Methodenartikel

Ontwikkeling van organoïden uit muizenpluipcel als in vitro model om hypofyse stamcelbiologie te verkennen

DOI:

10.3791/63431

⸱

25 februari 2022

 ,  , 
1Laboratory of Tissue Plasticity in Health and Disease, Cluster of Stem Cell and Developmental Biology, Department of Development and Regeneration, Leuven Stem Cell Institute, KU Leuven (University of Leuven)

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hypofyse is de belangrijkste regulator van het endocriene systeem van het lichaam. Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van organoïden uit de hypofyse van de muis als een nieuw 3D in vitro model om de stamcelpopulatie van de klier te bestuderen waarvan de biologie en functie slecht begrepen blijven.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hypofyse is de belangrijkste endocriene klier die belangrijke fysiologische processen reguleert, waaronder lichaamsgroei, metabolisme, seksuele rijping, voortplanting en stressrespons. Meer dan tien jaar geleden werden stamcellen geïdentificeerd in de hypofyse. Ondanks de toepassing van transgene in vivo benaderingen blijven hun fenotype, biologie en rol echter onduidelijk. Om dit raadsel aan te pakken, wordt een nieuw en innovatief organoïde in vitro model ontwikkeld om de hypofysestamcelbiologie diep te ontrafelen. Organoïden vertegenwoordigen 3D-celstructuren die, onder gedefinieerde kweekomstandigheden, zichzelf ontwikkelen uit de (epitheliale) stamcellen van een weefsel en meerdere kenmerken van die stamcellen en hun weefsel samenvatten. Hier wordt aangetoond dat van hypofyse afgeleide organoïden van muizen zich ontwikkelen uit de stamcellen van de klier en hun in vivo fenotypische en functionele kenmerken getrouw samenvatten. Ze reproduceren onder andere de activeringstoestand van de stamcellen als in vivo optredend als reactie op transgeen toegebrachte lokale schade. De organoïden zijn langdurig uitbreidbaar met behoud van hun stengelfenotype. Het nieuwe onderzoeksmodel is zeer waardevol om het fenotype en gedrag van de stamcellen te ontcijferen tijdens belangrijke omstandigheden van hypofyseremodellering, variërend van neonatale rijping tot verouderingsgerelateerde vervaging en van gezonde tot zieke klieren. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om van hypofyse afgeleide organoïden van muizen vast te stellen, die een krachtig hulpmiddel bieden om in de nog raadselachtige wereld van hypofysestamcellen te duiken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De hypofyse is een kleine endocriene klier aan de basis van de hersenen, waar het is verbonden met de hypothalamus. De klier integreert perifere en centrale (hypothalamische) inputs om een afgestemde en gecoördineerde hormoonafgifte te genereren, waardoor stroomafwaartse doel endocriene organen (zoals bijnieren en geslachtsklieren) worden gereguleerd voor het produceren van geschikte hormonen op het juiste moment. De hypofyse is de belangrijkste regulator van het endocriene systeem en wordt daarom met recht de meesterklier1 genoemd.

De hypofyse van de muis bestaat uit drie lobben (figuur 1), d.w.z. de voorkwab (AL), de tussenkwab (IL) en de achterkwab (PL). De belangrijkste endocriene AL bevat vijf hormonale celtypen, waaronder somatotropen die groeihormoon (GH) produceren; lactotropen die prolactine (PRL) genereren; corticotropen die adrenocorticotroop hormoon (ACTH) afscheiden; thyrotropen die verantwoordelijk zijn voor de productie van schildklierstimulerend hormoon (TSH); en gonadotrofen die luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) maken. De PL bestaat uit axonale projecties van de hypothalamus waarin de hormonen oxytocine en vasopressine (antidiuretisch hormoon) zijn opgeslagen. De IL bevindt zich tussen de AL en PL en herbergt melanotropen die melanocytstimulerend hormoon (MSH) produceren. In de menselijke hypofyse gaat de IL achteruit tijdens de ontwikkeling en worden melanotropen verspreid binnen de AL1. Naast de endocriene cellen bevat de hypofyse ook een pool van stamcellen, in wezen gekenmerkt door de transcriptiefactor SOX2 2,3,4,5,6. Deze SOX2+-cellen bevinden zich in de marginale zone (MZ), de epitheelbekleding van de spleet (een embryonaal restlumen tussen de AL en IL), of zijn als clusters verspreid over het parenchym van de AL, waardoor twee stamcelniches in de klier worden voorgesteld (figuur 1)2,3,4,5,6.

Gezien de onmisbare aard van de hypofyse, wordt slecht functioneren van de klier geassocieerd met ernstige morbiditeit. Hyperpituïtarisme (gekenmerkt door oversecretie van een of meer hormonen) en hypopituïtarisme (defecte of ontbrekende productie van een of meer hormonen) kunnen worden veroorzaakt door hypofyse neuro-endocriene tumoren (PitNETs; bijv. ACTH-producerende tumoren die leiden tot de ziekte van Cushing) of door genetische defecten (bijv. GH-deficiëntie resulterend in dwerggroei)7. Daarnaast zijn hypofysechirurgie (bijvoorbeeld om tumoren te verwijderen), infecties (bijv. Hypothalamus-hypofysetuberculose of infecties na bacteriële meningitis of encefalitis), het syndroom van Sheehan (necrose vanwege onvoldoende bloedstroom als gevolg van zwaar bloedverlies bij de geboorte), hypofyse-apoplexie en traumatisch hersenletsel andere belangrijke oorzaken van hypofysehypofunctie8 . Het is aangetoond dat de hypofyse van de muis het regeneratieve vermogen bezit en in staat is om lokale schade te herstellen die wordt geïntroduceerd door transgene ablatie van endocriene cellen 9,10. De SOX2+ stamcellen reageren acuut op de toegebrachte verwonding met een geactiveerd fenotype, gekenmerkt door verhoogde proliferatie (resulterend in stamcelexpansie) en verhoogde expressie van stamgerelateerde factoren en routes (bijv. WNT / NOTCH). Bovendien beginnen de stamcellen het geableerde hormoon tot expressie te brengen, wat uiteindelijk resulteert in een aanzienlijk herstel van de uitgeputte celpopulatie gedurende de volgende (5 tot 6) maanden 9,10. Ook tijdens de neonatale rijpingsfase van de klier (de eerste 3 weken na de geboorte) gedijen de hypofysestamcellen in een geactiveerde toestand 6,11,12,13, terwijl organismale veroudering geassocieerd is met verminderde in situ stamcelfunctionaliteit, als gevolg van een toenemende inflammatoire (micro-) omgeving bij veroudering (of 'ontsteken')10,14 . Bovendien is tumorigenese in de klier ook geassocieerd met stamcelactivering 7,15. Hoewel stamcelactivering is gedetecteerd in verschillende situaties van hypofyseremodellering (beoordeeld in 7,16), blijven de onderliggende mechanismen onduidelijk. Aangezien in vivo benaderingen (zoals het traceren van afstamming bij transgene muizen) geen duidelijk of volledig beeld van hypofysestamcellen hebben opgeleverd, is de ontwikkeling van betrouwbare in vitro modellen om stamcelbiologie in normale en zieke hypofyse te onderzoeken essentieel. Standaard in vitro kweek van primaire hypofysestamcellen blijft ontoereikend vanwege de zeer beperkte groeicapaciteit en niet-fysiologische (2D) omstandigheden met snel verlies van fenotype (voor een meer gedetailleerd overzicht, zie16). 3D-bolculturen (pituisferen) zijn vastgesteld uit hypofysestamcellen zoals geïdentificeerd door zijpopulatie en SOX2+ fenotype 2,3,4. De pituisferen groeien klonaal uit de stamcellen, drukken stammarkers uit en vertonen differentiatievermogen in de endocriene celtypen. Ze breiden zich echter niet aanzienlijk uit terwijl ze slechts een beperkte doorgang vertonen (2-3 passages)3,4. Bolachtige structuren werden ook verkregen uit niet-gedissocieerde hypofyse stamcelclusters wanneer gekweekt in 50% verdund Matrigel gedurende 1 week, maar de uitbreidbaarheid werd niet aangetoond17. De pituisfeerbenadering wordt meestal gebruikt als uitleesmiddel voor stamcelaantallen, maar verdere toepassingen worden beperkt door inferieure expansiecapaciteit16.

Om deze tekortkomingen aan te pakken en te overwinnen, is onlangs een nieuw 3D-model vastgesteld, d.w.z. organoïden, uitgaande van de belangrijkste endocriene AL van muizen die de MZ en parenchymale stamcellen bevatten. Het is aangetoond dat de organoïden inderdaad zijn afgeleid van de stamcellen van de hypofyse en hun fenotype18 getrouw samenvatten. Bovendien zijn de organoïden op lange termijn uitbreidbaar, terwijl ze hun stengelachtigheid robuust behouden. Daarom bieden ze een betrouwbare methode om primaire hypofysestamcellen uit te breiden voor diepgaande verkenning. Een dergelijke exploratie is niet haalbaar met het beperkte aantal stamcellen dat uit een hypofyse kan worden geïsoleerd, die ook niet uitbreidbaar zijn in 2D-omstandigheden16. Het is aangetoond dat de organoïden waardevolle en betrouwbare hulpmiddelen zijn om nieuwe hypofysestamcelkenmerken te ontdekken (vertaalbaar naar in vivo)14,18. Belangrijk is dat het organoïde model de hypofysestamcelactiveringsstatus getrouw weerspiegelt als optredend tijdens lokale weefselbeschadiging en neonatale rijping, met verbeterde vormingsefficiëntie en replicerende upregulated moleculaire routes14,18. Vandaar dat het van hypofyse afgeleide organoïdemodel een innovatief en krachtig hypofysestamcelbiologisch onderzoeksmodel is, evenals een hulpmiddel voor het uitlezen van stamcelactivering.

Dit protocol beschrijft in detail de vestiging van van hypofyse afgeleide organoïden van muizen. Om dit doel wordt de AL geïsoleerd en gedissocieerd in afzonderlijke cellen, die zijn ingebed in extracellulair matrix-nabootsend Matrigel (hierna ECM genoemd). De cel-ECM-assemblage wordt vervolgens gekweekt in een gedefinieerd medium, dat in wezen stamcelgroeifactoren en hypofyse-embryonale regulatoren bevat (verder aangeduid als 'hypofyseorganoïde medium' (PitOM)18; Tabel 1). Zodra de organoïden volledig zijn ontwikkeld (na 10-14 dagen), kunnen ze verder worden uitgebreid door sequentiële passaging en worden onderworpen aan uitgebreide downstream-exploratie (bijv. Immunofluorescentie, RT-qPCR en bulk- of eencellige transcriptomica; Figuur 1). Op de langere termijn wordt verwacht dat de hypofysestamcelorganoïden de weg vrijmaken voor weefselherstelbenaderingen en regeneratieve geneeskunde.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dierproeven voor deze studie werden goedgekeurd door de Ethische Commissie dierproeven KU Leuven (P153/2018). Alle muizen werden gehuisvest in de dierenfaciliteit van de universiteit onder gestandaardiseerde omstandigheden (constante temperatuur van 23 ± 1,5 ° C, relatieve vochtigheid 40% -60% en een dag / nachtcyclus van 12 uur), met toegang tot water en voedsel ad libitum.

1. Muizen

  1. Gebruik in de handel verkrijgbare muizenstammen, zoals C57BL/6J-muizen, van jongvolwassen leeftijd (8-12 weken oud). Over het algemeen bieden 2-3 muizen een voldoende aantal AL-cellen voor het protocol.

2. Isolatie en dissociatie van muis AL

OPMERKING: Medium A, B en C worden van tevoren voorbereid19,20. De samenstellingen zijn weergegeven in tabel 2.

  1. Isolatie van muis AL
    1. Euthanasie de muizen door CO 2-verstikking, gevolgd door onthoofding (figuur 2A). Was muizenkoppen met gedeïoniseerd water om het bloed te verwijderen en besproei ze met 70% EtOH om een steriele omgeving te genereren.
    2. Verwijder met steriele chirurgische hulpmiddelen de huid van het hoofd tussen de oren (figuur 2B).
    3. Open de schedel en verwijder de hersenen.
      1. Breek de 'neusbrug' (d.w.z. het voorste deel van het voorste bot; Figuur 2B) met steriele schaar.
      2. Open de schedel verder met een schaar, beginnend vanaf de gebroken neusbrug naar de oren, aan beide zijden (figuur 2C).
      3. Verwijder de schedel en de hersenen met een steriel pincet, zonder de hypofyse aan te raken (figuur 2D).
    4. Verwijder de diafragma sellae met een stomp pincet, zonder de hypofyse te beschadigen. Gooi de PL en de IL van de AL onder een stereomicroscoop.
      OPMERKING: De PL en IL zijn gekoppeld en dus tegelijkertijd verwijderd. Deze delen verschijnen als wit weefsel, in vergelijking met het roze gekleurde AL (figuur 2D).
    5. Isoleer de AL zorgvuldig met een stomp pincet en verzamel deze in een Erlenmeyer van 10 ml, gevuld met 3 ml medium A (zie tabel 2). Leg de kolf op ijs tot verdere verwerking.
  2. Dissociatie van muis AL
    1. Verwijder het supernatant (SN) medium A uit de Erlenmeyer met de geïsoleerde AL. Voeg 2 ml voorgewarmde (37 °C) 2,5 % trypsineoplossing toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C.
    2. Voeg zonder de trypsineoplossing te verwijderen 2 ml voorgewarmde (37 °C) DNase-oplossing toe (2 μg/ml in medium A; steriel gefilterd door een gaas van 0,22 μm) en draai de Erlenmeyer 10 keer rond. Laat de hypofyse naar de bodem zinken (~1 min) en verwijder het SN.
    3. Voeg 2 ml voorgewarmde (37 °C) trypsineremmeroplossing toe (0,1 mg/ml in medium A; steriel gefilterd door een maaswijdte van 0,22 μm) en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C. Laat het hypofysesediment naar de bodem gaan en verwijder het SN.
    4. Voeg 2 ml voorverwarmd (37 °C) medium B (zie tabel 2) toe en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg zonder het SN te verwijderen 2 ml voorverwarmd (37 °C) medium C (zie tabel 2) toe en incubeer bij 37 °C gedurende 15 minuten.
    5. Laat de hypofyse naar de bodem zakken en verwijder het SN. Spoel de hypofyse driemaal af met voorverwarmd (37 °C) medium C.
    6. Dissocieer de hypofyse in enkele cellen.
      1. Voeg 2 ml voorgewarmd (37 °C) medium C. Aspiraat toe en verwijder de hypofyse meerdere keren met een steriele, vlamgepolijste Pasteurpipet, totdat fragmenten niet meer zichtbaar zijn.
      2. Breng de suspensie over in een buis van 15 ml met 4,5 ml voorverwarmde (37 °C) DNase-oplossing (2 μg/ml in medium A; steriel gefilterd door een maaswijdte van 0,22 μm). Spoel de Erlenmeyer driemaal met 2 ml voorgewarmd (37 °C) medium C en breng de suspensie over op de buis van 15 ml.
    7. Meng de verzamelde celsuspensie en filter deze door een celzeef van 40 μm in een buis van 30 ml. Spoel de buis van 15 ml en de celzeef drie keer af met 2 ml medium C en breng de suspensie over naar de buis van 30 ml.
    8. Plaats de punt van een glazen Pasteur-pipet, gevuld met 2 ml 3% runderserumalbumine (BSA)-oplossing (in medium A; steriel gefilterd door een gaas van 0,22 μm), op de bodem van de buis en pipetteer voorzichtig om een zichtbare dichtheidslaag te vormen. Centrifugeer bij 190 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
    9. Verwijder het SN door de buis in één vloeiende beweging om te keren en verwijder de resterende SN-druppels met een P1000-punt. Resuspend de celkorrel in 1 ml ijskoude Advanced DMEM/F12 (Adv DMEM/F12) en kwantificeer de cellen met een celteller.

3. Oprichting en kweek van van AL afgeleide organoïden

OPMERKING: Ontdooi ECM van tevoren op ijs (2-3 uur voor 1 ml) en houd het op ijs voor de duur van het protocol.

  1. Organoïde zaaien en kweken
    1. Centrifugeer de AL-celsuspensie bij 190 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en verwijder het SN. Resuspend de celkorrel in Adv DMEM/F12 met behulp van het specifieke volume berekend om een celdichtheid van 1,1 x 106 cellen/ml te bereiken.
      OPMERKING: Als de celsuspensie bijvoorbeeld 500.000 cellen /ml bevat, moet men de celkorrel resuspenderen in 454,54 μL Adv DMEM / F12 om de gewenste dichtheid van 1,1 x 106 cellen / ml te bereiken.
    2. Neem het volume celsuspensie dat nodig is voor plating (volgens het gewenste aantal putten om te zaaien voor organoïde ontwikkeling) en voeg ECM toe in een verhouding van 30:70 (30% celsuspensie (in Adv DMEM / F12 ) en 70% ECM). Meng goed door op en neer te pipetteren.
      OPMERKING: Bijvoorbeeld, voor één druppel van 30 μL (zie stap 3.1.3), moet men (voorzichtig) 9 μL celsuspensie (met ~ 10.000 cellen wanneer genomen uit de 1,1 x 106 cellen / ml suspensie) mengen met 21 μL ECM.
    3. Deponeer per put een druppel van 30 μL van het celsuspensie/ECM-mengsel (zie stap 3.1.2) op een voorverwarmde (37 °C) 48-wells plaat. Draai de plaat ondersteboven en laat de ECU gedurende 20 minuten stollen bij 37 °C.
      OPMERKING: Verwarm de kweekplaten ten minste 24 uur voor bij 37 °C.
    4. Breng de plaat terug in de juiste richting en voeg voorzichtig 250 μL voorgewarmde (37 °C) PitOM (zie tabel 1) toe, aangevuld met 10 μM Rock Inhibitor (Y-27632).
    5. Blijf de organoïden kweken door het medium (verstoken van Y-27632) om de 2-3 dagen te veranderen totdat de organoïden volgroeid zijn, wat tussen de 10-14 dagen duurt (figuur 3A). Passeer vervolgens de organoïden.
      OPMERKING: Zorg er bij het aanzuigen van het medium voor dat u de ECM-koepel niet verstoort. Kantel de kweekplaat iets en verwijder het medium van de onderrand van de put. Vers (voorgewarmd bij 37 °C) medium moet voorzichtig aan de zijkant van de put worden toegevoegd. Als geldruppeltjes zich ontvouwen, verzamel dan de organoïden en resuspend en kweek ze opnieuw in een nieuwe ECM-druppel.
  2. Organoïde passageing
    1. Zuig het medium voorzichtig op en voeg 400 μL ijskoude Adv DMEM/F12 toe om de ECU te desintegreren en de organoïden in een microcentrifugebuis te verzamelen. Eenmaal wassen met 400 μL ijskoude Adv DMEM/F12 EM. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    2. Verwijder het SN voorzichtig en voeg 400 μL voorverwarmd (37 °C) TrypLE Express Enzyme (1X) toe. Meng door de buis meerdere keren om te keren en incubeer bij 37 °C gedurende 5 minuten.
    3. Voeg 400 μL ijskoude Adv DMEM/F12 toe en centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 min bij 4 °C. Verwijder het SN.
    4. Resuspend de pellet met 100 μL ijskoude Adv DMEM/F12 en breek vervolgens de organoïden af door krachtig op en neer te pipetteren met een vernauwd P200-puntje (d.w.z. duw de lege punt tegen de bodem van de microcentrifugebuis om de openingsdiameter te verkleinen) totdat organoïdefragmenten (met een diameter van ongeveer 50 μm) zijn verkregen (figuur 3B).
      OPMERKING: Het dissociatiemengsel moet voornamelijk organoïde fragmenten en slechts enkele afzonderlijke cellen bevatten. Harde dissociatie van de organoïden in afzonderlijke cellen heeft een negatieve invloed op de hergroei van de organoïden.
    5. Voeg 800 μL Adv DMEM/F12 toe en centrifugeer bij 190 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Verwijder het SN.
    6. Passeer de organoïden in een verhouding van 1:2 tot 1:4. Resuspend de pellet in een voldoende volume Adv DMEM/F12 indien nodig voor het plateren en voeg ECM toe in een verhouding van 30:70 (30% celsuspensie en 70% ECM). Meng goed door op en neer te pipetteren.
    7. Zaad en kweek de organoïden zoals hierboven beschreven in stappen 3.1.3-3.1.5.
      OPMERKING: Gemiddeld ontwikkelen zich 20 organoïden per put uit de 10.000 hele AL-cellen die zijn gezaaid (0,2%). Deze passage 0 organoïden kunnen gesplitst worden in een 1:2 verhouding, waardoor zich >50 organoïden per put ontwikkelen (passage 1). Organoïden kunnen dan tijdens volgende passages in een verhouding van 1:2 tot 1:4 worden gesplitst. Hergroei van de organoïden vertraagt na ~10 passages (overeenkomend met 3 maanden cultuur), geconcretiseerd in geleidelijk minder en kleinere organoïden.

4. Cryopreservatie van al-afgeleide organoïden en ontdooien

  1. Cryopreservatie van organoïden
    1. Volg het passagingprotocol van stap 3.2.1 tot stap 3.2.5.
    2. Resuspend de organoïde pellet (met fragmenten en cellen) met 1 ml cryopreservatiemedium (tabel 3). Breng de suspensie over in een cryoviaal en plaats deze op ijs.
      OPMERKING: Organoïden (d.w.z. resulterende fragmenten en cellen) uit maximaal vier putten van de 48-putplaat kunnen worden gecombineerd in één cryoviaal.
    3. Plaats de cryovialen in een vriescontainer en breng ze over op -80 °C.
    4. Breng de monsters na 24 uur over naar een cryobox en bewaar ze in vloeibare stikstof (-196 °C) voor langdurige opslag.
  2. Ontdooien van gecryopreserveerde organoïden
    1. Verwijder het cryoviaal uit de tank met vloeibare stikstof en plaats het op ijs. Ga onmiddellijk verder met het ontdooiprotocol.
    2. Ontdooi de oplossing met de gecryopreserveerde organoïdefragmenten en enkele cellen bij 37 °C (waterbad).
      OPMERKING: Bewaar de oplossing niet langer dan 2 minuten bij 37 °C om celtoxiciteit door DMSO te voorkomen.
    3. Breng de inhoud over in een buis van 15 ml met 10 ml ijskoude Adv DMEM/F12 met 30% foetaal runderserum (FBS). Spoel de cryovial af met 1 ml Adv DMEM/F12 met 30% FBS.
    4. Centrifugeer bij 190 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Resuspend de pellet met 1 ml ijskoude Adv DMEM/F12 en breng de suspensie over naar een microcentrifugebuis.
    5. Centrifugeer bij 190 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Resuspend de pellet in een voldoende volume Adv DMEM/F12 indien nodig voor het beplaten en voeg ECM toe in een verhouding van 30:70. Meng goed door op en neer te pipetteren.
    6. Zaad en kweek de organoïden zoals hierboven beschreven in stappen 3.1.3-3.1.5.

5. Validatie van al-afgeleide organoïden

  1. Verzameling en lysis van organoïden voor RNA-isolatie
    1. Verzamel en centrifugeer de organoïden zoals hierboven beschreven (stap 3.2.1).
    2. Verwijder het SN en voeg 350 μL lysisbuffer toe met 1% 2-mercapto-ethanol. Vortex gedurende 30 s en bewaren bij -80 °C of onmiddellijk overgaan tot RNA-isolatie.
      LET OP: Pas op dat 2-mercapto-ethanol een giftige verbinding is. Al het werk moet worden gedaan in een chemische zuurkast terwijl u nitrilhandschoenen, een stofmasker en een veiligheidsbril draagt. 2-Mercapto-ethanol kan onherstelbare schade aan de ogen en de huid veroorzaken.
  2. Fixatie en inbedding van organoïden voor immuno-histochemie/-fluorescentiekleuring
    1. Verzamel en centrifugeer de organoïden zoals hierboven beschreven (stap 3.2.1).
    2. Verwijder het SN, voeg 1 ml 4% paraformaldehyde (PFA) toe en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) op een orbitale shaker (100 rpm).
      LET OP: PFA is een bekend carcinogeen voor de mens dat onomkeerbare schade aan het hoornvlies kan veroorzaken. Alle werkzaamheden moeten in een chemische zuurkast worden uitgevoerd. Nitril handschoenen en veiligheidsbrillen moeten altijd worden gedragen.
    3. Centrifugeer bij 200 x g gedurende 5 minuten en verwijder het SN. Voeg 1 ml PBS toe, incubeer 10 min bij RT op een orbitale shaker (100 rpm) en centrifugeer bij 90 x g gedurende 3 minuten bij 4 °C. Herhaal de wasstap twee keer. Bewaren in PBS bij 4 °C.
    4. Verwijder voor weefselverwerking en uitdroging het SN en voeg 150 μL 2% agarosegel (in PBS) toe aan de organoïde pellet met behulp van een voorverwarmde verbrede p200-tip (gemaakt door een klein stukje van de punt te snijden). Pipetteer onmiddellijk het volledige volume omhoog en werp het deksel van de microcentrifugebuis uit.
      OPMERKING: Het is belangrijk om snel te werken, omdat de gel met de organoïden snel zal stollen.
    5. Laat de gel 30 minuten stevig stollen en verplaats de gelschijf naar een histologiecassette. Dompel onder en bewaar in 50% EtOH, totdat uitdroging in de weefselverwerker.
    6. Voor paraffine inbedding plaatst u de gelschijf (met behulp van een tang) in een insluitvorm en vult u deze met warme paraffine (60 °C). Plaats de vormpjes op 4 °C totdat de paraffine vast is (ongeveer 45 min). Deze monsters kunnen worden opgeslagen bij 4 °C of kunnen onmiddellijk worden onderworpen aan sectie.
    7. Microtome de paraffineblokken die organoïden bevatten op een dikte van 5 μm en verzamel de monsters op glazen dia's. Voeg een druppel gedeïoniseerd water toe onder elke sectie om de sectie goed uit te rekken en plaats de dia's 's nachts op een vlakke verwarmingsplaat bij 37 °C. Bewaar de dia's met secties bij 4 °C of ga direct verder met immunohistochemische of immunofluorescentiekleuring.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Na isolatie en dissociatie van de AL worden de verkregen enkelvoudige cellen in ECM gezaaid en in PitOM gekweekt (figuur 1, tabel 1). Figuur 3A toont de celcultuur en dichtheid bij het zaaien (dag 0). Er kan wat klein puin aanwezig zijn (figuur 3A, witte pijlpunten), maar zal verdwijnen bij het passeren. Veertien dagen na het zaaien zijn de van AL afgeleide organoïden volledig ontwikkeld (figuur...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De al-afgeleide organoïden, zoals hier beschreven, vertegenwoordigen een krachtig onderzoeksmodel om hypofysestamcellen in vitro te bestuderen. Op dit moment is deze organoïde benadering het enige beschikbare hulpmiddel om op betrouwbare en robuuste wijze primaire hypofysestamcellen te laten groeien en uit te breiden. Eerder is een hypofyse-organoïdemodel afgeleid van embryonale stamcellen (ESC) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) gemeld, dat de hypofyse-embryonale organogenese nauw samenvat

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het KU Leuven Research Fund en het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) - Vlaanderen. E.L. (11A3320N) en C.N. (1S14218N) worden ondersteund door een Ph.D. Fellowship van het FWO/FWO-SB.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
48-well plates, TC treated, individually wrappedCostar734-1607
A83-01Sigma-AldrichSML0788
Advanced DMEM/F12Gibco12634010
Albumin Bovine (cell culture grade)Serva47330
B-27 Supplement (50X), minus vitamin AGibco12587010
Base mouldsVWR720-1918
Buffer RLTQiagen79216
Cassettes, Q Path MicrotwinVWR720-2191
Cell strainer, 40 µm mesh, disposableFalcon352340
Cholera Toxin from Vibrio choleraeSigma-AldrichC8052
Deoxyribonuclease I from bovine pancreasSigma-AldrichD5025
D-glucoseMerck108342
Dimethylsulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2650
DMEM, powder, high glucoseGibco52100039
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mLEppendorf30120086
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slidesThermo Fisher ScientificJ1800AMNZ
Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240VacThermo Fisher Scientific12587976
Ethanol Absolute 99.8+%Thermo Fisher Scientific10342652
Fetal bovine serum (FBS)Sigma-AldrichF7524
GlutaMAX SupplementGibco35050061
HEPESSigma-AldrichH4034
HEPES Buffer SolutionGibco15630056
InSolution Y-27632Sigma-Aldrich688001
L-Glutamine (200 mM)Gibco25030081
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-FreeCorning15505739
Mr. Frosty Freezing ContainerThermo Fisher Scientific5100-0001
N-2 Supplement (100X)Thermo Fisher Scientific17502048
N-Acetyl-L-cysteineSigma-AldrichA7250
Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic TubesThermo Fisher Scientific375353
Paraformaldehyde for synthesis (PFA)Merck818715
PBS, pH 7.4Gibco10010023
Penicillin G sodium saltSigma-AldrichP3032
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Gibco15140122
Phenol redMerck107241
Potassium Chloride (KCl)Merck104936
Recombinant Human EGF Protein, CFR&D systems236-EG
Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) ProteinR&D systems234-FSE
Recombinant Human FGF-10Peprotech100-26
Recombinant Human IGF-1Peprotech100-11
Recombinant Human IL-6Peprotech200-06
Recombinant Human NogginPeprotech120-10C
Recombinant Human R-Spondin-1Peprotech120-38
Recombinant Human/Murine FGF-8bPeprotech100-25
Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-TerminusR&D systems464-SH
RNeasy micro kitQiagen74004
SB202190Sigma-AldrichS7067
SeaKem LE AgaroseLonza50004
Sodium Chloride (NaCl)BDH102415K
Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydratePanReac-AppliChemA1047
Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3)Merck106329
Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3)Sigma-AldrichP5280
Stericup-GP, 0.22 µmMilliporeSCGPU02RE
Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μmMilliporeSCGP00525
Sterile waterFreseniusB230531
Streptomycin sulfate saltSigma-AldrichS6501
Thermo Scientific Excelsior ES Tissue ProcessorThermo Scientific12505356
Titriplex IIIMerck108418
TrypL Express Enzyme (1X), phenol redThermo Fisher Scientific12605028
Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)Sigma-AldrichT9003
Trypsin solution 2.5 %Thermo Fisher Scientific15090046
```

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Melmed, S. The pituitary. 3rd ed. , Elsevier/Academic Press. Cambridge. 1(2011).
  2. Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
  3. Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
  4. Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
  5. Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
  6. Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
  7. Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176(2021).
  8. Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
  9. Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
  10. Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
  11. Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
  12. Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
  13. Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142(2021).
  14. Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118(2021).
  15. Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
  16. Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519(2021).
  17. Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
  18. Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
  19. Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
  20. Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
  21. Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer's and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
  22. Trompeter, H. -I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111(2013).
  23. Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
  24. Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
  25. Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
  26. Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
  27. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
  28. Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hypofyse organo denhypofyse stamcellenorgano denkweekepitheliale markersimmunofluorescentiekleuringpasseren van organo dencystische morfologiestamcelmarkers

Gerelateerde artikelen