Methodenartikel

Een stapsgewijze methode om neutraliserende antilichamen tegen AAV te detecteren met behulp van een colorimetrische celgebaseerde test

DOI:

10.3791/63419

⸱

7 december 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Baker Heart and Diabetes Institute, 2Department of Physiology, Anatomy and Microbiology, La Trobe University, 3Florey Institute of Neuroscience and Mental Health, University of Melbourne, 4Department of Physiology, Centre for Muscle Research (CMR), The University of Melbourne, 5Department of Diabetes, Central Clinical School, Monash University, 6Baker Department of Cardiometabolic Health, The University of Melbourne, 7Department of Physiology and Department of Medicine Alfred Hospital, Monash University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Een uitgebreid laboratoriumprotocol en analyseworkflow worden beschreven voor een snelle, kosteneffectieve en eenvoudige colorimetrische celgebaseerde test om neutraliserende elementen tegen AAV6 te detecteren.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Recombinante adeno-geassocieerde virussen (rAAV) hebben bewezen een veilige en succesvolle vector te zijn voor het overbrengen van genetisch materiaal om verschillende gezondheidsproblemen in zowel het laboratorium als de kliniek te behandelen. Reeds bestaande neutraliserende antilichamen (NAbs) tegen AAV-capsiden vormen echter een voortdurende uitdaging voor de succesvolle toediening van gentherapieën in zowel grote dierexperimentele modellen als menselijke populaties. Voorlopige screening op gastheerimmuniteit tegen AAV is noodzakelijk om de werkzaamheid van op AAV gebaseerde gentherapieën te waarborgen als zowel een onderzoeksinstrument als een klinisch levensvatbaar therapeutisch middel. Dit protocol beschrijft een colorimetrische in vitro test om neutraliserende factoren tegen AAV serotype 6 (AAV6) te detecteren. De test maakt gebruik van de reactie tussen een AAV die codeert voor een alkalisch fosfatase (AP) reporter gen en het substraat NBT / BCIP, dat een onoplosbare kwantificeerbare paarse vlek genereert bij combinatie.

In dit protocol worden serummonsters gecombineerd met een AAV die AP tot expressie brengt en geïncubeerd om potentiële neutraliserende activiteit mogelijk te maken. Virusserummengsel wordt vervolgens toegevoegd aan cellen om virale transductie mogelijk te maken van eventuele AAV's die niet zijn geneutraliseerd. Het NBT/BCIP-substraat wordt toegevoegd en ondergaat een chromogene reactie, die overeenkomt met virale transductie en neutraliserende activiteit. Het aandeel van het gekleurde gebied wordt gekwantificeerd met behulp van een gratis softwaretool om neutraliserende titers te genereren. Deze test toont een sterke positieve correlatie tussen kleuring en virale concentratie. Beoordeling van serummonsters van schapen voor en na toediening van een recombinant AAV6 leidde tot een dramatische toename van de neutraliserende activiteit (125 tot >10.000-voudige toename). De test vertoonde voldoende gevoeligheid om neutraliserende activiteit te detecteren in >1:32.000 serumverdunningen. Deze test biedt een eenvoudige, snelle en kosteneffectieve methode om NAbs tegen AAV's te detecteren.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adeno-geassocieerde virussen (AAV) worden steeds vaker gebruikt als vectoren voor de levering van gentherapieën aan proefbehandelingen voor verschillende gezondheidsproblemen die van invloed zijn op het cardiovasculaire, pulmonale, circulatoire, oculaire en centrale zenuwstelsel1,2,3,4,5. De populariteit van AAV-vectoren als toonaangevend gentherapieplatform komt voort uit hun positieve veiligheidsprofiel, transgenexpressie op lange termijn en brede weefselspecifieke tropismen1,6. Succesvolle resultaten in dierstudies hebben de weg vrijgemaakt voor meer dan vijftig klinische onderzoeken naar AAV-gentherapie die met succes hun werkzaamheidseindpunten hebben bereikt7, evenals de release van het eerste commercieel beschikbare AAV-gentherapiegeneesmiddel dat is goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration8. Na de eerste successen is AAV blijven tractie krijgen in de basis- en klinische onderzoekssectoren als een vector bij uitstek en is het momenteel de enige in vivo gentherapie die is goedgekeurd voor klinisch gebruik in de VS en Europa9. Niettemin blijft de aanwezigheid van reeds bestaande neutraliserende antilichamen (NAbs) tegen AAV-vectorcapsiden een belemmering voor zowel preklinisch onderzoek als de werkzaamheid van klinische onderzoeken. NAbs zijn aanwezig in zowel naïeve menselijke als dierlijke populaties en remmen gentransductie na in vivo toediening van een AAV-vector1. AAV-seropositiviteit is een uitsluitingscriterium voor de meeste gentherapiestudies en daarom is voorlopige screening op gastheerimmuniteit cruciaal in zowel het laboratorium als de kliniek. Het opzetten van een test die de aanwezigheid van NAbs tegen AAV kan detecteren, is een essentiële stap in de pijplijn van elk op AAV-gentherapie gebaseerd onderzoeksproject. Dit rapport richt zich op AAV6 dat van belang is geweest voor onderzoekers vanwege de efficiënte en selectieve transductie in dwarsgestreepte spieren (hart- en skeletspieren)1,10,11,12. Gentherapie wordt beschouwd als een veelbelovende strategie voor het richten op het hart, omdat het moeilijk is om specifiek op het hart te richten zonder invasieve openhartprocedures.

Neutraliserende activiteit wordt meestal bepaald met behulp van een celgebaseerde in vitro of in vivo transductie remmingstest. In vivo NAb-assays omvatten meestal het toedienen van serum van een proefpersoon (bijv. Menselijk of groot dier) aan muizen, gevolgd door een AAV met een reporter-gen, gevolgd door testen op de expressie van het reporter-gen of het bijbehorende antigeen. In vitro assays bepalen NAb-titers door serum of plasma van een mens of groot dier in seriële verdunningen te incuberen met een recombinant AAV (rAAV) dat een reporter-gen tot expressie brengt. Cellen zijn geïnfecteerd met het serum/virusmengsel en de mate waarin de genexpressie van de reporter wordt geremd, wordt beoordeeld in vergelijking met controles. In vitro assays worden veel gebruikt voor NAb-screening vanwege hun relatief lagere kosten, snelheid bij het testen en grotere capaciteit voor standaardisatie en validatie13,14 in vergelijking met in vivo assays. Van in vivo assays wordt vaak gemeld dat ze een grotere gevoeligheid hebben15,16, maar dezelfde claim is gemaakt met betrekking tot in vitro assays14,17.

Tot op heden hebben in vitro NAb-assays voornamelijk luminescentie (luciferase) gebruikt als het reporter-gen om neutralisatie te detecteren. Hoewel een op licht gebaseerde methode in veel contexten verdienstelijk is, kan een colorimetrische / chromogene NAb-test in sommige omstandigheden voordelig zijn. Colorimetrische assays om neutralisatie te beoordelen zijn met succes gebruikt voor andere virussen zoals influenza en adenovirus18,19. Hun aantrekkelijkheid komt voort uit hun eenvoud, lagere kosten en de behoefte aan alleen alledaagse laboratoriumapparatuur en gereedschappen20. NAb-assays die een op luminescentie gebaseerd reporter-gen gebruiken, vereisen dure substraatkits, een luminometer en bijbehorende software voor analyse21. Deze colorimetrische test heeft het voordeel dat alleen een lichtmicroscoop en een zeer goedkoop substraat nodig zijn. Rapportage van de gevoeligheid van colorimetrische versus luminescente assays heeft tegenstrijdige resultaten opgeleverd. Eén studie suggereerde dat op luminescentie gebaseerde ELISA-assays een grotere gevoeligheid en vergelijkbare reproduceerbaarheid vertonen als colorimetrische assays22, terwijl een andere vond dat op colorimetrische gebaseerde ELISA-assays een grotere gevoeligheid verlenen23. Hier wordt een gedetailleerd protocol gegeven voor een in vitro NAb-test tegen AAV die gebruik maakt van de chromogene reactie tussen een AAV-codering van een alkalisch fosfatase (AP) reportergen en een nitroblauw tetrazolium / 5-broom-4-chloor-3-indolylfosfaat (NBT / BCIP) substraat. Dit stapsgewijze protocol is ontwikkeld op basis van een eerder rapport dat een hPLAP (human placental alkaline phosphatase) reporter gen (AAV6-hPLAP) gebruikte om neutraliserende activiteit tegen AAV24 te detecteren. Deze test is kosteneffectief, tijdbesparend, eenvoudig in te stellen en vereist minimale technische vaardigheden, laboratoriumapparatuur en reagentia. Bovendien geeft de eenvoud van deze test het potentieel om te worden geoptimaliseerd voor brede toepassingen in verschillende soorten cellen, weefsels of virale serotypen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle aspecten van dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Florey Institute of Neuroscience and Mental Health en de Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes volgens Reference25. Voor het onderzoek werden 1,5-3-jarige Merino-ooien gebruikt. Een schematisch overzicht van het testprotocol is te vinden in figuur 1.

figure-protocol-1
Figuur 1: Schematisch diagram van het NAb-assayprotocol. (A) Visuele weergave van de NAb-assay die de primaire stappen illustreert die betrokken zijn bij het driedaagse protocol. Kortom, cellen worden 's nachts gekweekt en verguld. De volgende dag worden seriële verdunningen van serum bereid, geïncubeerd met AAV en vervolgens 's nachts met de cellen geïncubeerd. De volgende dag worden cellen gefixeerd, gewassen, geïncubeerd, gecombineerd met het substraat en opnieuw geïncubeerd, gevolgd door beeldvorming en kwantificering. (B) Representatieve beelden van een minimale signaalcontrole (volledige AAV-remming), een maximale signaalcontrole (geen remming) en een ovineserummonster met ~50% signaalremming. Schaalbalk = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Eerste voorbereiding

  1. Voor beoordeling bij schapen: bloed verzamelen in 8 ml serumscheider stolsel activatorbuizen (zie Materialen tabel), laat het bloedmonster 20-30 minuten bij kamertemperatuur (RT) staan en draai vervolgens gedurende 15 minuten af bij 2.100 x g . Het heldere supernatant dat zich aan de bovenkant van de buisjes vormt, is serum. Vul de heldere waterige fase in microcentrifugebuizen en bewaar bij -80 °C.
    OPMERKING: Het serum bij -80 °C blijft ~5 jaar stabiel. Bloed werd verzameld uit de halsslagader met behulp van een naald van 16 G (tip cut-off) en spuit van bewuste dieren.
  2. Verwarm foetaal runderserum (FBS) door het gedurende 30 minuten in een waterbad bij 56 °C te plaatsen en met tussenpozen te wervelen. Plaats voor de precisie een thermometer in een tweede fles met een equivalent volume water en voeg deze tegelijkertijd met de FBS-fles toe aan het warmtebad. Begin met de timing wanneer de thermometer 56 °C bereikt.
  3. Gebruik de juiste aseptische techniek en celkweekpraktijk voor alle volgende stappen die worden uitgevoerd in de celkweek hood26,27. Spuit voor gebruik 70% ethanol op alle voorwerpen en de kap en reinig na voltooiing met 1% natriumhypochloriet.
  4. Maak Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) compleet door hoge glucose (4,5 g/L) DMEM (89%) te combineren met warmte-geïnactiveerde FBS (10%) en Penicilline Streptomycine (1%). Combineer en filter met behulp van een steriel vacuümfiltratiesysteem (poriegrootte van 0,22 μm, polyethersulfonmembraan) (zie Materiaaltabel). Bewaar complete DMEM gewikkeld in folie bij 4 °C.
  5. Stel HT1080-cellen op (zie Materiaaltabel) en doorgang in een vierkante kolf van 75 cm2 zoals beschreven in Referentie28. Maak meerdere bevroren voorraden cellen. Gebruik geen cellen na 20 passages, omdat verdere passageing de testresultaten kan beïnvloeden.

2. Dag 1 - Plating van cellen

  1. Passage HT1080-cellen wanneer ze ~ 80% confluentie bereiken.
  2. Verwarm volledige DMEM (bereid in stap 1.4), 0,05% trypsine-EDTA en 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) tot 37 °C in een waterbad. Verwijder het groeimedium uit gepasseerde cellen met behulp van een aspiratiesysteem.
    OPMERKING: Alle aspiraties in dit protocol maken gebruik van een vacuümsysteem met een buis bevestigd aan een steriele serologische pipet van 5 ml.
  3. Was de cellen in 10 ml voorverwarmde (37 °C) 1x PBS en trypsinize cellen gedurende 3-4 minuten in 4 ml voorverwarmde 0,05% trypsine-EDTA om de cellen los te maken van de kolf.
  4. Inactiveer de trypsine door 6 ml voorverwarmde complete DMEM toe te voegen en pipetteer de cellen in een buis van 50 ml. Bereken het aantal en de concentratie van levensvatbare cellen met behulp van een hemocytometer en de trypan blue exclusion methode29.
  5. Verdun de cellen tot een concentratie van 1 x 105 cellen/ml in voorverwarmde complete DMEM. Zaai 100 μL cellen/goed in heldere 96-put platbodemplaten (1 x 104 cellen per put). Incubeer de plaat bij 37 °C, 5% koolstofdioxide (CO2) gedurende 16-22 uur.

3. Dag 2 - Infecteren van de cellen

  1. Verwijder plaat (en) uit de incubator en gebruik een lichtmicroscoop om te bevestigen dat cellen gelijkmatig in de putten zijn verspreid en dat de samenvloeiing ~ 50% is. Als cellen zich niet binnen een bereik van 45% -55% confluentie bevinden, herhaal dan het 'Dag 1'-protocol en pas de initiële celconcentratie dienovereenkomstig aan.
  2. Genereer seriële verdunningen van de serummonsters van belang in microcentrifugebuizen van 1,5 ml met behulp van voorverwarmde complete DMEM als verdunningsmiddel. Tabel 1 toont de generatie van een verdunningscascade voor drievoudige monsters.
    1. Om de test in drievoud uit te voeren, bereidt u een 7,5 x 106 vectorgenomen (vg)/μL werkoplossing van AAV6-hPLAP (zie Materiaaltabel) voor door een virusvoorraadoplossing in 1x PBS te verdunnen.
    2. Voeg 66 μL van de 7,5 x 106 vg/μL viruswerkoplossing toe aan elke buis met 264 μL serum/mediaverdunning (330 μL totaal volume/verdunning, zie tabel 1).
      OPMERKING: Dit is een robuuste test die geen perfecte kweekomstandigheden vereist. Om echter nauwkeurig te kwantificeren en ervoor te zorgen dat elke testrun betrouwbaar is, is het noodzakelijk om het volgende op te nemen: (1) een virus- en mediacontrolecontrole, (2) een media-only controle en (3) een NAb-positief controlemonster op alle platen onder dezelfde experimentele omstandigheden. Het beschreven volume (330 μL) is goed voor drievoudige monsters +10% van het serum- en virusmengsel. Het uitvoeren van replicaties wordt ten zeerste aanbevolen voor de nauwkeurige bepaling van neutraliserende activiteit.
  3. Meng het virus/serum verdunningen door te pipetteren en plaats de buisjes met het virus/serummengsel in een incubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 30 minuten om mogelijke neutralisatie mogelijk te maken.
  4. Pipetteer 100 μL van het virus/serummengsel naar elke put op de 96-putplaat met 1 x 104 cellen/putje voor elke verdunning.
    OPMERKING: Dit zal een uiteindelijke virale concentratie van 15k virussen / celmultipliciteit van infectie (MOI) in elke put genereren. Tabel 2 geeft een voorbeeld van een 96-put monsterplaatindeling voor het beoordelen van monsters tot een 1/512 verdunning.
  5. Wikkel de 96-well plaat met cellen, serum en AAV-hPLAP in folie en plaats in een incubator bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 16-24 uur om AAV toegang tot de cellen mogelijk te maken.
Cascadelabel verdunningVerdunning3 x monster (240 μL) + 10% buffervolume (24 μL)Verhouding van serum:media
Verdunning 1 (D1)1/2264 μL serum 264 μL media50:50
Verdunning 2 (D2)1/4264 μL D1 + 264 μL media25:75
Verdunning 3 (D3)1/8264 μL D2 +264μL media12.5:87.5
Verdunning 4 (D4)1/16264 μL D3 +264 μL media6.25:93.75
Verdunning 5 (D5)1/32264 μL D4 +264 μL media3.13:96.87
Verdunning 6 (D6)1/64264 μL D5 +264 μL media1.56:98.44
Verdunning 7 (D7)1/128264 μL D5 +264 μL media0.78:99.22
Verdunning 8 (D8)1/256264 μL D5 +264 μL media0.39:99.61
Verdunning 9 (D9)1/512264 μL D7 + 264 μL media0.2:99.8
Verdunning 10 (D10)1/2048132 μL D8 + 396 μL media0.05:99.95
Verdunning 11 (D11)1/8192132 μL D9 + 396 μL media0.01:99.99
Verdunning 12 (D12)1/32768132 μL D10 + 396 μL media0.003:99.997

Tabel 1: Volumes serum en verdunningsmiddel die nodig zijn om seriële verdunningen van serum in drievoud te genereren.

Serummonster #1Serummonster #2Serummonster #3Mono AB (mAB), controles en extra monsters
123456789101112
Een1/21/21/21/21/21/21/21/21/250 ng MAb50 ng MAb50 ng MAb
B1/41/41/41/41/41/41/41/41/45 ng MAb5 ng MAb5 ng MAb
C1/81/81/81/81/81/81/81/81/80,5 ng MAb0,5 ng MAb0,5 ng MAb
D1/161/161/161/161/161/161/161/161/16MA (-C)MA (-C)MA (-C)
E1/321/321/321/321/321/321/321/321/32VO (+C)VO (+C)VO (+C)
F1/641/641/641/641/641/641/641/641/64Voorbeeld #1 1/512Voorbeeld #1 1/512Voorbeeld #1 1/512
G1/2561/2561/2561/2561/2561/2561/2561/2561/256Voorbeeld #2 1/512Voorbeeld #2 1/512Voorbeeld #2 1/512
H1/5121/5121/5121/5121/5121/5121/5121/5121/512Voorbeeld #3 1/512Voorbeeld #3 1/512Voorbeeld #3 1/512

Tabel 2: Voorbeeld 96-putplaatindeling voor het beoordelen van naïeve serummonsters in verdunningen variërend van 1/2 tot 1/512. Hogere verdunningen worden in de test opgenomen als een monster wordt beoordeeld waarvan bekend is dat het positief is voor AAV NAbs (monsters na toediening) of als een hogere titer vereist is. MO (-C): Controle alleen media. VO (+C): Virus en media controleren alleen. mAb: Monoklonaal antilichaam tegen AAV (NAb positieve controle).

4. Dag 3 - Fixeren en toevoegen van substraat aan de cellen

  1. Verwarm een aliquot van 1x PBS voor tot 37 °C (~25 ml/96-well plaat). Koel afzonderlijke aliquots van PBS (~ 25 ml / 96-well plaat) en dubbel gedestilleerde H2O (DDW, ~ 25 ml / 96-well plaat) tot 4 ° C. Los een pellet BCIP/NBT (zie Tabel met materialen) op in 10 ml DDW in een conische centrifugebuis van 50 ml door vortexing (10 ml is voldoende voor 2 x 96 putplaten).
  2. Zuig de media uit de putten van de 96-putplaat op met behulp van een serologische pipet of iets dergelijks dat is bevestigd aan een op zuiging gebaseerd aspiratiesysteem of zuurkastvacuüm. Plaats voorzichtig de punt van de serologische pipet in de put en verwijder de media en wees voorzichtig om de aangehechte cellen niet te verstoren.
    1. Voeg 50 μL RT 4% PFA toe aan elke put met behulp van een pipet. Wikkel de plaat in folie en laat het 10 minuten bij RT staan om de cellen te fixeren.
      LET OP: Paraformaldehyde (PFA) is waarschijnlijk carcinogeen en giftig door huid- of oogcontact of inademing. Handvat in een zuurkast met de juiste persoonlijke beschermingsmiddelen en een mondkapje. Maak verse 4% PFA verdund in PBS (~ 7 ml vereist per 96-well plaat).
  3. Was en aspirateer de cellen met 200 μL RT 1x PBS. Herhaal deze stap twee keer.
    OPMERKING: Een meerkanaalspipet is een efficiënte optie voor de pipetteerstappen.
  4. Pipetteer 200 μL voorverwarmd PBS in elke put, wikkel de plaat in folie en incubeer bij 65 °C gedurende 90 minuten om de endogene alkalische fosfatase-activiteit te denatureren30.
  5. Zuig putten en wascellen op met 200 μL koude (4 °C) PBS. Opnieuw aspirateren, 200 μl koude DDW inspoelen en opnieuw aspirateren.
  6. Pipetteer 50 μL van het opgeloste BCIP/NBT (bereid in stap 4.1) in elke put.
  7. Wikkel de plaat in folie en incubeer bij RT gedurende 2-24 uur.
    OPMERKING: Wees consistent met de incubatietijd tussen runs; de tijdflexibiliteit stelt gebruikers in staat om putten te fotograferen op dag 3 of de volgende dag.
  8. Maak met behulp van een lichtmicroscoopcamera foto's van elke put met behulp van een 4x objectieflens, zodat dezelfde belichting, witbalans en lichtinstellingen consistent worden gebruikt voor alle uitgevoerde tests.
    1. Plaats elke put identiek en zorg ervoor dat de randen van de put niet zichtbaar zijn op de foto's. Sla foto's op in TIF-indeling of iets dergelijks.
      OPMERKING: Specifieke instellingen variëren tussen microscopen, maar kwantificering zal het meest effectief zijn als de achtergrondverlichting hoog en consistent is in de putten (figuur 1B).

5. Kwantificering om de neutraliserende activiteit te bepalen met ImageJ

  1. Download en installeer de gratis beschikbare software "ImageJ" (zie Materiaaltabel).
  2. Open de te analyseren afbeelding in ImageJ door Bestand > Openen (Afbeelding 2) te selecteren.
  3. Als u gekleurde afbeeldingen gebruikt, converteert u deze naar grijswaarden door Afbeelding > Type > 8-bits te selecteren.
  4. Klik op Afbeelding > > drempel aanpassen. Pas de drempel aan totdat alle gekleurde gebieden rood zijn gekleurd, maar de achtergrond niet. Na toevoeging van NBT/BCIP zal het gekleurde product zich afzetten in het gebied rond de cellen dat hPLAP tot expressie brengt.
    OPMERKING: Het wordt aanbevolen om dezelfde drempelinstelling te gebruiken voor alle afbeeldingen die op dezelfde plaat zijn vastgelegd.
  5. Klik op Analyseren > Metingen instellen en vink de selectievakjes Gebied, Beperken tot drempel, Gebiedsfractie en Label weergeven aan en klik op OK.
  6. Om de signaalaflezing (percentage van de kleuring) van een bepaalde put te bepalen, klikt u op Analyseren > meten. In de kolom '% Gebied' van het pop-upvenster wordt de signaallezing weergegeven.
  7. Voer kwantificering uit voor alle monsterreplicaties. Sluit verontreinigde putten, putten met een ongelijke celverdeling of putten die variëren in celdichtheid of verlichting uit.
    OPMERKING: Zie aanvullende figuur 1 voor voorbeelden van putten die in aanmerking moeten worden genomen voor uitsluiting. Meestal kunnen 3-4 putten uitsluiting van een 96-putplaat vereisen. Figuur 2 geeft een visuele weergave van het kwantificeringsproces met behulp van ImageJ.

figure-protocol-2
Figuur 2: Stappen voor het bepalen van de procentuele kleuring met behulp van ImageJ-software. (A) Open de afbeelding die moet worden geanalyseerd met ImageJ-software. (B) Converteer de afbeelding naar 8-bits grijswaarden. (C) Open het drempelvenster. (D) Pas de maximale drempel aan zodat alle gekleurde gebieden bedekt zijn, maar het achtergrondgebied niet (deze drempel moet consistent zijn over een hele plaat). (E) Selecteer de dropbox 'Analyseren', klik op 'Metingen instellen' en vink 'Gebied', 'Gebiedsfractie', 'Limietdrempel' en 'Weergavelabel' aan en klik op 'OK'. (F) Klik op "Maatregel" om het betrokken gebied te meten. Het gebied % geeft het deel van de afbeelding aan dat is gekleurd. Dit kan vervolgens worden gebruikt met de controlemonsters om de TI50-titer te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

6. Bepaling van de titer transductieremming (TI50)

  1. Bepaal de gemiddelde uitlezing van replicaties (met behulp van de stappen die worden beschreven in stap 5) voor het volgende: (1) Alleen mediacontrole (basislijnsignaaluitlezing). (2) Virus + media alleen controle (maximale signaalaflezing). (3) Virus + serummonsters van belang.
  2. Bereken het remmingspercentage met behulp van de volgende formule:
    100 - [(Signaaluitlezing van het testmonster (virus + interessant serummonster) - basislijnsignaaluitlezing (alleen mediacontrole)) / (maximale signaaluitlezing (alleen media en virus) - basislijnsignaaluitlezing) x 100] = % transductieremming13.
  3. Bereken de % transductieremming van alle replicaties van elke verdunning voor alle monsters met behulp van de formule in punt 6.2. Bepaal de gemiddelde transductieremming tussen de technische replicaties voor elke verdunning voor alle monsters en controles.
  4. Bereken de 50% transductieremmingtiter (TI50-titer ) van een interessant monster door de laagste verdunning van het monster te bepalen die 50% of meer transductieremming van hPLAP-activiteit oplevert. Bijvoorbeeld, als een 1/8 verdunning van een monster meer dan 50% transductieremming heeft op basis van de berekening uitgevoerd in 6.2 (en een 1/4 verdunning niet), rapporteer de TI50-titer als 1/8.

7. Bepaling van geneutraliseerde AAV-deeltjes

  1. Bereken het aantal geneutraliseerde AAV-deeltjes per μL serum voor een bepaald monster met behulp van de volgende formule:
    ((MOI x celtelling/put) / (volume serum/verdunningsfactor van TI50 titer)) / 2 = geneutraliseerde AAV-deeltjes / μL serum9.
    OPMERKING: Delen door 2 houdt rekening met de TI50 die 50% van de geneutraliseerde deeltjes meet. Voor een monster dat een TI50-titer van 1/4 (25% serum, 75% verdunningsmiddel) geeft waarin de test 80 μL onverdund serum en een MOI van 15k op 1 x 104 cellen gebruikte, zou de volgende berekening worden gebruikt: ((15000 x 10000) / (80/4)) / 2 = 3,75x106 geneutraliseerde deeltjes / μL serum.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transductietest om de optimale virale dosering voor plaatdekking vast te stellen
HT1080-cellen, een gevestigde fibrosarcoomcellijn, werden geselecteerd voor deze test. Een concentratie van 1 x 104 HT1080 cellen/put leverde ~50% celconfluentie in elke put van een 96-putplaat. Om de optimale virale concentratie voor de test te bepalen, werd een rAAV die codeert voor een hPLAP (human placental alkaline phosphatase) reporter gen (AAV6-hPLAP)31 toegevoegd in drievoud bij ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit rapport beschrijft een colorimetrische test die de mate van AAV-neutralisatie in een bepaald serummonster beoordeelt door een chromogene reactie te evalueren die overeenkomt met de mate van in vitro virale transductie. De ontwikkeling van het protocol was gebaseerd op de bekende chromogene reactie tussen het enzym alkalische fosfatase en NBT/BCIP, die op grote schaal is gebruikt als kleuringsinstrument voor de detectie van eiwitdoelen in toepassingen zoals immunohistochemie en als een reportertool voor het e...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd gefinancierd door een National Health and Medical Research Council Project Grant aan JRM en CJT (ID 1163732) en gedeeltelijk door het Operational Infrastructure Support Program van de Victoriaanse overheid. SB wordt ondersteund door een gezamenlijke Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University Doctoral Scholarship. KLW wordt ondersteund door The Shine On Foundation en een Future Leader Fellowship van de National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM wordt ondersteund door een National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (ID 1078985).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.05% Trypsin/EDTAGibco25300-054
50 mL conische centrifugeerbuisFalcon14-432-22Of gelijkwaardig
75 cm2 vierkante flessenFalcon353136Of gelijkwaardig
96-wels plaat met platte bodemFalcon353072
AAV6-CMV-hPLAP VectorMuscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP kan op aanvraag worden geleverd.
Aluminiumfolie
Anti-AAV6 (intacte deeltje) muis monoklonaal antilichaam, (ADK6)PROGEN610159Positieve controle monoklonaal antilichaam
BCIP/NBTSIGMAFASTB5655
Veiligheidskast voor cel- en weefselkweek
Elektronische pipetten5 & 10 mL stripette inserts
Fetaal runderserumGibco10099-141
Hemocytometer
Hoge glucose Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM)Gibco11965118
HT1080 cellenATCC
ImageJ SoftwareGratis beschikbaar: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Incubator37 °C, 5% CO2
Lichtmicroscoop met cameraBeschikt over een 4x objectieflens
OvenVoor een 65 °C incubatie
ParaformaldehydeMERCK30525-89-4
Penicilline StreptomycineGibco15140-122
Fosfaat gebufferd zoutoplossing
Pipetten en punten20 μL, 200 μL & 1 mL enkele pipetten en punten & 200 μL multikanaals pipet
Stericup snel los te koppelen filterMilliporeS2GPU10REGebaat voor het combineren van media reagentia
Trypan blauwe oplossingSigma-AldrichT8154
VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator CoagulantGreiner BIO-ONE455071Gebaat voor serum verzameling & verwerking van schapen
Waterbad

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
  2. Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M. Ocular gene therapy with adeno-associated virus vectors: current outlook for patients and researchers. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 15 (3), 396-399 (2020).
  3. Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system. Journal of Neurodevelopmental Disorders. 10 (1), 16(2018).
  4. Guggino, W. B., Cebotaru, L. Adeno-Associated Virus (AAV) gene therapy for cystic fibrosis: Current barriers and recent developments. Expert Opinion on Biological Therapy. 17 (10), 1265-1273 (2017).
  5. Perrin, G. Q., Herzog, R. W., Markusic, D. M. Update on clinical gene therapy for hemophilia. Blood. 133 (5), 407-414 (2019).
  6. Wang, D., Tai, P. W. L., Gao, G. Adeno-associated virus vector as a platform for gene therapy delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (5), 358-378 (2019).
  7. Kuzmin, D. A., et al. The clinical landscape for AAV gene therapies. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (3), 173-174 (2021).
  8. Russell, S., et al. Efficacy and safety of voretigene neparvovec (AAV2-hRPE65v2) in patients with RPE65-mediated inherited retinal dystrophy: A randomised, controlled, open-label, phase 3 trial. Lancet. 390 (10097), 849-860 (2017).
  9. Weber, T. Anti-AAV Antibodies in AAV gene therapy: Current challenges and possible solutions. Frontiers in Immunology. 12, 658399(2021).
  10. Weeks, K. L., et al. Phosphoinositide 3-kinase p110alpha is a master regulator of exercise-induced cardioprotection and PI3K gene therapy rescues cardiac dysfunction. Circulation: Heart Failure. 5 (4), 523-534 (2012).
  11. Gregorevic, P., et al. Systemic delivery of genes to striated muscles using adeno-associated viral vectors. Nature Medicine. 10 (8), 828-834 (2004).
  12. Bernardo, B. C., et al. Gene delivery of medium chain acyl-coenzyme A dehydrogenase induces physiological cardiac hypertrophy and protects against pathological remodelling. Clinical Science (London). 132 (3), 381-397 (2018).
  13. Meliani, A., et al. Determination of anti-adeno-associated virus vector neutralizing antibody titer with an in vitro reporter system. Human Gene Therapy Methods. 26 (2), 45-53 (2015).
  14. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  15. Wang, D., et al. Adeno-Associated virus neutralizing antibodies in large animals and their impact on brain intraparenchymal gene transfer. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 11, 65-72 (2018).
  16. Wang, M., et al. Prediction of adeno-associated virus neutralizing antibody activity for clinical application. Gene Therapy. 22 (12), 984-992 (2015).
  17. Kruzik, A., et al. Detection of biologically relevant low-titer neutralizing antibodies against adeno-associated virus require sensitive in vitro assays. Human Gene Therapy Methods. 30 (2), 35-43 (2019).
  18. Lehtoranta, L., Villberg, A., Santanen, R., Ziegler, T. A novel, colorimetric neutralization assay for measuring antibodies to influenza viruses. Journal of Virological Methods. 159 (2), 271-276 (2009).
  19. Johnston, P. B., Grayston, J. T., Loosli, C. G. Adenovirus neutralizing antibody determination by colorimetric assay. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 94 (2), 338-343 (1957).
  20. Xiaoli Zhu, T. G. Nano-Inspired Biosensors for Protein Assay with Clinical Applications. , Elsevier. 237-264 (2019).
  21. Jungmann, A., Muller, O., Rapti, K. Cell-based measurement of neutralizing antibodies against adeno-associated virus (AAV). Methods in Molecular Biology. 1521, 109-126 (2017).
  22. Samineni, S., et al. Optimization, comparison, and application of colorimetric vs. chemiluminescence based indirect sandwich ELISA for measurement of human IL-23. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 27 (2), 183-193 (2006).
  23. Siddiqui, J., Remick, D. G. Improved sensitivity of colorimetric compared to chemiluminescence ELISAs for cytokine assays. Journal of Immunoassay and Immunochemistry. 24 (3), 273-283 (2003).
  24. Arnett, A. L., Garikipati, D., Wang, Z., Tapscott, S., Chamberlain, J. S. Immune responses to rAAV6: The Influence of canine parvovirus vaccination and neonatal administration of viral vector. Frontiers in Microbiology. 2, 220(2011).
  25. National Health and Medical Research Council. Australian code for the care and use of animals for scientific purposes. National Health and Medical Research Council. , Canberra, Australia. Available from: https://www.nhmrc.gov.au/about-us/publications/australian-code-care-and-use-animals-scientific-purposes (2013).
  26. Coecke, S., et al. Guidance on good cell culture practice. A report of the second ECVAM task force on good cell culture practice. Alternatives to Laboratory Animals. 33 (3), 261-287 (2005).
  27. Journal of Visualized Experiments. General Laboratory Techniques. Journal of Visualized Experiments Database. , (2018).
  28. AAV-HT1080 Cells. Stratagene. , Available from: https://www.chem-agilent.com/pdf/strata/240109.pdf (2003).
  29. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Current Protocols in Immunology. 111 (3), 1-3 (2015).
  30. Bieber, S., et al. Extracorporeal delivery of rAAV with metabolic exchange and oxygenation. Scientific Reports. 3, 1538(2013).
  31. Winbanks, C. E., Beyer, C., Qian, H., Gregorevic, P. Transduction of skeletal muscles with common reporter genes can promote muscle fiber degeneration and inflammation. PLoS One. 7 (12), 51627(2012).
  32. Thomas, C. J., et al. Evidence that the MEK/ERK but not the PI3K/Akt pathway is required for protection from myocardial ischemia-reperfusion injury by 3',4'-dihydroxyflavonol. European Journal of Pharmacology. 758, 53-59 (2015).
  33. Barger, A., et al. Use of alkaline phosphatase staining to differentiate canine osteosarcoma from other vimentin-positive tumors. Veterinary Pathology. 42 (2), 161-165 (2005).
  34. Gregorevic, P., et al. Evaluation of vascular delivery methodologies to enhance rAAV6-mediated gene transfer to canine striated musculature. Molecular Therapy. 17 (8), 1427-1433 (2009).
  35. Sharma, A., Ghosh, A., Hansen, E. T., Newman, J. M., Mohan, R. R. Transduction efficiency of AAV 2/6, 2/8 and 2/9 vectors for delivering genes in human corneal fibroblasts. Brain Research Bulletin. 81 (2-3), 273-278 (2010).
  36. Smejkal, G. B., Kaul, C. A. Stability of nitroblue tetrazolium-based alkaline phosphatase substrates. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (9), 1189-1190 (2001).
  37. Falese, L., et al. Strategy to detect pre-existing immunity to AAV gene therapy. Gene Therapy. 24 (12), 768-778 (2017).
  38. Orlowski, A., et al. Successful transduction with AAV Vectors after selective depletion of anti-aav antibodies by immunoadsorption. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 16, 192-203 (2020).
  39. Goossens, K., et al. Differential microRNA expression analysis in blastocysts by whole mount in situ hybridization and reverse transcription quantitative polymerase chain reaction on laser capture microdissection samples. Analytical Biochemistry. 423 (1), 93-101 (2012).
  40. Entrican, G., Wattegedera, S. R., Griffiths, D. J. Exploiting ovine immunology to improve the relevance of biomedical models. Molecular Immunology. 66 (1), 68-77 (2015).
  41. Walters, E. M., Prather, R. S. Advancing swine models for human health and diseases. Molecular Medicine. 110 (3), 212-215 (2013).
  42. Rapti, K., et al. Neutralizing antibodies against AAV serotypes 1, 2, 6, and 9 in sera of commonly used animal models. Molecular Therapy. 20 (1), 73-83 (2012).
  43. Tellez, J., et al. Characterization of naturally-occurring humoral immunity to AAV in sheep. PLoS One. 8 (9), 75142(2013).
  44. Gupta, S., et al. Recommendations for the validation of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody immune responses elicited against biological therapeutics. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 55 (5), 878-888 (2011).
  45. Gupta, S., et al. Recommendations for the design, optimization, and qualification of cell-based assays used for the detection of neutralizing antibody responses elicited to biological therapeutics. Journal of Immunological Methods. 321 (1-2), 1-18 (2007).
  46. Shankar, G., et al. Recommendations for the validation of immunoassays used for detection of host antibodies against biotechnology products. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 48 (5), 1267-1281 (2008).
  47. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. Center for Drug Evaluation and Research (CDER). Immunogenicity Testing of Therapeutic Protein Products — Developing and Validating Assays for Anti-Drug Antibody Detection. U.S. Department of Health and Human Services Food and Drug Administration. , (2019).
  48. Baatartsogt, N., et al. A sensitive and reproducible cell-based assay via secNanoLuc to detect neutralizing antibody against adeno-associated virus vector capsid. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 22, 162-171 (2021).
  49. Watano, R., Ohmori, T., Hishikawa, S., Sakata, A., Mizukami, H. Utility of micro mini pigs for evaluating liver-mediated gene expression in the presence of neutralizing antibody against vector capsid. Gene Therapy. 27 (9), 427-434 (2020).
  50. Majowicz, A., et al. Therapeutic hFIX activity achieved after single AAV5-hFIX treatment in Hemophilia B patients and NHPs with pre-existing anti-AAV5 NABs. Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 14, 27-36 (2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Detectie van neutraliserende antilichamenAAV6 colorimetrische assayrecombinant AAVserumneutralisatiealkalische fosfatase reportervirale transductieImageJ analysemultiplicity of infectionmonoklonaal antilichaam assay

Gerelateerde artikelen