Isolatie van miltmicrovesikels in een muizenmodel van intraperitoneale bacteriële infectie

Summary

Microblaasjes die uit het plasmamembraan worden afgestoten, werken als cellulaire effectoren. Miltmicroblaasjes (SMV's) zijn surrogaatmarkers van pathofysiologische aandoeningen. Bij ratten en muizen kenmerken het SMV-gehalte en de eigenschappen veroudering of ontsteking en worden ze veranderd door cytoprotectieve behandelingen, waardoor ze een waardevol maar overvloedig monitoringinstrument zijn voor preklinisch onderzoek.

Abstract

Microblaasjes (MV's) zijn submicronfragmenten die vrijkomen uit het plasmamembraan van geactiveerde cellen en die fungeren als pro-inflammatoire en procoagulante cellulaire effectoren. Bij ratten zijn milt-MV's (SMV's) surrogaatmarkers van pathofysiologische aandoeningen. Eerdere in vitro studies hebben aangetoond dat Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), een belangrijke parodontale ziekteverwekker, de endotheliale afstoting en apoptose mogelijk maakt, terwijl lipopolysaccharide (LPS) de afstoting van splenocyt-afgeleide microblaasjes (SMV's) bevordert. In vivo studies toonden de haalbaarheid aan van farmacologische controle van SMV-uitscheiding. Het huidige protocol stelt een gestandaardiseerde procedure vast voor het isoleren van milt-SMV's uit het P. gingivalis acute muizeninfectiemodel. Infectie met P. gingivalis werd geïnduceerd bij jonge C57BL/6-muizen door intraperitoneale injectie (drie injecties van 5 x 10⁷ bacteriën/week). Na twee weken werden de milten verzameld, gewogen en de plenocyten geteld. SMV's werden geïsoleerd en gekwantificeerd door middel van eiwit-, RNA- en protrombinase-assays. De levensvatbaarheid van de cellen werd beoordeeld aan de hand van propidiumjodide of trypanblauwe uitsluitingskleurstoffen. Na extractie van splenocyten werden neutrofielentellingen verkregen door middel van flowcytometrie na 24 uur splenocytenkweek. Bij met P. gingivalis geïnjecteerde muizen werd een 2,5-voudige toename van het miltgewicht en een 2,3-voudige toename van het aantal splenocyten waargenomen, terwijl het aantal neutrofielen met een 40-voudige toename was. De cellevensvatbaarheid van splenocyten van met P. gingivalis geïnjecteerde muizen varieerde van 75%-96% en was na 24 uur kweek met 50% afgenomen zonder enig significant verschil in vergelijking met niet-blootgestelde controles. Splenocyten van geïnjecteerde muizen scheiden echter grotere hoeveelheden MV's af door protrombinase-assay of eiwitmetingen. De gegevens tonen aan dat de procoagulerende SMV's betrouwbare hulpmiddelen zijn om een vroege miltrespons op intraperitoneale P. gingivalis-infectie te beoordelen.

Introduction

Microblaasjes (MV's), ook wel microdeeltjes of ectosomen genoemd, zijn plasmamembraanfragmenten met een diameter van 0,1-1,0 μm die vrijkomen in lichaamsvloeistoffen en de extracellulaire ruimte als reactie op verschillende celstimuli. MV's werden eerst geïdentificeerd als bloedplaatjesstof dat procoagulerende fosfolipiden, meestal fosfatidylserine (PSer), blootstelt en vormen een extra oppervlak voor de assemblage van de bloedstollingscomplexen ^1,2. De sleutelrol van circulerende MV's als procoagulerende effectoren is aangetoond bij patiënten met het syndroom van Scott², een zeldzame genetische ziekte die leidt tot disfunctionele blootstelling aan PSer en bloedingen (aanvullende figuur 1). MV's zijn uitgebreid bestudeerd als circulerende biomarkers van trombotisch risico bij chronische ziekten geassocieerd met cardiovasculaire aandoeningen zoals diabetes, chronische nierziekte, pre-eclampsie en hypertensie ^3,4. Ze worden momenteel erkend als echte cellulaire effectoren in vloeistoffen of orgaanweefsels zoals het myocardium¹. Omdat ze actieve eiwitten, lipiden en miRNA transporteren, moduleren ze op afstand vasculaire reacties zoals hemostase, ontsteking, vasculaire angiogenese en vasculaire groei of weefselremodellering⁵.

Terwijl klinische studies de prognosewaarde van MV's met betrekking tot risicofactoren onderzoeken, maken MV's geïsoleerd uit de vloeistoffen of weefsels van de patiënt de ex vivo beoordeling van hun effectoreigenschappen mogelijk⁶. Het ontcijferen van de mechanismen die de biogenese van MV en het vermogen om overspraak te overspreken, wordt over het algemeen bereikt in celkweekmodellen om actieve moleculen te identificeren die worden blootgesteld door of ingekapseld in de MV's en hun stroomafwaartse signalering. De MV-interacties met doelcellen zijn afhankelijk van membraaneiwit/eiwitbinding, wanneer geschikte contraliganden beschikbaar zijn, en/of lipidenfusie⁷.

Onder fysiologische omstandigheden zijn MV's die in het plasma circuleren meestal afkomstig van vasculaire cellen, zoals geïdentificeerd door de differentiatiemarkers van de afstammingscluster (CD)^8,9. Bij pathologie, met name bij kanker¹⁰ en afstoting van het transplantaat^11,12, worden MV's echter afgestoten uit het beschadigde weefsel en vertonen ze schadelijke procoagulerende en pro-inflammatoire kenmerken. Deze worden gedetecteerd in de systemische circulatie, waardoor ze nuttige sondes zijn voor het monitoren van beschermende of verjongingstherapieën, en mogelijke farmacologische doelen¹³. Omdat MV's circuleren als een dynamische opslagpool die de homeostase van vasculaire en weefselcellen bij gezondheid en ziekte weerspiegelt, moet een beter begrip van hun werking op afstand ook in vivo worden onderzocht, na IV-injectie of nasale instillatie bij kleine dieren^14,15. MV's worden inderdaad beschouwd als belangrijke bijdragers aan de ingewikkelde routes die overdreven ontsteking en trombose koppelen¹⁶.

Parodontitis is een ontstekingsziekte van infectieuze oorsprong die tandondersteunende weefsels aantast^17,18 en wordt geassocieerd met trombotisch risico. Het wordt gekenmerkt door tandvleesbloedingen, alveolaire botvernietiging, tandmobiliteit en kan uiteindelijk leiden tot tandverlies. Parodontitis komt wereldwijd veel voor en treft meer dan 50% van de bevolking, waarbij 11% een ernstige vorm van¹⁹ vertoont. Parodontitis wordt veroorzaakt door bacteriële dysbiose van de subgingivale biofilms, die een verergerde ontstekingsreactie in stand houden die weefselvernietiging veroorzaakt²⁰. In het afgelopen decennium is parodontitis in verband gebracht met systemische ziekten zoals hart- en vaatziekten, diabetes en reumatoïde artritis. De mogelijke verklaringen zijn de werking van de parodontale pathogenen op afstand en/of de verhoogde systemische ontsteking gemedieerd door pro-inflammatoire cytokines zoals interleukine (IL-1, IL-6) en TNF-α^21,22.

Onder de pathogenen die verband houden met het ontstaan en de ontwikkeling van parodontitis, wordt Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis)²³ aangetroffen in de meeste ernstige laesies die verschillende virulentiefactoren oogsten, waaronder lipopolysaccharide (LPS)²⁴ die Toll-like-receptor (TLR)-gemedieerde ontstekingsreacties induceert²⁵ en de rekrutering van neutrofielen en polymorfonucleaire leukocyten (PMN's) op de plaats van de eerste infectie²⁶. De LPS van P. gingivalis activeert TLR-4 of TLR-2, waardoor immuundetectie en bacteriële overleving worden vergemakkelijkt²⁷. Op vasculair niveau is activering van TLR2 door LPS geassocieerd met immunotrombose. Het unieke vermogen van P. gingivalis om TLR-2-signalering te stimuleren, terwijl TLR-4-afhankelijke herkenning aanzienlijk is aangetast, bevordert aanhoudende laaggradige infectie^28,29.

In vivo procedures om de MV-responsen op laaggradige pathogene, chronische en aanhoudende infectie te bestuderen, zijn schaars. Methodologische benaderingen voor tissulaire MV-extractie zijn slecht beschreven in de literatuur en hebben over het algemeen betrekking op de oogst van MV's uit pathologische weefsels zoals solide tumoren, leversteatose, atherotrombotische plaques of transplantaten 11,29,30, terwijl de milt bacteriën en virussen in de bloedbaan detecteert. Het slaat ook erytrocyten, bloedplaatjes, lymfocyten, monocyten, basofielen en eosinofielen op die betrokken zijn bij de immuunrespons. Granulocyten zoals neutrofielen uit de rode pulp genereren ook reactieve zuurstofsoorten (ROS) en proteasen die ziekteverwekkers vernietigen en voorkomen dat infectie zich verspreidt^31,32. Verbazingwekkend, en voor zover wij weten, worden milt-MV's niet onderzocht in de context van door pathogenen geïnduceerde weefselbeschadigingen. Er is een wereldwijde onvervulde behoefte om de variaties van tissulaire MV's in de fysiopathologie te bestuderen.

In vitro gegevens van ons laboratorium toonden aan dat LPS de afstoting van procoagulerende MV's uit splenocyten van ratten induceert, wat op zijn beurt de senescentie van gekweekte coronaire endotheelcellen en een opeenvolgend pro-inflammatoir procoagulant endotheelfenotype¹¹ veroorzaakt. De haalbaarheid van de farmacologische controle van de milt MV's werd verder aangetoond na behandeling van het dier met een geoptimaliseerde omega-3-formule. De orale maagsonde van ratten van middelbare leeftijd en leeftijd bleek beschermend te zijn tegen zowel het afstoten van procoagulerende MV's uit splenocyten als hun prosenescente schadelijke eigenschappen naar het coronaire endotheel³³.

In vergelijking met bloed biedt de milt het voordeel dat het bij één persoon een belangrijke bron van leukocyten is. Bovendien is onlangs een milt-cardiale as voorgesteld ^3,34, waardoor de milt een mogelijke bijdrage levert aan het infectiegerelateerde cardiovasculaire risico dat van gunstig belang is voor farmacologische controle. De beoordeling van de eigenschappen of afgifte van de SMV's is essentieel voor het begrijpen van door pathogenen geïnduceerde of inflammatoire reacties. Interessant is dat het kan worden bereikt bij behandelde dieren en in verschillende fysiopathologische modellen (leeftijd, hypertensie, diabetes). Door ratten van middelbare leeftijd en leeftijd te vergelijken³³, kunnen de verschillen in eigenschappen en afgifte van milt-MV's worden aangetoond na een eenvoudige 24-uurs splenocytencultuur.

Gezien de bovenstaande bewijzen van de verandering van de effectoreigenschappen van milt-MV's met de fysiopathologische aandoening en de haalbaarheid van hun farmacologische controle bij ratten, wordt hierin een gestandaardiseerd protocol beschreven voor de isolatie van MV's van milt van muizen. De procedure zou beter passen bij diepgaand onderzoek naar de in vivo mechanismen die SMV's-gemedieerde effecten ondersteunen, eventueel bij gemanipuleerde muizen. De procedure werd vastgesteld bij C57BL/6-muizen met behulp van een lokale intraperitoneale infectie door P. gingivalis, om bewijs te leveren van een werking op afstand van de ziekteverwekker op milt MV (SMV) effectoreigenschappen.

Protocol

Alle experimentele protocollen werden goedgekeurd door en volgden de relevante richtlijnen van de lokale ethische commissie (APAFIS#28745-2020121815051557) en de dierenverzorging van de thuisuniversiteit en van het INSERM. Mannelijke jonge C57BL/6-muizen van 6-8 weken oud werden gebruikt voor de experimenten. Muizen werden regelmatig onderzocht om pijn en stress te evalueren, en hun gewicht werd dagelijks gecontroleerd. Tenzij anders vermeld, moeten alle extractiebuffers en -oplossingen steriel en op kamertemperatuur zijn.

1. Voorbereiding van dieren

1. Dien de muizen gedurende 2 weken elke 2 dagen zes intraperitoneale injecties van P. gingivalis (PG) toe (drie injecties van 5 x 10⁷ bacteriën/week, aanvullend dossier 1).
2. Verdoof de muizen met een combinatie van 100 mg/kg ketamine en 10 mg/kg xylazine.
3. Offer de verdoofde muizen en oogst de milt na laparotomie.
   OPMERKING: De specifieke voorwaarden voor infectie met P. gingivalis en het offeren van de dieren voor de miltoogst worden gedetailleerd beschreven in de sectie "dierproeven" van aanvullend dossier 1. De schematische weergave van de protocolstappen is weergegeven in figuur 1.

2. Extractie van splenocyten

1. Hak met een scalpel het miltweefsel in plakjes van ~ 1 mm in een petrischaaltje dat al gevuld is met 3 ml RPMI met antibiotica (streptomycine (100 E/ml)/penicilline (100 e/ml), Fungizone (250 mg/ml), L-glutamine (2 mM)), en aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) (zie materiaaltabel).
2. Breng de plakjes over naar een zeef (zie Materiaaltabel), die van tevoren is bevestigd aan een polystyreenbuis van 50 ml.
3. Gebruik de zuiger van een spuit als stamper om de tissues op de zeef te pletten.
4. Spoel de zeef af met het RPMI-medium (3 ml).
5. Centrifugeer de celsuspensie bij 450 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het bovenstaande voorzichtig weg door terugstroming.

3. Verwijdering van erytrocyten via een osmotische shock

1. Voeg 1 ml ACK-buffer toe (zie materiaaltabel), meng goed, incubeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur en schud voorzichtig met de handrotatie.
2. Verdun door 9 ml RPMI toe te voegen en meng goed met behulp van aspiratie en terugslag.
3. Centrifugeer op 450 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
4. Gooi het bovenstaande weg door aspiratie en terugstroming en suspendeer de pellet in 5 ml RPMI-medium.
5. Meng voorzichtig (aspiratie/terugstroming) en verwijder eventueel eventueel lipidenvuil door te pipetteren of een zeef te gebruiken.

4. Aanpassing van de geïsoleerde splenocytenconcentratie

1. Vul een microbuisje van 1,5 ml met 900 μL RPMI.
2. Neem met behulp van een micropipet 100 μl van de cellulaire suspensie, voeg toe aan de microbuis van 1,5 ml met 900 μl RPMI-medium en meng goed.
3. Breng 10 μL van de verdunde cellen over in een microbuisje, voeg 10 μL van de trypanblauwe uitsluitingskleurstof toe en meng goed.
4. Plaats 10 μL van de oplossing (stap 3.3) in de teldia van de automatische cellenteller (zie Materiaaltabel) en bepaal het celgetal.
   OPMERKING: De software van het apparaat geeft twee waarden: het totale aantal cellen en het aantal en percentage levende cellen.
5. Pas de concentratie van levende cellen aan op 3 of 5 x 10⁶ cellen/ml (V_max = 20 ml; maximale totale capaciteit is 100 x 10⁶ cellen/ml).
6. Zaai de cellen in een kolf van 75 ml met RPMI.
7. Incubeer de kolf verticaal in een bevochtigde broedmachine bij 37 °C gedurende 24 uur.
   LET OP: Trypanblauw is een mutageen en kankerverwekkend middel^35,36. Zorg ervoor dat u handschoenen draagt tijdens het tellen, zelfs buiten de capuchon. Gooi tips en vloeistoffen onmiddellijk weg in containers en was het oppervlak van de bank.
   OPMERKING: Als de verzamelde cellen kleiner zijn dan 50 x 10⁶, gebruik dan een kweekkolf van 25 ml. Het aantal cellen mag niet veel verschillen van persoon tot persoon. Het percentage levende cellen is in deze stap over het algemeen hoger dan 80%.

5. Isolatie van splenocytmicroblaasjes

1. Giet de inhoud van de kolf na 24 uur in een buis van polypropyleen of polystyreen van 50 ml.
2. Centrifugeer op 450 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur om cellen en vuil te verwijderen.
3. Bewaar na het centrifugeren 100 μl van het 1e supernatans (SN1) voor een eventuele meting van de initiële MV-concentratie om de isolatieopbrengst te berekenen. Let op het SN1-volume.
4. Centrifugeer de SN1 op 450 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
5. Gooi de pellet weg en centrifugeer opnieuw op 450 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Neem snel SN2 op en verzamel ze (let op het volume).
6. Breng SN2 over in microbuisjes van 1,8 ml met conische bodems. Houd 100 μL SN2 aan voor een eventuele meting van de initiële MV-concentratie om de isolatieopbrengst te berekenen voor het geval te veel vuil uiteindelijk de MV-meting in SN1 schaadt.
7. Voeg 5 ml RPMI-medium toe aan de pellet (cellen) en tel de splenocyten.
   OPMERKING: De celsuspensie kan ook worden gefixeerd voor karakterisering van flowcytometrie in 0,1% paraformaldehyde (eindconcentratie)³⁷.
8. Centrifugeer SN2 bij 14.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C en koel de rotor eventueel van tevoren door de lege rotor bij 4 °C te laten draaien. Deze stap genereert SN3.
9. Trek SN3 onmiddellijk uit elke microbuis door deze om te keren over een enkele steriele buis van 50 ml (onder de kap). Let op het SN3-volume.
10. Meng SN3 voorzichtig met behulp van een pipet onder de kap. Bewaar aliquots voor eventuele metingen in de suspensie.
    OPMERKING: De oplossing is nu uitgeput van MV's, maar bevat de oplosbare mediatoren en exosomen.
11. Schraap elke microbuis (gesloten) op een rek met spikes om de resuspensie van de MV's in de pellet mechanisch te bevorderen.
12. Voeg 200 μL Hank's gebalanceerde zoutoplossing zonder Ca²⁺ en Mg²⁺ (HBSS) toe aan de eerste microtube (zie materiaaltabel).
13. Resuspendeer de MV-pellet van de eerste buis door zachte aspiratie-/terugstroomcycli (~10 keer) met behulp van een micropipet van 1 ml. Zorg ervoor dat er geen schuim ontstaat, omdat dit de oxidatie van de blaasjes en andere delen in de suspensie bevordert.
14. Oogst de eerste 200 μL geresuspendeerde MV's en giet ze in de tweede buis over de pellet. Meng voorzichtig zoals hierboven beschreven, giet dan opnieuw in de derde tube en meng voorzichtig. De suspensie wordt van buis tot buis steeds troebeler. Sluit de derde buis.
15. Start het verzamelen van de volgende drie microbuisjes zoals hierboven (stap 4.14).
16. Verzamel alle geresuspendeerde MV's in een enkele (of twee) collectormicrobuisje (2 ml met conische vorm aan de onderkant). Houd 50 μl aan voor de uiteindelijke berekening van het rendement van deze stap. Let op het volume van de ophanging.
17. Centrifugeer de opvangbuis bij 14.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °C. Deze stap genereert SN4.
18. Gooi de SN4 onmiddellijk weg (giet over een supernatans verzamelbuis). Houd een hoeveelheid SN4 aan om de opbrengst van de zuiveringsstap te berekenen en suspendeer de pellet voorzichtig in 500 μl HBBS (zonder Ca²⁺ en Mg²⁺). Houd een aliquot van 50 μl van de geresuspendeerde pellet aan om het zuiveringsrendement te berekenen en noteer het volume.
19. Bewaar de geresuspendeerde pellet maximaal een maand bij 4 °C voor functionele assays onder steriele omstandigheden of bij -20 °C voor structurele assays.
20. Bereken het zuiveringsrendement (zie opmerking hieronder) van elke stap of de hele procedure door de concentratie van MV's in supernatanten en/of pelletsuspensies te meten.
    OPMERKING: Zuiveringsrendement (%): ([MV1] x SN1-volume) / ([MV4] x eindsuspensievolume) x 100.
    Deze opbrengst moet worden gerationaliseerd tot het aantal splenocyten dat uit de kweekkolf is geïsoleerd en in stap 4.4 moet worden geteld. Het zuiveringsrendement van het huidige experiment is ~70%, beginnend met 111 x 10⁶ cellen en 60 ml supernatant.
    1. Evalueer het verlies van SMV's veroorzaakt door de procedure te meten door de SMV's te meten die achterblijven in de supernatanten die verarmd zijn door SMV's en die voornamelijk exosomen bevatten (SN2 en SN4).
    2. Meet de MV-concentratie met TRPS of prothrombinase-assay³⁸ voor hoge gevoeligheid en specificiteit.
       LET OP: Oogst de MV's na centrifugatie door het snelle ondersteboven gieten van het supernatant. Wachten of het gebruik van U-vormige microbuisjes zal leiden tot MV-verlies op de wand van de microbuisjes. Gebruik nooit een micropipet om het supernatant weg te gooien; In plaats daarvan kan de korrel worden opgezogen. Vertraag het proces nooit nadat de centrifuge is gestopt. Centrifugeren met te hoge snelheid zal resulteren in contaminatie van de MV-pellet door exosomen.
       OPMERKING: De centrifugatiesnelheden en -duur zijn geoptimaliseerd voor een MV-verrijking met minimale besmetting door exosomen. Dit protocol is niet betrouwbaar om miltmonocyt/macrofaag MV's te bestuderen, omdat deze cellen kunnen fagocyten en snel hun eigen MV's kunnen heroveren³⁹. Het protocol kan niet worden gepauzeerd en later opnieuw worden opgestart vanwege verlies van cellen als gevolg van de levensvatbaarheid van de cellen.

Results

De verstrekte gegevens geven een volledig beeld van de hele procedure, waarbij gebruik wordt gemaakt van twee belangrijke dieromstandigheden: controle onbehandelde jonge C57BL/6-muizen en hun nestgenoten onderworpen aan zes intraperitoneale (IP) PG-injecties om de 2 dagen, gedurende 2 weken. Ze tonen ook de werking op afstand van een intraperitoneale PG-injectie op de miltrespons na 2 weken. Splenocytmicroblaasjes werden gekwantificeerd door middel van een protrombinase-enzymatische test...

Discussion

De huidige studie bevestigt dat de milt een belangrijke en betrouwbare bron is van MV's met fysiopathologische relevantie in vergelijking met andere bronnen zoals bloed, met een beperkt volume bij muizen. Op voorwaarde dat er voorzorgsmaatregelen worden genomen, is de methode eenvoudig in te stellen en vereist er geen dure apparatuur. Aangezien er geen andere alternatieve manier dan in vivo beoordeling beschikbaar is, lijkt het huidige model een waardevolle methode om de impact ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2 mL tubes type Eppendorf	Dutscher	54816	Conical bottom stériel microtubes
Allegra 64 R Centrifuge	Beckman Coulter
Automatic cell counter	Biorad
Bovine serum albumin	Euromedex	04-100-812-E	Prepared, filtered with 0.22 µm sieve and stored at 4 °C under sterile conditions by using the following formulas: 2 mM EDTA, 0,5% BSA and sterile PBS
CD11 (Mac-1)	e-Biosciences	45-00112-80	Conjugated to eFluor 450; λmax excitation 405 nm λmax emission 445 nm
CD16/32	BD Biosciences	553142	unconjugated
EDTA	Calbiochem	Calbiochem	S 6381-92-6
Falcon tube	Cell star	227261	50 mL
Fetal Bovine serum	Dutscher	S1810-500	Batch number = S14028S1810
Fortessa Aria	BD Biosciences		for cell sorting
Fortessa flow cytometer	Becton-Dickinson.
Fungizone	PAN biotech	P06-01050
HBSS	Gibco	14175-053	Without phenol red, without Ca+2 and Mg+2
ICAM-1	abcam	ab171123
LYG-6 (Gr-1)	BD Biosciences	566218	Conjugated to BUV395; λmax excitation 348 nm, λmax emission 395 nm
Lysis buffer erythrocytes (ACK)	Sigma		Prepared, filtered with 0.22 µm sieve and stored at 4°C under sterile conditions by using the following formulas: NH4Cl, 0.15 M (molarity), 53.491 (mw) 4 g KHCO3 1 mM (molarity) 100.115 (mw), 50 mg EDTA  0.1 mM (molarity), 292.24 (mw), 14.6 g pH: 7.2–7.4
NanoDrop 1000 spectrophotometer	Thermoscientific
PBS	Lonza	17-516F	Without Ca+2  and Mg+2
Plastic petri dish			100 mm
Polystyren tube	Falcon	352070
q-Nano Gold	iZON science
RPMI 1640 culture medium: 2 g/L glucose	PAN biotech	p04-18047	Supplemented withsupplemented with Streptomycin (100 U/mL) /Penicillin (100 U/mL), Fungizone (250 mg/mL), L-glutamine (2 mM) and FBS 10%.
Scalpels
Sieve Nylon	Falcon USA	352360	100 µm
Streptomycin/Penicillin	PAN biotech	P06-07100
Syringe			2 mL
Trypan Blue	Biorad	1450013
VCAM1	abcam	ab215380