Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

In vivo Positronemissietomografie om activiteitspatronen te onthullen die worden geïnduceerd door diepe hersenstimulatie bij ratten

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63478

⸱

23 maart 2022

 ,  ,  ,  , 
1Centro Nacional de Investigaciones Cardiovasculares (CNIC), 2Laboratorio de Imagen Médica, Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, 3Departamento de Bioingeniería e Ingeniería Aeroespacial, Universidad Carlos III de Madrid, 4CIBER de Salud Mental (CIBERSAM), 5High Performance Research Group in Physiopathology and Pharmacology of the Digestive System (NeuGut), Universidad Rey Juan Carlos

In dit artikel

Samenvatting

We beschrijven een preklinische experimentele methode om metabole neuromodulatie geïnduceerd door acute diepe hersenstimulatie met in vivo FDG-PET te evalueren. Dit manuscript bevat alle experimentele stappen, van stereotaxische chirurgie tot de toepassing van de stimulatiebehandeling en de verwerving, verwerking en analyse van PET-beelden.

Samenvatting

Diepe hersenstimulatie (DBS) is een invasieve neurochirurgische techniek gebaseerd op de toepassing van elektrische pulsen op hersenstructuren die betrokken zijn bij de pathofysiologie van de patiënt. Ondanks de lange geschiedenis van DBS blijven het werkingsmechanisme en de juiste protocollen onduidelijk, wat de noodzaak benadrukt van onderzoek dat gericht is op het oplossen van deze raadsels. In die zin is het evalueren van de in vivo effecten van DBS met behulp van functionele beeldvormingstechnieken een krachtige strategie om de impact van stimulatie op de hersendynamiek te bepalen. Hier wordt een experimenteel protocol voor preklinische modellen (Wistar-ratten), gecombineerd met een longitudinale studie [18F]-fluorodeoxyclucose positronemissietomografie (FDG-PET), beschreven om de acute gevolgen van DBS op het hersenmetabolisme te beoordelen. Ten eerste ondergingen dieren stereotactische chirurgie voor bilaterale implantatie van elektroden in de prefrontale cortex. Een postoperatieve computertomografie (CT) -scan van elk dier werd verkregen om de plaatsing van de elektrode te verifiëren. Na een week herstel werd een eerste statische FDG-PET van elk geopereerd dier zonder stimulatie (D1) verkregen en twee dagen later (D2) werd een tweede FDG-PET verkregen terwijl dieren werden gestimuleerd. Daarvoor werden de elektroden aangesloten op een geïsoleerde stimulator na toediening van FDG aan de dieren. Zo werden dieren gestimuleerd tijdens de FDG-opnameperiode (45 min), waarbij de acute effecten van DBS op het hersenmetabolisme werden geregistreerd. Gezien het verkennende karakter van deze studie, werden FDG-PET-beelden geanalyseerd door een voxel-wise benadering op basis van een gepaarde T-test tussen D1- en D2-studies. Over het algemeen maakt de combinatie van DBS- en beeldvormingsstudies het mogelijk om de neuromodulatiegevolgen op neurale netwerken te beschrijven, wat uiteindelijk helpt om de raadsels rond DBS te ontrafelen.

Inleiding

De term neurostimulatie omvat een aantal verschillende technieken gericht op het stimuleren van het zenuwstelsel met een therapeutisch doel1. Onder hen valt diepe hersenstimulatie (DBS) op als een van de meest wijdverspreide neurostimulatiestrategieën in de klinische praktijk. DBS bestaat uit de stimulatie van diepe hersenkernen met elektrische pulsen die worden afgegeven door een neurostimulator, rechtstreeks in het lichaam van de patiënt geïmplanteerd, via elektroden die in het hersendoel worden geplaatst om te worden gemoduleerd door stereotactische chirurgie. Het aantal artikelen dat de haalbaarheid van DBS-toepassing bij verschillende neurologische en psychiatrische aandoeningen evalueert, groeit voortdurend2, hoewel slechts enkele ervan zijn goedgekeurd door de Food and Drug Association (FDA) (d.w.z. essentiële tremor, de ziekte van Parkinson, dystonie, obsessief-compulsieve stoornis en medisch refractaire epilepsie)3 . Bovendien wordt een groot aantal hersendoelen en stimulatieprotocollen onderzocht voor DBS-behandeling van veel meer pathologieën dan officieel goedgekeurd, maar geen van hen wordt als definitief beschouwd. Deze inconsistenties in DBS-onderzoek en klinische procedures kunnen gedeeltelijk te wijten zijn aan een gebrek aan volledig begrip van het werkingsmechanismeervan 4. Daarom worden enorme inspanningen geleverd om de in vivo effecten van DBS op de hersendynamiek te ontcijferen, omdat elke vooruitgang, hoe klein ook, zal helpen bij het verfijnen van DBS-protocollen voor meer therapeutisch succes.

In deze context openen moleculaire beeldvormingstechnieken een direct venster om in vivo neuromodulerende effecten van DBS te observeren. Deze benaderingen bieden niet alleen de mogelijkheid om de impact van DBS te bepalen terwijl het wordt toegepast, maar ook om de aard van de gevolgen ervan te ontrafelen, ongewenste bijwerkingen en klinische verbetering te voorkomen en zelfs stimulatieparameters aan te passen aan de behoeften van de patiënt5. Onder deze methoden is positronemissietomografie (PET) met behulp van 2-deoxy-2-[18F]fluoro-D-glucose (FDG) van bijzonder belang omdat het specifieke en realtime informatie biedt over de activeringstoestand van verschillende hersengebieden6. In het bijzonder biedt FDG-PET-beeldvorming een indirecte evaluatie van neurale activering op basis van het fysiologische principe van metabole koppeling tussen neuronen en gliacellen6. In die zin hebben verschillende klinische studies DBS-gemoduleerde hersenactiviteitspatronen gemeld met behulp van FDG-PET (zie3 voor beoordeling). Niettemin ondervinden klinische studies gemakkelijk verschillende nadelen wanneer ze zich richten op patiënten, zoals heterogeniteit of wervingsproblemen, die hun onderzoekspotentieel sterk beperken6. Deze context brengt onderzoekers ertoe om diermodellen van menselijke aandoeningen te gebruiken om biomedische benaderingen te evalueren vóór hun klinische vertaling of, indien al toegepast in de klinische praktijk, om de fysiologische oorsprong van therapeutische voordelen of bijwerkingen te verklaren. Dus, ondanks de grote afstanden tussen menselijke pathologie en de gemodelleerde toestand bij proefdieren, zijn deze preklinische benaderingen essentieel voor een veilige en effectieve overgang naar de klinische praktijk.

Dit manuscript beschrijft een experimenteel DBS-protocol voor muizenmodellen, gecombineerd met een longitudinale FDG-PET-studie, om de acute gevolgen van DBS op het hersenmetabolisme te beoordelen. De uitkomsten die met dit protocol worden verkregen, kunnen helpen om de ingewikkelde modulatorische patronen te ontrafelen die door DBS op hersenactiviteit worden geïnduceerd. Daarom wordt een geschikte experimentele strategie geboden om in vivo de gevolgen van stimulatie te onderzoeken, waardoor clinici onder specifieke omstandigheden kunnen anticiperen op therapeutische effecten en vervolgens de stimulatieparameters kunnen aanpassen aan de behoeften van de patiënt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Proefdierprocedures werden uitgevoerd volgens richtlijn 2010/63/EU van de Raad van de Europese Gemeenschappen en goedgekeurd door de ethische commissie voor dierproeven van het ziekenhuis Gregorio Marañón. Een grafische samenvatting van het experimentele protocol is weergegeven in figuur 1A.

1. Lokalisatie van hersendoelen door in vivo neuroimaging

  1. Dierlijke bereiding
    OPMERKING: Mannelijke Wistar-ratten van ~ 300 g werden gebruikt.
    1. Plaats het dier in een anesthesie-inductiedoos en sluit de bovenkant af.
    2. Zet de sevofluraan vaporizer aan (5% voor inductie in 100% O2). Wanneer de rat is verdoofd, schakelt u de gasstroom naar de neuskegel. Bevestig de staat van anesthesie door in de rattenpoot te knijpen.
    3. Leg het dier in rugligging op het CT-bed en behoud de anesthesie van sevofluraan (3% voor onderhoud in 100% O2).
  2. CT-beeldvorming
    OPMERKING: De selectie van stroomsterkte, spanning, aantal projecties, aantal opnamen en voxelresolutie is afhankelijk van de CT-scanner. Hier werden de volgende parameters: 340 mA, 40 KV, 360 projecties, 8 opnamen en 200 μm resolutie gebruikt 7,8,9.
    1. Bevestig het mondkapje of de neuskegel aan de rat.
    2. Bevestig het rattenlichaam aan het hoofd, de schouders, heupen en de staart met zijden tape om voldoende terughoudendheid te bieden zonder schade.
    3. Controleer de rat continu.
    4. Plaats de kop in het midden van het gezichtsveld van de CT-scanner.
    5. Ga verder met het verkrijgen van het CT-beeld met behulp van acquisitieparameters volgens de specificaties van de scanner.
    6. Na 10 minuten, wanneer de in vivo CT-scan is voltooid, stopt u de sevofluraanstroom en plaatst u de rat in de MRI-scanner.
  3. MR beeldvorming
    OPMERKING: Scanacquisitiespecificaties variëren per scanner, inclusief verschillende softwaresystemen en nog belangrijker, de specifieke onderzoeksvraag. Hier werd een 7-Tesla scanner gebruikt. Er werd een T2-gewogen spin-echosequentie van 7,8,9 met TE = 33 ms, TR = 3732 ms en een plakdikte van 0,8 mm (34 plakjes), matrixgrootte van 256 x 256 pixels met een FOV van 3,5 x 3,5 cm 2 gebruikt.
    1. Leg het dier in rugligging op het MRI-bed en behoud de anesthesie van sevofluraan (3% voor onderhoud in 100% O2).
    2. Bevestig het hoofd aan een stereotactisch frame dat op het scannerbed is geplaatst om hoofdbewegingen tijdens MRI-acquisitie te voorkomen. Beveilig ook de rest van het rattenlichaam met zijden tape.
    3. Plaats het hoofd in het midden van het gezichtsveld van de MRI-scanner.
    4. Zodra de positie correct is, gaat u verder met het verkrijgen van het MRI-beeld.
    5. Wanneer de in vivo MRI-scan is voltooid, stopt u de sevofluraanstroom en plaatst u de rat in zijn kooi.
    6. Zoek een verwarmingslamp in de buurt van de kooi, omdat ratten meestal hun lichaamstemperatuur verlagen tijdens de scan.
    7. Controleer de rat tot herstel van de anesthesie.
  4. Atlas colokalisatie en berekening van doelcoördinaten
    1. Zodra CT- en MRI-beelden zijn verkregen en gereconstrueerd volgens de aanbevelingen van de scanner, registreert u de CT- en MRI-beelden samen.
    2. Gebruik een beeldverwerkingssoftware om CT en MRI ruimtelijk te normaliseren met behulp van een automatisch rigide registratiealgoritme op basis van wederzijdse informatie10.
    3. Lokaliseer de Bregma-lijn in de co-geregistreerde afbeelding en meet de afstand in de voorste / achterste (AP: +3,5 mm), middellijn / laterale (ML: +0,6 mm) en dorsoventrale (DV: -3,4 mm) as van Bregma tot het doelwit (d.w.z. mediale prefrontale cortex, mPFC), volgens de Paxinos en Watson rattenhersenenatlas11.
      OPMERKING: Coördinaten van Bregma naar het doelwit kunnen verschillen tussen ratten wanneer gewicht, grootte, geslacht en ras verschillend zijn.

2. Stereotaxische chirurgie

LET OP: Autoclaaf al het chirurgisch materiaal, implantaten en stereotaxische eenheden voor gebruik en desinfecteer het chirurgische gebied om infecties en complicaties te voorkomen die het dierenwelzijn kunnen beïnvloeden. Gebruik steriele chirurgische handschoenen en bedek het dier met kleverige gordijnen om besmetting te voorkomen.

  1. Voorbereiding en anesthesie van dieren
    1. De dieren kregen de dag voor de operatie 0,1 mg/kg buprenorfine intraperitoneaal toegediend. Plaats het dier in een anesthesie-inductiekastkamer en sluit de bovenkant af.
    2. Zet de sevofluraan vaporizer aan (5% voor inductie in 100% O2).
    3. Wanneer de rat ligfiets is, schakel je de sevofluraanverdamper uit en verwijder je de rat uit de dooskamer.
    4. Intraperitoneaal een mengsel van ketamine (100 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) toedienen om het dier te verdoven.
    5. Wacht tot het dier volledig verdoofd is. Controleer het niveau van anesthesie door het interdigitale gebied te knijpen.
    6. Scheer het gebied tussen de oren en de ogen.
  2. Plaatsing in het stereotactische frame en craniotomie
    1. Plaats het dier in buikligging op het stereotactische frame en gebruik de hoofdadapter voor ratten om het dier tijdens de operatie in de juiste positie te houden.
    2. Zorg voor immobiliteit van de kop door de rat oorbalken te gebruiken. Wees voorzichtig met het inbrengen van de oorstaven, omdat een te diepe inbrenging het trommelvlies kan beschadigen.
    3. Breng oogheelkundige smeergel aan op de ogen om uitdroging tijdens de operatie te voorkomen en bedek ze met steriel gaas.
    4. Bedek het dier met kleverige gordijnen om besmetting te voorkomen.
    5. Breng iodopovidonoplossing aan op het geschoren gebied en reinig het met steriel gaas.
    6. Breng mepivacaine in gel aan op het geschoren gebied om het lokale gebied te verdoven.
    7. Maak een longitudinale incisie in de huid boven de schedel tussen de oren en strek 1,5-2 cm van lambda naar Bregma (d.w.z. van de schedeltex naar de ogen).
    8. Leg de schedel bloot met behulp van 2 of 3 klemmen. Verwijder het botvlies met een wattenstaafje en reinig het bloed met een zoutoplossing om Bregma en de sagittale hechtingen bloot te leggen. Verwijder de overtollige zoutoplossing met gaas.
    9. Kras het schedeloppervlak met een scalpel om de hechting van tandcement te verbeteren. Reinig het gebied met een wattenstaafje gedrenkt in waterstofperoxide.
  3. Elektrodeplaatsing en fixatie op de schedel
    1. Maak de elektroden recht met een plastisch pincet om de juiste plaatsing tijdens de operatie te garanderen.
      OPMERKING: Concentrische bipolaire platina-iridium elektroden met de grond worden gebruikt in dit protocol.
    2. Zoek één elektrode op de houder van de rechterarm van het stereotactische frame.
      OPMERKING: Het kan nodig zijn om de houder aan te passen aan de elektrode om deze beter te bevestigen (zie figuur 1B). Zorg ervoor dat de elektrode evenwijdig is aan de as van de houder.
    3. Beweeg de rechterarm die de elektrode vasthoudt door het stereotaxische frame en plaats de punt van de elektrode precies over Bregma. Probeer de elektrodepunt zo dicht mogelijk bij de schedel te brengen, maar zonder deze aan te raken om vervorming van de elektrode te voorkomen, en noteer de resulterende coördinaten voor Bregma die door het stereotaxische frame worden verstrekt. Maak een markering op de schedel die de beginpositie van de elektrode aangeeft met een chirurgische pen.
    4. Verplaats de houder naar de AP- en ML-coördinaten die zijn verkregen in stap 1.4.3 en maak een markering op de schedel met een chirurgische pen die de positie van het elektrodedoel aangeeft.
    5. Verwijder de rechterarm van het stereotactische frame dat de elektrode vasthoudt. Pas op dat u niets met de elektrode aanraakt.
    6. Gebruik een kleine elektrische boor om een gat door de schedel (ongeveer 1-1,5 mm in diameter) in de doelpositie te maken totdat de dura zichtbaar is. Stop eventuele bloedingen met een wattenstaafje.
    7. Boor 4 gaten langs de schedel om 4 schroeven te lokaliseren (bij voorkeur roestvrijstalen schroeven van 2-3 mm lengte) om het oppervlak van het tandcement te vergroten en de grond te lokaliseren. Bevestig de 4 schroeven.
    8. Lokaliseer de rechterarm van het stereotactische frame met de rechterelektrode. Verplaats de arm naar de berekende positie, die moet samenvallen met het gat. Laat vervolgens de elektrode zakken totdat deze de dura mater raakt. Deze positie zal dienen als 0 niveau in de DV-richting.
    9. Plaats de punt van de elektrode in de DV-richting met behulp van de DV-positie in stap 1.4.3. Reinig het bloed en het hersenvocht rond het gebied van de elektrode met een wattenstaafje.
    10. Bevestig de grond aan een van de schroeven die zich het dichtst bij de elektrode bevinden.
    11. Breng tandcement aan rond de elektrode en schroeven zorg ervoor dat het tandcement wordt gevormd en vermijd scherpe randen, die het dier kunnen verwonden. Tandcement wordt in een laag aangebracht om oververhitting/thermische schade aan het weefsel/de schedel te voorkomen. Dikke lagen hebben meer tijd nodig om uit te harden voordat er extra lagen worden toegevoegd. Zorg ervoor dat het tandcement volledig is uitgehard voordat u de elektrode uit de houder verwijdert.
      LET OP: De bereiding van het tandcement produceert de emanatie van giftige dampen uit het mengsel, dat eindigt met de stolling van het cement. Draag daarom een beschermingsmasker dat effectief is tegen chemische gassen vanaf dit punt en tot het einde van de operatie.
    12. Herhaal dezelfde procedure uit stap 2.3.2-2.3.11 voor de andere hersenhelft.
    13. Breng meer tandcement aan om een dop te vormen zonder de elektrode te bedekken. Wacht tot het hard wordt.
    14. Gebruik gevlochten natuurlijke zijde niet-absorbeerbare hechtdraad 1/0, met een driehoekige naald, om voor en achter de dop te hechten. Verwijder indien nodig de niet-absorbeerbare hechtingen op een bepaald moment, afhankelijk van het lichaamsgebied waar ze zich bevinden. Gebruik een iodopovidonoplossing om het operatiegebied te desinfecteren.
    15. Verwijder de rat uit het stereotactische frame.
  4. CT-beeldvorming voor bevestiging van elektrodeplaatsing
    1. Voer stap 1.2.4-1.2.5 uit en zie figuur 1C.
    2. Zodra de in vivo CT-scan is voltooid, plaatst u de rat in zijn kooi.
    3. Volg stap 1.3.6. en 1.3.7.
  5. Postoperatieve zorg
    1. Dien antibiotica (ceftriaxon, 100 mg/kg, subcutaan) toe gedurende 5 dagen en pijnstillend (buprenorfine, 0,1 mg/kg, intraperitoneaal) gedurende 3 dagen als postoperatieve zorg. Dit antibioticumregime kan 5 dagen worden verlengd als er tekenen van infectie (roodheid, zwelling en exsudaat) rond de dop worden waargenomen.
    2. Voer dagelijks een visuele inspectie van elk dier uit, op zoek naar tekenen van pijn of angst, en reinig de dop met iodopovidonoplossing.
    3. Zorg voor intensieve zorg tot 1 week na de operatie.

3. PET/CT-beeldvormingsacquisitie

OPMERKING: Elk dier ondergaat twee PET/CT-onderzoeken (d.w.z. in afwezigheid en tijdens dbs-toediening) onder geïnhaleerde anesthesie om de acute effecten te beoordelen die door de elektrische stimulatie worden veroorzaakt. Beide scansessies volgen hetzelfde beeldvormingsacquisitieprotocol en worden 1 week na de operatie (D1, zonder stimulatie) en 2 dagen later (D2, tijdens DBS) uitgevoerd.

  1. Voorbereiding en anesthesie van dieren
    1. Snel de rat gedurende 8-12 uur voorafgaand aan elke PET-scan om een hogere hersenopname van FDG mogelijk te maken, waardoor de signaal-ruisverhouding12 wordt verbeterd.
    2. Plaats het dier in een anesthesie-inductiedoos en sluit de bovenkant af.
    3. Zet de sevofluraan vaporizer aan (5% voor inductie in 100% O2).
    4. Wanneer de rat is verdoofd, schakelt u de gasflux over naar de neuskegel.
  2. FDG injectie en opname periode
    LET OP: FDG is een radiotracer, dus overweeg radioprotectiemaatregelen om blootstelling aan radioactiviteit te voorkomen. Bevestig dat de instelling alle toestemming heeft om met radioactieve verbindingen te werken.
    1. Bewaar de FDG-injectieflacon in een met lood beklede kast totdat deze wordt gebruikt om ongewenste blootstelling aan radioactiviteit te voorkomen.
    2. Vul een kleine spuit (~27G) met ~37 MBq van de FDG-oplossing in het minder mogelijke volume, zoals gemeten in een activimeter.
    3. Plaats een verwarmingskussen onder de staart van het dier of gebruik infrarood licht om de staartaders te verwijden.
    4. Zodra de laterale aderen zichtbaar zijn in de piek van de staart, reinigt u het gebied met sanitaire alcohol (96%).
    5. Injecteer de FDG-oplossing door een van de laterale staartaders en nader de ader met een spuit parallel aan de baan en met de schuine kant van de naald naar boven gericht.
    6. Schakel de anesthesie uit en plaats het dier terug in zijn kooi om volledig te herstellen onder een verwarmingslamp.
    7. Laat 45 minuten radiotraceropname toe voordat u de beeldacquisitiesessie start. Houd het dier tijdens deze periode wakker en in een met lood afgeschermde kamer.
    8. In het geval van het D2-onderzoek, dbs toedienen zoals hieronder uitgelegd in rubriek 4 (Toediening van elektrische stimulatie) tijdens de FDG-opnameperiode.
  3. PET-acquisitie en beeldvormingsreconstructie
    OPMERKING: De specificaties voor het verkrijgen van PET-afbeeldingen zijn afhankelijk van de scanner en de scantijd. Voor dit protocol werd gedurende 45 minuten een statisch PET-beeld verkregen met een PET/CT-scanner voor kleine dieren, met behulp van een energievenster van 400-700 keV 7,8,9. Bekijk de specificaties van de PET/CT-apparatuur voordat u het acquisitieprotocol ontwerpt.
    1. Plaats het dier 45 minuten na FDG-injectie in een anesthesie-inductiedoos en sluit de bovenkant af.
    2. Zet de sevofluraan vaporizer aan (5% voor inductie in 100% O2).
    3. Breng het dier over naar het PET/CT-bed en leg het in rugligging, zet de neus vast aan de anesthesieneuskegel en handhaaf sevofluraan anesthesie (3% voor onderhoud in 100% O2). Bevestig de staat van anesthesie door in de rattenpoot te knijpen.
    4. Herhaal stap 1.2.2 en 1.2.3.
    5. Plaats de kop in het midden van het gezichtsveld van de PET-scanner.
    6. Verkrijg het statische PET-beeld met behulp van acquisitieparameters volgens de specificaties van de scanner.
    7. Ga verder met het reconstrueren van de afbeelding met behulp van een 2D-OSEM (geordende subsetverwachtingsmaximalisatiealgoritme) en pas verval- en dode tijdcorrecties toe 7,8,9.
    8. Wanneer de in vivo PET-scan is voltooid, handhaaft u de stroom van sevofluraan naar de rat om vervolgens over te gaan tot de CT-acquisitie zonder de hoofdpositie van het dier op het scannerbed te verplaatsen.
  4. Ct-overname
    1. Zonder de positie van het dier ten opzichte van de vorige PET-acquisitie te veranderen, gaat u verder met het verkrijgen van het CT-beeld.
    2. Herhaal stap 1.2.3-1.2.5.
    3. Zodra de in vivo CT-scan is voltooid, stopt u de sevofluraanstroom en plaatst u de rat in zijn respectievelijke kooi voor herstel.
    4. Volg stap 1.3.6. en 1.3.7.
    5. Houd het dier in een met lood afgeschermde kamer totdat de radioactiviteit volledig vervalt.

4. Toediening van elektrische stimulatie

OPMERKING: Elektrische stimulatie wordt geleverd tijdens de FDG-opnameperiode in de D2-beeldvormingssessie. Voor dit protocol werd de stimulatie geleverd met een geïsoleerde stimulator, met een hoogfrequente (130 Hz) elektrische stimulatie in een constante stroommodus, 150 μA, en een pulsbreedte van 100 μs 7,13,14.

  1. DBS-stimulatorconfiguratie
    1. Bereid de geïsoleerde stimulator en de benodigde draden voor in een brede en rustige ruimte, met voldoende ruimte voor de dierenkooien en minimale invloed van potentieel storende stimuli.
    2. Sluit de stimulatiedraden aan op de swivels zodat dieren vrij kunnen bewegen in hun kooien en op de stimulator.
    3. Stel de stimulatieparameters in op basis van de behoeften van het onderzoek.
    4. Gebruik een oscilloscoop om de huidige modus, frequentie en pulsbreedte te controleren. Bevestig de bifasische golfvorm met een rechthoekige pulsvorm (figuur 1D).
  2. DBS levering
    1. Na de D1-beeldvormingssessie en tot de D2-acquisitie, onderwerpen de dieren aan een dagelijks gewenningsprotocol (45 min/dag) om ze te laten wennen aan het stimulatiesysteem en de hantering van de operator, waarbij ongewenste stressreacties in D2 worden vermeden. Sluit het stimulatiesysteem aan op elk dier, maar zonder de stimulatie aan te zetten.
    2. Zodra de stimulator is ingesteld en het dier is geïnjecteerd met FDG, sluit u de zwenkbeweging aan op de elektroden en schakelt u de stimulator in.
    3. Schakel na 45 minuten de stimulator uit, koppel het dier los van de zwenk en breng het snel over naar een anesthesie-inductiekamer om stap 3.3 te beginnen.

figure-protocol-1
Figuur 1: Experimenteel ontwerp. (A) Samenvatting van de experimentele stappen die in dit protocol zijn gevolgd. (B) Representatieve foto's van een houderaanpassing voor een betere fixatie van de elektrode, met (links) en zonder (rechts) een elektrode. (C) Gefuseerd beeld van een MRI met een CT van een geopereerd dier, met de juiste elektrodeplaatsing in de mediale prefrontale cortex (mPFC). (D) Screenshot van het oscilloscoopscherm met de bifasische stimulatiegolfvorm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. PET-beeldverwerking en -analyse

OPMERKING: Volg dezelfde beeldverwerking op afbeeldingen van D1 en D2 om vergelijkbare gegevens te verkrijgen voor latere voxel-wise statistische analyse.

  1. Ruimtelijke registratie van PET-beelden
    1. Gebruik gespecialiseerde beeldverwerkingssoftware. De hele registratieworkflow wordt geïllustreerd in figuur 2.
    2. Centreer en snijd elke PET- en CT-afbeelding naar het gezichtsveld. Registreer het PET-beeld op zijn CT met behulp van een automatisch rigide registratiealgoritme op basis van wederzijdse informatie15.
      OPMERKING: Rigide registratiemethoden zijn alleen geschikt als er geen significante verschillen in lichaamsgewicht of grootte tussen dieren zijn. Overweeg anders om elastische methoden te gebruiken.
    3. Registreer elke CT-opname op een referentie-CT die ruimtelijk is geregistreerd in de Paxinos en Watson rattenhersenenatlas11 zoals in stap 5.1.2. Sla de resulterende transformatieparameters op.
    4. Pas de in stap 5.1.3 verkregen transformatieparameters toe. op elke geregistreerde PET-afbeelding die het PET-beeld verkrijgt dat is geregistreerd op het referentie-CT-beeld.
    5. Sla alle definitieve PET-afbeeldingen op in Nifti-formaat.
  2. Intensiteitsnormalisatie en vloeiend maken van PET-beelden
    OPMERKING: Intensiteitsnormalisatie en smoothing worden uitgevoerd met verschillende interne scripts op basis van openbaar beschikbare bronnen.
    1. Strijk de PET-beelden glad met een isotrope Gaussische kernel van 2 mm Full-Width Half Maximum (FWHM) om mogelijke registratiefouten te corrigeren.
      OPMERKING: De grootte van het afvlakfilter is afhankelijk van de resolutie van de PET-acquisitie, maar het wordt aanbevolen om een filter van 2-3 keer de voxelgrootte van FWHM te gebruiken.
    2. Normaliseer de intensiteit van de PET-voxelwaarden met behulp van een geschikte referentieclusternormalisatiemethode16.
    3. Segmenteer een hersenmasker van een referentie-MRI die is geregistreerd naar het referentie-CT-beeld.
    4. Pas het hersenmasker toe op elk PET-beeld om voxels buiten de hersenen uit te sluiten van de voxel-wise analyse.
  3. Voxel-gewijze analyse
    OPMERKING: De statistische analyse, bestaande uit een voxel-wise analyse van de PET-beeldgegevens, werd uitgevoerd met behulp van gespecialiseerde beeldvormingsanalysesoftware17.
    1. Vergelijk D1- en D2 PET-beelden met behulp van een gepaarde T-test, waarbij adequate statistische significante drempels worden ingesteld.
    2. Beschouw als definitieve resultaten van de analyse alleen die clusters groter dan 50 aangrenzende voxels om type I-fouten te verminderen.
    3. Vertegenwoordig de resultaten in T-kaarten bedekt met een T2 MRI, die de veranderingen in het glucose-hersenmetabolisme laten zien die worden geïnduceerd door DBS (koude kleuren voor FDG-reductie en warme kleuren voor FDG-toename).

figure-protocol-2
Figuur 2: Registratieworkflow voor Micro PET/CT-beeldvorming. Gedetailleerde stappen van pet-beeld ruimtelijke normalisatie verwerking voor daaropvolgende voxel-wise analyse met Statistical Parametric Mapping (SPM) software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De dieren werden geofferd met CO2 aan het einde van het onderzoek of wanneer het welzijn van het dier in het gedrang kwam. Een voorbeeld van een volledig PET/CT-onderzoek van een geopereerd dier is weergegeven in figuur 3. De elektrode die in het rattenbrein is ingebracht, kan dus duidelijk worden waargenomen in de CT-afbeelding in figuur 3A. Deze beeldvormingsmodaliteit levert goede anatomische informatie op en vergemakkelijkt de registratie van FDG-...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Gezien de vooruitgang in het begrip van de hersenfunctie en de neurale netwerken die betrokken zijn bij de pathofysiologie van neuropsychiatrische aandoeningen, erkent steeds meer onderzoek het potentieel van DBS in een breed scala van neurologisch gebaseerde pathologieën2. Het werkingsmechanisme van deze therapie blijft echter onduidelijk. Verschillende theorieën hebben geprobeerd de effecten te verklaren die worden verkregen in specifieke pathologische en stimulatieomstandigheden, maar de hetero...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn in verband met dit artikel.

Dankbetuigingen

Wij danken Prof. Christine Winter, Julia Klein, Alexandra de Francisco en Yolanda Sierra voor hun onschatbare steun bij de optimalisatie van de hier beschreven methodologie. MLS werd ondersteund door het Ministerio de Ciencia e Innovación, Instituto de Salud Carlos III (projectnummer PI17/01766 en subsidienummer BA21/0030), medegefinancierd door het Europees Fonds voor Regionale Ontwikkeling (EFRO), "A way to make Europe"; CIBERSAM (projectnummer CB07/09/0031); Delegación del Gobierno para el Plan Nacional sobre Drogas (projectnummer 2017/085); Fundación Mapfre; en Fundación Alicia Koplowitz.  MCV werd ondersteund door Fundación Tatiana Pérez de Guzmán el Bueno als beurshouder van deze instelling en eu Joint Programme - Neurodegenerative Disease Research (JPND). DRM werd ondersteund door Consejería de Educación e Investigación, Comunidad de Madrid, medegefinancierd door het Europees Sociaal Fonds "Investeren in uw toekomst" (subsidienummer PEJD-2018-PRE/BMD-7899). NLR werd ondersteund door Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón, "Programa Intramural de Impulso a la I+D+I 2019". Md-werk werd ondersteund door Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) en Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (PT20/00044). Het CNIC wordt ondersteund door het Instituto de Salud Carlos III (ISCIII), het Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN) en de Pro CNIC Foundation, en is een Severo Ochoa Center of Excellence (SEV-2015-0505).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
7-Tesla Biospec 70/20 scannerBruker, DuitslandSN0021MRI-scanner voor beeldvorming van kleine dieren
BetadineMeda Pharma S.L., Spanje644625.6Jodiumoplossing (iodopovidone)
Beurer IL 11BeurerSN87318Infraroodlamp
Bipolare kabel 50 cm met 50 cm gaasbedekking tot 100 cmPlastics One, USA305-305 (CM)
Bipolare kabel TT2  50 cm tot 100 cmPlastics One, USA305-340/2Bipolare kabel TT2  50 cm tot 100 cm
BuprexSchering-Plough, S.A961425Buprenorfine (analgeticum)
Ceftriaxona Reig Jofré 1g IMLaboratorio Reig Jofré S.A., Spanje624239.1Ceftriaxon (antibioticum)
CommutatiePlastics One, USASL2+2C4-kanaals commutator voor DBS
Concentrische bipolaire platina-iridium elektrodenPlastics One, USAMS303/8-AIU/SpcElektroden voor DBS
BoormachineBoshT58704Boormachine
FDGCurium Pharma Spain S.A., Spanje-----2-[18F]fluoro-2-deoxy-D-glucose (PET-radiotracer)
VerwarmingskussenDAGA, Spanje23115Verwarmingskussen
KetolarPfizer S.L., Spanje776211.9Ketamine (anesthetisch middel)
Lipolasic 2 mg/gBausch & Lomb S.A, Spanje65277Oftalmisch smeermiddel
MatLab R2021aThe MathWorks, IncOndersteunende software voor SPM12
MRIcroMcCausland Center for Brain Imaging,  University of South Carolina, USAv2.1.58-0Software voor beeldvoorbewerking en -analyse
Multimodaliteitswerkstation (MMWKS)BiiG, SpanjeSoftware voor beeldverwerking en -analyse
Omicrom VISION VETRGB Medical Devices, Spanje731100 ReV BCardiorespiratoire monitor voor kleine beeldvorming
Prevex katoenen wattenPrevex, Finland-----Katoenen watten
SevoraneAbbVie Spain, S.L.U, Spanje673186.4Sevofluraan (inhalatieanesthesie)
Kleine schroevenMax Witte GmbH1,2 x 2 DIN 84 A2Kleine schroeven
Standaard U-Frame Stereotaxic Instrument voor Rat, 18° Ear BarHarvard Apparatus, USA75-1801Twee-armige stereotactische frame voor rat
Statistical Parametric Mapping (SPM12)The Wellcome Center for Human Neuroimaging, UCL Queen Square Institute of Neurology, UKSPM12Software voor voxel-gewijze beeldanalyse
STG1004Multi Channel Systems GmbH, DuitslandSTG1004Geïsoleerde stimulator
SuperArgus PET/CT-scannerSedecal, SpanjeS0026403NanoPET/CT-scanner voor beeldvorming van kleine dieren
Hechtdraad met naald, 1/ºLorca Marín S.A., Spanje55325Gevlochten natuurlijke zijde niet-absorbeerbare hechtdraad 1/0, met driehoekige naald
Technovit 4004 (poeder en vloeistof)Kulzer Technique, Duitsland64708471; 64708474Acrylisch tandheelkundig cement voor craniotomie-tap
Wistar-ratten (Rattus norvergicus)Charles River, SpanjedierproefinstituutGebruikt diermodel
XylagesicLaboratorios Karizoo, A.A, Spanje572599-4Xylazin (anesthetisch middel)
Normon S.A., Spanje602910Mepivacaïne in gel voor topisch gebruik

Referenties

  1. Gildenberg, P. L. Neuromodulation: A historical perspective. Neuromodulation. 1, 9-20 (2009).
  2. Lee, D. J., Lozano, C. S., Dallapiazza, R. F., Lozano, A. M. Current and future directions of deep brain stimulation for neurological and psychiatric disorders. Journal of Neurosurgery. 131 (2), 333-342 (2019).
  3. Casquero-Veiga, M. Preclinical molecular neuroimaging in deep brain stimulation. Complutense University of Madrid. , Faculty of Medicine, Department of Pharmacology (2021).
  4. Blaha, C. D. Theories of deep brain stimulation mechanisms. Deep Brain Stimulation: Indictions and Applications. , Jenny Stanford Publishing. New York. 314-338 (2016).
  5. Fins, J. J. Deep brain stimulation: Ethical issues in clinical practice and neurosurgical research. Neuromodulation. 1, 81-91 (2009).
  6. Desmoulin-Canselier, S., Moutaud, B. Animal models and animal experimentation in the development of deep brain stimulation: From a specific controversy to a multidimensional debate. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 51(2019).
  7. Casquero-Veiga, M., Hadar, R., Pascau, J., Winter, C., Desco, M., Soto-Montenegro, M. L. Response to deep brain stimulation in three brain targets with implications in mental disorders: A PET study in rats. PLOS One. 11 (12), 0168689(2016).
  8. Casquero-Veiga, M., García-García, D., Desco, M., Soto-Montenegro, M. L. Understanding deep brain stimulation: In vivo metabolic consequences of the electrode insertional effect. BioMed Research International. 2018, 1-6 (2018).
  9. Casquero-Veiga, M., García-García, D., Pascau, J., Desco, M., Soto-Montenegro, M. L. Stimulating the nucleus accumbens in obesity: A positron emission tomography study after deep brain stimulation in a rodent model. PLOS One. 13 (9), 0204740(2018).
  10. Pascau, J., Vaquero, J. J., Abella, M., Cacho, R., Lage, E., Desco, M. Multimodality workstation for small animal image visualization and analysis. Scientific Papers. Molecular Imaging and Biology. 8, 97-98 (2006).
  11. Paxinos, G., Watson, C. The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. Sydney. (1998).
  12. Roy, M., et al. A dual tracer PET-MRI protocol for the quantitative measure of regional brain energy substrates uptake in the rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (82), e50761(2013).
  13. Klein, J., et al. A novel approach to investigate neuronal network activity patterns affected by deep brain stimulation in rats. Journal of Psychiatric Research. 45 (7), 927-930 (2011).
  14. Soto-Montenegro, M. L., Pascau, J., Desco, M. Response to deep brain stimulation in the lateral hypothalamic area in a rat model of obesity: In vivo assessment of brain glucose metabolism. Molecular Imaging and Biology. , 830-837 (2014).
  15. Pascau, J., et al. Automated method for small-animal PET image registration with intrinsic validation. Molecular Imaging and Biology. 11 (2), 107-113 (2009).
  16. Andersson, J. L. R. How to estimate global activity independent of changes in local activity. Neuroimage. 244 (60), 237-244 (1997).
  17. Wellcome Trust Centre for Neuroimaging SPM12-Statitstical Parametric Mapping. , Available from: https://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/software/spm12/ (2022).
  18. Lozano, A. M., et al. Deep brain stimulation: current challenges and future directions. Nature Reviews Neurology. 15 (3), (2019).
  19. Boecker, H., Drzezga, A. A perspective on the future role of brain pet imaging in exercise science. NeuroImage. 131, (2016).
  20. Sprengers, M., et al. Deep brain stimulation reduces evoked potentials with a dual time course in freely moving rats: Potential neurophysiological basis for intermittent as an alternative to continuous stimulation. Epilepsia. 61 (5), 903-913 (2020).
  21. Middlebrooks, E. H., et al. Acute brain activation patterns of high- versus low-frequency stimulation of the anterior nucleus of the thalamus during deep brain stimulation for epilepsy. Neurosurgery. 89 (5), 901-908 (2021).
  22. Ashkan, K., Rogers, P., Bergman, H., Ughratdar, I. Insights into the mechanisms of deep brain stimulation. Nature Reviews Neurology. 13 (9), 548-554 (2017).
  23. Williams, N. R., Taylor, J. J., Lamb, K., Hanlon, C. A., Short, E. B., George, M. S. Role of functional imaging in the development and refinement of invasive neuromodulation for psychiatric disorders. World Journal of Radiology. 6 (10), 756-778 (2014).
  24. Rodman, A. M., Dougherty, D. D. Nuclear medicine in neuromodulation. Neuromodulation in Psychiatry. , John Wiley & Sons. West Sussex, UK. 81-99 (2016).
  25. Albaugh, D. L., Shih, Y. -Y. I. Neural circuit modulation during deep brain stimulation at the subthalamic nucleus for Parkinson's disease: what have we learned from neuroimaging studies. Brain Connectivity. 4 (1), 1-14 (2014).
  26. Mayberg, H. S., et al. Reciprocal limbic-cortical function and negative mood: Converging PET findings in depression and normal sadness. Neurology, and Radiology. 156 (5), 675-682 (1999).
  27. Kennedy, S. H., et al. Differences in brain glucose metabolism between responders to CBT and Venlafaxine in a 16-week randomized controlled trial. American Journal of Psychiatry. 164 (5), 778-788 (2007).
  28. Kennedy, S. H., et al. Changes in regional brain glucose metabolism measured with positron emission tomography after paroxetine treatment of major depression. American Journal of Psychiatry. 158 (6), 899-905 (2001).
  29. Brown, E. C., Clark, D. L., Forkert, N. D., Molnar, C. P., Kiss, Z. H. T., Ramasubbu, R. Metabolic activity in subcallosal cingulate predicts response to deep brain stimulation for depression. Neuropsychopharmacology. 45, 1681-1688 (2020).
  30. Klooster, D. C. W., et al. Technical aspects of neurostimulation: Focus on equipment, electric field modeling, and stimulation protocols. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 65, 113-141 (2016).
  31. Kasoff, W., Gross, R. E. Deep brain stimulation: Introduction and Technical Aspects. Neuromodulation in Psychiatry. , John Wiley & Sons. West Sussex, UK. 245-275 (2016).
  32. Perez-Caballero, L., et al. Early responses to deep brain stimulation in depression are modulated by anti-inflammatory drugs. Molecular Psychiatry. 19, 607-614 (2014).
  33. Solera Ruiz, I., UñaOrejón, R., Valero, I., Laroche, F. Craniotomy in the conscious patient. Considerations in special situations. Spanish Journal of Anesthesiology and Resuscitation. 60 (7), 392-398 (2013).
  34. Casali, M., et al. State of the art of 18F-FDG PET/CT application in inflammation and infection: a guide for image acquisition and interpretation. Clinical and Translational Imaging. 9 (4), 299-339 (2021).
  35. Gonzalez-Escamilla, G., Muthuraman, M., Ciolac, D., Coenen, V. A., Schnitzler, A., Groppa, S. Neuroimaging and electrophysiology meet invasive neurostimulation for causal interrogations and modulations of brain states. NeuroImage. 220, 117144(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

FDG-PET-beeldvorminghersenmetabolismestereotactische chirurgieprefrontale cortexelektrode-implantatieneurale netwerkactiviteitbeeldvorming van het rattenbreinvoxel-gewijze analyse
In vivo Positronemissietomografie om activiteitspatronen te onthullen die worden geïnduceerd door diepe hersenstimulatie bij ratten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.