Een uitgebreid laboratoriumprotocol en analyseworkflow worden beschreven voor een snelle, kosteneffectieve en eenvoudige colorimetrische celgebaseerde test om neutraliserende elementen tegen AAV6 te detecteren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een stapsgewijze methode om neutraliserende antilichamen tegen AAV te detecteren met behulp van een colorimetrische celgebaseerde test
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Recombinante adeno-geassocieerde virussen (rAAV) hebben bewezen een veilige en succesvolle vector te zijn voor het overbrengen van genetisch materiaal om verschillende gezondheidsproblemen in zowel het laboratorium als de kliniek te behandelen. Reeds bestaande neutraliserende antilichamen (NAbs) tegen AAV-capsiden vormen echter een voortdurende uitdaging voor de succesvolle toediening van gentherapieën in zowel grote dierexperimentele modellen als menselijke populaties. Voorlopige screening op gastheerimmuniteit tegen AAV is noodzakelijk om de werkzaamheid van op AAV gebaseerde gentherapieën te waarborgen als zowel een onderzoeksinstrument als een klinisch levensvatbaar therapeutisch middel. Dit protocol beschrijft een colorimetrische in vitro test om neutraliserende factoren tegen AAV serotype 6 (AAV6) te detecteren. De test maakt gebruik van de reactie tussen een AAV die codeert voor een alkalisch fosfatase (AP) reporter gen en het substraat NBT / BCIP, dat een onoplosbare kwantificeerbare paarse vlek genereert bij combinatie.
In dit protocol worden serummonsters gecombineerd met een AAV die AP tot expressie brengt en geïncubeerd om potentiële neutraliserende activiteit mogelijk te maken. Virusserummengsel wordt vervolgens toegevoegd aan cellen om virale transductie mogelijk te maken van eventuele AAV's die niet zijn geneutraliseerd. Het NBT/BCIP-substraat wordt toegevoegd en ondergaat een chromogene reactie, die overeenkomt met virale transductie en neutraliserende activiteit. Het aandeel van het gekleurde gebied wordt gekwantificeerd met behulp van een gratis softwaretool om neutraliserende titers te genereren. Deze test toont een sterke positieve correlatie tussen kleuring en virale concentratie. Beoordeling van serummonsters van schapen voor en na toediening van een recombinant AAV6 leidde tot een dramatische toename van de neutraliserende activiteit (125 tot >10.000-voudige toename). De test vertoonde voldoende gevoeligheid om neutraliserende activiteit te detecteren in >1:32.000 serumverdunningen. Deze test biedt een eenvoudige, snelle en kosteneffectieve methode om NAbs tegen AAV's te detecteren.
Inleiding
Adeno-geassocieerde virussen (AAV) worden steeds vaker gebruikt als vectoren voor de levering van gentherapieën aan proefbehandelingen voor verschillende gezondheidsproblemen die van invloed zijn op het cardiovasculaire, pulmonale, circulatoire, oculaire en centrale zenuwstelsel1,2,3,4,5. De populariteit van AAV-vectoren als toonaangevend gentherapieplatform komt voort uit hun positieve veiligheidsprofiel, transgenexpressie op lange termijn en brede weefselspecifieke tropismen1,6
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle aspecten van dierverzorging en experimenten werden uitgevoerd volgens de richtlijnen van het Florey Institute of Neuroscience and Mental Health en de Australian Code for the Care and Use of Animals for Scientific Purposes volgens Reference25. Voor het onderzoek werden 1,5-3-jarige Merino-ooien gebruikt. Een schematisch overzicht van het testprotocol is te vinden in figuur 1.
Figuur 1: Schematisc....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Transductietest om de optimale virale dosering voor plaatdekking vast te stellen
HT1080-cellen, een gevestigde fibrosarcoomcellijn, werden geselecteerd voor deze test. Een concentratie van 1 x 104 HT1080 cellen/put leverde ~50% celconfluentie in elke put van een 96-putplaat. Om de optimale virale concentratie voor de test te bepalen, werd een rAAV die codeert voor een hPLAP (human placental alkaline phosphatase) reporter gen (AAV6-hPLAP)31 toegevoegd in drievoud bij .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit rapport beschrijft een colorimetrische test die de mate van AAV-neutralisatie in een bepaald serummonster beoordeelt door een chromogene reactie te evalueren die overeenkomt met de mate van in vitro virale transductie. De ontwikkeling van het protocol was gebaseerd op de bekende chromogene reactie tussen het enzym alkalische fosfatase en NBT/BCIP, die op grote schaal is gebruikt als kleuringsinstrument voor de detectie van eiwitdoelen in toepassingen zoals immunohistochemie en als een reportertool voor het e.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd gefinancierd door een National Health and Medical Research Council Project Grant aan JRM en CJT (ID 1163732) en gedeeltelijk door het Operational Infrastructure Support Program van de Victoriaanse overheid. SB wordt ondersteund door een gezamenlijke Baker Heart and Diabetes Institute-La Trobe University Doctoral Scholarship. KLW wordt ondersteund door The Shine On Foundation en een Future Leader Fellowship van de National Heart Foundation of Australia (ID 102539). JRM wordt ondersteund door een National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (ID 1078985).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.05% Trypsin/EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| 50 mL conische centrifugeerbuis | Falcon | 14-432-22 | Of gelijkwaardig |
| 75 cm2 vierkante flessen | Falcon | 353136 | Of gelijkwaardig |
| 96-wels plaat met platte bodem | Falcon | 353072 | |
| AAV6-CMV-hPLAP Vector | Muscle Research & Therapeutics Lab (University of Melbourne, Australia) AAV6-CMV-hPLAP kan op aanvraag worden geleverd. | ||
| Aluminiumfolie | |||
| Anti-AAV6 (intacte deeltje) muis monoklonaal antilichaam, (ADK6) | PROGEN | 610159 | Positieve controle monoklonaal antilichaam |
| BCIP/NBT | SIGMAFAST | B5655 | |
| Veiligheidskast voor cel- en weefselkweek | |||
| Elektronische pipetten | 5 & 10 mL stripette inserts | ||
| Fetaal runderserum | Gibco | 10099-141 | |
| Hemocytometer | |||
| Hoge glucose Dulbecco's Gemodificeerd Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11965118 | |
| HT1080 cellen | ATCC | ||
| ImageJ Software | Gratis beschikbaar: https://imagej.nih.gov/ij/download.html | ||
| Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| Lichtmicroscoop met camera | Beschikt over een 4x objectieflens | ||
| Oven | Voor een 65 °C incubatie | ||
| Paraformaldehyde | MERCK | 30525-89-4 | |
| Penicilline Streptomycine | Gibco | 15140-122 | |
| Fosfaat gebufferd zoutoplossing | |||
| Pipetten en punten | 20 μL, 200 μL & 1 mL enkele pipetten en punten & 200 μL multikanaals pipet | ||
| Stericup snel los te koppelen filter | Millipore | S2GPU10RE | Gebaat voor het combineren van media reagentia |
| Trypan blauwe oplossing | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VACUETTE TUBE 8 ml CAT Serum Separator Coagulant | Greiner BIO-ONE | 455071 | Gebaat voor serum verzameling & verwerking van schapen |
| Waterbad |
Referenties
- Bass-Stringer, S., et al. Adeno-associated virus gene therapy: Translational progress and future prospects in the treatment of heart failure. Heart, Lung and Circulation. 27 (11), 1285-1300 (2018).
- Casey, G. A., Papp, K. M., MacDonald, I. M.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
