Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit S. cerevisiae-cellen

2.3K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63425

⸱

2 februari 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Ben-Gurion University of the Negev, Israel, 2Department of Biotechnology Engineering, Ben-Gurion University of the Negev, Israel

In dit artikel

Erratum-melding

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Samenvatting

De bidirectionele mitotische kinesine-5 Cin8 hoopt zich op in clusters die splitsen en samensmelten tijdens hun beweeglijkheid. Accumulatie in clusters verandert ook de snelheid en directionaliteit van Cin8. Hier wordt een protocol voor motiliteitstests met gezuiverde Cin8-GFP en analyse van beweeglijke eigenschappen van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 beschreven.

Samenvatting

De mitotische bipolaire kinesine-5 motoren vervullen essentiële functies in de spindeldynamica. Deze motoren vertonen een homo-tetramere structuur met twee paar katalytische motordomeinen, gelegen aan tegenovergestelde uiteinden van het actieve complex. Deze unieke architectuur stelt kinesine-5-motoren in staat om antiparallel spindelmicrotubuli (MT's) te kruisen en uit elkaar te schuiven, waardoor de naar buiten gerichte kracht wordt geleverd die de spindelpolen uit elkaar scheidt. Voorheen werd aangenomen dat kinesine-5-motoren uitsluitend plus-end gericht waren. Recente studies toonden echter aan dat verschillende schimmelkinesisine-5-motoren minus-end gericht zijn op het niveau van één molecuul en onder verschillende experimentele omstandigheden van directionaliteit kunnen veranderen. De Saccharomyces cerevisiae kinesine-5 Cin8 is een voorbeeld van een dergelijk bidirectioneel motoreiwit: in omstandigheden met hoge ionische sterkte bewegen enkele moleculen van Cin8 in de minus-eindrichting van de MT's. Er werd ook aangetoond dat Cin8 beweeglijke clusters vormt, voornamelijk aan het min-einde van de MT's, en een dergelijke clustering stelt Cin8 in staat om van directionaliteit te veranderen en langzame, plus-end gerichte motiliteit te ondergaan. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor alle stappen van het werken met GFP-gelabelde kinesine-5 Cin8, van eiwitoverexpressie in S. cerevisiae-cellen en de zuivering ervan tot in vitro motiliteitstest met één molecuul. Een nieuw ontwikkelde methode die hier wordt beschreven, helpt onderscheid te maken tussen afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8, op basis van hun fluorescentie-intensiteit. Deze methode maakt een afzonderlijke analyse van de beweeglijkheid van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 mogelijk, waardoor de afhankelijkheid van Cin8-motiliteit van de clustergrootte wordt gekarakteriseerd.

Inleiding

Een groot aantal motiliteitsgebeurtenissen in eukaryote cellen worden gemedieerd door de functie van moleculaire motoreiwitten. Deze motoren bewegen langs de cytoskeletale filamenten, actinefilamenten en microtubuli (MT's) en zetten de chemische energie van ATP-hydrolyse om in kinetische en mechanische krachten die nodig zijn om de biologische beweeglijkheid in cellen te stimuleren. De op MT gebaseerde S. cerevisiae Cin8 is een bipolair, homotetrameer kinesine-5 motoreiwit dat spindel-MT's uit elkaar schuift1. Cin8 vervult essentiële functies tijdens mitose, in spindelassemblage 2,3,4 en spilverlenging tijdens anafase 5,6,7. Eerder was aangetoond dat Cin8 een bidirectionele motor is, die directionaliteit schakelt onder verschillende experimentele omstandigheden. Onder omstandigheden met een hoge ionische sterkte bewegen enkele Cin8-motoren bijvoorbeeld naar het min-uiteinde van de MT's, terwijl cin8-motoren in clusters, in meermotorige MT-glijtests en tussen antiparallel MT's voornamelijk naar de plus-uiteinden van de MT'sbewegen 8,9,10,11,12 . Deze bevindingen waren om verschillende redenen zeer onverwacht. Ten eerste draagt Cin8 zijn katalytische motorische domein op het amino-eindpunt en dergelijke motoren werden eerder verondersteld uitsluitend plus-end gericht te zijn, terwijl Cin8 werd aangetoond dat minus-end gericht was op het niveau van één molecuul. Ten tweede werd aangenomen dat kinesinemotoren unidirectioneel waren, hetzij minus-end of plus-end gericht, terwijl Cin8 bidirectioneel bleek te zijn, afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Ten slotte kon, vanwege de MT-oriëntatie op de mitotische spil, de klassieke rol van kinesine-5-motoren in de scheiding van spindelpolen tijdens spindelassemblage en anafase B alleen worden verklaard door hun plus-end gerichte motiliteit op de MT's die ze1,13 crosslinken. Na de eerste rapporten over de bidirectionaliteit van Cin8, werd aangetoond dat een paar andere kinesinemotoren bidirectioneel 14,15,16 zijn, wat aangeeft dat de bidirectionele beweeglijkheid van kinesinemotoren vaker voorkomt dan eerder werd aangenomen.

Eerder is gemeld dat Cin8 in cellen ook op een bidirectionele manier beweegt8, wat het idee ondersteunt dat de bidirectionele beweeglijkheid van sommige kinesine-5-motoren belangrijk is voor hun intracellulaire functies. Bovendien, aangezien de drie kinesine-5-motoren waarvan werd gemeld dat ze bidirectioneel waren, afkomstig zijn van schimmelcellen, is onlangs een mogelijke rol voor de bidirectionaliteit van kinesine-5-motoren voorgesteld in dergelijke cellen10. Volgens dit model, bij gesloten mitose van schimmelcellen, waarbij de nucleaire enveloppe niet afbreekt tijdens mitose, leveren kinesine-5-motoren de initiële kracht die de spindelpolen uit elkaar scheidt voorafgaand aan de spindelassemblage. Om deze taak uit te voeren, voorafgaand aan de scheiding van de spindelpool, lokaliseren kinesine-5-motoren zich in de buurt van de spilpolen, door hun minus-end gerichte motiliteit op enkele nucleaire MT's. Eenmaal op deze positie clusteren kinesine-5-motoren, schakelen ze van directionaliteit, vangen en cross-link MT's van naburige spindelpolen. Vervolgens zorgen kinesine-5-motoren voor de initiële scheiding van de polen door plus-end gerichte motiliteit op de MT's die ze crosslinken. Volgens dit model zijn zowel minus-end gerichte motiliteit op enkele MT's als plus-end gerichte motiliteit op cross-linked MT's tijdens antiparallel glijden vereist voor schimmel kinesine-5 motoren om hun rol te vervullen in spindelassemblage 1,13.

Het algemene doel van de beschreven methode is het verkrijgen van zeer zuivere schimmel GFP-gelabelde kinesine-5 Cin8 en het uitvoeren van motiliteitstests met één molecuul (figuur 1) terwijl de beweeglijkheid van afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8 afzonderlijk wordt geanalyseerd. De scheiding tussen afzonderlijke moleculen en clusters is belangrijk omdat een van de factoren waarvan is aangetoond dat ze de directionaliteit van Cin8 beïnvloeden, de accumulatie in clusters op de MT's 10,12 is. Alternatieve beweeglijkheidstests, zoals de MT-oppervlakteglijdende en MT-glijdende assays, geven geen informatie over de activiteit van enkelvoudige motoreiwitten17,18. De robuuste motiliteits- en analysemethoden met één molecuul die hier worden beschreven, zijn met succes toegepast om verschillende aspecten van kinesine-5-motoren, Cin8 en Kip1 10,11,12,14,19,20 te karakteriseren.

Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd voor Cin8-overexpressie en -zuivering, polymerisatie van MT's en de motiliteitstest met één molecuul. Verder worden ook de analyses beschreven om onderscheid te maken tussen afzonderlijke moleculen en clusters van Cin8, en om enkelvoudige motor- en clustersnelheden te bepalen door middel van gemiddelde verplaatsing (MD) en gemiddelde kwadratische verplaatsing (MSD). Dit protocol is bedoeld om onderzoekers te helpen alle stappen van de procedures te visualiseren en te helpen bij het oplossen van problemen met dit soort testen.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematische weergave van de motiliteitstest met één molecuul. Gebiotinyleerde fluorescerende MT's zijn bevestigd aan het glazen oppervlak, gecoat met Avidin dat interageert met het aan het oppervlak gehechte biotinylated-BSA. De groene pijl vertegenwoordigt de bewegingsrichting van enkele Cin8-moleculen onder omstandigheden met een hoge ionische sterkte. +/- de polariteit van het MT vertegenwoordigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Bereiding van buffers en reagentia

  1. Buffers
    1. -Leu aa dropout mix: Meng 2 g elk van Adenine, Uracil, Tryptofaan, Histidine, Lysine en Methionine en bewaar bij kamertemperatuur.
    2. Gistselectief medium met raffinose (1 L): Meng 6,7 g giststikstofbasis (met ammoniumsulfaat), 2 g -Leu aa dropout-mix en 20 g raffinose in dubbel gedestilleerd water door roeren (zonder verhitting) totdat het volledig is opgelost. Filtreer de oplossing met een filter van 0,22 μm in een steriele fles.
    3. Lysisbuffer: Bereid 25 ml oplossing in drievoudig gedestilleerd water (TDW) bestaande uit 50 mM Tris, 30 mM Pipes, 500 mM KCl, 10% glycerol, 1,5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP en 0,1% Triton X-100. Stel de pH in op 8 met 6 M HCl.
    4. Elutiebuffer: Bereid 10 ml oplossing in TDW bestaande uit 50 mM Tris, 30 mM Pipes, 500 mM KCl, 350 mM imidazool, 10% glycerol, 1,5 mM β-mercaptoethanol, 1 mM MgCl2, 0,1 mM ATP en 0,1% Triton X-100. Stel de pH in op 7,2 met 6 M HCl.
    5. P12 Buffer: Bereid 10 ml van een oplossing in TDW bestaande uit 12 mM buizen, 1 mM EGTA en 2 mM MgCl2. Stel de pH in op 6,9 met 10 M NaOH.
    6. BRB80-buffer: Bereid 50 ml van een oplossing bestaande uit 80 mM leidingen, 1 mM EGTA en 2 mM MgCl2 in ultrapuur water. Stel de pH in op 6,9 met 10 M NaOH.
    7. Algemene tubulinebuffer (GTB): Bereid 50 ml van een oplossing bestaande uit 80 mM pijpen, 0,5 mM EGTA en 2 mM MgCl2 in ultrapuur water. Stel de pH in op 6,9 met 10 M NaOH.
    8. Tris-Pipes oplossing: Bereid 40 ml 1M Tris-0,6 M Pipes-oplossing voor door 6,055 g Tris en 9,07 g Pipes in TDW te mengen en de pH aan te passen aan 7,2 met behulp van 6 M HCl. Breng het uiteindelijke volume op 50 ml met TDW.
      OPMERKING: P12,BRB80 en Tris-Pipes buffers worden gebruikt voor de bereiding van stamoplossingen voor motiliteitstest. Deze buffers kunnen in grote hoeveelheden worden bereid, aliquoteerd in buizen van 1,5 ml, vastgevroren en bewaard bij -20 °C.
  2. Stockoplossingen voor motiliteitstest
    1. Tubuline (10 mg ml-1): Los 1 mg gelyofiliseerde tubuline op in 100 μL koude (4 °C) algemene tubulinebuffer (GTB). Vries 1 μL aliquots in en bewaar ze bij -80 °C.
    2. Gebiotinyleerde tubuline (1 mg ml-1): Los 20 μg gelyofiliseerde tubuline op in 20 μl koude GTB. Vries 1 μL aliquots in en bewaar ze bij -80 °C.
    3. Rhodamine gelabelde tubuline (1 mg ml-1): Los 20 μg gelyofiliseerde tubuline op in 20 μl koude GTB. Snap-freeze 0,5 μL aliquots en bewaar ze bij -80 °C.
    4. GMPCPP (10 μM): GMPCPP wordt verkregen van de leverancier als een 100 μL waterige oplossing en opgeslagen bij -80 °C. Ontdooi de injectieflacon met GMPCPP op ijs. Bereid 1 μL aliquots, vries ze in en bewaar ze bij -80 °C.
    5. ATP: Bereid 500 μL oplossing van 100 mM ATP in 0,5 M Tris buffer (pH 8). 2 μL aliquots invriezen en bewaren bij -20 °C.
    6. MgCl2: Bereid 1 ml oplossing van 200 mM MgCl2 in P12 buffer. Bewaar 5 μL aliquots bij -20 °C.
    7. Caseïne: Bereid een 1 ml oplossing van 5 mg ml-1 caseïne in BRB 80 buffer. Vries 10 μL aliquots in en bewaar ze bij -20 °C.
    8. D-Glucose: Bereid een 1 ml oplossing van 1 M D-glucose in P12 buffer. Bewaar 10 μL aliquots bij -20 °C.
    9. Glucoseoxidase: Bereid een 1 ml oplossing van 10 mg ml-1 glucoseoxidase in P12-buffer. 2 μL aliquots invriezen en bewaren bij -20 °C.
    10. Catalase: Bereid een 1 ml oplossing van 0,8 mg ml-1 catalase in P12-buffer. 2 μL aliquots invriezen en bewaren bij -20 °C.
    11. Dithiothreitol (DTT): Bereid een 1 ml oplossing van 1 M DTT in P12-buffer in een zuurkast. Vries 10 μL aliquots in en bewaar ze bij -20 °C.
    12. Creatinefosfaat: Bereid een 1 ml oplossing van 1 M creatinefosfaat in P12 buffer. 2 μL aliquots invriezen en bewaren bij -20 °C.
    13. Creatinefosfokinase: Bereid een 1 ml oplossing van 5 mg ml-1 creatinefosfokinase in 0,25 M glycylglycine, pH 7,4. 2 μL aliquots invriezen en bewaren bij -20 °C.
    14. EGTA: Bereid een EGTA-oplossing van 100 mM in ultrapuur water en bewaar deze bij kamertemperatuur.
    15. KCl: Bereid een 1 M KCl-oplossing in ultrapuur water en bewaar deze bij kamertemperatuur.
  3. Motiliteitsbuffer en reactiemix
    1. Motiliteitsbuffer (MB) met 145 mM KCl, 2x bouillon: Bereid 1 ml 2x bouillon van de beweeglijkheidsbuffer door 100 μL voorgefabriceerde Tris-Pipes-oplossing, 20 μL 100 mM EGTA, 290 μL KCl en 590 μL TDW te mengen. Houd de buffer op ijs.
    2. Motiliteitsreactiemix: Bereid een motiliteitsreactiemix volgens tabel 1 en bewaar deze op ijs.
VolumeVoorraadNaam reagens
50 μL2xMB (vanaf stap 1.3.1)
40 μL-TDW
1 μl100mATP
1 μl200mMgCl2
2 μl5mg/mlCaseïne
1 μl1 miljoenGlucose
1 μl1 miljoenDTT
1 μl10mg/mlGlucoseoxidase
1 μl8mg/mlKatalase
1 μl1 miljoenFosfocreatine
1 μl5mg/mlCreatinefosfokinase
100 μLTotaal

Tabel 1.

2. Cin8 overexpressie en zuivering van S. cerevisiae cellen

  1. Kweek S. cerevisiae-cellen die het plasmide bevatten voor overexpressie van Cin8-GFP-6His tot de exponentiële groeifase (OD600 = 0,6-0,8) in 1 L gistselectief medium aangevuld met 2% raffinose (zie stap 1.1.2) bij 28 °C12.
  2. Induceer Cin8-GFP-6His overexpressie door toevoeging van 2% galactose. Monitor de groei van de gistcultuur door de absorptie bij 600 nm te meten.
  3. Oogst vijf uur na galactosetoevoeging de cellen door centrifugering bij 4.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C, suspensie de cellen in de lysisbuffer en vries in vloeistof N2.
    OPMERKING: Bevroren cellen kunnen worden bewaard bij -80 °C voor verder gebruik of onmiddellijk worden gemalen in vloeistof N2.
  4. Maal de bevroren cellen in vloeibare N2 met gekoelde vijzel en stamper. Voeg vloeistof N2 toe tijdens het malen om de extracten bevroren te houden. Het vereist meestal 4-5 keer het toevoegen van vloeistof N2.
  5. Monitor cellysis door observatie onder fasecontrast of DIC-microscoop.
  6. Ontdooi de gemalen cellen en centrifugeer bij 21.000 x g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Laad het supernatant op een zwaartekrachtstroomkolom gevuld met 2 ml Ni-NTA en vooraf gebalanceerd met lysisbuffer. Laat het bovennatuurlijk door de kolom naar buiten stromen.
  7. Was de kolom met vijf kolomvolumes lysisbuffer en vervolgens met vijf kolomvolumes lysisbuffer aangevuld met 25 mM imidazool.
  8. Elute Cin8-GFP-6His met elutiebuffer (zie stap 1.1.4).
  9. Analyseer de geëlueerde monsters door SDS-PAGE fractionering, gevolgd door Coomassie blue staining en western blot analyse gesondeerd met α-GFP antilichaam19.
  10. Pool de fracties die Cin8-GFP-6His bevatten (stappen 2.8 en 2.9). Zuiver ze bovendien door grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) bij een debiet van 0,5 ml min-1 en kolomdruklimiet van 1,5 MPa, met gelijktijdige bewaking van de absorptie bij 280 nm en de GFP-florescentie-emissie met excitatie bij 488 nm (figuur 2A).
  11. Verzamel de fracties die overeenkomen met het Cin8-GFP-tetrameer en analyseer ze met SDS-PAGE en western blotting (zie stap 2.9) (figuur 2B).
  12. Schat de eiwitconcentratie met behulp van spectrofotometrie of biochemische assays zoals Bradford assay, BCA assay etc.
  13. Vul de geselecteerde fracties toe, vries deze in vloeistof N2 in en bewaar tot gebruik bij -80 °C. Deze gezuiverde eiwitmonsters kunnen gedurende 6 maanden worden gebruikt.
    OPMERKING: Cin8-GFP wordt overexpressie gegeven en gezuiverd van een protease-deficiënte S. cerevisiae-stam die een plasmide van 2 μm bevat voor Cin8-GFP-6His overexpressie van de galactose-induceerbare promotor, LGY 4093: MATα, leu2-3,112, reg-1-501, ura3-52, pep4-3, prb1-1122, gal1, pOS7 (2μ, LEU2, P GAL1-CIN8-GFP-6HIS). De giststam en plasmide zijn op aanvraag beschikbaar.

figure-protocol-1
Figuur 2: Zuivering van Cin8-GFP. (A) Het grootte-uitsluitingschromatogram van Ni-NTA gezuiverde Cin8-GFP, met continue GFP-fluorescentiedetectie door 488 nm excitatie en emissie bij ~ 510 nm. Het Cin8-GFP-tetrameer elueert bij ~ 10 ml van de SEC-kolom (gemarkeerd met een pijl). (B) Coomassie-gekleurde SDS-PAGE-gel (boven) en α-GFP western blot (onder) van Cin8-GFP-fracties geëlueerd uit SEC. Monsters in de rijstroken zijn als volgt: M - Moleculaire gewichtsmarker, Ni2 +- Ni-NTA gezuiverd Cin8-GFP-monster dat in de SEC-kolom wordt geladen, GF-fracties: fractie die overeenkomt met Cin8-GFP SEC-elutie zoals gemarkeerd in paneel A. De pijl rechts geeft de grootte van het Cin8-GFP monomeer aan (verwacht op de SDS-PAGE). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Single-molecule motiliteitstest met de gezuiverde Cin8

  1. Polymerisatie van biotine en rhodamine gelabelde MT's, gestabiliseerd met GMPCPP.
    1. Start MT-polymerisatie door de volgende componenten in een buis van 1,5 ml te mengen: 1 μl tubuline-eiwit van 10 mg/ml, 1 μl 1 mg/ml gebiotinyleerde tubuline, 0,5 μl 1 mg/ml tubuline met rhodaminelabel, 1 μl 10 mM GMPCPP en 6,5 μl algemene tubulinebuffer (GTB). Incubeer het mengsel gedurende 1 uur bij 37 °C.
    2. Voeg na MT-polymerisatie 80 μL warme (37 °C) GTB toe, meng voorzichtig en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 16.500 x g .
    3. Gooi het supernatant weg en suspensie de pellet voorzichtig opnieuw door op en neer te pipetteren met 50 μL warme GTB. Bewaar de suspensie bij 28 °C.
    4. Onderzoek de MT's met een fluorescentiemicroscoop met behulp van het 647 nm rhodaminekanaal (figuur 3A).
      OPMERKING: Om gebiotinyleerde fluorescerend gelabelde MT's te verkrijgen, bevat de polymerisatiereactie niet-gelabelde tubuline, evenals gebiotinyleerde en fluorescerend gelabelde tubuline. In dit protocol wordt rhodamine-gelabelde tubuline gebruikt, maar andere fluorescerende conjugaten kunnen ook worden gebruikt.
  2. Flow Chamber assemblage
    1. Monteer een stromingskamer door vier stroken dubbelzijdige tape (~4 cm x ~3 mm) op een geavanceerde zelfklevende glasplaat (evenwijdig aan de langere rand en ~3-4 mm uit elkaar) te plaatsen om drie 'lanes' tussen de tapestroken te creëren. Verwijder het beschermende papier van tapestroken en plaats een silanized coverslip10 op de tapestrips om drie stroomkamers van ~ 10 μL in volume te creëren.
  3. MT-immobilisatie naar het met avidine bedekte oppervlak (figuur 1)
    1. Bestrijk de gesilaniseerde coverslip door met een micropipette met 15 μL 1 mg/ml gebiotinyleerd-runderserumalbumine (b-BSA, opgelost in GTB) in de stroomkamer te perfuseren. Was de kamer na 5 minuten met 80 μL GTB.
    2. Breng vervolgens, net als in stap 3.3.1, 15 μL avidine (opgelost in GTB) in de stroomkamer in die aan het b-BSA bindt. Was de kamer na 5 minuten met 80 μL GTB.
    3. Passiveer het gesilaniseerde afdekvlak met 20 μL 1% poloxameer. Na 3 min, wassen met 80 μL GTB.
    4. Bevestig gebiotinyleerde MT's (stap 3.1) aan de met b-BSA-avidine gecoate coverslip door 20 μL MT's in te brengen die doorgaans verdund zijn tot 1:20 in GTB. Incubeer de dia's in een omgekeerde positie, d.w.z. met de afdekplaat naar beneden gericht in een donkere vochtigheidskamer (bijvoorbeeld een petrischaal met nat tissuepapier) gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Was vervolgens met 200 μL GTB.
    5. Breng 30 μL motiliteitsreactiemix (zie stap 1.3.2) aan in de stroomkamer.
    6. Verdun de Cin8-GFP-motoren (stap 2.13) in 20 μL motiliteitsreactiemix (zie tabel 1) (meestal tot een eindconcentratie van 5-10 μM). Breng ze aan op de stroomkamer en breng onmiddellijk de beweging van de motoren langs de MT's in beeld.
  4. Beeldvorming van motormotiliteit
    OPMERKING: MT-binding en de beweeglijkheid van motoren werden gecontroleerd met behulp van een epifluorescentie-omgekeerde microscoop uitgerust met een kwikbooglamp, een numeriek diafragmaobjectief van 100x /1,4 en twee fluorescentiebandpassfiltersets, één met een golflengte van 647 nm (voor rhodamine) en een andere met een golflengte van 488 nm (voor GFP).
    1. Plaats een druppel onderdompelingsolie op het microscoopobjectief. Plaats de stroomkamer op de fluorescentiemicroscooptrap met de afdekking naar beneden gericht op het objectief.
    2. Schakel het rhodaminekanaal in om scherp te stellen op de MT's die aan het oppervlak van de coverslip zijn bevestigd en verkrijg het beeld met een belichting van 20 ms met behulp van de Micro-Manager ImageJ-Fiji-software21.
    3. Schakel het GFP-kanaal in en verkrijg 90 time-lapse-beelden met een interval van 1 s en een belichting van 800 ms voor het analyseren van de Cin8-GFP-beweeglijkheid.

figure-protocol-2
Figuur 3: MT's en MT-gebonden Cin8-GFP. (A) Afbeeldingen uit twee velden (links en rechts) voor MT's gepolymeriseerd volgens het protocol beschreven in stap 3.1 en afgebeeld met 100x objectief zoals beschreven in stap 3.4. (B) Afbeeldingen uit twee velden (links en rechts) voor de Cin8-GFP (onderste panelen, gemarkeerd met pijlen) bevestigd aan de MT die in de bovenste panelen wordt weergegeven. Schaalbalk: 4 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Motiliteitsanalyse

OPMERKING: Voer alle beeldanalyses uit en genereer kymografen met behulp van ImageJ-Fiji Software.

  1. Kymograaf generatie
    1. Open de timelapse-film en de bijbehorende MT-veldafbeelding. Synchroniseer deze twee vensters door de volgende optie te kiezen: >-hulpprogramma's analyseren > Windows synchroniseren.
    2. Markeer één MT met de optie Gesegmenteerde lijn en gebruik het tabblad Analyseren > Multi-kymograaf om een kymograaf te verkrijgen.
  2. Bepaling van de clustergrootte van Cin8-GFP (d.w.z. het aantal Cin8-moleculen in een cluster)
    1. Voer de achtergrondaftrek en de correctie voor ongelijke verlichting uit met de optie Achtergrond aftrekken > proces. Stel de rolling ball radius in op 100 pixels en vink de optie Glijdende paraboloïde aan .
    2. Volg de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van een specifieke niet-beweeglijke Cin8-GFP-motor (figuur 3B) als functie van de tijd binnen een cirkel van 4 pixels radius met behulp van de TrackMate-plug-in van de ImageJ-Fiji-software door de volgende optie te kiezen: Plug-ins > Tracking > TrackMate > LoG Detector > Simple Lap Tracker.
    3. Herhaal stap 4.2.2 voor verschillende Cin8-GFP-motoren. Zet de fluorescentie-intensiteit van de verschillende Cin8-GFP-motoren uit als functie van de tijd.
      OPMERKING: Een experimentele strategie om de clustergrootte te meten - d.w.z. het aantal Cin8-moleculen in een cluster - vormt een basis voor de analyse van Cin8-clusteringgerelateerde beweeglijkheid. Photobleaching van GFP bevestigd aan Cin8 wordt gebruikt om de bijdrage van enkele GFP-moleculen aan de totale intensiteit van Cin8-clusters te bepalen. De fluorescentie-intensiteiten nemen bijvoorbeeld af in stappen van ~ 50 willekeurige eenheden (a.u.), waarbij elke stap waarschijnlijk de fotobleaching van één GFP-molecuul vertegenwoordigt (figuur 4A). Omdat Cin8 een homo-tetrameer motoreiwit is, bevat het vier GFP-moleculen. Alle Cin8-motoren met een intensiteit ≤ 200 a.u. zijn dus waarschijnlijk enkele tetramere Cin8-moleculen. Volgens deze methode worden intensiteitsbereiken van Cin8-motorfluorescentie toegewezen als <200, 200-400 en >400 voor afzonderlijke Cin8-moleculen, paren Cin8-moleculen (dimeer van Cin8-tetrameer) en Cin8-oligomeren, respectievelijk12.
  3. Intensiteitsverdelingsanalyse voor Cin8-GFP-motoren
    1. Meet de gemiddelde florescence-intensiteit van alle fluorescerende Cin8-GFP-motoren in het eerste frame van de time-lapse-reeks met behulp van de TrackMate-plug-in in ImageJ-Fiji zoals beschreven in stap 4.2.2.
    2. Plot een histogram van de gemiddelde intensiteiten van Cin8-GFP met een bakgrootte van 20 a.u. en pas de belangrijkste piek van het histogram aan op een Gaussiaanse curve (figuur 4B).
      OPMERKING: De intensiteitsverdelingsanalyse vormt een aanvulling op de bepaling van de clustergrootte voor Cin8-GFP-motoren uit de fotobleachingexperimenten. De Gaussiaanse curve paste bij het intensiteitsverdelingshistogram voor de Cin8-GFP-populatie piekt op ~ 125 a.u., wat consistent is met de gemiddelde intensiteit van enkele tetramere Cin8-moleculen die één, twee, drie of vier fluorescerende (niet-gebleekte) GFP-moleculen bevatten, waarbij elk fluorescerend GFP-molecuul ~ 50 a.u. bijdraagt. Met behulp van deze intensiteitsverdelingsmethode kan dus ook de bijdrage van één GFP-molecuul worden berekend, die verder kan worden gebruikt om de clustergrootte van Cin8-GFP-moleculen toe te wijzen.

figure-protocol-3
Figuur 4: Cin8-GFP bleekprofiel en intensiteitsverdeling. (A) Fotobleaching van GFP in vier verschillende Cin8-GFP motoren. Enkele fotobleachingstappen, die elk waarschijnlijk de fotobleaching van één GFP vertegenwoordigen, leiden tot een daling van de fluorescentie-intensiteit van ~ 50 a.u. (B) De intensiteitsverdeling van Cin8-GFP-motoren in het eerste frame van een time-lapse-reeks (inzet). De Gaussische piek (blauw) gecentreerd op ~125 a.u vertegenwoordigt enkele Cin8-GFP-moleculen. Deze piek vertoont de gemiddelde intensiteit van enkele Cin8-tetrameren met één, twee, drie of vier fluorescerende GFP-moleculen, waarbij elk GFP-molecuul ~ 50 a.u. bijdraagt aan de totale intensiteit (d.w.z. (50 + 100 + 150 + 200) / 4 = 125). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

  1. Het volgen van de beweeglijkheid van de Cin8-GFP-moleculen langs de MT-sporen
    1. Snijd de MT die moet worden geanalyseerd bij in de time-lapse-reeks van opgenomen frames door deze te markeren met het gereedschap Rechthoek en vervolgens Afbeelding > bijsnijden te kiezen.
    2. Kies een fluorescerend Cin8-GFP-deeltje voor de analyse. Noteer de deeltjescoördinaten in elk frame (tijdspunt) van de timelapse-reeks met de opties Point Tool en Measure . Voer een vergelijkbare registratie uit van coördinaten voor andere fluorescerende deeltjes in de time-lapse-reeks.
    3. Wijs clustergrootte toe aan alle onderzochte Cin8-GFP-deeltjes in het eerste frame van hun verschijning, zoals beschreven in stap 4.2.
  2. Gemiddelde verplaatsing (MD) en gemiddelde vierkante verplaatsing (MSD) analyses
    1. Bereken uit de coördinaten van Cin8-GFP-bewegingen bepaald in stap 4.4 de verplaatsingen van Cin8-GFP op elk tijdstip ten opzichte van de begincoördinaten, met behulp van de vergelijking voor de berekening van de afstand tussen twee punten met gegeven coördinaten:
      figure-protocol-4
      waarbij dt de verplaatsingen van Cin8-GFP is op het moment t, xt en yt de respectievelijke coördinaten zijn op tijdstip t. x0 en y0 zijn de respectievelijke coördinaten van Cin8-GFP bij t = 0.
    2. Bereken op basis van deze verplaatsingswaarden de verplaatsing voor alle mogelijke tijdsintervallen voor een specifiek Cin8-GFP-deeltje. Herhaal de procedure voor alle onderzochte Cin8-GFP-deeltjes.
    3. Plot de gemiddelde verplaatsing (MD) van alle onderzochte Cin8-GFP-deeltjes versus tijdsinterval en afhankelijk van een lineaire fit, MD = v x t + c. De helling van deze fit (v) vertegenwoordigt de gemiddelde snelheid van beweeglijke Cin8-GFP-deeltjes.
      OPMERKING: Op deze manier kan de gemiddelde snelheid van alle Cin8-GFP-moleculen die tot elke clustergrootte behoren, afzonderlijk worden berekend, waarbij de beweeglijkheid van verschillende clustergroottes wordt gekarakteriseerd. Naast de MD-analyse kan ook de gemiddelde kwadraatverplaatsingsanalyse (MSD) worden uitgevoerd door de verplaatsingswaarden berekend in stap 4.5.1 en 4.5.2 te kwadrateren. MSD-waarden worden uitgezet versus tijdsinterval en aangepast aan de polynomiale curve MSD = v2 x t2 + 2D x t + c, wat de extra parameter D oplevert, wat de diffusiecoëfficiënt van Cin8-GFP-beweging is. MD-analyse moet worden uitgevoerd op polariteit gemarkeerd met MT's 8,10, terwijl voor de MSD-analyse kennis van de MT-polariteit niet nodig is.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het experiment heeft tot doel de beweeglijkheidskenmerken van bidirectioneel motoreiwit Cin8 van verschillende clustergroottes op enkele MT's te onderzoeken. Representatieve beweeglijkheid van Cin8-GFP blijkt ook uit de kymografen in figuur 5A, waar de ruimtelijke positie van de motor in de loop van de tijd wordt getoond.

Voor de analyse van de beweeglijke eigenschappen van Cin8-GFP wordt eerst de clustergrootte toegewezen (stap 4.3) aan elk MT-bevestigd beweeglij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit werk wordt een protocol voor single-molecule motiliteitstest met de bidirectionele kinesine-5 Cin8 en de motiliteitsanalyse gepresenteerd. De full-length Cin818 inclusief het native nuclear localization signal (NLS) op de C-terminal is gezuiverd van de native host S. cerevisiae. Omdat de Cin8 een nucleair motoreiwit is, blijkt het malen van de S. cerevisiae-cellen onder vloeibare stikstof de meest efficiënte methode voor cellysis te zijn. Na lysis, door metaalaffiniteit en...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd gedeeltelijk ondersteund door de Israel Science Foundation-beurs (ISF-386/18) en de Israel Binational Science Foundation-beurs (BSF-2019008), toegekend aan L.G.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AdenineFORMEDIUMDOC0230
ATPSigmaA7699
Biotinylated-BSASigmaA8549
CaseïneSigmaC7078
Catalase (C40)SigmaC40
Creatine-KinaseSigmaC3755
Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
EDTASigmaE5134
EGTASigmaE4378
Fluorescentie filterset voor GFPChroma49002: ET-EGFP (FITC/Cy2)
Fluorescentie filterset voor RhodamineChroma49004: ET-CY3/TRITC
Fluorescentie omgekeerde microscoopZeissAxiovert 200M
GalactoseTivan BiotechGAL02
GlucoseSigmaG8270
Glucose OxidaseSigmaG7141
GlycerolSigmaG5516
GlycylGlycineMerckG0674
GMPCPPJana BioscienceNu-405L
GTBCytoskeletonBST01-010
GTPSigmaG8877
HistidineDuchefa BiochemieH0710.0100
ImageJ-FIJI softwarehttps://imagej.net/plugins/trackmate/versie 2.1.0/1.53c; Java 1.8.0_172 [64-bit] voor Windows 10
ImidazolSigmaI0125
InstantBlue Coomassie EiwitkleuringAbcamab119211
LensZeiss100x/1.4 olie DIC objectief
LysineFORMEDIUMDOC0161
Magnesium ChlorideSigmaM8266
MethionineDuchefa BiochemieM0715.0100
NeoAndor TechnologiessCMOS camera
NeutraAvidinLifeA2666
Ni-NTA AgaroseInvitrogenR901-15
Phosfo-CreatineSigmaP1937
PipesSigmaP1851
Pluronic zuur F-127 (poloxamer)SigmaP2443
Kalium ChlorideSigmaP9541
RaffinoseTivan BiotechRAF01
Grootte-Excusie chromatografie instrumentGE HealthcareAKTA Pure
SpectrofotometerThermoFisher ScientificNanoDrop
Superose-6 10/300 GLGE Healthcare17-5172-01
TrisRoshe10708976001
Triton X-100SigmaT8787
TryptofaanDuchefa BiochemieT0720.0100
TubulineiwitCytoskeletonT240
Tubuline, biotinyleerdCytoskeletonT333P
Tubuline, TRITC RhodamineCytoskeletonTL530M
UracilSigmaU0750-100G
Gist stikstofbaseFORMEDIUMCYN0401S
α-GFP antilichaamSanta Cruz BiotechnologySC8036
β-mercaptoethanolSigmaM3148

Referenties

  1. Singh, S. K., Pandey, H., Al-Bassam, J., Gheber, L. Bidirectional motility of kinesin-5 motor proteins: structural determinants, cumulative functions and physiological roles. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (10), 1757-1771 (2018).
  2. Hoyt, M. A., He, L., Totis, L., Saunders, W. S. Loss of function of Saccharomyces cerevisiae kinesin-related CIN8 and KIP1 is suppressed by KAR3 motor domain mutations. Genetics. 135 (1), 35-44 (1993).
  3. Saunders, W. S., Hoyt, M. A. Kinesin-related proteins required for structural integrity of the mitotic spindle. Cell. 70 (3), 451-458 (1992).
  4. Hoyt, M. A., He, L., Loo, K. K., Saunders, W. S. Two Saccharomyces cerevisiae kinesin-related gene products required for mitotic spindle assembly. Journal of Cell Biology. 118 (1), 109-120 (1992).
  5. Gerson-Gurwitz, A., et al. Mid-anaphase arrest in S. cerevisiae cells eliminated for the function of Cin8 and dynein. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (2), 301-313 (2009).
  6. Fridman, V., Gerson-Gurwitz, A., Movshovich, N., Kupiec, M., Gheber, L. Midzone organization restricts interpolar microtubule plus-end dynamics during spindle elongation. EMBO Reports. 10 (4), 387-393 (2009).
  7. Movshovich, N., et al. Slk19-dependent mid-anaphase pause in kinesin-5-mutated cells. Journal of Cell Science. 121 (15), 2529-2539 (2008).
  8. Gerson-Gurwitz, A., et al. Directionality of individual kinesin-5 Cin8 motors is modulated by loop 8, ionic strength and microtubule geometry. Embo Journal. 30 (24), 4942-4954 (2011).
  9. Roostalu, J., et al. Directional switching of the kinesin Cin8 through motor coupling. Science. 332 (6025), 94-99 (2011).
  10. Shapira, O., Goldstein, A., Al-Bassam, J., Gheber, L. A potential physiological role for bi-directional motility and motor clustering of mitotic kinesin-5 Cin8 in yeast mitosis. Journal of Cell Science. 130 (4), 725-734 (2017).
  11. Goldstein-Levitin, A., Pandey, H., Allhuzaeel, K., Kass, I., Gheber, L. Intracellular functions and motile properties of bi-directional kinesin-5 Cin8 are regulated by neck linker docking. eLife. 10, 71036(2021).
  12. Pandey, H., et al. Drag-induced directionality switching of kinesin-5 Cin8 revealed by cluster-motility analysis. Science Advances. 7 (6), 1687(2021).
  13. Pandey, H., Popov, M., Goldstein-Levitin, A., Gheber, L. Mechanisms by which kinesin-5 motors perform their multiple intracellular functions. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6420(2021).
  14. Fridman, V., et al. Kinesin-5 Kip1 is a bi-directional motor that stabilizes microtubules and tracks their plus-ends in vivo. Journal of Cell Science. 126, 4147-4159 (2013).
  15. Edamatsu, M. Bidirectional motility of the fission yeast kinesin-5, Cut7. Biochemical and Biophysical Research Communications. 446 (1), 231-234 (2014).
  16. Popchock, A. R., et al. The mitotic kinesin-14 KlpA contains a context-dependent directionality switch. Nature Communications. 8, 13999(2017).
  17. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9 (9), 51131(2020).
  18. Gheber, L., Kuo, S. C., Hoyt, M. A. Motile properties of the kinesin-related Cin8p spindle motor extracted from Saccharomyces cerevisiae cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (14), 9564-9572 (1999).
  19. Pandey, H., et al. Flexible microtubule anchoring modulates the bi-directional motility of the kinesin-5 Cin8. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (16), 6051-6068 (2021).
  20. Shapira, O., Gheber, L. Motile properties of the bi-directional kinesin-5 Cin8 are affected by phosphorylation in its motor domain. Scientific Reports. 6, 25597(2016).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Britto, M., et al. Schizosaccharomyces pombe kinesin-5 switches direction using a steric blocking mechanism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (47), 7483-7489 (2016).
  23. Kapitein, L. C., et al. Microtubule cross-linking triggers the directional motility of kinesin-5. Journal of Cell Biology. 182 (3), 421-428 (2008).
  24. Furuta, K., Edamatsu, M., Maeda, Y., Toyoshima, Y. Y. Diffusion and directed movement in vitro motile properties of fission yeast kinesin-14 Pkl1. Journal of Biological Chemistry. 283 (52), 36465-36473 (2008).
  25. Katrukha, E. A., et al. Probing cytoskeletal modulation of passive and active intracellular dynamics using nanobody-functionalized quantum dots. Nature Communications. 8, 14772(2017).
  26. Tinevez, J. Y., et al. TrackMate: An open and extensible platform for single-particle tracking. Methods. 115, 80-90 (2017).
  27. Jakobs, M. A. H., Dimitracopoulos, A., Franze, K. KymoBulter, a deep learning software for automated kymograph analysis. eLife. 8, 42288(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells
Posted by JoVE Editors on 6/09/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: Motility of Single Molecules and Clusters of Bi-directional Kinesin-5 Cin8 Purified from S. cerevisiae Cells. The Authors section was updated.

One of the author names was updated from:

Roy Abraham

to:

Roy Avraham

Trefwoorden

Kinesine 5 motiliteitCin8 motorproteinenkelvoudige molecuulmotiliteitclustering van motorprote nenmicrotubuli dynamiekbidirectioneel motorproteingrootte uitsluitingschromatografiefluorescentiemicroscopieSaccharomyces cerevisiaeGFP tagging
Beweeglijkheid van enkele moleculen en clusters van bidirectionele kinesine-5 Cin8 gezuiverd uit S. cerevisiae-cellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.