Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose

Samenvatting

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is een krachtige, niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechniek. Een opkomende toepassing is gestimuleerde Raman-histologie, waarbij tweekleurige SRS-beeldvorming bij de eiwit- en lipide Raman-overgangen wordt gebruikt om pseudo-hematoxyline- en eosinebeelden te genereren. Hier demonstreren we een protocol voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming voor weefseldiagnose.

Samenvatting

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is naar voren gekomen als een krachtige optische beeldvormingstechniek voor weefseldiagnose. In de afgelopen jaren is aangetoond dat tweekleurige SRS in staat is om hematoxyline- en eosine (H & E) -equivalente beelden te leveren die een snelle en betrouwbare diagnose van hersenkanker mogelijk maken. Een dergelijk vermogen heeft spannende intraoperatieve kankerdiagnosetoepassingen mogelijk gemaakt. Tweekleurige SRS-beeldvorming van weefsel kan worden gedaan met een picoseconde of femtoseconde laserbron. Femtoseconde lasers hebben het voordeel dat ze flexibele beeldvormingsmodi mogelijk maken, waaronder snelle hyperspectrale beeldvorming en real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming. Een spectraal-focusbenadering met getjilpte laserpulsen wordt meestal gebruikt met femtosecondelasers om een hoge spectrale resolutie te bereiken.

Tweekleurige SRS-acquisitie kan worden gerealiseerd met orthogonale modulatie en lock-in detectie. De complexiteit van pulsgefluit, modulatie en karakterisering is een knelpunt voor de wijdverspreide toepassing van deze methode. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol om de implementatie en optimalisatie van spectraal-gerichte SRS en real-time, tweekleurige beeldvorming van hersenweefsel van muizen in de epi-modus te demonstreren. Dit protocol kan worden gebruikt voor een breed scala aan SRS-beeldvormingstoepassingen die gebruikmaken van de hoge snelheid en spectroscopische beeldvormingsmogelijkheden van SRS.

Inleiding

Traditionele weefseldiagnostiek is gebaseerd op kleuringsprotocollen gevolgd door onderzoek onder een optische microscoop. Een veel voorkomende kleuringsmethode die door pathologen wordt gebruikt, is H & E-kleuring: hematoxyline kleurt celkernen een paarsblauw en eosine kleurt de extracellulaire matrix en cytoplasma roze. Deze eenvoudige kleuring blijft de gouden standaard in de pathologie voor veel weefseldiagnosetaken, met name kankerdiagnose. H&E-histopathologie, met name de bevroren sectietechniek die wordt gebruikt in een intraoperatieve setting, heeft echter nog steeds beperkingen. De kleuringsprocedure is een moeizaam proces waarbij weefsel wordt ingesloten, se....

Protocol

Alle experimentele dierprocedures werden uitgevoerd met 200 μm, vaste, gesegmenteerde muizenhersenen, in overeenstemming met het protocol (# 4395-01) goedgekeurd door het Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Washington. Wild-type muizen (C57BL/6J stam) worden geëuthanaseerd met CO₂. Vervolgens wordt een craniotomie uitgevoerd om hun hersenen te extraheren voor fixatie in 4% paraformaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing. De hersenen zijn ingebed in een 3% agarose en 0,3% gelatinemengsel en door een vibratoom in 200 μm dikke plakken gesneden.

1. Initiële uitlijning

Resultaten

Spectrale resolutie optimaliseren:
Dispersie door een materiaal wordt beïnvloed door het dispersieve medium (lengte en materiaal) en golflengte. Het veranderen van de lengte van de dispersiestaaf heeft invloed op de spectrale resolutie en de signaalgrootte. Het is een geven-en-nemen relatie die afhankelijk van de toepassing anders kan worden gewogen. De staven rekken de bundelpuls uit van breed in frequentie en smal in de tijd tot smal in frequentie en breed in de tijd. Figuur 7

Discussie

Het tweekleurige SRS-beeldvormingsschema dat in dit protocol wordt gepresenteerd, hangt af van de juiste implementatie van SRS-beeldvorming met één kleur. In SRS-beeldvorming met één kleur zijn de kritieke stappen ruimtelijke uitlijning, temporele uitlijning, modulatiediepte en faseverschuiving. Ruimtelijk combineren van de twee balken wordt bereikt door een dichroïsche spiegel. Verschillende stuurspiegels worden gebruikt voor fijnafstelling bij het verzenden van de balken naar de dichroïsche spiegel. Zodra de balken zij.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
100 mm Achromatische Lens	THORLABS	AC254-100-B	Broadband, 650 - 1.050 nm, achromatische lensbrandpuntsafstand, 100 mm
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Geconcentreerde LC Band Pass Filter, 19,2 - 23,6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatische Lens	THORLABS	AC254-200-B	Broadband, 650 - 1.050 nm, achromatische lensbrandpuntsafstand, 200 mm
Achromatische Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
Achromatische Quarter Waveplate	Union Optic	WPA4210-650-1100-M25.4	Broadband quarter waveplate
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
Dichroic Mirror	THORLABS	DMSP1000	Andere dichroics met een middengolflengte rond de 1.000 nm kunnen worden gebruikt.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)	Sigma Aldrich	472301	Oplosmiddel voor kalibratie van Raman-verschuiving. Andere oplosmiddelen met bekende Raman-pieken kunnen worden gebruikt.
Electro-optische Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	Twee EOM's zijn nodig voor orthogonale modulatie en dual-channel beeldvorming. De resonante versie wordt aanbevolen zodat een lagere aandrijfspanning kan worden gebruikt.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer en Line Driver, voor het genereren van de EOM aandrijffrequentie en de referentie naar de lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), voor het genereren van 20MHz vanuit de laseruitvoer.
Highly Dispersive Glass Rods	Union Optic	CYLROD01	Hoge dispersie H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+	Newport		Lasersysteem dat in staat is om twee gesynchroniseerde gepulseerde lasers uit te voeren (één vaste straal bij 1.040 nm en één afstembare straal, variërend van 680-1.300 nm) met een herhalingssnelheid van 80 MHz.
Lock-in Amplifier	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in versterker om SRS-signaal uit de fotodiode te extraheren. Een Zurich Instrument HF2LI of soortgelijk instrument kan ook worden gebruikt.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1.100 nm. Zilveren spiegels kunnen ook worden gebruikt.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	Delay stage voor fijne controle van de temporele overlapping van de pump- en de Stokes-lasers. Elke andere gemotoriseerde stage zou moeten werken.
Oil Immersion Condensor	Nikon	CSC1003	1,4 NA. Andere condensers met NA>1,2 kunnen worden gebruikt.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	Elke andere oscilloscoop met 400 MHz bandbreedte of hoger zou moeten werken.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	Voor het verschuiven van de fase van de modulatiefrequentie
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	Silicon PIN-diode met groot oppervlak (10 x 10 cm2). Andere diodes met groot oppervlak en lage capaciteit kunnen worden gebruikt.
Polarizing Beam Splitter	Union Optic	PBS9025-620-1000	Broadband polariserende beamsplitter
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR Right Angle Prism. Andere prisma's of retroreflector kunnen worden gebruikt.
RF Power Amplifier	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	We gebruikten een 5 mm spiegelset met zilveren coating
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	Laser scanning microscoop besturingssoftware
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25,0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1.000 nm. Voor efficiënte onderdrukking van de Stokes, kunnen twee filters nodig zijn.
Upright Microscope	Nikon	Eclipse FN1	Elke andere microscoopframe kan worden gebruikt. Als een laser scanning microscoop beschikbaar is, kan deze direct worden gebruikt. Anders moet een galvo-scanner en scanlens aan de microscoop worden toegevoegd.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	De multifoton 25X Objectief heeft een NA van 1,05. Andere soortgelijke objectieven kunnen worden gebruikt.