Methodenartikel

Een in vitro benadering om mitochondriale disfunctie te bestuderen: een cybridemodel

DOI:

10.3791/63452

⸱

9 maart 2022

 ,  ,  , 
1Unit of Medical Genetics and Neurogenetics, Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transmitocrodiale cybriden zijn hybride cellen die worden verkregen door mitochondriaal DNA (mtDNA)-uitgeputte cellen (rho0-cellen ) te fuseren met cytoplasten (enucleated cells) afgeleid van patiënten die zijn getroffen door mitochondriale aandoeningen. Ze maken het mogelijk om de nucleaire of mitochondriale oorsprong van de ziekte te bepalen, biochemische activiteit te evalueren en de pathogenetische rol van mtDNA-gerelateerde varianten te bevestigen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deficiëntie van de mitochondriale respiratoire ketencomplexen die oxidatieve fosforylering (OXPHOS) uitvoeren, is de biochemische marker van menselijke mitochondriale aandoeningen. Vanuit genetisch oogpunt is het OXPHOS een uniek voorbeeld omdat het het resultaat is van de aanvulling van twee verschillende genetische systemen: nucleair DNA (nDNA) en mitochondriaal DNA (mtDNA). Daarom kunnen OXPHOS-defecten te wijten zijn aan mutaties die nucleaire en mitochondriale gecodeerde genen beïnvloeden.

Het baanbrekende werk van King en Attardi, gepubliceerd in 1989, toonde aan dat menselijke cellijnen uitgeput van mtDNA (genaamd rho0) opnieuw kunnen worden bevolkt door exogene mitochondriën om de zogenaamde "transmitochondrial cybrids" te verkrijgen. Dankzij deze cybriden die mitochondriën bevatten die afkomstig zijn van patiënten met mitochondriale aandoeningen (MD's) en kernen van rho0-cellen , is het mogelijk om te verifiëren of een defect mtDNA- of nDNA-gerelateerd is. Deze cybriden zijn ook een krachtig hulpmiddel om de pathogeniciteit van een mutatie te valideren en de impact ervan op biochemisch niveau te bestuderen. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol dat cybridegeneratie, selectie en karakterisering beschrijft.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitochondriale aandoeningen (MD's) zijn een groep multisysteemsyndromen veroorzaakt door een aantasting van mitochondriale functies als gevolg van mutaties in nucleair (nDNA) of mitochondriaal (mtDNA) DNA1. Ze behoren tot de meest voorkomende erfelijke stofwisselingsziekten, met een prevalentie van 1:5.000. mtDNA-geassocieerde ziekten volgen de regels van mitochondriale genetica: maternale overerving, heteroplasmie en drempeleffect, en mitotische segregatie2. Menselijk mtDNA is een dubbelstrengs DNA-cirkel van 16,6 kb, die een kort controlegebied bevat met sequenties die nodig zijn voor replicatie en transcriptie, 13 eiwitcoderende genen (alle subeenheden van de ademhalingsketen), 22 tRNA en 2 rRNA-genen3.

Bij gezonde personen is er één enkel mtDNA-genotype (homoplasmie), terwijl meer dan één genotype naast elkaar bestaat (heteroplasmie) in pathologische omstandigheden. Schadelijke heteroplasmatische mutaties moeten een kritische drempel overwinnen om OXPHOS te verstoren en ziekten te veroorzaken die elk orgaan op elke leeftijdvan 4 jaar kunnen beïnvloeden. De dubbele genetica van OXPHOS dicteert overerving: autosomaal recessief of dominant en X-gebonden voor nDNA-mutaties, maternale voor mtDNA-mutaties, plus sporadische gevallen zowel voor nDNA als mtDNA.

Aan het begin van het mitochondriale geneeskundetijdperk legde een baanbrekend experiment van King en Attardi5 de basis om de oorsprong van een mutatie die verantwoordelijk is voor een MD te begrijpen door hybride cellen te maken die kernen bevatten uit tumorcellijnen waarin mtDNA volledig was uitgeput (rho0-cellen) en mitochondriën van patiënten met MD's. Next-generation sequencing (NGS) -technieken waren op dat moment niet beschikbaar, en het was niet eenvoudig om te bepalen of een mutatie aanwezig was in het nucleaire of mitochondriale genoom. De methode, beschreven in 1989, werd vervolgens gebruikt door verschillende onderzoekers die werkzaam zijn op het gebied van mitochondriale geneeskunde 6,7,8,9; een gedetailleerd protocol is onlangs gepubliceerd10, maar er is nog geen video gemaakt. Waarom zou zo'n protocol tegenwoordig relevant zijn als NGS precies en snel kan identificeren waar een mutatie zich bevindt? Het antwoord is dat cybridegeneratie nog steeds het state-of-the-art protocol is om de pathogene rol van elke nieuwe mtDNA-mutatie te begrijpen, het percentage heteroplasmie te correleren met de ernst van de ziekte en een biochemisch onderzoek uit te voeren in een homogeen nucleair systeem waarin de bijdrage van de autochtone nucleaire achtergrond van de patiënt afwezig is11, 12,13.

Dit protocol beschrijft hoe cytoplasten kunnen worden verkregen uit confluente, patiënt-afgeleide fibroblasten gekweekt in 35 mm petrischalen. Centrifugering van de schotels in aanwezigheid van cytochalasine B maakt de isolatie van enucleated cytoplasten mogelijk, die vervolgens worden gefuseerd met rho0-cellen in aanwezigheid van polyethyleenglycol (PEG). De resulterende cybriden worden vervolgens gekweekt in selectief medium totdat er klonen ontstaan. De sectie met representatieve resultaten toont een voorbeeld van moleculaire karakterisering van de resulterende cybriden om te bewijzen dat het mtDNA identiek is aan dat van de fibroblasten van de donorpatiënten en dat het nDNA identiek is aan het nucleaire DNA van de tumorale rho 0-cellijn.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: Het gebruik van menselijke fibroblasten kan ethische goedkeuring vereisen. Fibroblasten die in deze studie werden gebruikt, werden afgeleid van MD-patiënten en opgeslagen in de institutionele biobank in overeenstemming met ethische vereisten. Er werd geïnformeerde toestemming gegeven voor het gebruik van de cellen. Voer alle celkweekprocedures uit onder een steriele laminaire flowkast bij kamertemperatuur (RT, 22-25 °C). Gebruik steriel gefilterde oplossingen die geschikt zijn voor celkweek en steriele apparatuur. Kweek alle cellijnen in een bevochtigde incubator bij 37 °C met 5% CO2. Mycoplasma-tests moeten wekelijks worden uitgevoerd om mycoplasmavrije culturen te garanderen. 143BTK- rho0 cellen kunnen worden gegenereerd zoals eerder beschreven5.

1. Kweek van cellen

  1. Controleer voordat u een procedure start de aanwezigheid van de mutatie in fibroblasten afgeleid van MD-patiënt(en) en kwantificeer het percentage heteroplasmie of homoplasmie door Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) en/of hele mtDNA-sequencinganalyses14.
  2. Zaadfibroblasten in vier petrischalen van 35 mm, elk met 2 ml compleet kweekmedium (tabel 1). Laat de cellen groeien tot 80% confluent (48 uur).
  3. Kweek 143BTK- rho0 cellen in 8 ml supplemented culture medium (tabel 1) in een petrischaaltje van 100 mm.
  4. Houd de cellen in een incubator op 37 °C met 5% CO2.
  5. Controleer de afwezigheid van mtDNA in rho0-cellen door sequencingtechnieken14.

2. Enucleatie van fibroblasten

  1. Steriliseer vier centrifuge-geschikte flessen van 250 ml door autoclaafsterilisatie bij 121 °C gedurende een cyclus van 20 minuten. Droog ze in een laboratoriumoven of bij RT.
  2. Verwarm de centrifuge voor op 37 °C.
  3. Was de 35 mm vaat met de fibroblasten tweemaal, met 2 ml 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder (zonder) calcium en magnesium.
  4. Reinig het buitenoppervlak van de vaat met 70% ethanol en wacht tot de alcohol verdampt.
  5. Verwijder de deksels van de vaat en de schroefdoppen van de flessen. Plaats elke schaal, zonder deksel, ondersteboven op de bodem van elke centrifugefles van 250 ml.
  6. Voeg langzaam 32 ml enucleatiemedium toe aan elke fles (tabel 1), zodat het medium in de schaal kan komen en in contact kan komen met de cellen. Verwijder eventuele bubbels uit de gerechten met een lange glazen Pasteur-pipet en krom de punt in een Bunsen-vlam.
    OPMERKING: Het is belangrijk om de bubbels te verwijderen zodat het medium de schaal kan binnendringen en in contact kan komen met de cellen.
  7. Sluit elke fles met de schroefdop en breng ze over naar de centrifuge.
  8. Centrifugeer gedurende 20 minuten bij 37 °C en 8.000 × g, versnelling max, vertraging langzaam. Let op het balanceren van de centrifuge: contragewicht elke fles. Pas indien nodig het gewicht aan door een geschikt volume Enucleation Medium toe te voegen.
  9. Gebruik tijdens het centrifugeren vacuüm of een serologische pipet van 10 ml om het medium van de 143BTK- rho0 kweekplaten op te zuigen en weg te gooien en was ze tweemaal met 4 ml 1x PBS zonder calcium en magnesium.
  10. Voeg 2 ml trypsine toe om de celmonolaag volledig te bedekken.
  11. Plaats de gerechten in een incubator van 37 °C gedurende ~2 min.
  12. Verwijder de schotels uit de couveuse, observeer celloslating met behulp van een omgekeerde microscoop voor levende cellen (doelstellingen 4x of 10x) en rem de enzymactiviteit door 2 ml supplemented culture medium toe te voegen.
  13. Zuig de 4 ml van de celsuspensie in de schotel op met een pipet van 10 ml en breng deze over in een conische buis van 15 ml.
  14. Tel de cellen met behulp van een Burker hemocytometer kamer of een geautomatiseerde teller.
  15. Zuig aan het einde van de centrifugatie (stap 2.8) het medium uit de flessen en gooi het weg.
  16. Verwijder de gerechten door de flessen om te keren op een steriel gaasje dat eerder met 70% ethanol is besproeid. Reinig het buitenoppervlak van de vaat en hun deksels met 70% ethanol. Wacht tot de alcohol verdampt en sluit dan de gerechten.
  17. Controleer voordat u verder gaat op cytoplast (spookvorming) met behulp van een omgekeerde microscoop voor levende cellen (objectief 4x of 10x). Zoek naar extreem langwerpige fibroblasten als gevolg van de extrusie van hun kernen geïnduceerd door cytochalasine B.
  18. Voeg aan elke schaal van 35 mm 1 × 106 van 143BTK- rho0-cellen toe die zijn geresuspendeerd in 2 ml 143BTK- rho0 kweekmedium aangevuld met 5% foetaal runderserum (FBS).
  19. Laat de schotels 3 uur in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 staan en laat de 143BTK- rho0 cellen op de spoken bezinken. Verstoor de gerechten niet.

3. Fusie van de enucleated fibroblasten met rho 0 cellen

  1. Na 3 uur incubatie, aspirateer en gooi het medium uit de gerechten.
  2. Was de hechtende cellen tweemaal met 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) hoge glucose zonder serum of met Minimum Essential Medium (MEM).
  3. Aspirateer en gooi het medium weg.
  4. Voeg 500 μL PEG-oplossing (zie de tabel met materialen) toe aan de cellen en incubeer gedurende precies 1 minuut.
  5. Aspirateer en gooi de PEG-oplossing weg.
  6. Was de cellen driemaal met 2 ml DMEM hoge glucose zonder serum of met MEM.
  7. Voeg 2 ml Fusion Medium (tabel 1) toe en incubeer een nacht in de incubator bij 37 °C met 5% CO2.

4. Cybrid selectie en uitbreiding

  1. Verwijder na de incubatie 's nachts de platen uit de incubator, trypsiniseer de cellen zoals hierboven beschreven (stappen 2.9-2.13) en breng de inhoud van elke schaal van 35 mm over in een schaal van 100 mm.
  2. Voeg 8 ml selectiemedium toe (tabel 1) en plaats de platen in de incubator bij 37 °C met 5% CO2.
  3. Vervang het medium om de 2-3 dagen.
  4. Wacht op ~10-15 dagen selectie totdat kolonies cellen verschijnen.
  5. Vries een van de vier petrischalen in door alle klonen te verzamelen en een "enorme" cultuur te genereren als back-up van de cybriden, die uiteindelijk kan worden teruggewonnen en gebruikt voor verder onderzoek.
  6. Trypsiniseer de cellen in de resterende kweekschalen, tel en zaai in een of meer petrischalen met 50-100 cellen / schaal in het supplemented culture medium (tabel 1) totdat klonen verschijnen. Laat ze een paar dagen groeien.
  7. Pellet de resterende cellen door centrifugering bij 1.200 × g gedurende 3 minuten bij RT en gooi het supernatant weg.
  8. Extraheer DNA uit de pellet (zie de tabel met materialen).
  9. Voer genotypering uit door variabel aantal gelijktijdig herhaalde (VNTR) analyses zoals eerder gerapporteerd15.
  10. Pak klonen uit de petrischaal met klooncilinders of een pipetpunt, gebruik een stereomicroscoop om te voorkomen dat verschillende klonen worden samengevoegd en breng ze over naar een plaat met 96 putten, elk met 200 μL supplemented culture medium (tabel 1).
  11. Breid elke kloon uit totdat er voldoende cellen zijn om DNA te bevriezen en te extraheren.
  12. Controleer het mutatiepercentage van elke kloon met RFLP of andere sequencingmethoden. Probeer idealiter zowel klonen met wild-type mtDNA (0% mutatie) als klonen met verschillende mutatiepercentages te verkrijgen, beide opgeteld tot homoplasmatisch mutant mtDNA (100% mutatie). Zie figuur 1 voor een schematisch diagram van het cybridegeneratieprotocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het genereren van cybriden vereist 3 dagen laboratoriumwerk plus een selectieperiode (~ 2 weken) en extra 1-2 weken voor de groei van klonen. De kritische stappen zijn de kwaliteit van cytoplasten en de selectieperiode. De morfologie van cybriden lijkt op die van de rho0 donorcellen. Toewijzing van het juiste mtDNA en nDNA in de cybriden is verplicht om de identiteit van de cellen te bevestigen. Een voorbeeld is te zien in figuur 2. In dit geval genereerden we cybriden vanaf fibro...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het mtDNA heeft een zeer hoge mutatiesnelheid in vergelijking met nDNA vanwege het ontbreken van beschermende histonen en de locatie dicht bij de ademhalingsketen, waardoor het molecuul wordt blootgesteld aan schadelijke oxidatieve effecten die niet efficiënt worden tegengegaan door de reparatiesystemen16. De eerste pathogene mtDNA-mutaties werden geïdentificeerd in 1988 17,18, en sindsdien is een groot aantal mutaties beschreven. NGS-tech...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie werd uitgevoerd in het Center for the Study of Mitochondrial Pediatric Diseases (http://www.mitopedia.org), gefinancierd door de Mariani Foundation. VT is lid van het European Reference Network for Rare Neuromuscular Diseases (ERN EURO-NMD).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
5-Bromo-2'-DeoxyuridineSigma-Aldrich (Merck)B5002-500MG
6 well PlatesCorning3516
96 well PlatesCorning3596
Blood and Cell Culture DNA extraction kitQIAGEN13323
CentrifugeBeckman CoulterAvanti J-257,200 rcf, 37 °C
Centrifuge bottles, 250 mLBeckman Coulter356011
Cytochalasin B from Drechslera dematioideaSigma-Aldrich (Merck)C2743-200UL
Dialyzed FBSGibco26400-036 100mL
DMEM High Glucose (w/o L-Glutamine W/Sodium Pyruvate)EuroCloneECB7501L
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline - PBS (w/o Calcium w/o Magnesium)EuroCloneECB4004L
Ethanol Absolute AnhydrousCarlo Erba414601
FetalClone III (Bovine Serum Product)Cytiva - HyClone LaboratoriesSH30109.03
Glass pasteur pipettesVWRM4150NO250SP4
Inverted Research Microscope For Live Cell MicroscopyNikonECLIPSE TE200
JA-14 Fixed-Angle Aluminum RotorBeckman Coulter339247
Laboratory autoclave Vapormatic 770Labotech29960014
L-Glutamine 200 mM (100x)EuroCloneECB 3000D
Minimum Essential Medium MEMEurocloneECB2071L
MycoAlert Mycoplasma Detection KitLonzaLT07-318
PEG (Polyethylene glicol solution)Sigma-Aldrich (Merck)P7181-5X5ML
Penicillin-Streptomycin (solution 100x)EuroCloneECB3001D
Primo TC Dishes 100 mmEuroCloneET2100
Primo TC Dishes 35 mmEuroCloneET2035
Sodium Pyruvate 100 mMEuroCloneECM0542D
StereomicroscopeNikonSMZ1000
Trypsin 2.5% in HBSSEuroCloneECB3051D
UridineSigma-Aldrich (Merck)U3003-5G

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Reviews. Disease Primers. 2, (2016).
  2. DiMauro, S., Davidzon, G. Mitochondrial DNA and disease. Annals of Medicine. 37 (3), 222-232 (2005).
  3. El-Hattab, A. W., Craigen, W. J., Scaglia, F. Mitochondrial DNA maintenance defects. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Basis of Disease. 1863 (6), 1539-1555 (2017).
  4. Stewart, J. B., Chinnery, P. F. The dynamics of mitochondrial DNA heteroplasmy: implications for human health and disease. Nature Reviews Genetics. 16 (9), 530-542 (2015).
  5. King, M. P., Attardi, G. Human cells lacking mtDNA: repopulation with exogenous mitochondria by complementation. Science. 246 (4929), 500-503 (1989).
  6. Trounce, I., Neill, S., Wallace, D. C. Cytoplasmic transfer of the mtDNA nt 8993 T-->G (ATP6) point mutation associated with Leigh syndrome into mtDNA-less cells demonstrates cosegregation with a decrease in state III respiration and ADP/O ratio. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (18), 8334-8338 (1994).
  7. Jun, A. S., Trounce, I. A., Brown, M. D., Shoffner, J. M., Wallace, D. C. Use of transmitochondrial cybrids to assign a complex I defect to the mitochondrial DNA-encoded NADH dehydrogenase subunit 6 gene mutation at nucleotide pair 14459 that causes Leber hereditary optic neuropathy and dystonia. Molecular and Cellular Biology. 16 (3), 771-777 (1996).
  8. Dunbar, D. R., Moonie, P. A., Zeviani, M., Holt, I. J. Complex I deficiency is associated with 3243G:C mitochondrial DNA in osteosarcoma cell cybrids. Human Molecular Genetics. 5 (1), 123-129 (1996).
  9. Pye, D., et al. Production of transmitochondrial cybrids containing naturally occurring pathogenic mtDNA variants. Nucleic Acids Research. 34 (13), 95(2006).
  10. Bacman, S. R., Nissanka, N., Moraes, C. T. Chapter 18 - Cybrid technology. Methods in Cell Biology. 155, 415-439 (2020).
  11. Rucheton, B., et al. Homoplasmic deleterious MT-ATP6/8 mutations in adult patients. Mitochondrion. 55, 64-77 (2020).
  12. Xu, M., et al. Identification of a novel variant in MT-CO3 causing MELAS. Frontiers in Genetics. 12, 638749(2021).
  13. Habbane, M., et al. Human Mitochondrial DNA: Particularities and diseases. Biomedicines. 9 (10), 1364(2021).
  14. Legati, A., et al. Current and new Next-Generation Sequencing approaches to study mitochondrial DNA. The Journal of Molecular Diagnostics. 23 (6), 732-741 (2021).
  15. Boerwinkle, E., Xiong, W. J., Fourest, E., Chan, L. Rapid typing of tandemly repeated hypervariable loci by the polymerase chain reaction: application to the apolipoprotein B 3' hypervariable region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 86 (1), 212-216 (1989).
  16. Lawless, C., Greaves, L., Reeve, A. K., Turnbull, D. M., Vincent, A. E. The rise and rise of mitochondrial DNA mutations. Open Biology. 10 (5), 200061(2020).
  17. Wallace, D. C., et al. Mitochondrial DNA mutation associated with Leber's hereditary optic neuropathy. Science. 242 (4884), 1427-1430 (1988).
  18. Holt, I. J., Harding, A. E., Morgan-Hughes, J. A. Deletions of muscle mitochondrial DNA in patients with mitochondrial myopathies. Nature. 331 (6158), 717-719 (1988).
  19. Chomyn, A. Platelet-mediated transformation of human mitochondrial DNA-less cells. Methods in Enzymology. 264, 334-339 (1996).
  20. Sazonova, M. A., et al. Cybrid models of pathological cell processes in different diseases. Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2018, 4647214(2018).
  21. Tarrago-Litvak, L., et al. The inhibition of mitochondrial DNA polymerase gamma from animal cells by intercalating drugs. Nucleic Acids Research. 5 (6), 2197-2210 (1978).
  22. Swerdlow, R. H., et al. Mitochondria, cybrids, aging, and Alzheimer's disease. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 146, 259-302 (2017).
  23. Ghosh, S. S., et al. Use of cytoplasmic hybrid cell lines for elucidating the role of mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease and Parkinson's disease. Annals of the New York Academy of Sciences. 893, 176-191 (1999).
  24. Buneeva, O., Fedchenko, V., Kopylov, A., Medvedev, A. Mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease: focus on mitochondrial DNA. Biomedicines. 8 (12), 591(2020).
  25. Weidling, I. W., et al. Mitochondrial DNA manipulations affect tau oligomerization. Journal of Alzheimer's disease: JAD. 77 (1), 149-163 (2020).
  26. Ferreira, I. L., et al. Bioenergetic dysfunction in Huntington's disease human cybrids. Experimental Neurology. 231 (1), 127-134 (2011).
  27. Cruz-Bermúdez, A., et al. Spotlight on the relevance of mtDNA in cancer. Clinical & Translational Oncology. 19 (4), 409-418 (2017).
  28. Patel, T. H., et al. European mtDNA variants are associated with differential responses to cisplatin, an anticancer drug: implications for drug resistance and side effects. Frontiers in Oncology. 9, 640(2019).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Mitochondri le DNA mutatieoxidatieve fosforyleringademhalingsketencomplexengeneratie van cybridenheteroplasmie analysefibroblastfusierestrictiefragmentanalysemitochondri le myopathie

Gerelateerde artikelen