eerste beker de tijd waarop de dosering is voltooid.
5. Vervang het (de) weegpapier(en) waarop de monsters zijn geplaatst om besmetting met insecticiden tussen de doses te voorkomen.
6. Herhaal de dosering voor elke cup totdat alle monsters zijn gedoseerd met de juiste insecticideconcentraties en noteer de eindtijd wanneer alle monsters zijn gedoseerd.
7. Geef 10% sucrose-oplossing aan elke beker via een geweekt watje en zet de kopjes apart totdat de mortaliteit de volgende dag wordt beoordeeld. Bewaar de muggen bij 27 ± 1 °C met 75 ± 5% relatieve vochtigheid⁵ en de fruitvliegjes bij 23 ± 1 °C met 60 ± 5% relatieve vochtigheid.
   OPMERKING: Wees voorzichtig tijdens het knijpen in de wattenbollen om oververzadiging of onderverzadiging te voorkomen. De wattenbollen moeten vochtig zijn maar niet druipen. Druppelend suikerwater in de beker kan leiden tot sterfte van de monsters en dus van invloed zijn op de sterftebeoordeling van het insecticide.

6. Beoordeel de mortaliteit

1. Recordsterfte van specimens 24 uur na het begin van blootstelling aan insecticiden. Classificeer muggen als levend als ze kunnen vliegen en zichzelf rechtop kunnen houden; als dood als ze onbeweeglijk of ataxisch zijn (niet in staat om te staan of op te stijgen voor de vlucht), zoals beschreven door de WHO⁶. Volg dezelfde sterftebeoordeling voor fruitvliegjes ^8,33.
   OPMERKING: Om vertraagde sterfte te beoordelen, kan de mortaliteit bovendien worden beoordeeld na 48 en 72 uur met dagelijkse suikerwaterverversingen.
2. Nadat de sterfte is geregistreerd, plaatst u alle bekers met monsters gedurende ten minste 1 uur in een ingesloten zak in een vriezer om ervoor te zorgen dat alle monsters dood zijn voordat ze worden verwijderd of later worden gebruikt (bijvoorbeeld moleculaire of chemische analyse).

7. Replicaties uitvoeren

1. Herhaal stap 3-6 op een nieuwe set monsters en zorg ervoor dat u elke dag op hetzelfde tijdstip repliceert, omdat de gevoeligheid voor insecticiden kan veranderen afhankelijk van het tijdstip van dag³⁴.
2. Zorg voor minimaal 3 replicaties voor elke concentratie voor een nauwkeurige schatting van de dodelijke dosis die 50% van de monsters doodt (LD₅₀). Neem meer replicaties op als een hoge mate van variabiliteit wordt waargenomen.
3. Voltooi de analyse nadat alle gegevens zijn verzameld.

8. Analyseer de resultaten

1. Leg gegevens vast in een spreadsheetprogramma en gebruik de willekeurige ID-sleutel om de gegevens te ontmaskeren (referentiestap 3.4). Sla de gegevens op als tekstbestand (zie voorbeeldgegevens in Aanvullend bestand 3) voor analyse in het statistische programma R³⁵ (zie voorbeeld R-code in Aanvullend bestand 4) of andere software van keuze³⁶.
2. Voer binnen het softwareprogramma de volgende analyse uit. Zie Aanvullend bestand 4 voor een voorbeeld van een R-code.
   1. Bereken de dosis insecticide (ng) per monstermassa (mg) volgens Eq (3) hieronder:
      (3)
   2. Bereken de mortaliteit en pas abbott's formule³⁷ toe om de mortaliteit te corrigeren ten opzichte van de mortaliteit die in elke controle³⁷ is waargenomen. U kunt ook de Schneider-Orelli (1947) formule gebruiken om sterfte³⁸ te corrigeren. Pas bij beide formules de correctie toe op alle gegevens, ongeacht de mortaliteit in elke controlegroep, zoals eerder beschreven³⁷ en geïmplementeerd³⁹, tenzij de controlegegevens ongewoon hoog zijn (zie onderstaande discussie).
      OPMERKING: De formule van Abbott en gelijkwaardige alternatieven, zoals de Schneider-Orelli-formule, passen de sterftewaarden evenredig aan de mate van mortaliteit aan die niet in de controles is waargenomen en zullen geen daling van de mortaliteit veroorzaken voor kopjes met 100% mortaliteit. Zie voor meer informatie de aangehaalde referenties voor deze formules.
   3. Zet gecorrigeerde mortaliteitsgegevens om in probit (waarschijnlijkheidseenheid) waarden⁴⁰ en voer lineaire regressie uit tussen de insecticidedosis en getransformeerde mortaliteitsgegevens. Gebruik een chi-kwadraattest om de pasvorm van de lineaire model(en) te beoordelen.
      OPMERKING: Sterftewaarden van 0 (0% mortaliteit) of 1 (100% mortaliteit) worden uit de gegevens verwijderd voordat de probittransformatie wordt voltooid. Dit is nodig vanwege de aard van de probit-transformatie. Als zodanig bevatten de grafische gegevens geen positieve of negatieve controles of andere gegevens die hebben geleid tot 0% of 100% mortaliteit (nadat de correctie van Abbott is toegepast).
   4. Bereken de LD₅₀ en 95% betrouwbaarheidsintervallen (CI's) per specimen stam, populatie en/of geslacht volgens eerder gepubliceerde methoden 39,41,42.
   5. OPMERKING: Als de 95% CI's van twee stammen elkaar niet overlappen, hebben de stammen significant verschillende dosisresponsen.
   6. Bereken indien van toepassing de weerstandsverhoudingen (RR's) door de LD₅₀ van de interessante stam te delen door de LD₅₀ van de referentie-/controlestam.

Figuur 1: Topisch toepassingstestprotocoldiagram. Topische toepassingstestprotocol begint met (A) het sorteren van monsters op ijs, gevolgd door (B) het wegen van monsters op een analytische schaal, (C) het doseren van monsters met insecticide-oplossing (en) en (D) 24 uur wachttijd na blootstelling aan insecticiden met toegang tot 10% sucrose-oplossing ad libitum (via een geweekt watje), gevolgd door een sterftebeoordeling. Rode pijlen geven de locatie aan voor de toepassing van insecticiden voor muggen (links) en fruitvliegen (rechts). Houd er rekening mee dat de afbeelding niet op schaal is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Resultaten

Deze representatieve resultaten bevatten twee verschillende stammen van Ae. aegypti, Rockefeller (ROCK) en een geïsoleerde veldstam uit Florida met bekende knockdown-resistentiemutaties F1534C en V1016I (IICC-genotype). Daarnaast komt Drosophila melanogaster (Canton: S-stam) aan bod.

Figuur 2 en figuur 3 illustreren de dosisrespons van elk organisme per stam en geslacht getest volgens het bovenstaande protocol. Aangezien er geen verschillen werden waargenomen tussen de dosis-responscurven van mannelijke en vrouwelijke muggen binnen elke stam (t = 1,70, p = 0,098 voor ROCK en t = 0,64, p = 0,527 voor IICC), werden gegevens van beide geslachten binnen elke muggenstam samengevoegd. De massagerelativeerde LD₅₀ voor ROCK en IICC zijn respectievelijk 0,008 ng/mg (95% BI: 0-0,104) en 0,336 ng/mg (95% BI: 0,235-0,438). De 95% CI's van deze waarden overlappen elkaar niet, wat wijst op significant verschillende dosisresponsen van de stammen. De RR van de IICC-stam (ten opzichte van de ROCK-stam) is 41,7, wat volgens de WHO als zeer resistent wordt beschouwd⁵. Voor de Canton-S fruitvliegen is de massa-gerelativeerde LD₅₀ 0,213 ng/mg (95% BI: 0-0,490).

Figuur 2: Representatieve gegevens van muggen met behulp van topische toepassing bioassay. Representatieve dosis-responsgegevens van topische toepassingsbioassay volgens het bovenstaande protocol met deltamethrin en muggen: (A) vrouwelijke Ae. aegypti ROCK (n = 880) en IICC (n = 550) stammen, (B) mannelijke Ae. aegypti ROCK (n = 880) en IICC (n = 569) stammen. Deltamethrin-testconcentraties varieerden van 0,00075 ng / μL tot 9,68705 ng / μL, en de dosis toegepast deltamethrin (ng) per gemiddelde muggenmassa (mg) wordt weerspiegeld op de x-as. De sterfte wordt weergegeven als een verhouding op de y-as. De zwarte lijn door elk gegevenspuntcluster vertegenwoordigt de spanning en geslachtsspecifieke lineaire regressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve gegevens van fruitvliegen met behulp van topische toepassing bioassay. Representatieve dosis-responsgegevens van topische toepassingsbioassay volgens het bovenstaande protocol met deltamethrin en fruitvliegen: D. melanogaster Canton-S-stam (n = 1014). De testconcentraties van deltamethrin varieerden van 0,00499 tot 5,02876 ng/μL, en de dosis toegepast deltamethrin (ng) per gemiddelde fruitvliegmassa (mg) wordt weerspiegeld op de x-as. De sterfte wordt weergegeven als een verhouding op de y-as. De zwarte lijn vertegenwoordigt de lineaire regressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur S1: Benchtop insectenbehandelingstent. Benchtop insectenbehandelingstent wordt gebruikt voor het gemakkelijker vangen van ontsnappende muggen of vliegen tijdens de actuele toepassingstest. Structuur is gesloten in A en open in B. Deze structuur is gebouwd met PVC-buis en fijnmazige stof. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Spuit en repeater applicator unit. Spuit en repeater applicator unit gebruikt voor het doseren van insecten. De belangrijkste onderdelen zijn 1) naald, 2) spuitvat, 3) zuiger, 4) repeater en 5) repeaterknop. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Randomisatiescript: Randomisatiescript om niet-bevooroordeelde labels te maken voor alle kopjes van elk experiment. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 2: Sterftescoreblad: Sterftescoreblad om de sterftebeoordeling te ondersteunen. Blad bevat ook plaatsen om alle andere belangrijke informatie vast te leggen, zoals vermeld in het protocol, zoals de begin- en eindtijden van de insecticidetoepassing. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: Voorbeeld van sterftegegevens: Voorbeeldgegevensbestand dat is gebruikt om figuur 2 te maken. De beschrijvingen van de kolomkoppen zijn als volgt: "id" = identificatiecode van elk gegevenspunt; "soort" = soortnaam (bijv. Aedes aegypti); "insecticide" = naam van het insecticide dat topisch wordt aangebracht (bijv. Deltamethrin); "stam" = naam van de muggenstam (bijv. ROCK); "datum" = begindatum actuele toepassing; "seks" = geslacht van muggen; "leeftijd" = leeftijd van muggen (jong = 3-5 dagen oud; oud = 4 weken oud); "total.mosq" = totaal aantal muggen gewogen in batch; "gewicht" = gewicht (mg) van alle muggen binnen de partij; "concentratie" = concentratie van insecticide (μg/ml); "spuit" = druppelvolume (ml) van de spuit; "dosis" = hoeveelheid insecticide actief ingrediënt toegepast op elke mug (ng); "totaal" = aantal muggen in elke beker; "dood" = aantal dode muggen in elke beker. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: R-analysecode: Voorbeeld R-code die kan worden gebruikt om de Probit-analyse te voltooien (zoals beschreven in stap 8 van het protocol). De representatieve resultaten (toegankelijk via het aanvullende voorbeeldgegevensbestand) kunnen met deze R-code worden gebruikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Dit artikel presenteert een aangepast protocol voor de actuele toepassingstest voor muggen en fruitvliegen. Deze procedure kan gemakkelijk worden aangepast om in het veld en met andere organismen te worden gebruikt, omdat het minimale gespecialiseerde apparatuur vereist. Hieronder worden de kritieke stappen van dit protocol, mogelijke wijzigingen, advies voor probleemoplossing, beperkingen van de methode en het belang van deze methode behandeld.

Kritieke stappen in het protocol: Er zijn drie kritieke stappen in het protocol die, indien onjuist voltooid, de resultaten van de bioassay drastisch kunnen beïnvloeden: nauwkeurigheid van de insecticideconcentratie, knockdown van monsters en mortaliteitsbeoordeling.

Nauwkeurigheid van de insecticideconcentratie:
Het is uiterst belangrijk om nauwkeurige insecticide-oplossingen te hebben om reproduceerbare dosis-responscurven en zinvolle resultaten te verkrijgen. De volumetrische benadering van de bereiding van insecticide-oplossing komt vaker voor in de literatuur voor zowel CDC-flesbioassay⁷ als topische toepassingen 13,14,43. De gravimetrische benadering die hier wordt beschreven, is echter inherent nauwkeuriger vanwege de overweging van temperatuur door de opname van (temperatuurspecifieke) dichtheid, wat leidt tot een nauwkeuriger formuleringsvoorbereiding.

Specimen knockdown:
Het neerhalen van de monsters is een cruciaal onderdeel van deze methode en maakt de nauwkeurige toediening van het insecticide en gewichtsmetingen mogelijk. Het neerhalen van organismen bevat echter onvermijdelijk het risico op fysieke stress en schade, zoals eerder is aangetoond³⁰. Wees daarom voorzichtig en bedachtzaam bij het neerhalen van de exemplaren om ervoor te zorgen dat i) elk exemplaar voor een vergelijkbare duur wordt neergeslagen, ii) de lengte van knockdown tot een minimum wordt beperkt en iii) de methode van knockdown consistent wordt gehouden voor alle exemplaren. Bovendien wordt geadviseerd om de knockdown-methode afzonderlijk te testen, voorafgaand aan het aanbrengen van insecticiden, om ervoor te zorgen dat de methode succesvol is en geen controlesterfte van meer dan 10% induceert. De eerste test kan langer duren voor een onervaren gebruiker, wat leidt tot langere knockdown-tijden. Wees daarom voorzichtig bij het interpreteren van de resultaten van de eerste assays.

Sterftebeoordeling:
Het beoordelen van sterfte kan een uitdaging zijn, vooral wanneer het insecticide niet volledig doodt, maar alleen de mug of vlieg neerhaalt of verminkt. Daarom is het belangrijk om je bewust te zijn van hoe het insecticide het doelorganisme beïnvloedt en een duidelijke definitie te hebben voor "dode" (of neergeslagen) organismen voordat je begint. Bovendien wordt aanbevolen om dezelfde persoon de mortaliteit tussen doses en replicaties te laten beoordelen om variatie te verminderen.

Protocolwijzigingen: Verschillende hieronder beschreven wijzigingen kunnen op dit protocol worden toegepast om de veelzijdigheid en toegankelijkheid ervan te verbeteren.

Aanpassing van de test aan kleinere of grotere insecten:
Bij gebruik van kleinere of grotere monsters wordt geadviseerd om respectievelijk een kleiner of groter dosisvolume insecticide toe te passen. Als voorbeeld hebben we het muggenprotocol aangepast aan fruitvliegen door de dosis van 0,5 μL te verlagen tot een dosis van 0,2 μL. Zorg ervoor dat de juiste spuitgrootte is gekozen voor het gekozen dosisvolume.

Aanpassing van de test aan veldinsecten:
Bij het gebruik van veldinsecten kan er meer variatie in insectengrootte zijn. Daarom zou het wegen van de insecten in kleinere groepen (bijvoorbeeld per kopje) worden aanbevolen in plaats van als een grote groep (bijvoorbeeld alle insecten die voor één experiment worden gebruikt). Dit kan helpen bij het vastleggen van de potentiële variatie in insecticide gevoeligheid geassocieerd met de verschillen in veldinsectenmassa.

Aanpassingen aan de uitrusting:
Insectenbehandelingstent: Het doseren van het monster kan worden voltooid onder een insectenbehandelingstent die eenvoudig is opgebouwd met PVC-buis en muskietengaas. Dit kan een alternatief zijn voor een afgesloten ruimte (bijv. Insectary) en helpen bij het elimineren van mogelijke insecticidebesmetting in gebieden waar insectenopfok kan optreden. Deze insectenbehandelingstent is eenvoudig te bouwen en goedkoop (~ $ 70). Als alternatief kan een kooi voor het hanteren van insecten worden gekocht (~ $ 425).

Koeltafel: IJspakken of dienbladen met ijs kunnen worden gebruikt om het monster neer te slaan en/of het monster neergeslagen te houden.

Incubator: Incubators worden aanbevolen voor het fokken van het monster en het houden van het monster gedurende 24 uur na de behandeling met insecticiden. Als er geen incubator beschikbaar is, kan deze worden gebouwd. Apparatuur die nodig is om de incubator te bouwen, omvat een geïsoleerde container, luchtbevochtiger, warmtekabels, vochtigheids- en temperatuurregelaar en een licht, dat zou moeten oplopen tot een totale kosten van ~ $ 170, in navolging van en voortbouwend op eerdere methoden⁴⁴.

Bekers: Hoewel plastic bekers worden gebruikt om het behandelde monster te sorteren en vast te houden, zijn met was beklede papieren bekers of glazen containers geschikte alternatieven.

Modificatie van organismen en levensfasen:
Deze methode is zeer aanpasbaar voor gebruik met andere vectoren, insecten en / of geleedpotigen zoals Culex quinquefasciatus muggen³², huisvliegen³² en kakkerlakken⁴⁵, evenals niet-volwassen levensfasen, zoals muggenlarven⁴⁶.

Actuele wijziging van de toepassingslocatie:
Deze methode beschrijft het aanbrengen van het insecticide op de ventrale thorax en het buikgebied voor muggen (en de dorsum voor fruitvliegen). Andere toepassingslocaties kunnen echter worden gebruikt zolang de blootstellingslocatie consistent is. Consistentie is belangrijk omdat de gevoeligheid voor insecticiden kan variëren op basis van toepassingslocatie³².

Advies voor het oplossen van problemen: Deze methode kent verschillende stappen die in eerste instantie uitdagend zijn. Hieronder worden enkele van de meest voorkomende problemen beschreven die u kunt tegenkomen.

Lekkende/verdampende insecticide oplossingen:
Insecticiden worden vaak opgelost in aceton, een zeer vluchtige stof. Dit betekent dat aceton snel verdampt bij kamertemperatuur, waardoor de insecticideconcentraties in de loop van de tijd toenemen. Als de insecticide-oplossingen lijken te lekken of verdampen, maak de oplossingen dan opnieuw, zorg ervoor dat het deksel van de buis goed zit en controleer nogmaals of de opslagprotocollen correct worden gevolgd (bijv. Parafilm wordt gebruikt en de buizen worden rechtop opgeslagen). Als het lekken aanhoudt, probeer dan de buizen met een lager volume te vullen om meer ruimte te bieden voor de volumeverandering die de aceton bij verschillende temperaturen ervaart. Bovendien, als u aceton als oplosmiddel gebruikt, moet u ervoor zorgen dat de buizen geschikt zijn voor acetonopslag (bijv. FEP-, TFE- en PFA-kunststoffen). Als u hydrofobe insecticiden gebruikt, bewaar de oplossingen dan in glazen injectieflacons (omdat hydrofobe insecticiden zich minder dan plastic aan glas hechten). Het is ook een goede gewoonte om de meniscus van de oplossing te markeren voordat deze wordt opgeslagen om de verdamping te controleren.

Gewicht dat afdrijft op microbalans bij het wegen van organismen:
Als de gewichtsaflezing op de weegschaal afdrijft (langzaam omhoog of omlaag gaat), kan dit te wijten zijn aan statische elektriciteit. Drift komt meestal voor bij het wegen van organismen in plastic items, omdat plastic gemakkelijk een statische lading kan vasthouden. Om dit te voorkomen kan een weegpapier onder de plastic container worden geplaatst die wordt gewogen, of kan een niet-plastic container zoals glas worden gebruikt.

Abnormale sterfteresultaten:
Er zijn veel manieren waarop de sterfteresultaten abnormaal kunnen lijken, zoals het observeren van hoge mortaliteit in de controles of hoge / lage mortaliteit in alle insecticidedoses. Bekijk de volgende cases voor het oplossen van problemen met elk scenario.

Hoge controlesterfte
Als er een hoge mortaliteit is in de controlegroep (10% of meer), evalueer dan de knockdown-methode en de tijdsduur dat de monsters worden neergeslagen. Verkort indien mogelijk de tijdsduur gedurende welke de exemplaren worden neergeslagen. Andere mogelijke factoren om te overwegen voor hoge mortaliteit in de controles zijn i) controleren of de couveuseinstellingen correct zijn - abnormale temperaturen en / of vochtigheid kunnen leiden tot verhoogde mortaliteit. Temperatuur en vochtigheid moeten worden gecontroleerd met een onafhankelijke datalogger. ii) Beoordeling van de omgang met insecten. Te veel of te ruw omgaan met insecten kan leiden tot een hoge sterfte. iii) Controleren of er geen insecticideverontreiniging is in de 100% aceton die wordt gebruikt voor de behandeling van de controlegroep of op de instrumentatie. Vervang aceton en reinig alle instrumenten met aceton of ethanol. Voorkom besmetting door regelmatig handschoenen te vervangen, morsen te voorkomen en instrumenten te reinigen. Merk op dat in aanvullend bestand 3 maximaal twee muggen stierven binnen de controle (alleen aceton) kopjes. Dit sterfteniveau wordt niet als hoog beschouwd (het is minder dan 10%), en daarom was er geen reden tot bezorgdheid.

Hoge mortaliteit in alle blootgestelde groepen (maar niet in controlegroepen)
Gebruik lagere insecticideconcentraties of kleinere dosisvolumes voor het testen. De gebruikte doseringen kunnen boven de minimale dosis liggen die geen mortaliteit zal veroorzaken. Gebruik verschillende 10-voudige verdunningen om het juiste dosisbereik te bepalen en besmetting uit te sluiten. Om besmetting te voorkomen, begint u met de dosering met de laagste concentratie en werkt u naar de hoogste concentratie toe. Zorg er bovendien voor dat alle gebruikte apparatuur regelmatig wordt gereinigd met aceton en / of ethanol, dat de doses die op het monster worden aangebracht erg klein zijn en zelfs de geringste kruisbesmetting de resultaten kan beïnvloeden.

Lage mortaliteit in alle blootgestelde groepen
Gebruik hogere insecticideconcentraties. De gebruikte doseringen kunnen allemaal te laag zijn om sterfte in de bevolking te veroorzaken. Om het juiste dosisbereik te bepalen, stelt u monsters bloot aan nog een aantal 10-voudige geconcentreerde doseringen. Zorg ervoor dat de insecticide-oplossingen niet zijn verlopen of afgebroken (mogelijk als gevolg van hoge temperaturen of blootstelling aan licht). Als de oplossingen zijn verlopen of waarvan wordt vermoed dat ze zijn aangetast, maak de oplossingen dan opnieuw en zorg ervoor dat de juiste opslagomstandigheden worden gevolgd.

Inconsistente mortaliteit tussen replicaten/dagen
Het tijdstip van de dag waarop insecten worden blootgesteld aan het insecticide kan van invloed zijn op het niveau van resistentie dat wordt uitgedrukt, vooral voor metabole resistentie³⁴. Herhaal dit protocol elke dag gedurende hetzelfde tijdvenster om het tijdstip van de dag te vermijden als een potentiële variabele die bijdraagt aan veranderingen in de mortaliteit. Andere mogelijke factoren die bijdragen aan inconsistente mortaliteit tussen replicaties zijn i) monsters die differentieel worden gekweekt tussen experimenten. Zorg ervoor dat alle exemplaren van dezelfde leeftijdscategorie zijn, gefokt met dezelfde temperatuur en vergelijkbare dichtheden en voedselbeschikbaarheid. ii) insecticideconcentraties die in de loop van de tijd afnemen of geconcentreerder worden als gevolg van acetonverdamping. Maak de oplossingen opnieuw en zorg voor de juiste bewaarcondities. iii) Inconsistente sterftescore. Zorg ervoor dat dezelfde persoon sterfte scoort of ontwikkel een duidelijk protocol dat consistent in het hele team kan worden gebruikt. Gebruik blind scoren om bias in mortaliteitsscores te verminderen.

Insecten die aan het oppervlak van de sorteerbak kleven:
Aceton reageert op kunststoffen die in dit protocol worden gebruikt, zoals petrischalen. Het monster zal zich waarschijnlijk aan het oppervlak hechten als aceton op petrischalen of soortgelijke plastic oppervlakken wordt gebruikt. Deze hechting kan worden voorkomen door de sorteerbak te bekleden met weegpapier of door een niet-plastic sorteerbak te gebruiken. Bovendien kan condensatie op het oppervlak van plastic in de sorteerbak of bekers ertoe leiden dat insecten zich aan de condensatie hechten, of het monster kan te koud zijn en mogelijk aan de oppervlakte bevriezen. Pas de knockdown-methode aan om condensatie te verminderen en tegelijkertijd te voorkomen dat de monsters te koud/bevroren worden (plaats bijvoorbeeld weegpapier tussen de monsters en de plastic sorteerbak).

R-analysefouten:
Zodra de sterftegegevens zijn verzameld, kunnen er tijdens de analyse verschillende complicaties optreden. De meest voorkomende reden waarom een R-code de acties voor het gegevensbestand niet kan voltooien, is dat de gegevensindeling niet overeenkomt met de code (bijvoorbeeld kolomkoppen en/of lege cellen). Als er meer ernstige complicaties optreden, raadpleegt u de R-helppagina's die zijn ingebouwd in Rstudio³⁵.

Beperkingen van de hierboven beschreven topische toepassingsmethode:
Insecticide absorptie via topische toepassingsmethode bootst geen natuurlijke blootstelling na:
Topische toepassing op het primaire lichaam is niet de natuurlijke manier van insecticide absorptie. In het veld absorberen insecten meestal insecticiden via hun poten gedurende de tijd dat ze in contact komen met het met insecticide behandelde oppervlak of op hun vleugels door kleine aerosoldeeltjes^47,48, in plaats van een snelle blootstelling op het ventrale oppervlak. De directe toepassing van een bekende insecticidedosis zal echter nauwkeurig een fenotypische respons op insecticiden vaststellen, nodig voor genetische en evolutionaire studies of vergelijkingen van insecticidegevoeligheid in ruimte of tijd. Daarom is deze aanpak gunstig voor het testen van technische weerstand, maar zal deze niet direct de praktische weerstand meten (de effectiviteit van het eigenlijke interventie-instrument in een veldsetting¹⁵). Het is echter belangrijk op te merken dat de huidige standaardmethoden (bijv. WHO-buistests en CDC-flesbioassays) ook geen aerosol kunnen vangen of nabootsen (d.w.z. door blootstelling aan insecticiden in het veld te beslaan) door te beslaan.

Topische toepassingstests kunnen alleen contactabsorptie-insecticiden beoordelen:
Deze methode is bedoeld voor insecticiden die werken door contact en absorptie van het insecticide en niet voor gebruik met orale insecticiden, zoals boorzuur dat vaak wordt gebruikt in aantrekkelijk giftig suikeraas⁴⁹.

Betekenis van de methode:
De topische toepassingsmethode borduurt voort op gevestigde normen voor insecticide bioassays door de dodelijke dosis (niet de concentratie) te berekenen en de technische (niet praktische) resistentie te meten¹⁵. Hieronder worden de voor- en nadelen van deze methode ten opzichte van bestaande insecticide gevoeligheidstests gegeven.

Berekening van de dodelijke dosis:
Deze methode bepaalt de dodelijke dosis van het insecticide, in plaats van de dodelijke concentratie die de CDC en WHO bioassays gebruiken om de discriminerende dosis¹¹ vast te stellen. De dodelijke dosis is zinvoller omdat het een gekwantificeerde hoeveelheid insecticide is waarvan bekend is dat het sterfte veroorzaakt. Daarentegen houdt de dodelijke concentratie geen rekening met hoeveel insecticide het organisme daadwerkelijk verwerft. Bij gebruik van de berekening van de dodelijke dosis kunnen verschillen tussen geslachts- of grootteafhankelijke gevoeligheidsprofielen nauwkeuriger worden waargenomen en gekwantificeerd, waardoor deze meting nog veelzijdiger wordt.

Technische weerstand:
Deze methode beoordeelt de technische weerstand, dat is weerstand zoals gemeten onder gestandaardiseerde, gecontroleerde omgevingen. Dergelijke metingen zijn geschikt voor het toezicht op de verspreiding van insecticideresistentie en het koppelen van fenotypische resistentie aan potentiële markers¹⁵. Vanwege de verminderde variatie in mortaliteit als gevolg van de lokale toepassingsbioassay, maakt het een betere identificatie van nieuwe weerstandsmarkers mogelijk. Vanwege de onnatuurlijke blootstelling van insecticiden aan de mug is deze test echter niet geschikt voor de schatting van de werkzaamheid van een specifieke interventie in een specifieke populatie. Andere testen zijn nodig voor metingen van dergelijke praktische weerstand¹⁵.

Aanpassingsvermogen van het specimen:
Deze methode kan worden toegepast op andere belangrijke geleedpotigen zoals gewasplagen (bijv. Coloradokever), huisongedierte (bijv. Kakkerlakken en bedwantsen) of bestuivers (bijv. Bijen) met eenvoudige veranderingen in de knockdown-aanpak en / of insecticide dosis, volume en / of concentratie (zoals hierboven beschreven). Het gemak van aanpassingsvermogen kan helpen bij het analogiseren van onderzoek naar insecticideresistentie in verschillende onderzoeksgebieden. Het gebruik van een LD_50-waarde in plaats van een dodelijke concentratie die 50% van de monsters doodt (LC₅₀) maakt een nauwkeurige vergelijking tussen soorten mogelijk.

Kosten:
Net als bij CDC-flesbioassays en WHO-buistests zijn de kosten voor het uitvoeren van de actuele toepassingstest minimaal (zie de tabel met materialen). De essentiële uitrustingsstukken zijn de spuit (ongeveer $ 70) en de dispenser (ongeveer $ 100), die herbruikbaar zijn voor alle testen.

Aantal benodigde exemplaren:
Er moeten minimaal 20-25 monsters worden gebruikt per topische toepassingstestbeker. Per experiment wordt aanbevolen om minimaal vijf insecticideconcentraties te testen, met een minimum van drie replicaties die voor de procedure worden aanbevolen. Over het algemeen resulteert dit in een minimum van 300-375 monsters die nodig zijn voor een volledige test, vergelijkbaar met het aantal monsters dat nodig is om weerstandsintensiteitstests uit te voeren met behulp van WHO-buistests of CDC-flesbioassays. Als echter verminderde variabiliteit wordt bereikt met de topische toepassingsbioassay, kan hetzelfde aantal monsters leiden tot meer statistische kracht om gevoeligheidsgegevens in ruimte of tijd te vergelijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1.5 mL microcentrifuge tubes	Thomas Scientific	20A00L068	Acetonen aliquot opslag
1.5 mL schroefdopbuisjes	Thomas Scientific	1182K23	Opslag voor insecticide verdunning
15 mL conische buisjes	VWR	339651	Opslag voor insecticide verdunning
20 mL glazen scintillatiebuisjes	Fisher Scientific	0334125D	Vruchtvliegwogen
25 μL spuit	Fisher Scientific	14815288	Topicale applicator
Aceton	Fisher Scientific	AC423240040	ACS 99,6%, 4 L
Aedes aegypti (IICC-stam)	USDA CMAVE	NA	Insecticide resistent
Aedes aegypti (Rockefeller-stam)	CDC	NA	Gevoelig voor insecticiden
Analytische weegschaal	Fisher Scientific	14-557-409	Precisie tot 0,1 mg
Aspirator	Amazon	6.49986E+11	Muggenverzamelapparaat
Bankpapier	VWR	89126-794	Onder werkruimte plaatsen
Wattenstaafjes	Amazon	B092S8JVQN	Gebruik voor het sorteren van insecten
Wattenwolballen	Amazon	B0769MKZWT	Gebruik voor sucroseoplossing
Dispenser	Fisher Scientific	1482225	Repeater pipetteerder
Drosophila melanogaster (Canton-S-stam)	University of Wisconsin-Madison	NA	Gevoelig voor insecticiden
Fijne penselen	Amazon	B07KT2X1BK	Gebruik voor het sorteren van insecten
Vruchtvliegvoorraadflessen	Fisher Scientific	AS355	Gebruik voor het kweken en sorteren van vruchtvliegen
Handbediende CO2 dispenser	Fisher Scientific	NC1710679	Gebruik voor het verdoven van insecten
Opvangbekers	Amazon	B08DXG7V1S	Doorzichtige kunststof
IJspack	Amazon	B08QDWMMW5	Gebruik voor het verdoven van vruchtvliegen
IJsbakken	Amazon	9301085269	Gebruik voor het verdoven van insecten
Insectenpincetten	Amazon	B07B4767WR	Insectenpincetten
Insecticide	Sigma-Aldrich Inc	45423-250MG	Deltamethrin
Labelstickers	Amazon	B07Q4X9GWX	3/4" Kleurpuntstickers
Labeltape	Amazon	B00X6A1GYK	Witte tape
Netwerk	Amazon	B07F2PHHWV	Gebruik voor het bedekken van opvangbekers en insectenverwerkingsten
Petrischalen	Fisher Scientific	FB0875712H371	100 mm x 15 mm
PVC-buis	Lowe’s	23971	Materialen voor insectenverwerkingsten
Gummibandjes	Amazon	B00006IBRU	Gebruik voor het bevestigen van gaas/net op bekers
Sucrose	Amazon	B01J78INO0	Korrelige witte suiker
Weegpapier	VWR	12578-165	4" x 4"