Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Förster Resonance Energy Transfer Mapping: een nieuwe methodologie om wereldwijde structurele kenmerken op te helderen

1.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63433

⸱

16 maart 2022

 ,  , 
1Molecular Biology and Biochemistry Department, Wesleyan University, 2Molecular Biophysics Program, Wesleyan University

In dit artikel

Samenvatting

De studie beschrijft de methodologie van FRET-mapping, inclusief de selectie van etiketteringslocaties, keuze van kleurstoffen, acquisitie en data-analyse. Deze methodologie is effectief bij het bepalen van bindingsplaatsen, conformatieveranderingen en dynamische bewegingen in eiwitsystemen en is het meest nuttig als deze wordt uitgevoerd in combinatie met bestaande 3D-structurele informatie.

Samenvatting

Förster resonantie energieoverdracht (FRET) is een gevestigde fluorescentie-gebaseerde methode die wordt gebruikt om met succes afstanden in en tussen biomoleculen in vitro en binnen cellen te meten. In FRET heeft de efficiëntie van energieoverdracht, gemeten aan de hand van veranderingen in fluorescentie-intensiteit of levensduur, betrekking op de afstand tussen twee fluorescerende moleculen of labels. Bepaling van dynamica en conformatieveranderingen vanaf de afstanden zijn slechts enkele voorbeelden van toepassingen van deze methode op biologische systemen. Onder bepaalde voorwaarden kan deze methodologie bestaande röntgenkristalstructuren aanvullen en verbeteren door informatie te verstrekken over dynamiek, flexibiliteit en aanpassing aan bindende oppervlakken. We beschrijven het gebruik van FRET en bijbehorende afstandsbepalingen om structurele eigenschappen op te helderen, door de identificatie van een bindingsplaats of de oriëntaties van dimeersubeenheden. Door een verstandige keuze van etiketteringslocaties en vaak het gebruik van meerdere etiketteringsstrategieën, hebben we deze mappingmethoden met succes toegepast om wereldwijde structurele eigenschappen in een eiwit-DNA-complex en het SecA-SecYEG-eiwittranslocatiesysteem te bepalen. In het SecA-SecYEG-systeem hebben we FRET-mappingmethoden gebruikt om de preproteïne-bindingsplaats te identificeren en de lokale conformatie van het gebonden signaalsequentiegebied te bepalen. Deze studie schetst de stappen voor het uitvoeren van FRET-mappingstudies, inclusief identificatie van geschikte etiketteringslocaties, bespreking van mogelijke labels, waaronder niet-inheemse aminozuurresiduen, etiketteringsprocedures, hoe metingen uit te voeren en het interpreteren van de gegevens.

Inleiding

Voor eiwitten leidt opheldering van dynamica samen met 3-dimensionale (3D) structurele kennis tot een beter begrip van structuur-functierelaties van biomoleculaire systemen. Structurele methoden, zoals röntgenkristallografie en cryogene elektronenmicroscopie, vangen een statische structuur op en vereisen vaak de bepaling van meerdere structuren om aspecten van biomolecuulbinding en dynamica op te helderen1. In dit artikel wordt een oplossingsgerichte methode besproken voor het in kaart brengen van globale structurele elementen, zoals bindingsplaatsen of bindingsinteracties, die mogelijk meer van voorbijgaande aard zijn en minder gemakkelijk kunnen worden vastgelegd door statische methoden. Sterke kandidaatsystemen voor deze methodologie zijn systemen waarin een 3D-structuur eerder is bepaald door röntgenkristallografie, NMR-spectroscopie of andere structurele methoden. In dit geval maken we gebruik van de röntgenkristalstructuur van het SecA-SecYEG-complex, een centrale speler in de eiwit-algemene secretoire route, om de locatie van een signaalpeptidebindingsplaats in kaart te brengen met behulp van Förster resonantie-energieoverdracht (FRET) voorafgaand aan het transport van het preproteïne over het membraan2. Manipulatie van het biologische systeem door genetische modificaties in combinatie met onze kennis van de 3D-structuur maakte het mogelijk om de conformatie van de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied te bepalen onmiddellijk voorafgaand aan het inbrengen in het kanaal 3.

FRET omvat de stralingsloze overdracht van energie van het ene molecuul (donor) naar het andere (acceptor) op een afstandsafhankelijke manier die door de ruimte is 4,5. De efficiëntie van deze overdracht wordt bewaakt door een afname van de donor of een toename van de fluorescentie-intensiteit van de acceptor. De efficiëntie van energieoverdracht kan worden omschreven als

E = R06/(R06 + R6)

waarbij de R0-waarde de afstand is waarop de overdracht 50% efficiënt is6. De techniek is eerder beschreven als een moleculaire liniaal en is effectief in het bepalen van afstanden in het bereik van 2,5-12 nm, afhankelijk van de identiteit van de donor-acceptorkleurstoffen 4,7,8,9. De fluorescentie-intensiteiten en levensduur van de donor met of zonder acceptor maken het mogelijk om de overdrachtsefficiënties en bijgevolg de afstanden 5,8 te bepalen. Vanwege de beschikbaarheid van de technologie, de gevoeligheid van de methode en het gebruiksgemak, heeft FRET ook een brede toepassing gevonden op gebieden als fluorescentiespectroscopie met één molecuul en confocale microscopie6. De komst van fluorescerende eiwitten zoals groen fluorescerend eiwit heeft de waarneming van intracellulaire dynamica en live-cell imaging relatief gemakkelijk gemaakt10,11. Veel FRET-toepassingen zoals deze worden in dit virtuele nummer in detail besproken.

In deze studie richten we ons vooral op het gebruik van FRET-metingen om afstandswaarden te genereren om structurele details te bepalen. Voorheen werden FRET-metingen effectief gebruikt om de conformatie van DNA-moleculen te bepalen wanneer ze gebonden zijn aan eiwit 12,13,14, de interne dynamiek van eiwitten en eiwitbindingsinteracties 15,16,17. De voordelen van deze methode liggen in de mogelijkheid om flexibele en dynamische structurele elementen te bepalen in een oplossing met relatief lage hoeveelheden materiaal. Het is veelzeggend dat deze methode bijzonder effectief is wanneer deze wordt gebruikt in combinatie met bestaande structurele informatie en niet kan worden gebruikt als een middel voor 3D-structuurbepaling. De methode biedt het beste inzicht en de verfijning van de structuur als het werk voortbouwt op bestaande structurele informatie, vaak gekoppeld aan computationele simulatie18,19. Hier wordt het gebruik van afstanden verkregen uit steady-state en time-resolved FRET-metingen beschreven om een bindingsplaats, waarvan de locatie niet bekend was, op een bestaande kristallografische structuur van het SecA-SecYEG-complex, belangrijke eiwitten in de algemene secretoire route 3 in kaart tebrengen.

De algemene secretoire route, een sterk geconserveerd systeem van prokaryoten tot eukaryoten tot archaea, bemiddelt het transport van eiwitten over of in het membraan naar hun functionele locatie in de cel. Voor Gram-negatieve bacteriën, zoals E. coli, het organisme dat in onze studie wordt gebruikt, worden eiwitten ingebracht in of getransloceerd over het binnenmembraan naar het periplasma. Het bacteriële SecY-kanaalcomplex (de translocon genoemd) coördineert met andere eiwitten om het nieuw gesynthetiseerde eiwit te transloceren, dat naar de juiste locatie in de cel wordt geleid via een signaalsequentie die zich meestal bevindt op de N-terminus20,21. Voor eiwitten gebonden aan het periplasma, associeert het ATPase SecA-eiwit zich met de uitgangstunnel van het ribosoom en met het preproteïne nadat ongeveer 100 residuen zijn vertaald22. Samen met het SecB-chaperonne-eiwit houdt het het preproteïne in een ongevouwen toestand. SecA bindt aan de SecYEG-translocon en vergemakkelijkt door vele cycli van ATP-hydrolyse het eiwittransport over het membraan23,24.

SecA is een multi-domein eiwit dat bestaat in cytosolische en membraangebonden vormen. SecA, een homodimeer eiwit in het cytosol, bestaat uit een preproteïnebindend of cross-linking domein25, twee nucleotidebindende domeinen, een spiraalvormig vleugeldomein, een spiraalvormig steigerdomein en de twee helixvingers (THF)26,27,28,29 (figuur 1). In eerdere kristallografische studies van het SecA-SecYEG-complex suggereerde de locatie van de THF dat het actief betrokken was bij eiwittranslocatie en daaropvolgende cross-linking experimenten met het signaalpeptide stelden de betekenis van dit gebied in eiwittranslocatie verder vast30,31. Eerdere studies, met behulp van de FRET-mappingmethodologie, toonden aan dat exogene signaalpeptiden binden aan dit gebied van SecA 2,32. Om de conformatie en locatie van de signaalsequentie en het vroegrijpe gebied van het preproteïne volledig te begrijpen voorafgaand aan het inbrengen in het SecYEG-kanaal, werd een eiwitchimaera gemaakt waarin de signaalsequentie en residuen van het vroegrijpe gebied via een Ser-Gly-linker aan SecA werden bevestigd (figuur 1). Met behulp van dit biologisch levensvatbare construct werd verder aangetoond dat de signaalsequentie en het vroeg volwassen gebied van het preproteïne op een parallelle manier binden aan de THF2. Vervolgens werd de FRET-mappingmethodologie gebruikt om de conformatie en locatie van de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied in aanwezigheid van SecYEG op te helderen, zoals hieronder beschreven3.

Kennis van de 3D-structuur van het SecA-SecYEG-complex 33,34,35 en de mogelijke locatie van de bindingsplaats stelde ons in staat om oordeelkundig donor-acceptorlabels te plaatsen op locaties waar de kruising van individuele FRET-afstanden de bindingslocatie identificeert. Deze FRET-mappingmetingen onthulden dat de signaalsequentie en het vroege volwassen gebied van het preproteïne een haarspeld vormen met de punt aan de monding van het SecYEG-kanaal, wat aantoont dat de haarspeldstructuur wordt gesjabloond voorafgaand aan het inbrengen van het kanaal.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Selectie van etiketteringssites

  1. Identificeer ten minste drie potentiële etiketteringsplaatsen om de vermeende bindingsplaats op de bestaande eiwitstructuren te trianguleren. In dit geval werden SecA, SecYEG en preproteïne aan SecA bevestigd door genetische fusie geïdentificeerd2.
    1. Kies labelplaatsen binnen 25-75 Å van de vermeende bindingsplaats en in relatief statische gebieden van het eiwit bepaalt de afstand het specifieke FRET-kleurstofpaar dat moet worden gebruikt36. Lokaliseer de etiketteringsplaatsen in eiwitgebieden die relatief van elkaar verschillen, dus de sites beschrijven de hoekpunten van een driehoek met de vermeende bindingsplaats in het midden (figuur 1A-D).
    2. Cysteïneresiduen (Cys) introduceren of identificeren op etiketteringsplaatsen van belang in een eiwit dat geen andere Cys-residuen bevat, om de etiketteringsefficiëntie van de specifieke locatie te verbeteren37,38.
    3. Introduceer onnatuurlijke aminozuren, bijvoorbeeld p-azidofenylalanine voor etikettering met klikchemie, om één eiwit effectief te labelen op twee verschillende posities met verschillende kleurstoffen39,40.
    4. Test de Cys-mutanten op functieverlies. Controleer de activiteit van de Cys-loze mutant en de onnatuurlijke aminozuurmutant met behulp van een geschikte activiteitstest. In dit geval werd de activiteit geverifieerd met een groeitest gevolgd door een in vitro malachietgroene ATPase-test 32,41,42

2. Etikettering van het eiwit

  1. Zuiver het eiwit of de eiwitten van belang tot ten minste 95% zuiverheid voor een nauwkeurige etikettering. Zuiver SecA- en SecYEG-eiwitten volgens protocollen die zijn beschreven in referentie3. Zorg ervoor dat u ten minste 5 μg gezuiverd eiwit hebt voor deze stap, omdat er tijdens het etiketteringsproces wat eiwit verloren gaat.
  2. Kies twee kleurstoffen voor FRET-metingen, afhankelijk van hun R0-waarde en de voorspelde afstanden tussen gelabelde locaties. Schat de R0-waarden en observeer de overlap van donoremissie en acceptorabsorptie met behulp van de informatie uit de fluorescerende eiwitdatabase, die ook spectra geeft voor veelgebruikte kleurstoffen (https://www.fpbase.org/spectra/)36.
    OPMERKING: R0 wordt gedefinieerd als de afstand waarop de overdrachtsefficiëntie 50% is voor een bepaald kleurstofpaar. Voor karteringsexperimenten moeten voorspelde afstanden dicht bij de R0-waarde van het kleurstofpaar liggen om ervoor te zorgen dat afstanden nauwkeurig kunnen worden gemeten.
  3. Label de in stap 1.1.1 aangegeven posities. met het donor-acceptor kleurstofpaar.
    1. Label het eiwit volgens de instructies van de fabrikant met bijzondere aandacht voor parameters zoals optimale eiwitconcentratie, temperatuur, pH, tijdsduur en buffer voor de specifieke gebruikte kleurstoffen43,44.
    2. Bereid het eiwit in een concentratie van 1-2 mg/ml of ongeveer 10 μM in een 25 mM Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM KCl, 1 mM EDTA (TKE) buffer. Los kleurstof op in dimethylformamide (DMF) of dimethylsulfoxide (DMSO) tot een eindconcentratie van 1 mM. Voeg de kleurstof druppelsgewijs toe aan de oplossing terwijl u roert om een kleurstof:eiwitkiesverhouding van 5:1 (50 μM kleurstof: 10 μM eiwit) te bereiken.
    3. Laat de reactie gedurende 4 uur bij kamertemperatuur (RT) doorgaan in een glazen injectieflacon met zacht schommelen of een nacht bij 4 °C. Stop de reactie door β-mercaptoethanol toe te voegen.
      OPMERKING: Als eiwit niet compatibel is met Tris-buffer, kunnen fosfaat- of HEPES-buffers worden gebruikt. Handhaaf de pH in het bereik van 7,0-7,5. Als het eiwit disulfidebindingen heeft, voeg dan een reductiemiddel zoals DTT of TCEP toe voordat u het etiketteert. Verwijder DTT door dialyse of gelfiltratie voordat u kleurstof toevoegt.
  4. Verwijder voor nauwkeurige FRET-metingen de vrije kleurstof met een centrifugale concentrator met een geschikte moleculaire gewichtsafsnijding (MWCO) om de vrije kleurstof door te laten stromen met behoud van het gelabelde eiwit.
    1. Bereid het concentratormembraan voor door ~ 1 ml water in het bovenste deel van een 3 ml concentrator te plaatsen en centrifugeer het water vervolgens door het membraan (ten minste 10 minuten bij 4.300 x g)..
    2. Verwijder vrije kleurstof door het gelabelde monster in de concentrator te centrifugeren (20 min bij 4.300 x g). Herhaal dit 3-4 keer en gooi de stroom weg.
    3. Controleer de etiketteringsefficiëntie van het gelabelde eiwit met behulp van UV-Vis-absorptiespectroscopie.
      OPMERKING: FRET-metingen vereisen etiketteringsefficiënties van 50% of meer. Lagere etiketteringsefficiënties verminderen het FRET-signaal en kunnen leiden tot onnauwkeurigheden in de meting.
    4. Verkrijg een UV-Vis-spectrum van het gelabelde eiwit met een bereik van 250-700 nm om zowel de eiwitabsorptieband als de maximale absorptieband van de kleurstof te observeren. Meet de absorptie op de absorptiepiek van kleurstof en bij 280 nm voor eiwit.
    5. Bepaal de concentratie van eiwitten en corrigeer voor eventuele bijdragen van de kleurstof met behulp van de correctiefactor CF en de volgende vergelijkingen45,46:
      figure-protocol-1
      waarbij C de concentratie van het eiwit (M) is, A280 de monsterabsorptie bij 280 nm, Amax de absorptie bij het kleurstofabsorptiemaximum, ε eiwit de extinctiecoëfficiënt voor het eiwit bij 280 nm en CF de correctiefactor, A'280/A'max, waarbij A'280 de absorptie bij 280 nm is en A'max de absorptie op het piekmaximum voor alleen de kleurstof.
    6. Bepaal de efficiëntie van de etikettering met behulp van de volgende vergelijking:
      figure-protocol-2
      waarbij εkleurstof de molaire extinctiecoëfficiënt van de kleurstof is, C de concentratie van het eiwit zoals bepaald in stap 2.4.5 en E de etiketteringsefficiëntie. Herhaal stap 2.4.2 totdat de efficiëntiewaarde van de etikettering is gestabiliseerd en minder dan 100% is.

3. Bepaal de R 0-waarden

  1. Meet de R0-waarden in situ. Bereid twee eiwitmonsters in dezelfde concentratie van totaal eiwit, 4 μM, één met het eiwit gelabeld met alleen de donorkleurstof en één met het eiwit gelabeld met alleen de acceptorkleurstof. Voor SecA werkt een eiwitconcentratie van 4 μM SecA monomeer goed voor deze metingen.
    1. Bereid monstervolumes van 2,5 ml voor een cuvette van 1 cm x 1 cm, 600 μL voor een cuvette van 5 mm x 5 mm of 200 μL voor een cuvette van 3 mm x 3 mm.
  2. Schakel de fluorometer in en open het spectrale acquisitie- en analyseprogramma in de fluorescentiesoftware als u een spectrofluorometer gebruikt. Klik op de rode M om de computer op het instrument aan te sluiten (figuur 2A) en kies Emissiespectra.
    1. Voer scanparameters in, zoals excitatiegolflengte, het bereik voor emissiescan, temperatuur en monsterwisselaarpositie met behulp van het menu-item Experiment verzamelen (afbeelding 2B).
    2. Klik op RTC en optimaliseer de instrumentinstellingen (bijv. spectrale spleten) door de fluorescentie-emissie op de piek te bewaken met behulp van een excitatiegolflengte die is ingesteld op het absorptiemaximum van de kleurstof. Stel voor SecA de volgende instellingen in: bandpass als 1 nm; excitatie- en emissiespleten van respectievelijk 1 en 1,5 mm, met een temperatuur van 25 °C en een roersnelheid van 250 tpm.
      OPMERKING: Overschrijd de capaciteit van het instrument (cps) niet (typisch 2 x 106 cps).
  3. Plaats het door de donor gelabelde eiwitmonster in de monsterhouder en klik op Uitvoeren om een emissiescan te genereren van het eiwit dat is gelabeld met alleen de donorkleurstof (alleen donoreiwit) door het monster te prikkelen op het kleurstofabsorptiemaximum (bijv. 488 nm voor AF488) en de emissiepiek te scannen (505-750 nm voor alleen donor SecA-eiwit gelabeld met AF488).
  4. Stel een basislijn voor de scan vast door de scan 25-50 nm voorbij het einde van de piek te verlengen. Meet de kwantumopbrengst van het donor-only eiwit, door absorptie- en fluorescentiemetingen uit te voeren op monsters van verschillende concentraties zoals beschreven47. Houd dezelfde spleetinstellingen aan voor deze metingen.
    1. Gebruik vrije donorkleurstof als referentie voor de kwantumopbrengst. Verkrijg ten minste vier metingen van het donoreiwit en de vrije kleurstof in verschillende concentraties voor een nauwkeurige bepaling.
    2. Plot de fluorescentie-intensiteit of het geïntegreerde gebied versus de absorptie voor het donor-only eiwit en de vrije kleurstof of referentie. Bepaal de hellingen voor het donor-only eiwit (hellingD) en de referentie (hellingR).
    3. De kwantumopbrengst (Φ) wordt berekend met behulp van de volgende vergelijking:
      figure-protocol-3
      hier is ΦD de kwantumopbrengst van het donoreiwit, ΦR is de kwantumopbrengst van de vrije kleurstof (deze kan meestal worden verkregen van de fabrikant), hellingD en hellingR zijn de hellingen die in stap 3.4.2 zijn bepaald voor respectievelijk het donoreiwit en referentie, en ηD en ηR vertegenwoordigen de brekingsindex van het donoreiwit en de referentievrije kleurstofoplossingen, respectievelijk 47.
  5. Verkrijg een absorptiespectrum van uw acceptor-only eiwit met behulp van een 1 cm pathlength cel. Genereer een extinctiecoëfficiëntspectrum van uw acceptor-only eiwit door het absorptiespectrum te delen door de kleurstofconcentratie.
  6. Genereer de spectrale overlapintegraal, J (λ) met behulp van een grafisch analyseprogramma. Een standaard werkbladprogramma (bijv. Spreadsheet) kan ook worden gebruikt voor dit proces.
    1. Vermenigvuldig het fluorescentie-emissiespectrum van het donor-only eiwit (stap 3.4) met het extinctiecoëfficiëntspectrum van het acceptor-only eiwit om het overlapspectrum te genereren.
    2. Vermenigvuldig het resulterende overlapspectrum met λ4.
    3. Bepaal het gebied onder de curve door integratie van het overlapgebied. Het overlapgebied wordt gedefinieerd als het gebied waar het donoremissiespectrum vermenigvuldigd met het spectrum van de acceptor-extinctiecoëfficiënt positieve waarden oplevert. De spectrale overlapintegraal wordt gedefinieerd als:
      figure-protocol-4
      waarbij FD (λ) het emissiespectrum is van het donoreiwit (verkregen in stap 3.4) en εA(λ) het extinctiecoëfficiëntspectrum is van het eiwit dat alleen voor acceptoren geldt en eenheden van M-1 cm-1 heeft (verkregen in stap 3.5). De resulterende spectrale overlap integraal moet eenheden van M-1 cm-1nm4 hebben.
    4. Normaliseer de spectrale overlap integraal. Deel de overlap integraal door het geïntegreerde gebied van het donor only eiwitspectrum over hetzelfde spectrale bereik:
      figure-protocol-5
    5. Bereken de R0-waarde in Å met behulp van de volgende vergelijking:
      figure-protocol-6
      waarbij κ2 de oriëntatiefactor is, doorgaans genomen als 2/3 voor vrij roterende kleurstoffen, η de brekingsindex is en kan worden benaderd als 1,33 voor verdunde waterige oplossingen, QD de kwantumopbrengst van de donor is (stap 3.4) en J(λ) de spectrale overlapintegraal zoals bepaald in stap 3.6.35. OPMERKING: Als de kleurstoffen niet vrij ronddraaien, kunnen correcties worden aangebracht zoals beschreven door Ivanov 48 en geïmplementeerd door Auclair49 en Zhang 2,3.

4. Voer FRET spectrale metingen uit

  1. Bereid donor-only eiwit, acceptor-only eiwit en donor-acceptor eiwitmonsters in dezelfde concentratie; een concentratie van 4 μM wordt aanbevolen. Gebruik 200 μL oplossing, bij gebruik van een cuvette van 3 mm x 3 mm, 600 μL bij gebruik van een cuvette van 5 mm x 5 mm of 2,5 ml bij gebruik van een cuvette van 1 cm x 1 cm.
    1. Bereid het donor-acceptor eiwitmonster voor door gelijke molaire hoeveelheden van alleen de donor en het acceptor-only eiwit te gebruiken.
    2. Behoud dezelfde hoeveelheid gelabeld monster alleen in controledonor en acceptor alleen eiwitmonsters door de introductie van niet-gelabeld eiwit in gelijke molaire hoeveelheid aan de monsters van alleen de donor of de acceptor. Voor oplossingen met dezelfde concentratie zou elk FRET-monster met alleen donoren bijvoorbeeld 100 μL donoreiwit en 100 μL ongelabeld eiwit bevatten voor een volume van 200 μL.
  2. Genereer fluorescentie-emissiespectra van alleen de donor, alleen acceptor en donor-acceptor monsters. Optimaliseer het signaal zoals beschreven in stap 3.2. Eenmaal geoptimaliseerd, behoudt u dezelfde instellingen voor alle voorbeelden.
    1. Verkrijg de donor-only scan zoals beschreven in stap 3.3. Prikkel de oplossing op het maximale dosisabsorptie van de donorkleurstof en scan de emissiepieken van de donor en (verwachte) acceptor.
    2. Wissel het monster om in het eiwit dat alleen voor acceptoren geldt of verander de positie van de monsterwisselaar in het cuvet dat het alleen-acceptor-eiwit bevat.
    3. Verkrijg een emissiescan van het eiwit dat is geëtiketteerd met alleen acceptorkleurstof (alleen acceptor-eiwit) met dezelfde instellingen als in stap 4.2.1. Prikkel het monster op de donor excitatiegolflengte.
      OPMERKING: Dit spectrum biedt een correctie voor de hoeveelheid acceptor die wordt geëxciteerd op de donorgolflengte (FA in stap 5.1.2)
    4. Wissel het monster om in het donor-acceptor eiwitmonster of verander de positie van de monsterwisselaar in het cuvet dat het donor-acceptor gelabelde eiwit bevat.
    5. Verkrijg een emissiescan van het donor-acceptor eiwitmonster met dezelfde instellingen als in stap 4.2.1 en 4.2.3.
    6. Corrigeer voor alle spectra voor achtergrondfluorescentie door de achtergrondtellingen af te trekken die aan het einde van de scan zijn gemeten.
  3. Meet de levensduur van de donor van alleen de donor en de donor-acceptormonsters die zijn bereid zoals beschreven in stap 4.1.2. Gebruik een tijdgecorreleerd fluorescentie-instrument voor het tellen van één foton dat in staat is om fluorescerend verval in het nanoseconde (10-9 s) tijdsbereik te meten en op te lossen.
    OPMERKING: Voor FRET-kleurstofparen moet u de excitatielichtbron afstemmen op het absorptiemaximum van de donorkleurstof.
    1. Zet het instrument aan. Open de acquisitiesoftware, gebruik de instrumentbesturingssoftware voor gegevensverzameling met de fluorescentiespectrometer.
    2. Selecteer voor acquisitie TCSPC Decay, met een tijdsbereik van 55 ns, een winst van 1 en 4096 kanalen.
    3. Verkrijg een instrumentresponsfunctie (IRF) met behulp van een oplossing van niet-zuivel creamer of commerciële verstrooiingsoplossing en controleer de verstrooiing bij 490 nm. Pas de spleetinstelling aan en gebruik indien nodig filters met neutrale dichtheid om een voldoende lage telsnelheid te behouden om pulsophoping te voorkomen5. Klik op Accepteren en vervolgens op Starten. Hiermee wordt de overname gestart.
      LET OP: Een maximale telsnelheid van 4000 cps wordt gebruikt voor een herhalingsfrequentie van 180 kHz.
    4. Verzamel de IRF bij 490 nm totdat het piekkanaal maximaal 20.000 tellen heeft. Verzamel een IRF voor en na het meten van elk fluorescentieverval.
    5. Verkrijg de fluorescentieverval van de donor- en donoracceptormonsters door de fluorescentie-emissie te controleren op de donoremissiegolflengte, 520 nm.
    6. Pas de spleetinstellingen aan voor een maximale telsnelheid van 4000 cps of minder. Spleetinstellingen zijn meestal 15-20 nm bandpass voor eiwitmonsters. Verzamel het verval totdat 20.000 tellingen worden verkregen in het piekkanaal.
  4. Analyseer het verval of de fluorescentie-intensiteit (I) als functie van de tijd (t) voor de fluorescentielevensduur (τ). Pas het verval aan op een som van exponenten met de volgende vergelijking:
    figure-protocol-7
    waarbij αI de preexponentiële factor is van de ith-component en τI de levensduur is. De pasvorm wordt opnieuw samengesteld met de IRF om het fluorescentieverval te evenaren. Beoordeel de kwaliteit van de pasvorm aan de hand van de verlaagde Χ2-parameters .

5. Analyse van FRET-gegevens

  1. Bereken fret-efficiëntie uit de afname van de donorintensiteit van het donor-acceptormonster ten opzichte van de donor alleen met de volgende vergelijking.
    figure-protocol-8
    waarbij FDA de fluorescentie-intensiteit van het donor-acceptormonster is en FD de fluorescentie-intensiteit van het donormonster alleen op het hoogtepunt van de donorfluorescentie. Gebruik de geïntegreerde gebieden van de pieken als de gegevens luidruchtig zijn.
    1. Corrigeer voor eventuele verschillen in etikettering tussen de monsters van alleen de donor en de donor-acceptor. Bereken correcties op basis van de donorgraad van etikettering als volgt.
      figure-protocol-9
      waarbij fDA de efficiëntie van de donoretikettering is in het donoracceptormonster en fD de etiketteringsefficiëntie in het monster dat alleen donor is.
    2. Correct voor eventuele bijdragen van de acceptorfluorescentie aan het donor-geëxciteerde spectrum door aftrek van het acceptor-only eiwitspectrum (stap 4.2) van het donor-acceptor eiwitspectrum.
      figure-protocol-10
    3. Corrigeer voor de verschillen in etiketteringsefficiëntie van het acceptor-only eiwit ten opzichte van het donor-acceptor-eiwitmonster, wat de volgende vergelijking oplevert voor het berekenen van de efficiëntie:
      figure-protocol-11
      waarbij fA de fractionele hoeveelheid acceptoretikettering aangeeft. Deze vergelijking omvat alle correcties als gevolg van kleurstofetikettering en acceptorfluorescentie.
    4. Bereken FRET-afstanden van de efficiëntie met behulp van de volgende vergelijking:
      figure-protocol-12
      met behulp van de R0-waarde verkregen in stap 3.6.5.
    5. Bereken de FRET-efficiëntie met behulp van fluorescentielevensduur van alleen donor- en donor-acceptormonsters gemeten in stap 4.3.3-4.3.5:
      figure-protocol-13
    6. Gebruik de amplitudegewogen levensduur om FRET-efficiëntie te berekenen en vergelijk met steady-state resultaten5.
      figure-protocol-14
    7. Bereken de afstand zoals in stap 5.1.4 tot de efficiëntie bepaald door de fluorescentielevensduur. Vergelijk steady-state en time-resolved waarden voor FRET-efficiëntie en afstanden en zorg ervoor dat ze binnen de fout van elkaar liggen.

6. De afstanden in kaart brengen

  1. Gebruik de berekende afstanden om de bindingsplaats op de driedimensionale structuur in kaart te brengen. Bereken de afstanden en fouten voor alle onderzochte kleurstofparen en -locaties met behulp van de vergelijking in stap 5.1.4 en R0 waarden verkregen in stap 3.6.5 voor elk FRET-paar.
    1. Gebruik een 3D grafisch weergaveprogramma zoals PyMOL50 om de afstanden op de structuur in kaart te brengen (script gegeven in Aanvullend bestand). Opdrachten uit het script kunnen rechtstreeks in het opdrachtvenster worden ingevoerd met de juiste afstandsinformatie.
    2. Genereer een shell voor elke gemeten afstand en de bijbehorende fout (figuur 3, figuur 4, aanvullende figuren 1-3).
    3. Breng de positie in kaart via het snijpunt van de verschillende schelpen (aanvullende figuren 1-3). De signaalpeptidebindingsplaats werd in kaart gebracht via de drie verschillende locaties op SecA en SecYEG en vier verschillende locaties op het signaalpeptide (figuur 1).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Deze studie richtte zich op het bepalen van de locatie van de preproteïnebindingsplaats op SecA voorafgaand aan het inbrengen van het preproteïne in het SecYEG-kanaal. Om de bindingsplaats in kaart te brengen, werden FRET-experimenten uitgevoerd tussen verschillende regio's van het preproteïne en drie verschillende locaties op de SecA- en SecYEG-eiwitten (figuur 1A-D). Uit de verkregen afstanden en driedimensionale structuren van SecA, SecYEG en het preprote...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Door het gebruik van de FRET-mappingmethodologie identificeerden we de signaalsequentiebindingsplaats op het SecA-eiwit. Belangrijk is dat de aanwezigheid van een 3D-kristalstructuur van het complex onze studie aanzienlijk vergemakkelijkte. De kracht van deze mappingmethodologie ligt in de mogelijkheid om een bestaande structuur te gebruiken om locaties voor labeling te identificeren. Deze methodologie kan niet worden gebruikt om een 3D-structuur te bepalen; bepaling van structurele elementen56, v...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door National Institutes of Health grant R15GM135904 (toegekend aan IM) en National Institutes of Health Grant GM110552 (toegekend aan DBO).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
490 nm LED laserHoriba1684-LED
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide//DIBO AlkyneLife TechnologiesA20347
AgarDifcoDF0812
Alexa Fluor 488 C5 Maleimide/DIBO AlkyneLife TechnologiesA10254
Alexa Fluor 488 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10904
Alexa Fluor 647 DIBO AlkyneLife TechnologiesS10906
Amicon Ultra­4 Centrifugal filter (50kDa MWCO)SigmaUFC805008
Dodecylmaltoside (DDM)AnatraceD310
E. coli alkalische fosfatase signaalpeptide SP22Biomolecules MidwestN/AGesynthetiseerd aangepast item
uitgebreid signaalpeptide SP41Biomolecules MidwestN/AGesynthetiseerd aangepast item
FluorEssenceHoribaversie 2.4spectraal acquisitieprogramma voor Fluoromax4 spectrofluorometer
Fluoromax 4 spectrofluorometerHoribaN/A
GlobalsWELaboratory for Fluorescence Dynamics, University of California, Irvinespectraal analyseprogramma voor tijdsafhankelijke vervalprocessen
H­4­Azido­Phe­OHBACHEM4020250.0001
LB (Miller) BrothFisher ScientificBP9723
Ludox HS-40 colloïdaal silica (40 wt.% suspensie in H2O)Sigma-Aldrich420816verdunning is nodig om een goede verstrooiingsoplossing te maken
PTI Felix GXHoribaversie 4.1.0.4096spectraal acquisitieprogramma voor PTI Time Master Instrument
PTI Time Master InstrumentHoribaNA
Pymol Molecular Graphics ProgramSchrodingerversie 2.4
WaterbadThermo ScientificNESLAB RTE 10

Referenties

  1. Thompson, M. C., Yeates, T. O., Rodriguez, J. A. Advances in methods for atomic resolution macromolecular structure determination. F1000Research. 9, (2020).
  2. Zhang, Q., Li, Y., Olson, R., Mukerji, I., Oliver, D. Conserved SecA signal peptide-binding site revealed by engineered protein chimeras and Forester resonance energy transfer. Biochemistry. 55 (9), 1291-1300 (2016).
  3. Zhang, Q., et al. Alignment of the protein substrate hairpin along the SecA two-helix finger primes protein transport in Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (35), 9343-9348 (2017).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. Boston, MA. (2006).
  6. Algar, W. R., Hildebrandt, N., Vogel, S. S., Medintz, I. L. FRET as a biomolecular research tool - understanding its potential while avoiding pitfalls. Nature Methods. 16 (9), 815-829 (2019).
  7. Magde, D., Wong, R., Seybold, P. G. Fluorescence quantum yields and their relation to lifetimes of rhodamine 6G and fluorescein in nine solvents: improved absolute standards for quantum yields. Photochemistry and Photobiology. 75 (4), 327-334 (2002).
  8. Clegg, R. M. Fluorescence resonance energy transfer and nucleic acids. Methods in Enzymology. 211, 353-388 (1992).
  9. Scientific, T. F. R0 Values from Some Alexa Fluor Dyes - Table 1.6. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/tables/r0-values-for-some-alexa-fluor-dyes.html (2021).
  10. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors. 16 (9), Basel, Switzerland. 1488(2016).
  11. Day, R. N., Davidson, M. W. Fluorescent proteins for FRET microscopy: monitoring protein interactions in living cells. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular, and Developmental Biology. 34 (5), 341-350 (2012).
  12. Lee, S. J., Syed, S., Ha, T. Single-Molecule FRET Analysis of Replicative Helicases. Methods in Molecular Biology. 1805, Clifton, N.J. 233-250 (2018).
  13. Uhm, H., Hohng, S. Single-Molecule FRET Assay for Studying Cotranscriptional RNA Folding. Methods in Molecular Biology. 2106, 271-282 (2020).
  14. Globyte, V., Joo, C. Single-molecule FRET studies of Cas9 endonuclease. Methods in Enzymology. 616, 313-335 (2019).
  15. Qiao, Y., Luo, Y., Long, N., Xing, Y., Tu, J. Single-Molecular Förster Resonance Energy Transfer Measurement on Structures and Interactions of Biomolecules. Micromachines. 12 (5), 492(2021).
  16. Catipovic, M. A., Bauer, B. W., Loparo, J. J., Rapoport, T. A. Protein translocation by the SecA ATPase occurs by a power-stroke mechanism. The EMBO Journal. 38 (9), 101140(2019).
  17. Seinen, A. B., Spakman, D., van Oijen, A. M., Driessen, A. J. M. Cellular dynamics of the SecA ATPase at the single molecule level. Scientific Reports. 11 (1), 1433(2021).
  18. Dimura, M., et al. Quantitative FRET studies and integrative modeling unravel the structure and dynamics of biomolecular systems. Current Opinion in Structural Biology. 40, 163-185 (2016).
  19. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nature Methods. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  20. Paetzel, M. Structure and mechanism of Escherichia coli type I signal peptidase. Biochimica et Biophysica Acta. 1843 (8), 1497-1508 (2014).
  21. Ng, D., Brown, J., Walter, P. Signal sequences specify the targeting route to the endoplasmic reticulum membrane. The Journal of Cell Biology. 134 (2), 269-278 (1996).
  22. Huber, D., et al. SecA Cotranslationally Interacts with Nascent Substrate Proteins In Vivo. Journal of Bacteriology. 199 (2), 00622(2017).
  23. Lill, R., et al. SecA protein hydrolyzes ATP and is an essential component of the protein translocation ATPase of Escherichia coli. The EMBO Journal. 8 (3), 961-966 (1989).
  24. Lill, R., Dowhan, W., Wickner, W. The ATPase activity of SecA is regulated by acidic phospholipids, SecY, and the leader and mature domains of precursor proteins. Cell. 60 (2), 271-280 (1990).
  25. Kimura, E., Akita, M., Matsuyama, S., Mizushima, S. Determination of a region of SecA that interacts with presecretory proteins in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (10), 6600-6606 (1991).
  26. Hunt, J. F., et al. Nucleotide control of interdomain interactions in the conformational reaction cycle of SecA. Science. 297 (5589), New York, N.Y. 2018-2026 (2002).
  27. Sharma, V., et al. Crystal structure of Mycobacterium tuberculosis SecA, a preprotein tranlsocating ATPase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (5), 2243-2248 (2003).
  28. Vassylyev, D., et al. Crystal structure of the translocation ATPase SecA from Thermus thermophilus reveals a parallel, head-to-head dimer. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 248-258 (2006).
  29. Zimmer, J., Li, W., Rapoport, T. A. A novel dimer interface and conformational changes revealed by an X-ray structure of B. subtilis SecA. Journal of Molecular Biology. 364 (3), 259-265 (2006).
  30. Zimmer, J., Rapoport, T. A. Conformational flexibility and peptide interaction of the translocation ATPase SecA. Journal of Molecular Biology. 394 (4), 606-612 (2009).
  31. Bauer, B. W., Rapoport, T. A. Mapping polypeptide interactions of the SecA ATPase during translocation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (49), 20800-20805 (2009).
  32. Auclair, S., et al. Mapping of the signal peptide-binding domain of Escherichia coli SecA using Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 49 (4), 782-792 (2010).
  33. Zimmer, J., Nam, Y., Rapoport, T. A. Structure of a complex of the ATPase SecA and the protein-translocation channel. Nature. 455 (7215), 936-943 (2008).
  34. Li, L., et al. Crystal structure of a substrate-engaged SecY protein-translocation channel. Nature. 531 (7594), 395-399 (2016).
  35. Ma, C., et al. Structure of the substrate-engaged SecA-SecY protein translocation machine. Nature Communications. 10 (1), 2872(2019).
  36. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nature Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  37. Jilaveanu, L. B., Oliver, D. In vivo membrane topology of Escherichia coli SecA ATPase reveals extensive periplasmic exposure of multiple functionally important domains clustering on one face of SecA. The Journal of Biological Chemistry. 282 (7), 4661-4668 (2007).
  38. Ramamurthy, V., Oliver, D. Topology of the integral-membrane form of Escherichiacoli SecA protein. The Journal of Biological Chemistry. 272 (37), 23239-23246 (1997).
  39. Chin, J., et al. Addition of p-Azido-L-phenylalanine to the genetic code of Escherichia coli. Journal of the American Chemical Society. 124 (31), 9026-9027 (2002).
  40. Deiters, A., et al. Adding amino acids with novel reactivity to the genetic code of Saccharomyces cerevisiae. Journal of the American Chemical Society. 125 (39), 11782-11783 (2003).
  41. Lanzetta, P. A., Alvarez, L. J., Reinach, P. S., Candia, O. A. An improved assay for nanomole amounts of inorganic phosphate. Analytical Biochemistry. 100 (1), 95-97 (1979).
  42. Mitchell, C., Oliver, D. B. Two distinct ATP-binding domains are needed to promote protein export by Escherichia coli SecA ATPase. Molecular Microbiology. 10 (3), 483-497 (1993).
  43. Thiol-reactive Probe Labeling Protocol. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/labeling-chemistry-protocols/thiol-reactive-probe-labeling-protocol.html (2021).
  44. Click Chemistry - Section 3.1. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://www.thermofisher.com/us/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/reagents-for-modifying-groups-other-than-thiols-or-amines/click-chemistry.html (2021).
  45. Correction Factor. AAT Bioquest. , Available from: https://www.aatbio.com/resources/correction-factor/ (2019).
  46. Calculate dye:protein (F/P) molar ratios. Thermo Fischer Scientific. , Available from: https://tools.thermofischer.com/content/sfs/brochures/TR0031-Calc-FP-rations.pdf (2011).
  47. A Guide to Recording Fluorescence Quantum Yields. Horiba Scientific. , Available from: https://static.horiba.com/fileadmin/Horiba/Application/Materials/Material_Research/Quantum_Dots/quantumyieldstrad.pdf (2011).
  48. Ivanov, V., Li, M., Mizuuchi, K. Impact of emission anisotropy on fluorescence stectroscopy and FRET distance measurements. Biophysical Journal. 97 (3), 922-929 (2009).
  49. Auclair, S., Oliver, D., Mukerji, I. Defining the solution state dimer structure of Escherichia coli SecA using Forster resonance energy transfer. Biochemistry. 52 (14), 2388-2401 (2013).
  50. The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.4. , Schrodinger, LLC. New York. Available from: https://pymol.org/2/ (2021).
  51. Musial-Siwek, M., Rusch, S. L., Kendall, D. A. Selective photoaffinity labeling identifies the signal peptide binding domain on SecA. Journal of Molecular Biology. 365 (3), 637-648 (2007).
  52. Miller, A., Wang, L., Kendall, D. A. Synthetic signal peptides specifically recognize SecA and stimulate ATPase activity in the absence of preprotein. The Journal of Biological Chemistry. 273 (19), 11409-11412 (1998).
  53. Gelis, I., et al. Structural basis for signal-sequence recognition by the translocase motor SecA as determined by NMR. Cell. 131 (4), 756-769 (2007).
  54. Erlandson, K. J., et al. A role for the two-helix finger of the SecA ATPase in protein translocation. Nature. 455 (7215), 984-988 (2008).
  55. Das, S., Oliver, D. Mapping of the SecA-SecY and SecA-SecG interfaces by site-directed in vivo photocross-linking. The Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12371-12380 (2011).
  56. Wheatley, E. G., Pieniazek, S. N., Vitoc, I., Mukerji, I., Beveridge, D. L. Molecular Dynamics Structure Prediction of a Novel Protein-DNA Complex: Two HU Proteins with a DNA Four-way Junction. Innovations in Biomolecular Modeling and Simulations: Volume 2. , The Royal Society of Chemistry. 111-128 (2012).
  57. Vitoc, C. I., Mukerji, I. HU binding to a DNA four-way junction probed by Förster resonance energy transfer. Biochemistry. 50 (9), 1432-1441 (2011).
  58. Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature Protocols. 2 (8), 1849-1861 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

FRET mappingeiwitstructurele analyseligandbindingsplaatseiwitlabelingfluorescentiespectroscopiedonor acceptorpaarquantumopbrengstmetingeiwit DNA complexSecA SecYEG systeem
Förster Resonance Energy Transfer Mapping: een nieuwe methodologie om wereldwijde structurele kenmerken op te helderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.