Methodenartikel

Verwijdering van een interne translationele startplaats van mRNA met behoud van expressie van het eiwit over de volledige lengte

DOI:

10.3791/63405

⸱

16 maart 2022

 ,  ,  , 
1Nora Eccles Harrison Cardiovascular Research and Training Institute, University of Utah, 2Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het huidige protocol beschrijft een enkele M213L-mutatie in Gja1 die de connexin43-generatie over de volledige lengte behoudt, maar de vertaling van de kleinere GJA1-20k intern vertaalde isovorm voorkomt.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het CRISPR-Cas9 genbewerkingssysteem, gebaseerd op genoomherstelmechanismen, maakt het mogelijk om sneller en gemakkelijker gen-gemodificeerde muismodellen te genereren in vergelijking met traditionele homologe recombinatie. Het CRISPR-Cas9-systeem is vooral aantrekkelijk wanneer een single-point mutatie gewenst is. Het gap junction-eiwit, Connexin 43 (Cx43), wordt gecodeerd door gen Gja1, dat een enkel coderend exon heeft en niet kan worden gesplitst. Gja1 produceert echter niet alleen Cx43-eiwit over de volledige lengte, maar tot zes N-terminus afgeknotte isovormen door een proces dat bekend staat als interne translatie, het resultaat van ribosomale translatie-initiatie op interne AUG (Methionine) startplaatsen. GJA1-20k is de meest gegenereerde afgeknotte isovorm van Cx43 geïnitieerd bij het AUG-codon op positie 213 van Gja1 mRNA. Omdat residu 213 optreedt aan het einde van het laatste transmembraandomein van Cx43, is GJA1-20k effectief de 20 kDa C-terminusstaart van Cx43 als onafhankelijk eiwit. Eerdere onderzoekers identificeerden in cellen dat een cruciale rol van GJA1-20k is om de handel in Cx43 gap junction hemichannels over de volledige lengte naar het plasmamembraan te vergemakkelijken. Om dit fenomeen in vivo te onderzoeken, werd een mutante muis met een Gja1-puntmutatie gegenereerd die de ATG (Methionine) bij residu 213 vervangt door TTA (Leucine, M213L-mutatie). Het resultaat van M213L is dat Gja1 mRNA en full-length Cx43 nog steeds worden gegenereerd, maar de translatie van Gja1-20k is aanzienlijk verminderd. Dit rapport richt zich op het kiezen van de restrictie-enzymplaats om een één aminozuur gemuteerd (Gja1M213L / M213L) muismodel te ontwikkelen. Dit protocol beschrijft genetisch gemodificeerde muizen door het CRISPR-Cas9-systeem en snelle genotypering door pcr- en restrictie-enzymbehandelingen te combineren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De volledige lengte Connexin 43 (Cx43) en de N-terminus afgeknotte isovorm, GJA1-20k, gecodeerd door hetzelfde GJA1-mRNA, maar gebruiken verschillende startcodons1 om de translatie te initiëren. Cx43-translatie vindt plaats bij het eerste AUG-startcodon, terwijl GJA1-20k-translatie begint bij de AUG bij residu 213. Eerder werd vastgesteld dat GJA1-20k essentiële rollen heeft voor volledige Cx43-handel, actinestabilisatie en regulatie van mitochondriale morfologie in vitro 1,2,3.

Om de rol van GJA1-20k in vivo te begrijpen, werd een GJA1-20k "knock-out" muismodel gegenereerd dat de mogelijkheid behield om Cx43 van volledige lengte te maken. De aanpak was om het CRISPR-Cas9-systeem te gebruiken om het enkele residu bij 213 te vervangen van een methionine (M) naar een leucine (L) (Gja1M213L / M213L)4. Een interne M naar L mutatie vermindert de kans op interne translatie drastisch, maar behoudt de translatie en functie van eiwit4 over de volledige lengte. Omdat het wildtype (WT) en het gemuteerde allel identieke afmetingen en bijna identieke mRNA-producten hebben, is het bij de muizen erg moeilijk om het genotype te bevestigen. DNA-sequencing kan de mutatie identificeren, maar is te duur en tijdrovend voor routinematig gebruik. Over het algemeen zijn verschillende snellere genotyperingsmethoden vastgesteld, zoals Real-time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), minisequencing-ligatie, hoge-resolutie smeltanalyse en tetra-primer amplificatie refractair mutatiesysteem PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Toch vereisen deze alternatieve methoden meerdere stappen, unieke bronnen en /of verschillende specifieke primersets die niet-specifieke PCR-producten kunnen induceren.

Dit protocol introduceert een gedetailleerde gen targeting en editing aanpak door CRISPR-Cas9 om een enkele aminozuurmutatie te creëren, en snelle genotypering wordt gepresenteerd om de mutatie te bevestigen. Genotype-identificatie omvat het creatieve gebruik van restrictie-enzymen die slechts een enkele set primers gebruiken om het doelgen te identificeren. Lezers worden verwezen naar Referentie4 om het diepgaande elektrofysiologische effect van plotselinge hartdood te observeren, veroorzaakt door een één residu Gja1M213L / M213L substitutiemutatie die nog steeds eiwit over de volledige lengte genereert, maar er niet in slaagt een kleinere intern vertaalde truncation isoform te genereren. Dit protocol zal andere muizenmodellen helpen een puntmutatie te gebruiken om de interne translatie van een isovorm van belang te verminderen met behoud van de expressie van het endogene eiwit over de volledige lengte.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

'Alle dierverzorgings- en studieprotocollen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committees van Cedars-Sinai Medical Center en de University of Utah. C57BL/6J vrouwelijke muizen verkregen uit commerciële bronnen op de leeftijd van 8-9 weken (zie Tabel met materialen) werden gebruikt voor de experimenten.

1. Voorbereiding op gentargeting

  1. Selecteer de richtdoelsequentie rond de beoogde mutatieplaats die M213 codeert met behulp van CRISPOR-webalgoritme 4,9,10 (zie Tabel met materialen).
    OPMERKING: Er werd een 20-base gidssequentie (ATTCAGAGCGAGAGACACCA) geselecteerd, in de tegenovergestelde streng van de GJA1-coderende sequentie, met een MIT-score11 van 62, waarbij de potentiële splitsingsplaats zich bevindt na 16 basen stroomafwaarts van het te muteren codon (ATG) (figuur 1; de hele crRNA-sequentie is weergegeven in tabel 1).
  2. Synthetiseer het crRNA en tracrRNA die interageren met Cas9 als gids-RNA12.
    OPMERKING: Hoewel de MIT-score van het gids-RNA 62 is, is er slechts één potentiële off-target mutatie met vier mismatches meer dan 12 basen verwijderd van de PAM. Daarom wordt deze gids RNA als veilig beschouwd.
  3. Ontwerp een donor oligo complementair aan de gidssequentie om een enkele aminozuursubstitutie (ATG naar TTA; M213L) met 60 en 48 basen homologie armen in respectievelijk de 5'- en 3'-zijden.
    OPMERKING: Dit donor oligo omvat een puntmutatie voor verstoring van de PAM (AGG naar ACG) door introductie van een stille mutatie (TCC naar TCG; S217S) om herbewerking na CRISPR homology-directed repair (HDR)13 te voorkomen voor de introductie van de beoogde mutaties (figuur 1 en tabel 1).
  4. Gebruik NaCl (eindconcentratie van 200 mM) om 10 μg oligo's neer te slaan om zoutoverdracht naar pronucleaire micro-injectiebuffer te minimaliseren (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM EDTA en 100 mM NaCl zonder spermine en spermidine14).
    OPMERKING: Was de DNA-pellet niet met 70% ethanol, omdat de pellet in de oplossing kan worden opgelost.
  5. Meng 50 ng/μL donor oligo, 60 ng/μL crRNA/tracrRNA mix (1:1 molaire verhouding) (vanaf stap 1.2) en 50 ng/μL eSpCas9 eiwit (zie Tabel der Materialen) om crispr-mengsel in eindvolume 20 μL te maken (tabel 2). Verlaag de concentratie van het donor oligo als hoge toxiciteit wordt waargenomen (bijv. 25 ng/μL).

2. Inductie van superovulatie, oogsteieren, pronucleaire micro-injectie van CRISPR-mix en blastocystscreening

OPMERKING: Deze procedure volgt een eerder gepubliceerd algemeen protocol14.

  1. Injecteer 5 IE PMSG (serumgonadotrofine van de drachtige merrie) (zie materiaaltabel) in 100 μL steriel water aan 5-10 muizen op de leeftijd van 8 weken door een intraperitoneale benadering om ongeveer 15:00 uur.m. (dag 1).
  2. Injecteer 5 IE hCG (humaan choriongonadotrofine) (zie Materiaaltabel) in 100 μL steriel water aan de eiceldonoren door een intraperitoneale benadering 46-48 uur na PMSG-injectie (dag 3). Zet 1:1 fokken op met dekreuen.
  3. Oogst bevruchte eieren in M2-medium met hyaluronidase, was driemaal in 100 μL M2-medium rond 10:00 .m en bewaar vervolgens in mWM15 of KSOM16 medium (dag 4) (zie Materiaaltabel).
  4. Introduceer het CRISPR-mengsel (stap 1.3) in embryo's in het 1-celstadium die uit de muizen zijn geoogst door pronucleaire micro-injectie14 op 100 μL M2 bedekt met paraffineolie in een plastic schaal op een omgekeerde microscoop met een contrastverhogende optiek in de vroege tot late namiddag (video 1).
    OPMERKING: Pronucleaire micro-injectie van het CRISPR-mengsel werd uitgevoerd op embryo's in het 1-celstadium na 14-16 uur postcoïtum (p.c.). De geïnjecteerde embryo's werden gedurende enkele uren gekweekt in een 5% CO2-incubator en chirurgisch met 18-20 uur p.c. overgebracht naar ontvangende ICR-muizen die dezelfde ochtend een copulatieplug hadden.
  5. Breng 20-30 2-cel embryo's over in elke ontvanger om recombinante dieren te produceren.
    OPMERKING: Volg het algemene protocol14 of kweek die embryo's gedurende 4 dagen in mWM of KSOM-medium om de efficiëntie te valideren en de toxiciteit te onderzoeken. Toxiciteit van het CRISPR-mengsel is aanvaardbaar wanneer ten minste een derde van de geïnjecteerde embryo's vroeg in het volledig uitgebreide blastocyststadium komt met meerdere recombinanten onder hen. Tegelijkertijd bereikt meer dan 90% van de ongemanipuleerde embryo's hetzelfde blastocyststadium in een parallelle cultuur. Volg de stap 2.6-2.9 voor blastcystscreening die niet essentieel is, maar desgewenst kan worden gedaan om het slagingspercentage van HDR te kwantificeren.
  6. Individueel vroeg oppakken tot volledig geëxpandeerde blastocysten met 2 μL kweekmedium met behulp van een verstopte fijne pipetpunt met een micropipetter in enkele PCR-buizen (dag 8; Video 2).
  7. Lyse blastocysten in 8 μL vergistingsmengsel (hetzelfde als stap 3.2; zie Materiaaltabel) en verwerk bij 75 °C gedurende 10 minuten, 95 °C gedurende 5 minuten en koel vervolgens af tot 4 °C voor opslag. Gebruik 2 μL van het lysaat als sjabloon voor PCR in een totaal PCR-mengsel van 15 μL (stap 3).
  8. Onderzoek de werkzaamheid van de HDR door agarosegel-elektroforese17 van de PCR-monsters na restrictieve vertering met NlaIII (stap 3-5).
  9. Bevestig de status van gerichte recombinatie door de 668 bp amplicon17 in de oprichters en het daaropvolgende nageslacht te sequentiëren om de integriteit van de mutatie te bevestigen.

3. DNA-extractie

OPMERKING: Muizen op postnatale dag 10 werden gebruikt voor dit experiment als gevolg van plotselinge dood van GJA1-20k knock-out muis ongeveer 2-4 weken na de geboorte4. Een meer algemeen protocol kan ook worden toegepast naar aanleiding van eerder gepubliceerd rapport18.

  1. Knip 1-3 mm van de teen of staartpunt met een schone schaar en breng deze over naar een 0,2 ml 8-Strip PCR-buis. Om besmetting tussen de teen- of staartmonsters te voorkomen, gebruikt u een voorgezuiverde schaar of één mes per muis of reinigt u voorafgaand aan elk monster met 70% ethanol of 10% bleekmiddel. Als de staart na het bemonsteren bloedt, oefen dan korte druk uit met gaas om de bloeding te stoppen. Bewaar de staartmonsters bij -20 °C tot de extractie gedurende maximaal ongeveer een week.
  2. Voeg weefsellysisoplossing (zie materiaaltabel) toe in een buis van 100 μL/buis en meng goed, gevolgd door spin-down met een tafelmodel minicentrifuge (2.200 x g gedurende 10 s bij kamertemperatuur). Zorg ervoor dat de staartmonsters in de oplossing zijn ondergedompeld.
  3. Plaats de buizen op een thermische cycler die is ingesteld door het volgende programma; 75 °C gedurende 10 minuten (weefsellysis), 95 °C gedurende 5 minuten (inactivering) en 4 °C (vasthouden). Bewaar het weefsel lysaat bij 4 °C gedurende maximaal een week als PCR's niet onmiddellijk kunnen worden uitgevoerd.

4. DNA-amplificatie door PCR

  1. Bereid een PCR-oplossing met 5 μL nucleasevrije H2O, 0,75 μL van 10 μM voorwaartse en omgekeerde primers en 7,5 μL PCR-mastermix (zie Materialentabel) per monster in een nieuwe PCR-buis (zie tabel 1 voor primersequenties). Als er meerdere monsters zijn, schaal de inhoud dan tot aliquot 14 μL per buis.
  2. Voeg 1 μL van het weefsellysaat toe aan de in stap 3.1 bereide PCR-oplossing. Pas op dat u de staart niet aanraakt.
  3. Meng goed en draai af met een tafelmodel minicentrifuge (2.200 x g gedurende 10 s bij kamertemperatuur).
  4. Zet de buizen op een thermische cycler die is ingesteld door het onderstaande programma. Bewaar de PCR-producten bij 4 °C gedurende 1-2 maanden of ~1 jaar bij -20 °C.
    OPMERKING: 95 °C gedurende 3 minuten (stap 1, Initiële denaturatie), 95 °C gedurende 15 s (stap 2, Denaturatie), 60 °C gedurende 15 s (stap 2, Gloeien), 72 °C voor 45 s (stap 2, Extensie), herhaal stap 2 gedurende 35 cycli, 72 °C gedurende 10 minuten (stap 3, Definitieve extensie) en 4 °C (stap 4, Vasthouden).

5. Incubatie met restrictie-enzym

  1. Bereid de enzymoplossing met 7 μL nucleasevrij H2O, 2 μL 10x CutSmart-buffer en 1 μL NlaIII-restrictie-enzym (zie Materialentabel). Als er meerdere monsters zijn, vermenigvuldigt u elke inhoud om het mengsel te maken en aliquot 10 μL per buis.
  2. Voeg 10 μL PCR-product verkregen in stap 3 toe aan de enzymoplossing per buis.
  3. Meng goed en draai af met een tafelmodel minicentrifuge (2.200 x g gedurende 10 s bij kamertemperatuur).
  4. Plaats de buizen op een thermische cycler of warmteblok dat is ingesteld door het onderstaande programma. Bewaar het product na de incubatie bij 4 °C gedurende 1-2 maanden of ~1 jaar bij -20 °C.
    OPMERKING: 37 °C gedurende 16 uur (ten minste 2 uur; korte incubatietijd kan leiden tot onvoldoende splitsing) en 4 °C voor het vasthouden.

6. DNA-band detectie

  1. Bereid een 1,5% agarose gel met DNA-gelkleuring voor elektroforese.
    1. Voeg 0,75 g agarose toe in 50 ml 1x TAE-buffer gevolgd door mix en verwarm in de magnetron totdat agarose volledig oplost. Voeg na het afkoelen 5 μL DNA-kleuring toe en meng voorzichtig.
    2. Giet in de gelvorm (25 ml per vorm) en laat de gel stollen. Om een betere resolutie en scheiding te verkrijgen, verhoogt u de agaroseconcentratie naar 2,5% -4% indien nodig.
  2. Laad 10 μL verteerd PCR-product in de put. Meng indien nodig 6x laadbuffer.
  3. Laat de gel 35 min met 100 V lopen.
    OPMERKING: Deze parameters moeten mogelijk worden geoptimaliseerd.
  4. Beeld onder UV-licht (302 nm golflengte).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het CRISPR/Cas9-genbewerkingssysteem produceert een ATG naar TTA-mutatie en een stille TCC naar TCG-mutatie bij 56.264.279 tot 56.264.281 en bij 56.264.291 tot 56.264.293 op muischromosoom 10, of bij respectievelijk 869 tot 871 en 881 tot 883 op Gja1 mRNA. Die mutatie resulteert in een methionine 213 tot Leucine (M213L) mutatie op GJA1 eiwit en de TTC naar TTG mutatie verstoort een nabijgelegen PAM-sequentie om ongewenste geneditie te voorkomen (figuur 1). De details van de mutatie zijn besc...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een gen-gemodificeerd muismodel is een veel voorkomende benadering voor het begrijpen van de genfunctie. Omdat de intern vertaalde isovorm van GJA1-20k echter wordt vertaald uit hetzelfde Gja1-mRNA als Cx43 van volledige lengte, werd een creatieve strategie bedacht om de Cx43-expressie over de volledige lengte te behouden en toch de GJA1-20k-expressie te onderdrukken. De aanpak is gebaseerd op een mutatie van het interne startcodon van GJA1-20k. Met een single point mutatie werd M213 overgeschakeld naar L op

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het project werd ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (R01HL152691, R01HL138577 en R01HL159983) aan RMS.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.2 mL 8-Strip PCR tubeThomas Scientific1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0Invitrogen15575-038Voor pronucleaire micro-injectie buffer
10x CutSmart bufferNew England BiolabsB7204SDigestiebuffer voor NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7.5Invitrogen15567-027Voor pronucleaire micro-injectie buffer
50x TAE BufferInvitrogen24710-030
96-well Thermal cyclerApplied BiosystemsModel # 9902
AgaroseSigma-AldrichA9539
C57BL/6JThe Jackson Laboratory664muisstam
Chemidoc MP beeldvormingssysteemBio-radOm gelbeeld te maken met 302 nm UV-licht
eSpCas9-eiwitMilliporeSigmaESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x)New England BiolabsB7024SLaadbuffer voor elektroforese
Handschoenen
hCG (humaan choriongonadotropine)MilliporeSigma23-073-425G
HyaluronidaseMilliporeSigmaH3884-100MG
Image Lab-softwareBio-radOm gelbeeld te analyseren
Omgekeerde stereomicroscoop met plasDICZeissAxiovert A1
KAPA Mouse Genotyping KitsRoche DiagnosticsKK7352Voor weefsel- of cellyse, DNA-extractie en PCR-mastermix
KSOMLifeGlobalZEKS-050embryocultuurmedium
Lab coat
M2 mediumMilliporeSigmaMR015D
NlaIIINew England BiolabsR0125SOm PCR-product te verteren
Nuclease-vrij waterAmbionAM9937Om reagentia te verdunnen
ParaffineolieNacalai USA2613785
Plugged 20 μL fijne pipettipFisherScientific02-707-171Om blastocyten op te halen
PMSG (zwangerschapsserum van merrie)ProSpec-TanyHOR-272
NatriumchlorideInvitrogenAM9760GVoor pronucleaire micro-injectie buffer
SYBR safe DNA Gel StainInvitrogenS33102Om banden in gel te detecteren
tracrRNADharmaconU-002000-120Gids-RNA

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smyth, J. W., Shaw, R. M. Autoregulation of connexin43 gap junction formation by internally translated isoforms. Cell Reports. 5 (3), 611-618 (2013).
  2. Basheer, W. A., et al. GJA1-20k arranges actin to guide Cx43 delivery to cardiac intercalated discs. Circulation Research. 121 (9), 1069-1080 (2017).
  3. Fu, Y., et al. Cx43 isoform GJA1-20k promotes microtubule dependent mitochondrial transport. Frontiers in Physiology. 8, 905(2017).
  4. Xiao, S., et al. Auxiliary trafficking subunit GJA1-20k protects connexin-43 from degradation and limits ventricular arrhythmias. Journal of Clinical Investigation. 130 (9), 4858-4870 (2020).
  5. Syvanen, A. C. From gels to chips: "minisequencing" primer extension for analysis of point mutations and single nucleotide polymorphisms. Human Mutation. 13 (1), 1-10 (1999).
  6. Han, Y., et al. Genome-wide SNP discovery in tetraploid alfalfa using 454 sequencing and high resolution melting analysis. BMC Genomics. 12, 1-11 (2011).
  7. Han, Y., Khu, D. M., Monteros, M. J. High-resolution melting analysis for SNP genotyping and mapping in tetraploid alfalfa (Medicago sativa L.). Molecular Breeding. 29 (2), 489-501 (2012).
  8. Peng, B. Y., et al. A novel and quick PCR-based method to genotype mice with a leptin receptor mutation (db/db mice). Acta Pharmacologica Sinica. 39 (1), 117-123 (2018).
  9. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  10. Concordet, J. P., Haeussler, M. CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research. 46 (1), 242-245 (2018).
  11. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnology. 31 (9), 827-832 (2013).
  12. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  13. Paquet, D., et al. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9. Nature. 533 (7601), 125-129 (2016).
  14. Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K., Nagy, A. Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual. , (2014).
  15. Pomp, D., Critser, E. S., Rutledge, J. J. Lower sodium lactate in Whitten's medium improves in vitro developmental capacity of one-cell mouse embryos. Theriogenology. 29 (5), 1019-1025 (1988).
  16. Summers, M. C., McGinnis, L. K., Lawitts, J. A., Raffin, M., Biggers, J. D. IVF of mouse ova in a simplex optimized medium supplemented with amino acids. Human Reproduction. 15 (8), 1791-1801 (2000).
  17. Green, M. R. S. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Fourth Edition). , (2012).
  18. Koh, J. Y., Iwabuchi, S., Huang, Z., Harata, N. C. Rapid genotyping of animals followed by establishing primary cultures of brain neurons. Journal of Visualized Experiments. 95. (95), e51879(2015).
  19. Iyer, V., et al. No unexpected CRISPR-Cas9 off-target activity revealed by trio sequencing of gene-edited mice. PLoS Genetics. 14 (7), 1007503(2018).
  20. Nature Medicine. Keep off-target effects in focus. Nature Medicine. 24 (8), 1081(2018).
  21. Mayer, H. Optimization of the EcoRI-activity of EcoRI endonuclease. FEBS Letters. 90 (2), 341-344 (1978).
  22. Kozak, M. Point mutations close to the AUG initiator codon affect the efficiency of translation of rat preproinsulin in vivo. Nature. 308 (5956), 241-246 (1984).
  23. Kozak, M. Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell. 44 (2), 283-292 (1986).
  24. Basheer, W. A., et al. Stress response protein GJA1-20k promotes mitochondrial biogenesis, metabolic quiescence, and cardioprotection against ischemia/reperfusion injury. JCI Insight. 3 (20), 121900(2018).
  25. Shimura, D., et al. Protective mitochondrial fission induced by stress-responsive protein GJA1-20k. Elife. 10, 69207(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

CRISPR Cas9 genbewerkinginterne translatieconnexine 43Gja1 puntmutatiegenereren van muismodelPCR genotyperingrestrictie enzymdigestieagarosegelelektroforesezuivering van oligo donoreneffici ntie van genoombewerking

Gerelateerde artikelen