Isolatie en functionele analyse van arteriolar endotheel van muishersenparenchym

Samenvatting

Intensieve voorbereiding van intacte cerebrale endotheelbuizen van muizen uit cerebrale parenchymale arteriolen wordt geïllustreerd voor het bestuderen van cerebrale bloedstroomregulatie. Verder demonstreren we de experimentele sterke punten van dit endotheelstudiemodel voor fluorescentiebeeldvorming en elektrofysiologische meting van belangrijke cellulaire signaalroutes, inclusief veranderingen in intracellulaire [Ca^{2 +}] en membraanpotentiaal.

Samenvatting

Cerebrale bloedstroom wordt getransporteerd door vasculaire weerstandsslagaders en stroomafwaartse parenchymale arteriolen. Steady-state vasculaire weerstand tegen de bloedstroom neemt toe met afnemende diameter van slagaders tot arteriolen die uiteindelijk in haarvaten worden gevoed. Vanwege hun kleinere omvang en locatie in het parenchym zijn arteriolen relatief onderbelicht en met minder reproduceerbaarheid in bevindingen dan oppervlaktepiale slagaders. Hoe dan ook, arteriolar endotheelcelstructuur en -functie - integraal onderdeel van de fysiologie en etiologie van chronische degeneratieve ziekten - vereist uitgebreid onderzoek. In het bijzonder toont opkomend bewijs aan dat een gecompromitteerde endotheelfunctie voorafgaat aan en verergert cognitieve stoornissen en dementie.

In de parenchymale microcirculatie is de endotheel K ⁺ -kanaalfunctie de meest robuuste stimulus om de verspreiding van vaatverwijding fijn te beheersen om een toename van de bloedtoevoer naar gebieden met neuronale activiteit te bevorderen. Dit artikel illustreert een verfijnde methode voor het vers isoleren van intacte en elektrisch gekoppelde endotheelbuizen (diameter, ~ 25 μm) van parenchymale arteriolen van muizenhersenen. Arteriolar endotheelbuizen worden gezekerd tijdens fysiologische omstandigheden (37 °C, pH 7,4) om experimentele variabelen op te lossen die de K ⁺ kanaalfunctie en hun regulatie omvatten, inclusief intracellulaire Ca^{2 +} dynamiek, veranderingen in membraanpotentiaal en membraanlipideregulatie. Een duidelijk technisch voordeel ten opzichte van arterieel endotheel is de verbeterde morfologische resolutie van cel- en organel (bijv. Mitochondriën) dimensies, wat het nut van deze techniek uitbreidt. Gezonde cerebrale perfusie gedurende het hele leven brengt een robuuste endotheelfunctie in parenchymale arteriolen met zich mee, waarbij de bloedtoevoer direct wordt gekoppeld aan het voeden van neuronale en gliale activiteit in precieze anatomische gebieden van de hersenen. Er wordt dus verwacht dat deze methode de algemene kennis van vasculaire fysiologie en neurowetenschappen met betrekking tot de gezonde en zieke hersenen aanzienlijk zal bevorderen.

Inleiding

Parenchymale arteriolen leveren direct essentiële zuurstof en voedingsstoffen in de hersenen¹. Tijdens interfacing met haarvaten reageren zeer vasoactieve arteriolen op retrograde signalering geïnitieerd door capillaire ionkanalen die metabole signalen van specifieke neuronale regio's waarnemen². Nu hersenparenchym historisch gezien het grootste deel van het onderzoek heeft ontvangen, is er nu een rol voor endotheeldisfunctie ontstaan voor het verduidelijken van pathologische mechanismen die verband houden met verschillende cerebrovasculaire aandoeningen die ten grondslag liggen aan dementie (bijv. Ischemische beroerte, de ziekte van Alzheimer)3,4,5,6 . Het endotheel is een integraal onderdeel van de perfusie van de hersenen in overeenstemming met de heterogeniteit van genetica, structuur en functie in vasculaire segmenten⁷. Piale slagaders zijn uitgebreid bestudeerd vanwege hun relatief grote omvang, hoge segmentale vasculaire weerstand en rol in de bloedstroomverdeling naar het onderliggende cerebrum ^8,9. Een beter begrip van arteriolar endotheelmechanismen zal dus waarschijnlijk het begrip van de regulering van de bloedstroom in de hersenen in gezondheid en ziekte verbeteren in de richting van de ontwikkeling van nieuwe therapeutische regimes.

Opkomend bewijs benadrukt het belang van het bestuderen van parenchymale arteriolen in relatie tot verschillende signaalroutes en ziekten ^8,10. Deze benadering is echter beperkt gebleven tot het gebruik van intacte arteriole¹¹ onder druk en/of capillair-parenchymale arteriole (CaPA) preparaten¹². Vers geïsoleerde, inheemse cerebrale arteriolar endotheelcellen zonder andere celtypen en verstorende factoren zijn niet onderzocht, waarschijnlijk als gevolg van technische problemen bij hun isolatie. Dit artikel bevordert een eerdere techniek die de isolatie van piaal arterieel endotheel¹³ benadrukt om nu betrouwbaar en reproduceerbaar het endotheel van hersenparenchymale arteriolen te isoleren (breedte: ~ 25 μm, lengte: ~ 250 μm). Deze techniek helpt bij het bereiken van een optimale resolutie van elektrisch en chemisch gekoppelde cellen in hun individuele oriëntatie en cellulaire netwerken.

Belangrijke routes van belang zijn de interactie van intracellulaire Ca^{2 +} ([Ca^{2 +}]_i) signalering en hyperpolarisatie van membraanpotentiaal (V_m)^14,15 - integraal voor vaatverwijding¹⁶ - om bloed in de haarvaten te laten komen en zuurstof en voedingsstoffen te leveren aan actief parenchym¹⁷. Deze preparaten maken real-time elektrofysiologische opnames van ionkanalen mogelijk, waaronder Ca²⁺-permeant, transient receptor potential (TRP) en K⁺ kanalen en/of fluorescerende beeldvorming van intracellulaire organellen in endotheelcelbuizen in bijna fysiologische omstandigheden. Dit is een geschikte techniek voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in fysiologische cellulaire mechanismen die de controle van endotheelcellen van cerebrale bloedstroomafgifte aan het hersenparenchym regelen. Al met al zal deze techniek onderzoekers helpen fundamentele endotheelsignaleringsroutes en netwerkcommunicatie van arteriolen ingebed in hersenparenchym beter te begrijpen, terwijl vragen met betrekking tot cerebrovasculaire fysiologie en pathologie worden aangepakt.

Protocol

Experimentatoren moeten ervoor zorgen dat het aangewezen gebruik van dieren en bijbehorende protocollen worden goedgekeurd door hun Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) en worden uitgevoerd in overeenstemming met de "Guide for the Care and Use of Laboratory Animals" (^8e editie, 2011) van de National Research Council en de ARRIVE-richtlijnen. De IACUC van Loma Linda University en de University of Arizona heeft alle protocollen goedgekeurd die voor dit manuscript worden gebruikt voor C57BL / 6N- en 3xTg-AD-muizen (mannetjes en vrouwtjes; leeftijdscategorie: 2-30 maanden). Zie figuur 1 als een overzicht van de isolatie en het onderzoek van arteriolar endotheelbuizen vers geïsoleerd uit parenchymale arteriolen van de hersenen bij muizen.

1. Materialen en uitrusting

OPMERKING: Zie de tabel met materialen voor alle reagentia en materialen die nodig zijn voor dit protocol. Bovendien kunnen handleidingen en websites die zijn gekoppeld aan de respectieve leveranciers ook worden geraadpleegd als dat nodig is. Illustraties van dissectiestations en experimentele apparaten zijn eerder verstrekt¹³.

1. Flow kamer
   1. Bevestig een superfusiekamer met een glazen afdekkingslip op een platform dat bestaat uit geanodiseerd aluminium. Bevestig het platform met de kamer op een aluminium microscooptrap.
   2. Plaats een micromanipulator met een pinnenpipet aan elk uiteinde van het platform op de aluminium microscooptrap.
      OPMERKING: Gebruik indien nodig een overdraagbaar podiumapparaat met een stroomkamereenheid om een beveiligde, geïsoleerde endotheelbuis van het ene microscoopapparaat naar het andere te verplaatsen voor experimenten.
2. Microscopen
   1. Gebruik stereomicroscopen (5x tot 50x vergrotingsbereik) en glasvezellichtbronnen voor dissectieprocedures.
   2. Gebruik voor de isolatie van endotheelbuizen een omgekeerde microscoopinstallatie die is uitgerust met fasecontrast- of differentieel interferentiecontrast (DIC)-compatibele objectieven (10x, 20x en 40x) en een aluminium trap.
   3. Zorg dat er een microsyringe pompregelaar klaar staat naast het apparaat dat is bedoeld om endotheelbuizen te isoleren uit gedeeltelijk verteerde bloedvaten.
   4. Stel het experimentele apparaat in door een omgekeerde microscoop (objectieven: 4x, 10x, 20x, 40x en 60x) en een handmatige aluminium trap op een trillingsisolatietafel te plaatsen.
3. Intracellulair V_m controleapparaat
   1. Sluit de elektrometer aan op een compatibele headstage. Gebruik accessoires, zoals een functiegenerator en stimulator, voor protocollen die stroominjectie vereisen.
   2. Sluit versterkeruitgangen aan op een data digitizer systeem, oscilloscoop en hoorbare baseline monitoren. Bevestig de referentiebadelektrode (Ag/AgCl-pellet) in de buurt van de uitgang van de stroomkamer.
   3. Monteer een fotometrisch systeem met geïntegreerde componenten van een fluorescentiesysteeminterface, booglamp met hoge intensiteit en voeding, hyperswitch, fotomultiplicatorbuis (of PMT) en camera om [Ca²⁺]_i in endotheelcellen te meten.
   4. Monteer een temperatuurregelaar uitgerust met een inline verwarmingstoestel om een fysiologische temperatuur (37 °C) gedurende het hele experiment te verhogen en te handhaven.
   5. Monteer een meerkanaals platform dat is aangesloten op een klepregelaar met een inline debietregelklep om de levering van oplossingen aan endotheelbuizen die in de kamer zijn bevestigd, te regelen.
4. Micropipettes en scherpe elektroden
   OPMERKING: De experimentator heeft een elektronische glastrekker en een microvorge nodig voor het voorbereiden van trituratie- en pinpipeten.
   1. Om de endotheelbuis te scheiden van het gedeeltelijk verteerde arteriolar-segment, bereidt u warmtegepolijste trituratiepipeten (interne tipdiameter: 30-50 μm) van borosilicaatglascapillairen.
   2. Om de endotheelbuis in de superfusiekamer te bevestigen, bereidt u warmtegepolijste pinpipeten met een stomp, bolvormig uiteinde (buitendiameter: 50-70 μm) bereid uit dunwandige borosilicaatglascapillairen.
   3. Om V_m van een endotheelcel op te nemen, bereidt u scherpe elektroden voor met een tipweerstand van ~ 150 ± 30 MΩ uit glazen haarvaten met alleen de glazen trekker.

2. Oplossingen en geneesmiddelen

1. Fysiologische zoutoplossing (PSS)
   1. Bereid minimaal 1 l PSS met 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethaansulfonzuur (HEPES) en 10 mM glucose.
   2. Bereid de nodige oplossingen voor zonder CaCl₂ (nul Ca²⁺ PSS) voor dissectie van cerebrale arteriolen en isolatie van endotheelbuis.
      OPMERKING: Bereid alle oplossingen voor in ultrapuur gedeïoniseerd H₂O, gevolgd door filtratie (0,22 μm). Zorg ervoor dat het eindproduct een pH van 7,4 bevat met een osmolaliteit tussen 290 en 300 mOsm.
2. Runderserumalbumine (BSA, 10%)
   1. Los 1 g van het gelyofiliseerde BSA-poeder op in een bekerglas van 10 ml nul Ca²⁺ PSS. Dek het bekerglas af en laat minstens 2 uur met langzaam roeren de BSA oplossen.
   2. Filter de oplossing met behulp van een spuit van 10 ml plus een filter van 0,22 μm en bereid 1 ml aliquots voor om te worden bewaard bij -20 °C.
3. Ontledingsoplossing
   1. Voeg 500 μL BSA (10%) toe aan 49,5 ml nul Ca²⁺ PSS voor een totaal volume van 50 ml.
   2. Breng de oplossing over naar een petrischaal voor arteriolar dissecties.
4. Dissociatie oplossing
   1. Voeg 5 μL CaCl_2-oplossing (1 M) en 500 μL BSA (10%) toe aan 49,5 ml nul Ca²⁺ PSS voor een totaal volume van 50 ml. Incubeer de oplossing bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur.
5. Enzymen
   1. Bereid 1 ml digestieoplossing met 100 μg / ml papaïne, 170 μg / ml dithioerythritol, 250 μg / ml collagenase (type H-mengsel) en 40 μg / ml elastase.
      OPMERKING: Enzymactiviteiten kunnen variëren, hoewel succesvolle protocollen waarschijnlijk de volgende enzymatische activiteiten vereisen: ≥ 10 eenheden / mg voor papaïne, ≥ 1 eenheid / mg voor collagenase en ≥ 5 eenheden / mg voor elastase.
6. Fura-2 en farmacologische middelen
   1. Bereid Fura-2 AM-bouillon voor in dimethylsulfoxide (DMSO; 1 mM). Bereid 500 μL werkconcentratie (10 μM) voor door 5 μL van de voorraad toe te voegen aan 495 μL PSS om te laden.
   2. Bereid naar gelang van het geval ten minste 50 ml werkconcentraties van farmacologische agentia in PSS of DMSO.
7. Geleidende oplossing
   1. Bereid 2 M KCl voor door KCl op te lossen in gedeïoniseerd H₂O (7,455 g KCl in 50 ml H₂O). Laat de oplossing door een spuit met een filter van 0,22 μm gaan voordat u de scherpe elektroden opvult.
8. Fluorescerende organel trackers en antilichamen
   1. Bereid plasmamembraan- of organellaire (bijv. nucleus, endoplasmatisch reticulum) trackers in de juiste fysiologische zoutoplossing volgens de instructies van de fabrikant.
   2. Bereid primaire en secundaire antilichamen volgens de instructies van de fabrikant in de juiste fysiologische zoutoplossing.

3. Dissectie en isolatie van cerebrale arteriolen van muizen

OPMERKING: Stereomicroscopen en geslepen microdissectiegereedschappen (bijv. fijnpunttang, vannas-achtige dissectieschaar) moeten worden gebruikt voor monstervergroting (tot 50x) in al deze dissectieprocedures.

1. Isolatie van muizenhersenen
   1. Anesthetiseer een standaard laboratoriummuis (bijv. C57BL/6, 3xTg-AD; 2-30 maanden oud, mannelijk of vrouwelijk) met behulp van isofluraaninhalatie (3% gedurende 2-3 minuten), gevolgd door onmiddellijke onthoofding met een scherpe schaar of guillotine volgens IACUC-goedkeuring. Plaats de muizenkop in een petrischaaltje (diameter 10 cm, diepte 1,5 cm) met koude (4 °C) dissectie-oplossing.
   2. Verwijder tijdens het kijken onder een stereomicroscoop de huid en het haar over de schedel en spoel overtollig bloed weg met koude dissectie-oplossing. Maak met behulp van de uiteinden van de standaard dissectieschaar (bijv. bladen van 24 mm) een incisie die begint met het achterhoofdsbeen en zich uitstrekt door het neusbeen van de schedel. Gebruik een tang met grove punt om de schedel voorzichtig langs de incisie te openen en scheid bindweefsel (hersenvliesmembraan) om de hersenen te isoleren die een intacte cirkel van Willis bevatten.
   3. Was de geïsoleerde hersenen met koude dissectie-oplossing in een beker of petrischaal om het resterende bloed van het oppervlak van de hersenen te verwijderen. Plaats de ventrale kant van de hersenen naar boven gericht in een kamer met koude dissectie-oplossing voor isolatie van parenchymale arteriolen (figuur 2A).
2. Isolatie van parenchymale arteriolen
   OPMERKING: Arteriolen die voortkomen uit de middelste hersenslagaders (MCA's) en ingebed in hersenparenchym worden gekozen voor dit protocol. De arteriolen worden geïsoleerd zoals eerder beschreven¹¹, met modificatie.
   1. Gebruik stalen pinnen (diameter: 0,2 mm, lengte: 11 tot 12 mm) om de geïsoleerde hersenen vast te zetten in koude dissectie-oplossing in een petrischaal met een met houtskool doordrenkte siliciumpolymeercoating (diepte ≥ 50 cm).
   2. Knip met een scherpe en uitgelijnde dissectieschaar een rechthoek van hersenweefsel (lengte: 5 mm, breedte: 3 mm) (figuur 2B) rond de MCA terwijl u ervoor zorgt dat het bovenste deel van het weefselsegment voorbij het vertakkingspunt van de cirkel van Willis is. Knip een andere rechthoek van hersenweefsel uit de andere hersenhelft om indien nodig toegang te krijgen tot meer arteriolen.
   3. Bevestig het gescheiden hersenweefselsegment in de schaal met de MCA naar boven gericht (distale van de Cirkel van Willis) met behulp van stalen pinnen (diameter: 0,1 mm, lengte: 13 tot 14 mm). Maak voorzichtig een ondiepe incisie in de buurt van de pinnen om de pia met een kleine tang te verwijderen en voorzichtig van het ene uiteinde naar het andere af te pellen (figuur 2C). Verwijder de pia uit het andere weefselsegment om indien nodig toegang te krijgen tot meer arteriolen. Zet de geïsoleerde pia met parenchymale arteriolen vertakt van MCA in de schaal met de pinnen zorgvuldig vast en ontleed de parenchymale arteriolen (figuur 2D), zodat de arteriolen niet worden beschadigd.
      OPMERKING: Als de arteriolen niet gemakkelijk met de pia uit het parenchym kunnen worden getrokken, gebruik dan een fijne tang en graaf in de hersenen, te beginnen bij het MCA-aftakkingspunt van de Cirkel van Willis. Lokaliseer de arteriole, maak het weefsel rond arteriolen voorzichtig los (figuur 2E) en trek de arteriole voorzichtig uit het parenchym, waarbij u het bovenste uiteinde van de arteriole vasthoudt (figuur 2F). Meerdere arteriolen (lengte: ~1,5-2 mm) kunnen worden geïsoleerd uit één rechthoek van hersenweefsel.
   4. Zorg ervoor dat de arteriole schoon is zonder dat er weefsel aan vastzit en knip eventuele resterende distale takken af (figuur 3A). Gebruik deze schone, intacte arteriole voor enzymatische spijsvertering. Als alternatief snijdt u elke arteriole in twee stukken (lengte: 0,75-1 mm) voor enzymatische spijsvertering voor de bereiding van endotheelbuizen indien gewenst.

4. Vertering van parenchymale arteriolen en bereiding van endotheelbuizen

1. Opstelling van apparatuur en pipetten
   OPMERKING: Isolatie van arteriële endotheelbuizen uit de hersenen is eerder beschreven^13,18. Het huidige protocol bevat wijzigingen voor de isolatie van endotheel uit parenchymale (intracerebrale) arteriolen. Meerdere arteriolen en/of stukjes arteriolen kunnen samen gebruikt worden voor enzymatische vertering.
   1. Monteer het trituratieapparaat¹³ voor het voorbereiden van endotheelbuizen met behulp van een aluminium trap die een kamer en micromanipulators ondersteunt. Monteer een microscoop uitgerust met objectieven (5x-60x) en een camera aangesloten op een computermonitor. Bevestig een microsyringe met een pompregelaar naast het podium en het monster.
   2. Bevestig een trituratiepipet gevuld met minerale olie over de microsyringe-zuiger. Gebruik de microsyringe met de pompregelaar om de dissociatieoplossing op te zuigen in de trituratiepipet (~ 130 nL) bovenop de minerale olie, terwijl u ervoor zorgt dat luchtbellen in de pipet worden vermeden.
2. Gedeeltelijke vertering van arteriolar segmenten
   1. Plaats intacte arteriolar segmenten in 1 ml dissociatieoplossing in een glazen buis van 10 ml met 100 μg / ml papaïne, 170 μg / ml dithioerythritol, 250 μg / ml collagenase en 40 μg / ml elastase. Incubeer arteriolar segmenten bij 34 °C gedurende 10-12 min.
   2. Vervang na de vertering de enzymoplossing door 3-4 ml verse dissociatieoplossing bij kamertemperatuur.
3. Isolatie van arteriolar endotheelbuis
   OPMERKING: Breng na de vertering en vervanging van de enzymoplossing een of meerdere gedeeltelijk verteerde segmenten over in de dissociatieoplossing in een superfusiekamer die aan een mobiel platform is bevestigd. Selecteer tijdens het bekijken met een vergroting van 100x tot 200x een gedeeltelijk verteerd maar ononderbroken vatsegment en concentreer je erop onder de microscoop.
   1. Plaats de trituratiepipet die met de microsyringe-injector is bevestigd in de dissociatieoplossing in de kamer en plaats deze dicht bij het ene uiteinde van het segment van het verteerde vat. Stel een snelheid in binnen het bereik van 1-3 nL/s op de pompregelaar voor zachte trituratie.
   2. Met behoud van 100x tot 200x vergroting, trek het arteriolar segment terug in de pipet en werp vervolgens uit om de adventitia en gladde spiercellen te dissociëren (figuur 3B). Triturateer het vaatsegment totdat alle gladde spiercellen zijn gedissocieerd en alleen endotheelcellen overblijven als een intacte "buis".
      OPMERKING: Gebruik indien nodig tijdens de trituratie zorgvuldig een tang met fijne punt om de gedissocieerde adventitia en interne elastische lamina uit de endotheelbuis te verwijderen. Meestal leveren slechts enkele cycli van trituratie een intacte endotheelbuis op.
   3. Gebruik micromanipulatoren om elk uiteinde van de endotheelbuis op de glazen afdekkingslip in de kamer vast te zetten met borosilicaatglas pinpipeten (figuur 3C,D).
4. Het vastzetten van de arteriolar endotheelbuis
   1. Vervang de dissociatieoplossing door een superfusieoplossing (PSS met 2 mM CaCl₂) en zorg ervoor dat niet-endotheelmateriaal uit de kamer wordt gewassen.
   2. Breng beveiligde endotheelbuis in het mobiele platform over naar de microscoopinstallatie die is ontworpen voor continue superfusie en intracellulaire of fluorescerende opnames / beeldvorming.
   3. Pas continue levering van PSS toe tijdens het experiment. Stel het debiet (5-7 ml/min) gedurende het hele experiment handmatig in met behulp van de inline stroomregelklep, consistent met de laminaire stroom, terwijl de toevoer van de oplossingsstroom wordt afgestemd op de mate van vacuümafzuiging. Laat ≥5 minuten PSS-stroom naar de kamer voor superfusie van de endotheelbuis voordat u achtergrondgegevens en/of kleurstofbelasting verkrijgt.

5. Gebruik van arteriolar endotheelbuizen voor het onderzoek van de cellulaire fysiologie

OPMERKING: Geïsoleerde en beveiligde arteriolar endotheelbuizen kunnen worden gebruikt voor intracellulaire opnames van [Ca²⁺]_i dynamica en V_m met behulp van respectievelijk fotometrie en scherpe elektrode-elektrofysiologie, zoals eerder geïllustreerd¹³ (figuur 4). [Ca²⁺] _i en V_m kunnen naar behoefte als afzonderlijke of gecombineerde experimentele variabelen worden gemeten¹³ (figuur 4). Arteriolar endotheelbuizen zijn echter delicater dan arterieel endotheel en de experimenteertijd mag niet langer zijn dan 1 uur.

1. Meting van [Ca²⁺]_i
   1. Schakel de apparatuur en software in voor [Ca²⁺]_i-opnames met behoud van continue superfusie met een stroomsnelheid van 5-7 ml/min.
   2. Laad de endotheelbuis met de Ca²⁺ kleurstof Fura-2 AM gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Was de cellen nog eens 20-30 minuten met superfusieoplossing terwijl u de badtemperatuur geleidelijk verhoogt tot 37 °C. Houd de temperatuur gedurende het hele experiment op 37 °C.
   3. Pas het beeldvenster handmatig aan met behulp van fotometriesoftware om scherp te stellen op ~ 20 endotheelcellen (figuur 4A). Zet bij afwezigheid van licht de PMT op de fluorescentie-interface en begin met de verwerving van [Ca²⁺]_i door fura-2 afwisselend (≥10 Hz) te prikkelen bij 340 nm en 380 nm terwijl de fluorescentie-emissie bij 510 nm wordt verzameld. Zodra een stabiele baselineregistratie van [Ca²⁺]_i is vastgesteld, past u farmacologische middelen (bijv. purinerge receptoragonisten) toe per experimenteel objectief (figuur 4B).
2. Meting van V_m
   1. Schakel de apparatuur en software in voor V_m-opnames en stel de gegevensacquisitiesnelheid (≥10 Hz) in met behoud van continue superfusie bij een stroomsnelheid van 5-7 ml / min. Verhoog de badtemperatuur geleidelijk tot 37 °C en houd deze vol tot het einde van het experiment.
   2. Trek een scherpe elektrode met behulp van een borosilicaatglas capillair, vul op met 2 M KCl en bevestig deze over een zilverdraad bedekt met chloride in de pipethouder die is bevestigd aan een elektrometer, die op zijn beurt wordt vastgehouden door een micromanipulator.
   3. Gebruik tijdens het kijken door het 4x objectief een micromanipulator om de scherpe elektrodepunt net over een cel van de arteriolar endotheelbuis voorzichtig in het stromende PSS in de kamer te plaatsen.
   4. Verhoog de vergroting geleidelijk tot 400x en verplaats de elektrodepunt indien nodig.
   5. Breng met behulp van de micromanipulator voorzichtig de punt van een scherpe elektrode in een van de cellen van de endotheelbuis en begin met de registratie V_m met behulp van een elektrometer (figuur 4A).
   6. Zodra de endotheelrust V_m stabiel is (−30 tot −40 mV), past u de gewenste farmacologische middelen per experimenteel doel toe (figuur 4C).

6. Cellulaire beeldvorming

OPMERKING: Endotheelbuizen die in de kamer van het mobiele platform zijn bevestigd, kunnen ook worden gebruikt voor microscopische beeldvorming in zowel levende als vaste omstandigheden¹⁹ met behulp van standaard fluorescentie of confocale microscopie. Immunohistochemie met verschillende antilichamen voor receptoren en ionkanalen kan ook worden toegepast zoals eerder beschreven²⁰.

1. Laad de endotheelbuis met de fluorescentietracker voor het plasmamembraan of het gewenste organel (bijv. kern, endoplasmatisch reticulum) bij 37 °C gedurende 15-30 minuten.
2. Was de cellen met verse superfusie PSS en beeld levende cellen onder de microscoop op de excitatiegolflengte van de respectieve kleurstoffen (figuur 4D,E).
   OPMERKING: Immunohistochemie kan op dit buismodel worden uitgevoerd met behulp van antilichamen van belang.

Resultaten

Een demonstratie van het protocol is weergegeven in figuur 1 met arteriolar dissectie en endotheelbuisisolatiestappen als respectievelijk figuur 2 en figuur 3. Hier werd de endotheelfunctie beoordeeld door [Ca^2+]_i en V_m te meten met behulp van Fura-2-fotometrie en scherpe elektrode-elektrofysiologie (figuur 4A) als reactie op een farmacologisch middel [2-methylthioadenos...

Discussie

Groeiend bewijs suggereert dat cerebrovasculaire ziekte (CVD), veroudering en de ziekte van Alzheimer sterk gecorreleerd zijn en een actueel onderwerp zijn van dementieonderzoek 4,8,14,21. Het is dus duidelijk dat studies van het cerebrovasculaire netwerk een brede impact op de gezondheid zouden hebben, terwijl voortdurend uitgebreid onderzoek tijdens ziekteomstandigheden vereist is. Als een be...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Versterkers	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Axoclamp 2B & Axoclamp 900A
Hoorbare baseline-monitors	Ampol US LLC, Sarasota, FL, USA	BM-A-TM
Badkoeler (Isotemp 500LCU)	ThermoFisher Scientific	13874647
Borosilicaatglazen capillairen (Pinning)	Warner Instruments	G150T-6
Borosilicaatglazen capillairen (Sharp Electrodes)	Warner Instruments	GC100F-10
Borosilicaatglazen capillairen (Trituratie)	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	1B100-4
BSA: bovien Serum Albumine	Sigma	A7906
CaCl2: calciumchloride	Sigma	223506
Collageenase (Type H Blend)	Sigma	C8051
Dekglas (2,4 × 5,0 cm)	ThermoFisher Scientific	12-548-5M
Data Acquision Digitizer	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	Digidata 1550A
Dissectiekom (Glas Petri met houtskool Sylgard-bodem)	Living Systems Instrumentation, St. Albans City, VT, USA	DD-90-S-BLK
Dithioerythritol	Sigma	D8255
DMSO: dimethylsulfoxide	Sigma	D8418
Elastase (varkenspancreas)	Sigma	E7885
Endoplasmatisch reticulum tracker (ER-Tracker Red, BODIPY TR Glibenclamid)	ThermoFisher Scientific	E34250
Vezeloptische lichtbronnen	Schott, Mainz, Duitsland & KL200, Zeiss	Fostec 8375
Flow Control Valve	Warner Instruments	FR-50
Fluorescentie systeeminterface, ARC-lamp & voeding, hyperswitch en PMT	Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA	IonOptix Systems
Pincetten (fijne punt, geslepen)	FST	Dumont #5 & Dumont #55
Functiegenerator	EZ Digital, Seoul, Zuid-Korea	FG-8002
Fura-2 AM-kleurstof	Invitrogen, Carlsbad, CA, USA	F14185
Glucose	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)	G7021
HCl: zoutzuur	ThermoFisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA)	A466250
Headstages	Molecular Devices	HS-2A & HS-9A
HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)	Sigma	H4034
Inline Solution Heater	Warner Instruments	SH-27B
KCl: kaliumchloride	Sigma	P9541
MgCl2: magnesiumchloride	Sigma	M2670
Microforge	Narishige, East Meadow, NY, USA	MF-900
Micromanipulator	Siskiyou	MX10
Micropipet puller (digitaal)	Sutter Instruments, Novato, CA, USA	P-97 of P-1000
Microscoop (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc, Melville, NY, USA	Ts2
Microscoop (Nikon-inverted)	Nikon Instruments Inc	Eclipse TS100
Microscoop objectieven	Nikon Instruments Inc	20X (S-Fluor) en 40X (Plan Fluor)
Microscoop platform (geanodiseerd aluminium; diameter, 7,8 cm)	Warner Instruments	PM6 of PH6
Microscope Stage (Aluminum)	Siskiyou, Grants Pass, OR, USA	8090P
Microsyringe Pomp Controller	World Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, USA	SYS-MICRO4
MTA: 2-methylthioadenosine difosfaat trinatriumzout	Tocris	1624
NaCl: natriumchloride	Sigma	S7653
NaOH: natriumhydroxide	Sigma	S8045
Kernkleuring (NucBlue Live ReadyProbes Reagens; Hoechst 33342)	ThermoFisher Scientific	R37605
Oscilloscoop	Tektronix, Beaverton, Oregon, USA	TDS 2024B
Papaïne	Sigma	P4762
Phase contrast objectieven	Nikon Instruments Inc	(Ph1 DL; 10X & 20X)
Plasmamembraankleuring (CellMask Deep Red)	ThermoFisher Scientific	C10046
Plexiglas superfusiekamer	Warner Instruments, Camden, CT, USA	RC-27
Scharen (3 mm & 7 mm bladen)	Fine Science Tools (of FST), Foster City, CA, USA	Moria MC52 & 15000-00
Scharen (Vannas-stijl; 9,5 mm & 3 mm bladen)	World Precision Instruments	555640S, 14364
Stereomicroscopen	Zeiss, NY, USA	Stemi 2000 & 2000-C
Spuitfilter (0,22 µm)	ThermoFisher Scientific	722-2520
Temperatuurregelaar (Dual Channel)	Warner Instruments	TC-344B of C
Ventilatie Control System	Warner Instruments	VC-6
Vibratie-isolatietafel	Technical Manufacturing, Peabody, MA, USA	Micro-g