Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Primaire culturen van rat astrocyten en microglia en hun gebruik in de studie van amyotrofische laterale sclerose

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63483

⸱

23 juni 2022

 ,  ,  , 
1Center for Laser Microscopy, Institute for Physiology and Biochemistry “Jean Giaja”, University of Belgrade Faculty of Biology

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren hier een protocol over het voorbereiden van primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia uit rattencorticosterces voor time-lapse videobeeldvorming van intracellulaire Ca2+ voor onderzoek naar pathofysiologie van amyotrofische laterale sclerose in het hSOD1G93A-rattenmodel .

Samenvatting

Dit protocol laat zien hoe primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia kunnen worden bereid uit de cortices van Sprague Dawley-ratten en hoe deze cellen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de pathofysiologie van amyotrofische laterale sclerose (ALS) in het rat hSOD1G93A-model . Ten eerste laat het protocol zien hoe astrocyten en microglia uit postnatale rattencorticosterces kunnen worden geïsoleerd en gekweekt, en vervolgens hoe deze culturen kunnen worden gekarakteriseerd en getest op zuiverheid door immunocytochemie met behulp van de gliale fibrillaire zure eiwit (GFAP) marker van astrocyten en de geïoniseerde calciumbindende adaptermolecuul 1 (Iba1) microgliale marker. In de volgende fase worden methoden beschreven voor het laden van kleurstoffen (calciumgevoelige Fluo 4-AM) van gekweekte cellen en de opnames van Ca2+ veranderingen in videobeeldexperimenten op levende cellen.

De voorbeelden van video-opnames bestaan uit: (1) gevallen van Ca2+ beeldvorming van gekweekte astrocyten die acuut zijn blootgesteld aan immunoglobuline G (IgG) geïsoleerd van ALS-patiënten, met een karakteristieke en specifieke respons in vergelijking met de respons op ATP zoals aangetoond in hetzelfde experiment. Voorbeelden tonen ook een meer uitgesproken voorbijgaande stijging van de intracellulaire calciumconcentratie opgewekt door ALS IgG in hSOD1G93A astrocyten in vergelijking met niet-transgene controles; (2) Ca2+ beeldvorming van gekweekte astrocyten tijdens een uitputting van calciumvoorraden door thapsigargin (Thg), een niet-competitieve remmer van het endoplasmatisch reticulum Ca2+ ATPase, gevolgd door opgeslagen calciuminvoer opgewekt door de toevoeging van calcium in de opnameoplossing, wat het verschil aantoont tussen Ca2+ winkelwerking in hSOD1G93A en in niet-transgene astrocyten; (3) Ca2+ beeldvorming van de gekweekte microglia die voornamelijk een gebrek aan respons op ALS IgG laat zien, terwijl ATP-toepassing een Ca2+ verandering veroorzaakte. Dit artikel benadrukt ook mogelijke kanttekeningen en waarschuwingen met betrekking tot kritische celdichtheid en zuiverheid van culturen, waarbij de juiste concentratie van de Ca2 + kleurstof- en kleurstoflaadtechnieken wordt gekozen.

Inleiding

Celkweektechnieken hebben geleid tot tal van vooruitgang op verschillende gebieden van cellulaire neurofysiologie in gezondheid en ziekte. Met name primaire celculturen, vers geïsoleerd uit het neuronale weefsel van een proefdier, stellen de experimentator in staat om het gedrag van diverse cellen in verschillende biochemische media en fysiologische opstellingen nauwkeurig te bestuderen. Het gebruik van verschillende fluorescerende fysiologische indicatoren zoals de Ca2+-gevoelige kleurstoffen in combinatie met time-lapse videomicroscopie geeft in real time beter inzicht in de cellulaire biofysische en biochemische processen.

ALS is een verwoestende neurodegeneratieve ziekte die de bovenste en onderste motorneuronenaantast 1. De ziekte heeft een complexe pathogenese van het familiale type, maar meestal van de sporadische vorm (90% van de gevallen)2. Het is bekend dat niet-cel autonome mechanismen bijdragen aan de PATHOFYSIOLOGIE VAN ALS, voornamelijk vanwege de essentiële rol van gliacellen3. ALS wordt ook goed gekarakteriseerd als een neuro-inflammatoire ziekte met betrokkenheid van humorale en cellulaire ontstekingsfactoren.

Immunoglobuline G wordt veel gebruikt als moleculaire marker bij ALS en andere neurodegeneratieve ziekten. Het bestuderen van het serumniveau van deze marker kan wijzen op de aanwezigheid en het stadium van neuro-inflammatie bij de ziekte 4,5,6, terwijl de aanwezigheid ervan in het hersenvocht kan wijzen op een doorbraak van de bloed-hersenbarrière7. IKG's werden ook geïdentificeerd als afzettingen in de motorneuronen van het ruggenmerg van ALS-patiënten7. Niettemin heeft deze benadering enkele inconsistenties aangetoond in de correlatie van het niveau van IgG's met het stadium en de kenmerken van de ziekte6.

IgG geïsoleerd uit de sera van ALS-patiënten (ALS IgG) kan een calciumrespons induceren in naïeve astrocyten8 en glutamaatafgifte in neuronen, wat wijst op een excitotoxisch effect - een kenmerk van ALS-pathologie9. Studies naar het hSOD1G93A ALS-rattenmodel (met meerdere kopieën van de menselijke SOD1-mutatie10) toonden echter een aantal markers van oxidatieve stress in gekweekte neurogliale cellen11, weefsels 12,13,14 of levende dieren 13. Het is opmerkelijk dat de astrocyten gekweekt uit het ALS-rattenmodel meer vatbaar waren voor oxidatieve stress veroorzaakt door peroxide dan de astroglia van niet-transgene nestgenoten11.

Microgliale cellen in cultuur worden op een minder duidelijke manier beïnvloed door ALS IgG. Een BV-2 microgliale cellijn vertoonde namelijk een stijging van het signaal van fluorescerende markers van oxidatieve stress als reactie op de toepassing van slechts 4/11 ALS IgG-patiëntenmonsters15. Het is bekend dat microglia deelnemen aan vele neuro-inflammatoire pathologieën, wat bijdraagt aan oxidatieve stress en late progressiefase in het niet-cel autonome mechanisme van ALS 16,17. Niettemin gaven de gegevens met ALS IgG's aan dat deze cellen mogelijk niet zo reactief zijn als astrocyten op deze humorale factoren van ALS-ontsteking. Er zijn verschillende studies uitgevoerd met primaire astrocyten van ALS-muizenmodellen, niet alleen bij pups maar ook bij symptomatische dieren, hetzij op de hersenen of op het ruggenmerg 18,19,20,21. Dit geldt ook voor microgliale primaire culturen, hoewel in mindere mate dan astrocyten en meestal uit hersengebieden in het embryonale stadium 22,23,24.

We gebruiken time-lapse video beeldvorming van Ca2+ op cellen in cultuur voornamelijk als een middel om intracellulaire transiënten van dit ion te volgen als een fysiologische marker van excitotoxiciteit. Dus door biofysische karakterisering van deze transiënten (amplitude, gebied onder transiënt, rise-time, frequentie) kan de onderzoeker experimentele diagnostische parameters verkrijgen uit verschillende cellulaire modellen van neurodegeneratie. Deze techniek biedt dus een voordeel van een kwantitatieve fysiologische beoordeling van IKG's als ziektebiomarkers. Er is een grote hoeveelheid literatuur over de rol van IgG's en Ca2+ bij de inductie van ALS. De meeste van deze studies werden uitgevoerd door ALS te induceren door patiënt IgG's in proefdierente injecteren 25,26,27,28,29, die vervolgens intracellulaire Ca2+ verhoging en IgG-afzettingen vertoonden. Een reeks studies onderzocht het effect van ALS IKG's op de motorische synaps in vitro 30,31,32. In de bovenstaande context legt de hier gepresenteerde techniek de focus op de gliacellen als belangrijke spelers in het niet-cel autonome mechanisme van ALS en kwantificeert hun potentiële excitotoxische reactie op IgG's als humorale factoren van neuro-inflammatie. Deze aanpak kan een bredere toepassing hebben bij het testen van andere humorale factoren zoals hele sera, CSF of cytokines in verschillende celkweeksystemen en in cellulaire modellen van algemene ontsteking.

Dit artikel beschrijft hoe primaire culturen van gliacellen, astrocyten en microglia kunnen worden bereid uit de cortices van Sprague Dawley-ratten en hoe deze cellen verder kunnen worden gebruikt om ALS-pathofysiologie te bestuderen met van sera afgeleide IgG van patiënten. Protocollen zijn gedetailleerd voor het laden van kleurstof van gekweekte cellen (figuur 1) en de opnames van Ca2+ veranderingen in time-lapse videobeeldvormingsexperimenten. Voorbeelden van video-opnames zullen laten zien hoe gliacellen reageren op ALS IgG in vergelijking met ATP, waarbij de laatste purinerge membraanreceptoren activeert. Voor het eerst wordt een voorbeeld getoond over hoe astrocyten geïsoleerd uit de hSOD1G93A ALS-rattenhersenen reageren met een meer uitgesproken Ca2+ respons op ALS IgG in vergelijking met niet-transgene controles en hoe dit proces te relateren aan de verschillen in Ca2+ winkelwerking. Ook is een voorbeeld getoond van calciumbeeldvorming in microgliale cellen die acuut worden uitgedaagd met ALS IgG, met slechts een bescheiden respons van intracellulair calcium.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd in overeenstemming met de EU-richtlijnen inzake de bescherming van dieren voor wetenschappelijke doeleinden en met toestemming van de Ethische Commissie van de Faculteit Biologie, Universiteit van Belgrado (goedkeuringsnummer EK-BF-2016/08). Met betrekking tot patiëntenmateriaal (sera voor IgG's) werd het verzameld voor routinematig klinisch onderzoek met toestemming van de geïnformeerde patiënt in overeenstemming met de ethische code van de World Medical Association (Verklaring van Helsinki) voor experimenten met mensen. Het protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van het Klinisch Centrum van Servië (nr. 850/6).

1. Primaire celkweekvoorbereiding

  1. Isolatie van hersenweefsel
    OPMERKING: Isolatie moet worden uitgevoerd op ijs, met behulp van ijskoude oplossingen.
    1. Gebruik pasgeboren pups van 1-3 dagen oud voor primaire neonatale celkweek33.
      OPMERKING: Voor de hier gepresenteerde studie werden Sprague Dawley hSOD1G93A en niet-transgene ratten gebruikt. Voor genotypering werden rattenstaarten gebruikt voor latere DNA-extractie en PCR.
    2. Bestrooi het hoofd van de pup met 70% ethanol en onthoofd het onmiddellijk snel met een schaar.
    3. Knip de huid open met een schaar met een kleine hoek om de schedel bloot te leggen. Open de schedel door een snede te maken van het foramen magnum naar de banen. Maak vervolgens een loodrechte middellijnsnede. Verwijder de hersenen uit de schedel en plaats deze in een petrischaal met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).
      OPMERKING: Reinig de gereedschappen tussen pups om kruisbesmetting tussen transgene en niet-transgene pups te voorkomen. Isolatie van de cortices van de rest van de hersenen moet worden gedaan onder een stereomicroscoop.
    4. Gebruik de punt van de tang om de verbindingen tussen beide hemisferen te verbreken. Scheid vervolgens de hemisferen met een gebogen tang door voorzichtig een halve bol van het midden naar de zijkant te duwen.
    5. Verwijder de hersenvliezen door ze voorzichtig te scheuren met een rechte en gebogen tang.
    6. Verwijder de hippocampus door er met een gebogen tang in te knijpen. Gooi de hippocampus weg of gebruik het voor een ander celkweekpreparaat.
      OPMERKING: Verdere stappen moeten worden uitgevoerd onder de laminaire stromingskap om steriele omstandigheden te garanderen.
  2. Weefselhomogenisatie en dissociatie
    1. Breng een cortex over in een buis van 15 ml gevuld met 3 ml koude PBS. Pipetteer de ophanging op en neer met een tip van 1 ml en voltooi 10-15 slagen totdat de suspensie homogeen wordt.
      OPMERKING: Wees zeer voorzichtig om geen bubbels te produceren in dit proces.
    2. Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 3 ml koude PBS door het op en neer te pipetteren met een punt van 1 ml. Herhaal de centrifugatiestap.
      OPMERKING: Alle oplossingen die vanaf dit punt worden gebruikt, moeten worden voorbewarmd tot 37 °C.
    3. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 2 ml complete Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en antibiotica (penicilline en streptomycine). Breng het homogenaat over in een buis van 2 ml.
    4. Laat het homogenaat door naalden van 21 G en 23 G (elk drie keer) gaan om een suspensie van afzonderlijke cellen te maken.
      OPMERKING: Wees zeer voorzichtig om geen bubbels te produceren in dit proces.
  3. Giet de celsuspensie bereid uit één cortex in een petrischaal met een diameter van 60 mm of een T25-kolf (met het oppervlak voorbehandeld met een polypeptidecoating voor de groei van hechte cellen) met 3 ml volledige DMEM. Schud de petrischaal lichtjes zodat de suspensie gelijkmatig wordt verdeeld.
  4. Kweek de cellen in de incubator in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2/95% lucht bij 37 °C.
  5. Vervang het medium 48 uur na isolatie en vervang het medium om de 3 dagen.
  6. Om de groei van astrocyten te bevorderen, wanneer cellen 70% -80% samenvloeiing bereiken, wast u ze met voorbewarmde PBS om de losjes gehechte gliacellen en sporen van FBS in het medium te verwijderen.
    1. Trypsinize de onderliggende laag astrocyten door 1 ml voorgewarmde trypsine-oplossing toe te voegen (0,25% trypsine, 0,02% EDTA in PBS, steriel gefilterd).
    2. Zet het gerecht in de couveuse op 37 °C gedurende 2-5 min.
    3. Controleer de cellen onder de microscoop. Wanneer ze beginnen los te komen, voeg dan 4 ml volledige DMEM toe.
    4. Verzamel de celsuspensie en breng deze over naar een buis van 15 ml. Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 min.
    5. Gooi het supernatant weg en resuspenseer de pellet in 1 ml volledig medium. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
    6. Vergul de cellen opnieuw met een dichtheid van 104 cellen/cm2 in 5 ml verse complete DMEM.
  7. Verander het medium om de 3 dagen. Om de aanwezigheid van andere gliaceltypen te minimaliseren, nadat astrocyten 50% confluence hebben bereikt en voorafgaand aan elke mediavervanging, wast u de cellen met volledige DMEM.
    1. Aspirateer het supernatant medium met een pipet van 1 ml en doseer het meerdere keren voorzichtig op de cellaag. Zorg ervoor dat het hele oppervlak van de cellaag bedekt is tijdens deze wasstap.
  8. Zodra de cellen 80% samenvloeiing bereiken (meestal na 14 dagen), herhaalt u de trypsinisatie en de verzameling astrocyten zoals beschreven in stap 1.6.
  9. Zaad 5 × 103 astrocyten op een cirkelvormige glazen afdekplaat van 7 mm bedekt met poly-L-lysine (50 μg/ml). Gebruik ze in experimenten na 48 uur.
  10. Om microglia te bevorderen, laat je na stap 1.7 de gliacellen een confluentlaagbereiken 34. Wanneer microgliale cellen bovenop de astrocytenlaag verschijnen (na 10-15 dagen, te herkennen aan hun kleinere, meer ovale lichamen en kortere processen), schud de petrischaal op een orbitale shaker gedurende 2 uur bij 220 tpm.
  11. Dispergeren en zaaien van microgliale cellen
    1. Was de losgemaakte en losjes bevestigde cellen lichtjes door het supernatantmedium met een pipetpunt van 1 ml aan te zuigen en meerdere keren voorzichtig op de cellaag te doseren. Zorg ervoor dat u het hele oppervlak van de cellaag bedekt tijdens deze wasstap, verzamel het medium met de losgemaakte cellen en breng het over naar een buis van 15 ml.
    2. Centrifugeer bij 500 × g gedurende 5 min. Gooi het supernatant weg en resuspendeer de pellet in 1 ml medium.
    3. Laat de celsuspensie door een naald van 21 G gaan om een eencellige suspensie te verkrijgen.
      OPMERKING: De meeste gepubliceerde methoden gebruiken trypsine of papaïne om het weefsel te dissociëren; naalden van 21 G hebben echter het voordeel dat ze de overdigestie van cellen voorkomen, waardoor een zachtere dissociatie mogelijk is.
    4. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer. Zaad 5 × 103 microgliale cellen op een cirkelvormige glazen afdekplaat van 7 mm bedekt met poly-L-lysine (50 μg/ml). Gebruik ze in experimenten na 48 uur.
      OPMERKING: Het is moeilijk om een zuivere microgliale cultuur te verkrijgen door te schudden, omdat de oligodendrocytenvoorlopercellen en astrocyten nog steeds in een variabel aantal aanwezig kunnen zijn, afhankelijk van de ervaring van de experimentator. Het immunocytochemische protocol dat wordt gebruikt om de aanwezigheid van verschillende celpopulaties in gliaculturen te schatten, is elders beschreven35.

2. Immunocytochemie

  1. Spoel de cellen verguld op coverslips in PBS, 2 x 1 min.
  2. Bevestig de cellen in 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (RT).
  3. Wassen in PBS 3 x 5 min.
  4. Incubeer in een blokkerende oplossing met 10% normaal ezelserum (NDS)/1% runderserumalbumine (BSA)/0,1% Triton X-100 gedurende 45 minuten bij RT.
    1. Voeg 50 μL van een blokkerende oplossing per afdeksel met een diameter van 10 mm toe.
  5. Bereid primaire antilichamen in 1% NDS / 1% BSA / 0,1% TritonX-100 in de volgende verdunningen: muis anti-GFAP 1: 300, geiten anti-Iba1 1:500. Incubeer de cellen met primaire antilichamen 's nachts bij +4 °C.
  6. Afspoelen in PBS, 3 x 10 min.
  7. Incubeer met de secundaire antilichamen geconjugeerd met een fluorofoor: ezel anti-muis (excitatie 488 nm [1:200)) of ezel anti-geit (geëxciteerd bij 647 nm [1:200)). Incubeer de cellen gedurende 2 uur bij RT in het donker.
  8. Wassen in PBS, 7 x 5 min.
  9. Incubeer de cellen met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI, 1:4.000) gedurende 10 minuten bij RT.
  10. Wassen in PBS 5 x 5 min.
  11. Monteer de coverslips op microscoopglaasjes met behulp van een montageoplossing; gebruik er één druppel van per coverslip.
    OPMERKING: Antilichaamverdunningen kunnen variëren afhankelijk van de producent. Gebruikers moeten optimale verdunningen voor hun experimenten bepalen.

3. Time-lapse videobeelden

OPMERKING: Oplossingen die de fluorescerende kleurstof bevatten, moeten worden beschermd tegen direct licht. Voordat u met het beeldvormingsexperiment begint, moet u ervoor zorgen dat de glazen afdekplaat niet beweegt bij het inschakelen van de perfusie.

  1. Bereiding van oplossingen en cellen
    1. Bereid extracellulaire oplossing (ECS) voor beeldvorming: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCal2, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose en 10 mM HEPES. Stel de pH in op 7,4. Zorg ervoor dat de osmolariteit 280-300 mOsm/kg is en bereid ECS voor zonder Ca2+: 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM MgCl2, 10 mM D-glucose, 10 mM HEPES en 0,1 mM EGTA.
    2. Bereid de testoplossingen: 100 μM ATP opgelost in ECS, 1 μM Thg in ECS zonder Ca2+ en 0,1 mg/ml ALS IgG in ECS8.
    3. Breng een coverslip over op een schaal met ECS om de volledige DMEM uit te wassen. Bereid de kleurstofbelastingsoplossing door 1 mM stamoplossing van Fluo-4 AM met ECS te verdunnen tot de eindconcentratie van 5 μM Fluo-4 AM.
      1. Plaats de coverslip met cellen in de kleurstoflaadoplossing gedurende 30 minuten bij RT in het donker. Was de cellen in ECS gedurende 20 min.
    4. Als cellen niet voldoende worden geladen (d.w.z. als het basale fluorescentieniveau te laag is <5% van het dynamische bereik van de camera met een belichtingstijd van meer dan 400 ms), verhoog dan de laadtijd tot maximaal 45 minuten tot 1 uur bij 37 °C. U kunt ook de Fluo-4 AM stockoplossing mengen met een gelijk volume van 20% (w/v) wasmiddel (Pluronic) in DMSO voordat u verdunt in ECS, waardoor de uiteindelijke pluronische concentratie ~0,02% wordt.
      OPMERKING: De experimentele voorbeelden van deze studie werden uitgevoerd met menselijk IgG geïsoleerd uit bloedsera van ALS-patiënten zoals eerder beschreven 4,5,11. Elk experiment werd uitgevoerd met IgG-monsters van een enkele patiënt.
  2. Videobeelden
    OPMERKING: In dit protocol werd het Video Imaging System gecombineerd met een xenon korte booglamp, een polychromatorsysteem en een omgekeerde epifluorescentiemicroscoop uitgerust met water, glycerine en olie-onderdompelingsobject. Timelapse-beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een digitaal camerasysteem.
    1. Schakel de componenten van de beeldinstallatie 15 minuten voor het experiment in om het systeem de werktemperatuur te laten bereiken.
    2. Plaats de afdeksel in de opnamekamer met 1 ml werkoplossing (ECS of ECS zonder Ca2+).
    3. Om het juiste beeldvormingsprotocol te kiezen, opent u de beeldvormingssoftware en kiest u in het deelvenster Acquisitie de filterparen voor Fluo4-AM met een excitatiegolflengte bij 480 nm, een dichroïsche spiegel bij 505 nm en een emissiegolflengte bij 535 nm.
    4. Kies het gezichtsveld en zorg ervoor dat u gedurende het hele experiment een consistent aantal cellen hebt. Pas de belichtingstijd en detectorversterking op de juiste manier aan, zodat het signaal niet verzadigd is. Kies de pseudokleurmodus voor acquisitie. Raadpleeg voor meer gedetailleerde instructies de handleiding van de fabrikant.
    5. Pas de bemonsteringsfrequentie aan op 1 Hz (1 frame per seconde).
    6. Start de beeldvorming door het basale fluorescentieniveau gedurende 3-5 minuten te verkrijgen voor de basislijnbepaling (F0). Zorg voor een constante doorstroming van de werkoplossing.
    7. Stop de stroom van de werkoplossing en schakel over naar de testoplossing voor de gewenste tijdsduur (zie ook de tijdbalken in voorbeelden van figuur 2 en figuur 3). Was de cellen tussen elke testoplossing met een constante stroom van de werkoplossing gedurende 3-5 minuten.
    8. Houd het oplossingsvolume in de opnamekamer op ~1 ml door een constante zuigkracht van de bovenkant van de oplossing te regelen (zie figuur 2E).
      OPMERKING: Om de behandeling rechtstreeks op de afgebeelde cellen toe te passen, werd een aangepast toedieningssysteem gemaakt van een glazen pipet (0,8 mm binnendiameter) op ~ 350 μm afstand en ~ 1 mm boven de cellen geplaatst, onder een hoek van 45 ° in combinatie met het oplossingsuitwisselingssysteem met knijpkleppen en een elektronische klepregelaar (zie figuur 2E).

4. Data-analyse

  1. Definieer een interessante regio (ROI) die overeenkomt met de afzonderlijke cel.
    1. Kies het frame met de hoogste signaalintensiteit (d.w.z. van de toepassing van ATP) en omcirkel één cel met behulp van de toepassing Polygonal Tool. Herhaal dit voor alle cellen in het verkregen veld. Kies vijf ROI's op de achtergrond met behulp van het gereedschap Cirkel.
    2. Als u de gemiddelde signaalintensiteit van een enkele cel en de achtergrond voor elk tijdsbestek wilt meten, selecteert u alle ROIs en gebruikt u de opdracht Multi Measure in ROI Manager in ImageJ of een gelijkwaardige opdracht in commerciële software (zie de tabel met materialen).
  2. Exporteer de gemiddelde signaalintensiteitswaarden van de ROI's als spreadsheet.
  3. Gemiddeld vijf achtergrond-ROI's en trek de gemiddelde achtergrond van elk frame af van de gemiddelde ROI-intensiteit van het frame dat tegelijkertijd is verkregen.
  4. Om de verkregen gegevens te normaliseren naar het basislijnsignaal, gebruikt u vergelijking (1):
    ΔF/F0 = (F - F0)/F0 (1)
    waarbij F de signaalintensiteit is van elk tijdsbestek na achtergrondaftrek en F0 de basislijnfluorescentie Fluo-4 is.
    OPMERKING: In dit onderzoek is een op maat gemaakte code gebruikt.
  5. Om de calciumactiviteit te analyseren, bepaalt u verschillende parameters4: de amplitude van de calciumpiek (ΔF/F0), de geïntegreerde verandering (tijdintegraal, oppervlak onder de responsregistratie) van de calciumtransiënt (ΔF/F0 × s), tijd-tot-piek-verstreken tijd vanaf het begin van de stimulatie tot het maximum van calciumtransiënt(en), stijgende tijd verstreken vanaf het begin van de stimulatie tot de waarde van ΔF/F0 die 50%-80% van de maximale amplitude (s), halve breedte-volledige breedte van een transiënt bij half-maximale amplitude (s), frequentie van reacties als ze repetitief zijn (Hz).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Karakterisering van verschillende gliaceltypen in cultuur
Het duurt meestal 15-21 dagen om astrocyten te produceren voor experimenten, terwijl microgliale cellen 10-15 dagen nodig hebben om te groeien. Immunostaining werd uitgevoerd om de celzuiverheid van de kweek te beoordelen. Figuur 1 toont de expressie van dubbele labeling van de astrocytische marker GFAP en de microgliale marker Iba1 in respectievelijke culturen.

Van calciumbeeldvorming i...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit artikel presenteert de methode van primaire celkweek als een snelle en "on the budget" tool voor het bestuderen van verschillende aspecten van cel (patho)fysiologie zoals ALS in het rat hSOD1G93A model. De techniek is dus geschikt voor studies op het niveau van één cel die kunnen worden geëxtrapoleerd en verder kunnen worden onderzocht op een hoger organisatieniveau (d.w.z. in weefselplakken of bij een levend dier). Celkweek als techniek heeft echter een paar kanttekeningen. Het is het meest cruciaal om de...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs, Wetenschap en Technologische Ontwikkeling, contract nr. 451-03-9/2021-14/ 200178, het FENS - NENS Education and Training Cluster-project "Trilaterale cursus over glia in neuro-inflammatie" en de EC H2020 MSCA RISE-subsidie # 778405. We bedanken Marija Adžić en Mina Perić voor het leveren van de immunohistochemische beelden en Danijela Bataveljić voor hulp bij het schrijven van papier.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
15 mL tubeSarstedt, Germany62 554 502
2 mL tubeSarstedt, Germany72.691
21 G needleNipro, JapanHN-2138-ET
23 G needleNipro, JapanHN-2338-ET
5 mL syringeNipro, JapanSY3-5SC-EC
6 mm circular glass coverslipMenzel Glasser, Germany630-2113
60 mm Petri dishThermoFisher Sientific, USA130181
ATPSigma-Aldrich, GermanyA9062
AxioObserver A1Carl Zeiss, Germany
Bovine serum albumineSigma-Aldrich, GermanyB6917
Calcium chlorideSigma-Aldrich, Germany2110
CentrifugeEppendorf, Germany
DAPISigma-Aldrich, Germany10236276001
D-glucoseSigma-Aldrich, Germany158968
DMEMSigma-Aldrich, GermanyD5648
Donkey-anti goat AlexaFluor 647 IgG antibodyInvitrogen, USAA-21447
Donkey-anti mouse AlexaFluor 488 IgG antibodyInvitrogen, USAA-21202
EDTASigma-Aldrich, GermanyEDS-100G
EGTASigma-Aldrich, GermanyE4378
”evolve”-EM 512 Digital Camera SystemPhotometrics, USA
Fetal bovine serum (FBS)Gibco, ThermoFisher Scientific, USA10500064
Fiji ImageJ SoftwareOpen source under the GNU General Public Licence
FITC filter setChroma Technology Inc., USA
Fluo-4 AMMolecular Probes, USAF14201
Goat anti-Iba1Fujifilm Wako Chemicals, USA011-27991
HEPESBiowest, FranceP5455
HighSpeed Solution Exchange SystemALA Scientific Instruments, USA
IncubatorMemmert GmbH + Co. KG, Germany
Magnesium chlorideSigma-Aldrich, GermanyM2393
Matlab softwareMath Works, USA
Mouse anti-GFAPMerck Millipore, USAMAB360
Mowiol 40-88Sigma-Aldrich, Germany324590
Normal donkey serumSigma-Aldrich, GermanyD9663
ParaformaldehydeSigma-Aldrich, Germany158127
Penicilin and StreptomycinThermoFisher Sientific, USA15140122
Poly-L-lysineSigma-Aldrich, GermanyP5899
Potassium chlorideSigma-Aldrich, GermanyP5405
Potassium dihydrogen phosphateCarlo Erba Reagents, Spain471686
Shaker DELFIA PlateShakePerkinElmer Life Sciencies, USA
Sodium bicarbonateSigma-Aldrich, GermanyS3817
Sodium chlorideSigma-Aldrich, GermanyS5886
Sodium phosphate dibasic heptahydrateCarl ROTH GmbHX987.2
Sodium pyruvateSigma-Aldrich, GermanyP5280
ThapsigargineTocris Bioscience, UK1138
Triton X - 100Sigma-Aldrich, GermanyT8787
TrypsinSigma-Aldrich, GermanyT4799
Vapro Vapor Pressure Osmometer 5520Wescor, ELITechGroup Inc., USA
ViiFluor Imaging SystemVisitron System Gmbh, Germany
VisiChrome Polychromator SystemVisitron System Gmbh, Germany
VisiView high performance setupVisitron System Gmbh, Germany
Xenon Short Arc lampUshio, Japan

Referenties

  1. Kiernan, M. C., et al. Amyotrophic lateral sclerosis. Lancet. 377 (9769), 942-955 (2011).
  2. Taylor, J. P., Brown, R. H. J., Cleveland, D. W. Decoding ALS: from genes to mechanism. Nature. 539 (7628), 197-206 (2016).
  3. Gleichman, A. J., Carmichael, S. T. Glia in neurodegeneration: Drivers of disease or along for the ride. Neurobiology of Disease. 142, 104957(2022).
  4. Zhang, R., et al. Evidence for systemic immune system alterations in sporadic amyotrophic lateral sclerosis (sALS). Journal of Neuroimmunology. 159 (1-2), 215-224 (2005).
  5. Saleh, I. A., et al. Evaluation of humoral immune response in adaptive immunity in ALS patients during disease progression. Journal of Neuroimmunology. 215 (1-2), 6(2009).
  6. Wang, M., et al. Evaluation of Peripheral Immune Activation in Amyotrophic Lateral Sclerosis. Frontiers in Neurology. 12, 628710(2021).
  7. Li, J. -Y., et al. Blood-brain barrier dysfunction and myelin basic protein in survival of amyotrophic lateral sclerosis with or without frontotemporal dementia. Neurological Sciences. 43 (5), 3201-3210 (2022).
  8. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from patients with sporadic amyotrophic lateral sclerosis affects cytosolic Ca2+ homeostasis in cultured rat astrocytes. Cell Calcium. 54 (1), 17-25 (2013).
  9. Andjus, P. R., Stevic-Marinkovic, Z., Cherubini, E. Immunoglobulins from motoneurone disease patients enhance glutamate release from rat hippocampal neurones in culture. Journal of Physiology. 504, 103-112 (1997).
  10. Howland, D. S., et al. Focal loss of the glutamate transporter EAAT2 in a transgenic rat model of SOD1 mutant-mediated amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (3), 1604-1609 (2002).
  11. Dučić, T., Stamenković, S., Lai, B., Andjus, P., Lučić, V. Multimodal synchrotron radiation microscopy of intact astrocytes from the hSOD1 G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Analytical Chemistry. 91 (2), 1460-1471 (2019).
  12. Popović-Bijelić, A., et al. Iron-sulfur cluster damage by the superoxide radical in neural tissues of the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 96, 313-322 (2016).
  13. Stamenković, S., et al. In vivo EPR pharmacokinetic evaluation of the redox status and the blood brain barrier permeability in the SOD1(G93A) ALS rat model. Free Radical Biology & Medicine. 108, 258-269 (2017).
  14. Stamenković, S., Dučić, T., Stamenković, V., Kranz, A., Andjus, P. R. Imaging of glial cell morphology, SOD1 distribution and elemental composition in the brainstem and hippocampus of the ALS hSOD1(G93A) rat. Neuroscience. 357, 37-55 (2017).
  15. Milošević, M., et al. Immunoglobulins G from sera of amyotrophic lateral sclerosis patients induce oxidative stress and upregulation of antioxidative system in BV-2 microglial cell line. Frontiers in Immunology. 8, 1619(2017).
  16. Boillée, S., Cleveland, D. W. Revisiting oxidative damage in ALS: microglia, Nox, and mutant SOD1. Journal of Clinical Investigation. 118 (2), 474-478 (2008).
  17. Boillée, S., et al. Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia. Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).
  18. Martínez-Palma, L., et al. Mitochondrial modulation by dichloroacetate reduces toxicity of aberrant glial cells and gliosis in the SOD1G93A rat model of amyotrophic lateral sclerosis. Journal of American Society for Experimental Neurotherapeutics. 16 (1), 203-215 (2019).
  19. Díaz-Amarilla, P., et al. Phenotypically aberrant astrocytes that promote motoneuron damage in a model of inherited amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (44), 18126-18131 (2011).
  20. Barbosa, M., et al. Recovery of depleted miR-146a in ALS cortical astrocytes reverts cell aberrancies and prevents paracrine pathogenicity on microglia and motor neurons. Frontiers in Cell Developmental Biology. 9, 634355(2021).
  21. Gomes, C., et al. Astrocyte regional diversity in ALS includes distinct aberrant phenotypes with common and causal pathological processes. Experimental Cell Research. 395 (2), 112209(2020).
  22. Kovacs, M., et al. CD34 identifies a subset of proliferating microglial cells associated with degenerating motor neurons in ALS. International Journal of Molecular Sciences. 20 (16), 3880(2019).
  23. Komiya, H., et al. Ablation of interleukin-19 improves motor function in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Molecular Brain. 14 (1), 1-13 (2021).
  24. Trias, E., et al. Emergence of microglia bearing senescence markers during paralysis progression in a rat model of inherited ALS. Frontiers in Aging Neuroscience. 10, 1-14 (2019).
  25. Pullen, A. H., Demestre, M., Howard, R. S., Orrell, R. W. Passive transfer of purified IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis to mice results in degeneration of motor neurons accompanied by Ca2+ enhancement. Acta Neuropatholgica. 107 (1), 35-46 (2004).
  26. Obál, I., et al. Intraperitoneally administered IgG from patients with amyotrophic lateral sclerosis or from an immune-mediated goat model increase the levels of TNF-α, IL-10 in the spinal cord and serum of mice. Journal of Neuroinflammation. 13 (1), 121(2016).
  27. Obál, I., et al. Experimental motor neuron disease induced in mice with long-term repeated intraperitoneal injections of serum from ALS patients. International Journal of Molecular Sciences. 20 (10), 2573(2019).
  28. Mohamed, H. A., et al. Immunoglobulin Fc gamma receptor promotes immunoglobulin uptake, immunoglobulin-mediated calcium increase, and neurotransmitter release in motor neurons. Journal of Neuroscience Research. 69 (1), 110-116 (2002).
  29. Engelhardt, J. I., Siklos, L., Appel, S. H. Altered calcium homeostasis and ultrastructure in motoneurons of mice caused by passively transferred anti-motoneuronal IgG. Journal of Neuropathology & Experimental Neurology. 56 (1), 21-39 (1997).
  30. Pagani, M. R., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Calcium signaling pathways mediating synaptic potentiation triggered by amyotrophic lateral sclerosis IgG in motor nerve terminals. Journal of Neuroscience. 26 (10), 2661-2672 (2006).
  31. Carter, J. R., Mynlieff, M. Amyotrophic lateral sclerosis patient IgG alters voltage dependence of Ca2+ channels in dissociated rat motoneurons. Neuroscience Letters. 353 (3), 221-225 (2003).
  32. Fratantoni, S. A., Weisz, G., Pardal, A. M., Reisin, R. C., Uchitel, O. D. Amyotrophic lateral sclerosis IgG-treated neuromuscular junctions develop sensitivity to L-type calcium channel blocker. Muscle & Nerve. 23 (4), 543-550 (2000).
  33. McCarthy, K. D., de Vellis, J. Preparation of separate astroglial and oligodendroglial cell cultures from rat cerebral tissue. Journal of Cell Biology. 85 (3), 890-902 (1980).
  34. Vay, S. U., et al. The impact of hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) and voltage-gated potassium KCNQ/Kv7 channels on primary microglia function. Journl of Neuroinflammation. 17 (1), 100(2020).
  35. Bijelić, D. D., et al. Central nervous system-infiltrated immune cells induce calcium increase in astrocytes via astroglial purinergic signaling. Journal of Neuroscience Research. 98 (11), 2317-2332 (2020).
  36. Kawamata, H., et al. Abnormal intracellular calcium signaling and SNARE-dependent exocytosis contributes to SOD1G93A astrocyte-mediated toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neuroscience. 34 (6), 2331-2348 (2014).
  37. Nims, R. W., Price, P. J. Best practices for detecting and mitigating the risk of cell culture contaminants. In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 53 (10), 872-879 (2017).
  38. Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. Isolation and culture of mouse cortical astrocytes. Journal of Visualized Experiments. (71), e50079(2013).
  39. Adzic, M., et al. Extracellular ATP induces graded reactive response of astrocytes and strengthens their antioxidative defense in vitro. Journal of Neuroscience Research. 95 (4), 1053-1066 (2017).
  40. Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, 198(2020).
  41. Butovsky, O., et al. Identification of a unique TGF-β-dependent molecular and functional signature in microglia. Nature Neuroscince. 17 (1), 131-143 (2014).
  42. Vankriekelsvenne, E., et al. Transmembrane protein 119 is neither a specific nor a reliable marker for microglia. Glia. 70 (6), 1170-1190 (2022).
  43. Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Primaire astrocytencultuurmicroglia cultuurcalcium imagingisolatie van gliacellenhSOD1G93A modelimmunocytochemieGFAP markerIba1 markerFluo 4 AM kleurstof
Primaire culturen van rat astrocyten en microglia en hun gebruik in de studie van amyotrofische laterale sclerose
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.