Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose

3.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63484

⸱

1 februari 2022

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Washington

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is een krachtige, niet-destructieve en labelvrije beeldvormingstechniek. Een opkomende toepassing is gestimuleerde Raman-histologie, waarbij tweekleurige SRS-beeldvorming bij de eiwit- en lipide Raman-overgangen wordt gebruikt om pseudo-hematoxyline- en eosinebeelden te genereren. Hier demonstreren we een protocol voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming voor weefseldiagnose.

Samenvatting

Gestimuleerde Raman-verstrooiingsmicroscopie (SRS) is naar voren gekomen als een krachtige optische beeldvormingstechniek voor weefseldiagnose. In de afgelopen jaren is aangetoond dat tweekleurige SRS in staat is om hematoxyline- en eosine (H & E) -equivalente beelden te leveren die een snelle en betrouwbare diagnose van hersenkanker mogelijk maken. Een dergelijk vermogen heeft spannende intraoperatieve kankerdiagnosetoepassingen mogelijk gemaakt. Tweekleurige SRS-beeldvorming van weefsel kan worden gedaan met een picoseconde of femtoseconde laserbron. Femtoseconde lasers hebben het voordeel dat ze flexibele beeldvormingsmodi mogelijk maken, waaronder snelle hyperspectrale beeldvorming en real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming. Een spectraal-focusbenadering met getjilpte laserpulsen wordt meestal gebruikt met femtosecondelasers om een hoge spectrale resolutie te bereiken.

Tweekleurige SRS-acquisitie kan worden gerealiseerd met orthogonale modulatie en lock-in detectie. De complexiteit van pulsgefluit, modulatie en karakterisering is een knelpunt voor de wijdverspreide toepassing van deze methode. Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol om de implementatie en optimalisatie van spectraal-gerichte SRS en real-time, tweekleurige beeldvorming van hersenweefsel van muizen in de epi-modus te demonstreren. Dit protocol kan worden gebruikt voor een breed scala aan SRS-beeldvormingstoepassingen die gebruikmaken van de hoge snelheid en spectroscopische beeldvormingsmogelijkheden van SRS.

Inleiding

Traditionele weefseldiagnostiek is gebaseerd op kleuringsprotocollen gevolgd door onderzoek onder een optische microscoop. Een veel voorkomende kleuringsmethode die door pathologen wordt gebruikt, is H & E-kleuring: hematoxyline kleurt celkernen een paarsblauw en eosine kleurt de extracellulaire matrix en cytoplasma roze. Deze eenvoudige kleuring blijft de gouden standaard in de pathologie voor veel weefseldiagnosetaken, met name kankerdiagnose. H&E-histopathologie, met name de bevroren sectietechniek die wordt gebruikt in een intraoperatieve setting, heeft echter nog steeds beperkingen. De kleuringsprocedure is een moeizaam proces waarbij weefsel wordt ingesloten, sectie, fixatie en kleuring1. De typische doorlooptijd is 20 minuten of langer. Het uitvoeren van H & E tijdens bevroren secties kan soms een grotere uitdaging worden wanneer meerdere secties tegelijk worden verwerkt vanwege de noodzaak om cellulaire kenmerken of groeipatronen in 3D te evalueren voor margebeoordeling. Bovendien vereisen intraoperatieve histologische technieken bekwame technici en clinici. Beperking van het aantal door de raad gecertificeerde pathologen in veel ziekenhuizen is in veel gevallen een beperking voor intraoperatief overleg. Dergelijke beperkingen kunnen worden verlicht met de snelle ontwikkelingsinteresses in digitale pathologie en op kunstmatige intelligentie gebaseerde diagnose2. De H&E-kleuringsresultaten zijn echter variabel, afhankelijk van de ervaring van de technicus, wat extra uitdagingen oplevert voor computergebaseerde diagnose2.

Deze uitdagingen kunnen mogelijk worden aangepakt met labelvrije optische beeldvormingstechnieken. Een van die technieken is SRS-microscopie. SRS maakt gebruik van gesynchroniseerde gepulseerde lasers - pomp en Stokes - om moleculaire trillingen met een hoog rendement te prikkelen3. Recente rapporten hebben aangetoond dat SRS-beeldvorming van eiwitten en lipiden H & E-equivalente beelden kan genereren (ook bekend als gestimuleerde Raman-histologie of SRH) met intact vers weefsel, wat de noodzaak van weefselverwerking omzeilt, de tijd die nodig is voor diagnose aanzienlijk verkort en intraoperatief is aangepast4. Bovendien kan SRS-beeldvorming 3D-beelden leveren, wat extra informatie biedt voor diagnose wanneer 2D-beelden onvoldoende zijn5. SRH is onbevooroordeeld en genereert digitale beelden die direct beschikbaar zijn voor computergebaseerde diagnose. Het komt snel naar voren als een mogelijke oplossing voor intraoperatieve kankerdiagnose en tumormargeanalyse, vooral bij hersenkanker 6,7,8. Meer recent is SRS-beeldvorming van chemische veranderingen van weefsel ook voorgesteld om nuttige diagnostische informatie te bieden die clinici verder kan helpen bij het stratificeren van verschillende soorten kanker of stadia9.

Ondanks het enorme potentieel in weefseldiagnosetoepassingen, is SRS-beeldvorming meestal beperkt tot academische laboratoria die gespecialiseerd zijn in optica vanwege de complexiteit die gepaard gaat met het beeldvormingsplatform, dat ultrasnelle lasers, de laserscanmicroscoop en geavanceerde detectie-elektronica omvat. Dit protocol biedt een gedetailleerde workflow om het gebruik van een gemeenschappelijke femtoseconde laserbron voor real-time, tweekleurige SRS-beeldvorming en het genereren van pseudo-H & E-beelden van hersenweefsel van muizen te demonstreren. Het protocol heeft betrekking op de volgende procedures:

Optimalisatie van uitlijning en tjirp
De meeste SRS-beeldvormingsschema's gebruiken picoseconde- of femtosecondelasers als excitatiebron. Bij femtoseconde lasers is de bandbreedte van de laser veel groter dan de Raman lijnbreedte. Om deze beperking te overwinnen, wordt een spectrale focusbenadering gebruikt om de femtosecondelasers naar een picoseconde tijdschaal te tsjilpen om een smalle spectrale resolutie10 te bereiken. Optimale spectrale resolutie wordt alleen bereikt wanneer het temporele getjilp (ook bekend als de groepsvertragingsdispersie of gewoon dispersie) goed is afgestemd op de pomp en de Stokes-lasers. De uitlijningsprocedure en de stappen die nodig zijn om de dispersie van de laserstralen te optimaliseren met behulp van zeer dispersieve glazen staven worden hier gedemonstreerd.

Frequentie kalibratie
Een voordeel van spectraal focus SRS is dat de Raman excitatie snel kan worden afgestemd door de tijdsvertraging tussen de pomp en de Stokes lasers te veranderen. Een dergelijke afstemming biedt snelle beeldvorming en betrouwbare spectrale acquisitie in vergelijking met het afstemmen van lasergolflengten. De lineaire relatie tussen excitatiefrequentie en tijdvertraging vereist echter externe kalibratie. Organische oplosmiddelen met bekende Raman-pieken worden gebruikt om de Raman-frequentie te kalibreren voor spectraalfocusSRS.

Real-time, tweekleurenbeeldvorming
Het is belangrijk om de beeldvormingssnelheid in weefseldiagnosetoepassingen te verhogen om de tijd te verkorten die nodig is voor het analyseren van grote weefselmonsters. Gelijktijdige tweekleurige SRS-beeldvorming van lipiden en eiwitten voorkomt de noodzaak om de laser of tijdvertraging af te stemmen, waardoor de beeldvormingssnelheid meer dan twee keer toeneemt. Dit wordt bereikt door gebruik te maken van een nieuwe orthogonale modulatietechniek en tweekanaals demodulatie met een lock-in versterker11. Dit artikel beschrijft het protocol voor orthogonale modulatie en dual-channel beeldacquisitie.

Epi-mode SRS-beeldvorming
De meeste SRS-beeldvorming die tot nu toe is getoond, wordt uitgevoerd in transmissiemodus. Epi-mode beeldvorming detecteert backscattered fotonen uit weefsel12. Voor pathologietoepassingen kunnen chirurgische monsters vrij groot zijn. Voor beeldvorming in transmissiemodus is vaak weefselsectie nodig, wat ongewenst extra tijd vereist. Epi-modus beeldvorming kan daarentegen werken met intacte chirurgische monsters. Omdat hetzelfde objectief wordt gebruikt om teruggekaatst licht te verzamelen, is het ook niet nodig om een condensor met een hoog numeriek diafragma uit te lijnen die nodig is voor transmissiebeeldvorming. Epi-modus is ook de enige optie wanneer weefselsectie moeilijk is, zoals bij bot. Eerder hebben we aangetoond dat voor hersenweefsel epi-mode beeldvorming superieure beeldvormingskwaliteit biedt voor weefseldikte > 2 mm13. Dit protocol maakt gebruik van een polariserende bundelsplitser (PBS) om verstrooide fotonen te verzamelen die door weefsel zijn gedepolariseerd. Het is mogelijk om meer fotonen te verzamelen met een ringvormige detector ten koste van de complexiteit van aangepaste detectorassemblage12. De PBS-aanpak is eenvoudiger te implementeren (vergelijkbaar met fluorescentie), waarbij de standaard fotodiode al wordt gebruikt voor detectie van transmissiemodi.

Pseudo-H&E-beeldgeneratie
Zodra tweekleurige SRS-afbeeldingen zijn verzameld, kunnen ze opnieuw worden ingekleurd om H & E-kleuring te simuleren. Dit artikel demonstreert de procedure voor het converteren van lipide- en eiwit-SRS-afbeeldingen naar pseudo-H & E SRS-beelden voor pathologietoepassingen. Het experimentele protocol beschrijft kritieke stappen die nodig zijn om SRS-beelden van hoge kwaliteit te genereren. De hier getoonde procedure is niet alleen van toepassing op weefseldiagnose, maar kan ook worden aangepast voor vele andere hyperspectrale SRS-beeldvormingstoepassingen zoals beeldvorming van geneesmiddelen en metabole beeldvorming14,15.

Algemene systeemvereisten
Het lasersysteem voor dit protocol moet 2 gesynchroniseerde femtoseconde laserstralen kunnen produceren. Systemen zijn idealiter voorzien van een Optische Parametrische Oscillator (OPO) voor brede golflengteafstemming van een van de laserstralen. De opstelling in dit protocol maakt gebruik van een commercieel lasersysteem Insight DS + dat twee lasers uitvoert (een vaste straal bij 1.040 nm en een op OPO gebaseerde afstembare straal, variërend van 680 tot 1.300 nm) met een herhalingsfrequentie van 80 MHz. Laserscanmicroscopen, hetzij van grote microscoopfabrikanten of zelfgebouwd, kunnen worden gebruikt voor SRS-beeldvorming. De gebruikte microscoop is een rechtopstaande laserscanmicroscoop gebouwd bovenop een commercieel rechtopstaand microscoopframe. Een paar 5 mm galvo spiegels worden gebruikt om de laserstraal te scannen. Voor gebruikers die ervoor kiezen om een zelfgebouwde laserscanmicroscoop te gebruiken, raadpleegt u een eerder gepubliceerd protocol voor de constructie van een laserscanmicroscoop16.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimentele dierprocedures werden uitgevoerd met 200 μm, vaste, gesegmenteerde muizenhersenen, in overeenstemming met het protocol (# 4395-01) goedgekeurd door het Institute of Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Washington. Wild-type muizen (C57BL/6J stam) worden geëuthanaseerd met CO2. Vervolgens wordt een craniotomie uitgevoerd om hun hersenen te extraheren voor fixatie in 4% paraformaldehyde in fosfaat-gebufferde zoutoplossing. De hersenen zijn ingebed in een 3% agarose en 0,3% gelatinemengsel en door een vibratoom in 200 μm dikke plakken gesneden.

1. Initiële uitlijning

OPMERKING: Zorg ervoor dat de bundelgrootte en divergentie van beide armen op elkaar zijn afgestemd voor de beste gevoeligheid en resolutie. Collimeer de pomp en de Stokes-stralen en pas hun afmetingen aan voordat ze de laserscanmicroscoop betreden. Gebruik hiervoor een paar achromatische lenzen voor elke straal voordat u ze combineert op de dichroïsche spiegel. Draag altijd een goede laserbril voor het uitlijnen van de straal.

  1. Bundelcollimatie
    1. Installeer een paar achromatische lenzen voor de pompstraal. Gebruik als uitgangspunt een 100 mm lens en 200 mm lens om de laserstraalgrootte 2-voudig te vergroten. Zorg ervoor dat de afstand van de twee lenzen ongeveer 300 mm is. Lijn de pompstraal uit door het midden van beide lenzen.
    2. Plaats een spiegel achter de tweede lens om de straal naar een muur (>1 m afstand) te sturen. Wees voorzichtig bij het verzenden van de balk over lange afstanden. Traceer de straal van de spiegel naar de muur met een IR-kaart en controleer of de straal van grootte verandert. Collimeer de bundel als de bundel in grootte verandert als functie van de afstand.
      1. Als de bundel convergeert (afnemende grootte met voortplanting), plaatst u de twee lenzen dichter bij elkaar.
      2. Als de bundel divergeert (groter wordt met de voortplanting), plaatst u de twee lenzen verder uit elkaar. Pas de afstand aan totdat de bundel is gecollimeerd.
    3. Herhaal stap 1.1.1 en 1.1.2 voor de Stokes-bundel om de bundel te collimeren.
  2. Aanpassing van de bundelgrootte
    1. Als er een beam profiler beschikbaar is, meet dan de gecollimeerde bundelgrootte voor elke straal. U kunt ook de bundelgrootte schatten met behulp van de IR-kaart en een liniaal om een straaldiameter van 4-5 mm te verkrijgen.
    2. Als de bundelgrootte te klein of te groot is, wijzigt u het lenspaar dat in stap 1.1 is gebruikt. Pas het lenspaar aan totdat beide bundels een diameter van 4-5 mm hebben.
      OPMERKING: De vergroting van de bundel is de verhouding tussen de brandpuntsafstand van de tweede lens en de eerste lens (f2/f1).
  3. Ruimtelijke overlap
    OPMERKING: SRS-beeldvorming vereist dat beide laserstralen in ruimte en tijd worden gecombineerd om moleculaire trillingen op te wekken. Een schema van de spectraal-focus SRS-beeldvorming is weergegeven in figuur 1.
    1. Combineer de twee laserstralen door een dichroïsche spiegel te installeren met verschillende stuurspiegels voor aanpassing. Optimaliseer de ruimtelijke overlap van de pomp en Stokes door de bundels na de dichroïsche spiegel op twee verschillende posities ver uit elkaar (~ 1 m) te bewaken. Pas de stuurspiegel iteratief aan voor de dichroïsche en de dichroïsche spiegel om de Stokes-straal uit te lijnen met de pompstraal.
      OPMERKING: Als de twee balken elkaar op beide posities ruimtelijk overlappen, overlappen ze elkaar voldoende.
    2. Zorg ervoor dat de gecombineerde stralen naar het midden van de scanspiegels van de laserscanmicroscoop worden gestuurd door een paar stuurspiegels aan te passen wanneer de scanspiegels zich in de geparkeerde positie bevinden. Zorg ervoor dat beide bundels door het midden van het microscoopobjectief en de condensor reizen.
    3. Gebruik na de condensor een ander paar lenzen met brandpuntsafstanden van respectievelijk 100 mm en 30 mm om de uitgezonden straal door te geven aan de fotodiode. Zorg ervoor dat beide balken zich in de fotodiode bevinden en installeer twee laagdoorlaatfilters om de gemoduleerde Stokes-straal te blokkeren.

2. SRS-signaal detectie

  1. Elektrooptische modulatie (EOM)
    OPMERKING: EOM van 20 MHz wordt gebruikt om de Stokes-amplitude te moduleren. Zoals later besproken, is de EOM afgeleid van de 80 MHz laserpulstrein, die nodig is voor orthogonale modulatie. Andere modulatiefrequenties kunnen worden gebruikt als alleen eenkleurige of hyperspectrale SRS wordt uitgevoerd. In dat geval is synchronisatie van modulatiefrequentie naar laserfrequentie niet nodig. Een frequentiegenerator met een RF-eindversterker kan worden gebruikt om de EOM aan te drijven. Als gevolg hiervan kunnen stappen 2.1.1-2.1.4 worden overgeslagen.
    1. Plaats een beam sampler in het Stokes beam pad om 10% van de beam op te pikken en stuur deze naar een snelle fotodiode om de 80 MHz pulstrein te detecteren.
      OPMERKING: Het fotodiodesignaal wordt naar een frequentieverdeler gestuurd om een 20 MHz TTL-uitgang te genereren. Deze uitgang wordt verder in een fanoutbuffer gestuurd om de uitgang te repliceren in vier identieke 20 MHz-uitgangen. Een van de uitgangen wordt gebruikt om de oscilloscoop te activeren.
    2. Neem een van de uitgangen van de fanout buffer en filter deze met een bandpass filter om een 20 MHz sinusoïdale golf te krijgen. Gebruik een RF-verzwakker om de piek-piekspanning van de uitgang aan te passen tot ~ 500 mV.
    3. Stuur de resulterende uitgang naar een faseverschuiver, die een fijne aanpassing van de RF-fase met een spanningsbron mogelijk maakt. Stuur deze uitgang naar een RF eindversterker en sluit de uitgang van de versterker aan op de EOM.
    4. Deblokkeer de Stokes-bundel en optimaliseer de modulatiediepte van EOM1 door een fotodiode in het bundelpad te plaatsen. Pas de EOM-spanning en kwartgolfplaat aan totdat de modulatiediepte (dal-piekverhouding) bevredigend lijkt.
      OPMERKING: Bij 20 MHz modulatie (1/4 van de laserherhalingssnelheid) worden twee pulsen verwacht om de 50 ns.
  2. Tijdelijke overlap
    OPMERKING: Tijdelijke overlap van de pomp en Stokes wordt bereikt door een van de twee laserpulstreinen uit te stellen met een retroflector gemonteerd op een vertragingstrap (figuur 1 laat zien dat de Stokes vertraagd zijn). Grove overlap wordt bewaakt met de oscilloscoop en fijne overlap wordt bewaakt door het SRS-signaal. Fijne temporele overlap kan ook worden bereikt met een autocorrelator indien beschikbaar.
    1. Plaats een fotodiode achter de dichroïsche spiegel om de laserstraal te detecteren. Blokkeer eerst de Stokes-balk. Zoom in op een van de pomppulspieken op de oscilloscoop. Plaats een verticale cursor om de temporele positie van deze piek met de oscilloscoop te markeren.
    2. Blokkeer de pompbalk en deblokkeer de Stokes-balk. Vertaal de vertragingsfase om de piekpositie op de oscilloscoop tijdelijk af te stemmen op de gemarkeerde positie in de vorige stap. Zie figuur 2 voor een weergave van de tijdelijke overlap van twee balken.
      1. (OPTIONEEL) Als de translatie van de vertragingsfase onvoldoende is om de twee stralen tijdelijk overeen te laten komen, verplaatst u de vertragingsfase naar het midden van het bewegingsbereik.
      2. Bereken de vertragingsafstand die nodig is om de twee bundels overeen te laten komen door het temporele verschil tussen de twee bundels te nemen en het verschil te vermenigvuldigen met de lichtsnelheid om de hoeveelheid afstand te vinden die nodig is om de twee bundels tijdelijk overeen te laten komen.
      3. Verleng het straalpad van de snellere bundel of verkort het bundelpad van de langzamere bundel om de temporele vertraging dienovereenkomstig ongeveer aan te passen.
    3. Bereid een microscoopglaasje voor met DMSO en dubbelzijdige tape als afstandhouder om het monster tussen de dia en een coverslip te houden.
    4. Plaats het monster op de microscoop met de coverslipzijde naar het microscoopobjectief gericht. Verander de microscoop in brightfield-verlichting en observeer het monster van het oculair. Zoek de focus van het monster door eerst de focus te vinden op zowel de bovenste als de onderste laag luchtbellen op de glas-tape-interface en verplaats vervolgens de focus om tussen de twee lagen tape te zijn.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat de laserstralen zijn geblokkeerd voordat u in het oculair kijkt.
    5. Stel de instelbare bundeluitgang in op 798 nm. Stel op basis van de optische doorvoer van de condensor het optische vermogen in op ~ 40 mW elk voor de pomp en Stokes-stralen op de objectieve focus.
    6. Open ScanImage in MATLAB (of andere scansoftware die de microscoop bestuurt) en klik op de knop FOCUS om te beginnen met scannen.
      OPMERKING: De laserstralen worden rastergescand door het monster om een afbeelding te genereren. De laagfrequente signaaluitgang van de fotodiode (<100 kHz) wordt rechtstreeks naar kanaal 1 van de data-acquisitiekaart (het DC-kanaal genoemd) gestuurd. De hoogfrequente uitgang (>100 kHz) van de fotodiode wordt naar de lock-in versterker gestuurd en de X-uitgang van het lock-in versterkersignaal wordt naar kanaal 2 van de data-acquisitiekaart (het AC-kanaal genoemd) gestuurd.
    7. Pas de stuurspiegel voor de galvo-scanner aan om het DC-signaal op het kanaal 1-display te centreren. Verplaats de gemotoriseerde vertragingstrap en observeer nauwgezet de vergrendelingsuitgang die wordt weergegeven op het display van kanaal 2 (d.w.z. AC-kanaal).
      OPMERKING: Wanneer de pomp en Stokes in de tijd samenvallen, verschijnt er een signaal op het AC-kanaal. Het is handig om de kleurschaal van het AC-kanaal aan te passen om de kleine intensiteitsverandering weer te geven.
    8. Maximaliseer de ac-signaalintensiteit door de tijdvertraging nauwkeurig aan te passen. Pas de dichroïsche spiegel aan om het SRS-signaal op het AC-kanaal te centreren (terwijl het DC-kanaal gecentreerd blijft). Pas de fase van de lock-in versterker aan om het signaal te maximaliseren. Zie figuur 3 voor een bevredigend signaal.

3. Spectrale resolutie optimalisatie

OPMERKING: De pomp en Stokes-bundels die het monster bereiken, moeten dezelfde hoeveelheid groepsvertragingsdispersie (GDD) hebben om de spectrale resolutie te maximaliseren. De dispersie is sterk afhankelijk van de experimentele opstelling. De hier beschreven experimentele opstelling maakt gebruik van femtosecondepulsen bij 1.040 nm en 800 nm als respectievelijk Stokes en pomp. Dichte vuursteenglasstaven (H-ZF52A) worden gebruikt als het puls-stretching medium.

  1. Steek 48 cm van een zeer dispersieve glazen staaf (H-ZF52A of gelijkwaardig dicht vuursteenglas) in het 800 nm bundelpad. Schat de GDD met Eq (1):
    figure-protocol-1 (1)
    OPMERKING: van verschillende glasmaterialen op verschillende golflengten kan worden gevonden in de brekingsindexdatabasebron. Zo heeft de H-ZF52A een van 220,40 fs2/mm bij 800 nm. De totale GDD is 105792 fs2.
  2. Bereken hoeveel cm van de dispersieve glazen staaf nodig is om toe te voegen aan het 1.040 nm bundelpad om overeen te komen met de GDD van de pomp. Plaats de juiste lengte van dispersieve glazen staven in het bundelpad van 1.040 nm om ongeveer overeen te komen met de GDD van de 800 nm-bundel. Merk op dat de toevoeging van glazen staven de tijdelijke overlap van de twee balken zal veranderen en dat aanpassing van de vertraging nodig kan zijn.
  3. Kalibratie van spectrale resolutie
    1. Maak een microscoopglaasje met DMSO. Plaats de dia op de microscoop en controleer de kracht van de bundels die uit de microscoopcondensor komen. Pas het vermogen dienovereenkomstig aan om ~ 40 mW elk bij monsterfocus te hebben.
    2. Open ScanImage van MATLAB. Vind het maximale SRS-signaal door door de vertragingsfase te scannen, die overeenkomt met de 2.913 cm-1 Raman-piek van DMSO. Schat de fasepositie op basis van de vorige fasepositie met de toegenomen optische padlengte als gevolg van het inbrengen van staafjes. Richt de ruimtelijke overlap van de balk opnieuw uit vanwege de kleine afwijking van de balk wanneer glazen staven worden toegevoegd.
    3. Sla een hyperspectrale SRS-scan op door achtereenvolgens een reeks SRS-beelden te maken terwijl u het gemotoriseerde podium verplaatst.
      OPMERKING: Het bereik van de vertragingsscan omvat twee Raman-pieken, overeenkomend met respectievelijk de Raman-pieken van 2.913 cm-1 en 2.994 cm-1 van DMSO. Deze twee overgangen worden waargenomen bij gebruik van een 800 nm pomp en 1.040 nm Stokes laser.
    4. Zet de SRS-spectra van de DMSO-oplossing uit met behulp van ImageJ of MATLAB. Monteer de grote DMSO 2.913 cm-1 piek op een Gaussische of Lorentziaanse functie in MATLAB om de volledige breedte bij half maximum (FWHM) van de piek te berekenen.
      OPMERKING: Representatieve resultaten zijn weergegeven in figuur 4. Als er slechts één brede piek aanwezig is, betekent dit dat ofwel de spectrale resolutie te slecht is om de twee pieken te onderscheiden en er meer glazen staven nodig zijn, ofwel dat het gescande bereik te klein was om de tweede piek te detecteren. Typisch is een acceptabele spectrale resolutie DMSO ~ 20-25 cm-1 wanneer glazen stavenlengte van >60 cm worden gebruikt. Een lagere resolutie wordt vaak gebruikt voor weefselbeeldvorming om te ruilen voor hogere signalen met kortere pulsen17.
  4. (OPTIONEEL) Gebruik een autocorrelator of een FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) om de pulsduur van elke arm te bepalen om precies de hoeveelheid GDD en de lengte van de staven te berekenen die nodig zijn om overeen te komen met de GDD tussen de pomp en de Stokes.
  5. Herhaal stap 3.3.2-3.3.4 voor verschillende staaflengtes op de Stokes-bundel om de optimale spectrale resolutie te vinden, wat betekent dat de beste GDD-match experimenteel is gevonden. Gebruik meerdere sets glazen staven van verschillende lengte om een optimale spectrale resolutie te bereiken.

4. Signaal-ruis (SNR) karakterisering

  1. Zorg ervoor dat stap 4.2 wordt uitgevoerd na volledige ruimtelijke en temporele uitlijning.
  2. Verkrijg een SRS-afbeelding die overeenkomt met de 2.913 cm-1 Raman-piek van DMSO. Open de afbeelding in ImageJ en selecteer een klein gebied in het midden van het frame. Gebruik de meetfunctie om het gemiddelde en de standaarddeviatie van waarden in het geselecteerde gebied te berekenen.
  3. Deel de gemiddelde waarde van het geselecteerde gebied door de standaarddeviatie om de SNR-waarde te vinden, zoals in Eq (2).
    figure-protocol-2 (2)
    OPMERKING: Een goede SNR voor het systeem (met een lock-in tijdconstante van 4 μs) met DMSO bij 40 mw/40 mw bij focus voor beide armen is >800. Lagere concentraties DMSO of een lager vermogen kunnen worden gebruikt voor een nauwkeurigere schatting van de SNR als de data-acquisitiekaart een beperkte bitdiepte heeft.
  4. Als de SNR te laag is, richt u de laserpulsen opnieuw uit om ruimtelijke overlap, temporele overlap, afstemming van bundelgrootte/collimatie en/of dispersie te optimaliseren. Voor een objectief met een aberratiecorrectiekraag optimaliseert u het signaal door de correctiehalsband aan te passen.

5. Kalibratie van de frequentieas

OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd om de positie van de vertragingsfase te relateren aan de gescande Raman-overgang. Zorgvuldige selectie van oplosmiddelen is vereist om een geschikte "Raman-liniaal" te genereren. DMSO is een effectief oplosmiddel voor CH-bindingen omdat het twee scherpe Raman-pieken heeft bij 2.913 cm-1 en 2.994 cm-1.

  1. Sla een hyperspectrale scan op met het delay-stage bereik dat de 2.913 cm-1 en 2.994 cm-1 Raman-pieken van DMSO bestrijkt. Sla de faseposities op die overeenkomen met de hyperspectrale gegevensset.
    OPMERKING: De globale maximale piek van het spectrum komt overeen met de DMSO 2.913 cm-1 Raman-verschuiving en de tweede maximale piek komt overeen met de DMSO 2.994 cm-1 Raman-verschuiving .
  2. Voer lineaire regressie uit voor de podiumposities en Raman verschuift op 2.913 cm-1 en 2.994 cm-1. Gebruik de lineaire regressievergelijking die de fasepositie relateert aan de Raman-verschuiving en converteer de vertragingsposities naar de overeenkomstige Raman-frequenties.

6. Orthogonale modulatie en tweekleurenbeeldvorming

OPMERKING: De orthogonale modulatiestap is alleen nodig wanneer real-time tweekleurenbeeldvorming nodig is. Een schema van dit schema is weergegeven in figuur 5. De orthogonale modulatie maakt gebruik van een paar EOM's aangedreven op een kwart van de laserfrequentie (20 MHz voor 80 MHz laser) met een 90 ° faseverschuiving tussen de twee. Deze orthogonale modulatiestap kan worden overgeslagen voor single-color SRS-beeldvorming of hyperspectrale SRS-beeldvorming.

  1. EOM1 modulatie
    1. Installeer een PBS (PBS2), een kwartgolfplaat (QWP2) en een tweede EOM (EOM2) in het Stokes-bundelpad na de eerste EOM. Koppel de signaalingang los van EOM2. Sluit de signaalingang aan op EOM1 en schakel deze in.
    2. Moduleer de Stokes-bundel (gefixeerd op 1.040 nm) op 20 MHz (f0/4) door de bundel door de eerste EOM te sturen. Pas de kanteling en positie van EOM1 aan om ervoor te zorgen dat de straal recht en gecentreerd door het EOM-kristal slaat.
    3. Bewaak de modulatiediepte door beide polarisaties uit PBS1 met twee fotodiodes te observeren en de modulatie op een oscilloscoop weer te geven.
    4. Pas de QWP1-, EOM1-spanning en fase van de 20 MHz-ingang aan (met behulp van een fasedraaier) om de modulatiediepte van de verzonden bundel te optimaliseren om dicht bij 100% te liggen. Zie figuur 2B voor een illustratie van een goede modulatiediepte.
  2. EOM2 modulatie
    1. Koppel EOM1 los en sluit EOM2 aan.
    2. Stuur de hoogspanningsuitgang van de tweede versterker op 20 MHz naar EOM2. Pas de kanteling en positie van EOM2 aan om ervoor te zorgen dat de straal recht en gecentreerd door het EOM-kristal slaat.
    3. Controleer nogmaals de modulatiediepte door te kijken naar beide polarisaties die uit PBS2 komen met een oscilloscoop. Pas de QWP2-, EOM2-spanning en de fasedraaier indien nodig aan om bijna 100% modulatie voor beide polarisaties te bereiken.
    4. Zorg ervoor dat de pulstreinmodulatie een faseverschuiving van 90° heeft ten opzichte van de eerste modulatie.
      OPMERKING: Als de twee pomppulstreinen niet 90° orthogonaal zijn, zal overspraak tussen de twee kanalen een probleem zijn.
    5. Test de orthogonaliteit van de modulatie door zowel EOM1 als EOM2 in te schakelen en aan te sluiten. Controleer beide polarisaties die door PBS2 worden gesplitst met een oscilloscoop. Optimaliseer EOM1 en EOM2 afzonderlijk opnieuw als de pulstrein na de tweede PBS niet lijkt op figuur 2C.
    6. Installeer een 20 mm birefringent kwartskristal (BRC) en HWP stroomafwaarts van EOM2. Sluit beide EOM's tegelijk aan en bewaak de pulstrein zodanig dat deze lijkt op Figuur 2D.
      OPMERKING: Voor het getjilp dat in dit experiment wordt gebruikt, induceert 20 mm BRC een tijdsvertraging die overeenkomt met een 80 cm-1 Raman-verschuiving . Een andere BRC-lengte kan nodig zijn als een ander getjilp wordt gebruikt.
  3. Calibratie
    1. Kalibreer het systeem met DMSO door signalen van de lock-in versterker X- en Y-kanaaluitgang te detecteren (verzonden naar kanalen 2 en 3 van de data-acquisitiekaart).
    2. Controleer of de signalen die worden gegenereerd door de 2.913 cm-1 piek van de snellere polarisatie en die van de langzamere polarisatie bijna 90° uitfase zijn op de lock-in versterker. Als dit niet het geval is, past u de EOM-uitlijning aan totdat de twee signalen bijna 90° uit-fase zijn.
    3. Zodra de kalibratie is voltooid, zoekt u de vertragingspositie die de eiwitovergang op 2.930 cm-1 voor een van de orthogonale stralen onderzoekt. Zorg ervoor dat de andere polarisatie de lipideovergang van 2.850 cm-1 aftast.

7. Epi-mode SRS-beeldvorming

OPMERKING: In het beeldvormingsschema van de transmissiemodus richt het objectief de laser op het monster en vervolgens stuurt een condensorlens de verzonden straal naar een fotodiode voor lock-in detectie. In het epi-modus beeldvormingsschema wordt licht dat door het monster wordt teruggekaatst en gedepolariseerd, door het scherpstelobjectief opgevangen en geïsoleerd met behulp van een polariserende bundelsplitser. De geïsoleerde en teruggekaatste fotonen worden via een paar relaislenzen naar een fotodiode gestuurd voor lock-in detectie. Figuur 6 toont het epi-mode beeldvormingsschema.

  1. Installeer een HWP voordat de straal de microscoop binnenkomt om de polarisatie van de bundel die in de microscoop gaat te veranderen. Plaats een PBS boven het objectief om de gedepolariseerde teruggekaatste straal de detector te laten bereiken.
  2. Gebruik een paar lenzen bestaande uit een 75 mm achromatlens en een 30 mm asferische lens om de backscattered fotonen van het achterste diafragma van het objectief door te geven aan de fotodetector. Monteer de detector om het teruggekaatste licht te verzamelen dat door de PBS wordt aangestuurd. Installeer een filter om te voorkomen dat de gemoduleerde straal de detector binnenkomt.
  3. Plaats het weefselmonster onder het doel. Omdat de condensor niet nodig is voor epi-modus beeldvorming, verwijdert u deze als er meer ruimte nodig is.
  4. Beeldvorming
    1. Blokkeer de balk met een rolluik; schijn een witte lichtbron vanaf de zijkant op het monster; en gebruik brightfield om objectieve focus te vinden.
    2. Deblokkeer beide bundels en gebruik de vooraf gekalibreerde vertragingsposities om lipide- en eiwit-SRS-beelden te verkrijgen van weefsel uit de twee uitgangen van de lock-in versterker.
    3. Pas de vergrendelingsversterking en pixel bin-factor aan om afbeeldingen van goede kwaliteit te verkrijgen.

8. Valse kleuring

  1. Open de afbeeldingsstapel met ImageJ.
  2. Haal de twee afbeeldingen die overeenkomen met de lipide (2.850 cm-1) en eiwit (2.930 cm-1) soorten eruit door met de rechtermuisknop op de afbeelding te klikken en op Dupliceren te klikken.
  3. Hernoem het lipidenbeeld naar lipiden en het eiwitbeeld naar eiwitten.
  4. Ga naar proces- | Image Calculator en voer eiwitten af om lipiden af te trekken.
  5. Combineer de afbeeldingen door naar Afbeelding | te gaan Kleur | Kanalen samenvoegen, lipiden op groen zetten en eiwitten op blauw. Open het gereedschap Afbeeldingskanalen (Afbeelding | Kleur | Channels Tool) en pas de helderheid en het contrast aan (Image | | aanpassen Helderheid/contrast).
  6. Pas de helderheid en het contrast voor elk kanaal aan met het gereedschap Kanalen . Pas voor het lipidekanaal het contrast aan totdat de cellulaire kenmerken donker lijken. Pas voor het eiwitkanaal het contrast aan totdat de cellulaire kenmerken blauw lijken. Converteer de samengevoegde kanaal groen/blauwe afbeelding naar een RGB-afbeelding door naar Afbeelding | Soort | RGB-kleur. Exporteer deze afbeelding op Bestand | Opslaan als | Tiff.
    OPMERKING: Voor valse H & E-kleuring toont het kleurenschema roze cytoplasma, terwijl de kernen donkerblauw-paars zijn.
  7. Download het HE.m MATLAB-script van de valse H&E-vlekscriptbron in de Materiaaltabel.
  8. Voer het HE.m-script uit in MATLAB. Selecteer de geëxporteerde RGB-afbeelding uit de vorige stap om een kunstmatig H&E-gekleurde afbeelding te genereren.
  9. (OPTIONEEL) Normaliseer de beeldintensiteit voor grote beeldhoeken omdat het beeld donkerder lijkt in de periferie dan in het midden.
    1. Om veldnormalisatie van de afbeeldingen uit te voeren, moet u zoveel mogelijk afbeeldingen gemiddeld nemen. Verwijder vervolgens de intensiteitsfuncties met ImageJ (Process | Filters | Gaussische | Straal=50).
    2. Meet de maximale intensiteit van de wazige afbeelding (Ctrl+M). Deel de wazige afbeelding door de maximale intensiteit (Process | Wiskunde | Verdeel). Deel de onbewerkte SRS-afbeelding door de onscherpe afbeelding (proces| Afbeelding | Rekenmachine).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Spectrale resolutie optimaliseren:
Dispersie door een materiaal wordt beïnvloed door het dispersieve medium (lengte en materiaal) en golflengte. Het veranderen van de lengte van de dispersiestaaf heeft invloed op de spectrale resolutie en de signaalgrootte. Het is een geven-en-nemen relatie die afhankelijk van de toepassing anders kan worden gewogen. De staven rekken de bundelpuls uit van breed in frequentie en smal in de tijd tot smal in frequentie en breed in de tijd. Figuur 7

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het tweekleurige SRS-beeldvormingsschema dat in dit protocol wordt gepresenteerd, hangt af van de juiste implementatie van SRS-beeldvorming met één kleur. In SRS-beeldvorming met één kleur zijn de kritieke stappen ruimtelijke uitlijning, temporele uitlijning, modulatiediepte en faseverschuiving. Ruimtelijk combineren van de twee balken wordt bereikt door een dichroïsche spiegel. Verschillende stuurspiegels worden gebruikt voor fijnafstelling bij het verzenden van de balken naar de dichroïsche spiegel. Zodra de balken zij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Deze studie werd ondersteund door NIH R35 GM133435 tot D.F.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 mm Achromatische LensTHORLABSAC254-100-BBroadband, 650 - 1.050 nm, achromatische lensbrandpuntsafstand, 100 mm
20 MHz bandpass filterMinicircuitsBBP-21.4+Geconcentreerde LC Band Pass Filter, 19,2 - 23,6 MHz, 50 Ω
200 mm Achromatische LensTHORLABSAC254-200-BBroadband, 650 - 1.050 nm, achromatische lensbrandpuntsafstand, 200 mm
Achromatische Half WaveplateUnion OpticWPA2210-650-1100-M25.4Broadband half waveplate
Achromatische Quarter WaveplateUnion OpticWPA4210-650-1100-M25.4Broadband quarter waveplate
Beam SamplerTHORLABSBSN1110:90 Plate Beamsplitter
Dichroic MirrorTHORLABSDMSP1000Andere dichroics met een middengolflengte rond de 1.000 nm kunnen worden gebruikt.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)Sigma Aldrich472301Oplosmiddel voor kalibratie van Raman-verschuiving. Andere oplosmiddelen met bekende Raman-pieken kunnen worden gebruikt.
Electro-optische Amplitude ModulatorTHORLABSEO-AM-NR-C1Twee EOM's zijn nodig voor orthogonale modulatie en dual-channel beeldvorming. De resonante versie wordt aanbevolen zodat een lagere aandrijfspanning kan worden gebruikt.
False H&E Staining ScriptMatlabhttps://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout BufferPRL-414BPulse Research Lab1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer en Line Driver, voor het genereren van de EOM aandrijffrequentie en de referentie naar de lock-in
Fast PhotodiodeTHORLABSDET10A2Si Detector, 1 ns Rise Time
Frequency DividerPRL-220APulse Research LabTTL Freq. Divider (f/2, f/4, f/8, f/16), voor het genereren van 20MHz vanuit de laseruitvoer.
Highly Dispersive Glass RodsUnion OpticCYLROD01Hoge dispersie H-ZF52A Rod lens 120 mm, SF11 Rod lens 100 mm
Insight DS+NewportLasersysteem dat in staat is om twee gesynchroniseerde gepulseerde lasers uit te voeren (één vaste straal bij 1.040 nm en één afstembare straal, variërend van 680-1.300 nm) met een herhalingssnelheid van 80 MHz. 
Lock-in AmplifierLiquid InstrumentsMoku LabLock-in versterker om SRS-signaal uit de fotodiode te extraheren. Een Zurich Instrument HF2LI of soortgelijk instrument kan ook worden gebruikt.
MirrorsTHORLABSBB05-E03-10Broadband Dielectric Mirror, 750 - 1.100 nm. Zilveren spiegels kunnen ook worden gebruikt.
Motorized Delay StageZaberX-DMQ12P-DE52Delay stage voor fijne controle van de temporele overlapping van de pump- en de Stokes-lasers. Elke andere gemotoriseerde stage zou moeten werken.
Oil Immersion CondensorNikonCSC10031,4 NA. Andere condensers met NA>1,2 kunnen worden gebruikt.
OscilloscopeTektronixTDS7054Elke andere oscilloscoop met 400 MHz bandbreedte of hoger zou moeten werken.
Phase ShifterSigaTekSF50A2Voor het verschuiven van de fase van de modulatiefrequentie
PhotodiodeHamamatsu CorpS3994-01Silicon PIN-diode met groot oppervlak (10 x 10 cm2). Andere diodes met groot oppervlak en lage capaciteit kunnen worden gebruikt.
Polarizing Beam SplitterUnion OpticPBS9025-620-1000Broadband polariserende beamsplitter
Refactive Index Databaserefractiveindex.info
Retro-reflectorEdmund Optics34-408BBAR Right Angle Prism. Andere prisma's of retroreflector kunnen worden gebruikt.
RF Power AmplifierMinicircuitsZHL-1-2W+Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan MirrorsCambridge Technologies6215HWe gebruikten een 5 mm spiegelset met zilveren coating
ScanImageVidrioScanImage BasicLaser scanning microscoop besturingssoftware
Shortpass FilterTHORLABSFESH100025,0 mm Premium Shortpass Filter, Cut-Off Wavelength: 1.000 nm. Voor efficiënte onderdrukking van de Stokes, kunnen twee filters nodig zijn.
Upright MicroscopeNikonEclipse FN1Elke andere microscoopframe kan worden gebruikt. Als een laser scanning microscoop beschikbaar is, kan deze direct worden gebruikt. Anders moet een galvo-scanner en scanlens aan de microscoop worden toegevoegd.
Water Immersion ObjectiveOlympusXLPLN25XWMP2De multifoton 25X Objectief heeft een NA van 1,05. Andere soortgelijke objectieven kunnen worden gebruikt.

Referenties

  1. Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008, (2008).
  2. Cui, M., Zhang, D. Y. Artificial intelligence and computational pathology. Laboratory Investigation. 101 (4), 412-422 (2021).
  3. Freudiger, C. W., et al. Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy. Science. 322 (5909), 1857-1861 (2008).
  4. Orringer, D. A., et al. Rapid intraoperative histology of unprocessed surgical specimens via fibre-laser-based stimulated Raman scattering microscopy. Nature Biomedical Engineering. 1, 0027(2017).
  5. Ji, M., et al. label-free detection of brain tumors with stimulated Raman scattering microscopy. Science Translational Medicine. 5 (201), (2013).
  6. Hollon, T. C., et al. Near real-time intraoperative brain tumor diagnosis using stimulated Raman histology and deep neural networks. Nature Medicine. 26 (1), 52-58 (2020).
  7. Shin, K. S., et al. Intraoperative assessment of skull base tumors using stimulated Raman scattering microscopy. Scientific Reports. 9 (1), 20392(2019).
  8. Lu, F. -K., et al. Label-free neurosurgical pathology with stimulated Raman imaging. Cancer Research. 76 (12), 3451-3462 (2016).
  9. Shin, K. S., et al. Quantitative chemical imaging of breast calcifications in association with neoplastic processes. Theranostics. 10 (13), 5865-5878 (2020).
  10. Fu, D., Holtom, G., Freudiger, C., Zhang, X., Xie, X. S. Hyperspectral imaging with stimulated Raman scattering by chirped femtosecond lasers. The Journal of Physical Chemistry B. 117 (16), 4634-4640 (2013).
  11. Figueroa, B., Hu, R., Rayner, S. G., Zheng, Y., Fu, D. Real-time microscale temperature imaging by stimulated Raman scattering. The Journal of Physical Chemistry Letters. 11 (17), 7083-7089 (2020).
  12. Saar, B. G., et al. Video-rate molecular imaging in vivo with stimulated Raman scattering. Science. 330 (6009), 1368-1370 (2010).
  13. Hill, A. H., Hill, A. H., Manifold, B., Manifold, B., Fu, D. Tissue imaging depth limit of stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 11 (2), 762-774 (2020).
  14. Fu, D., et al. Imaging the intracellular distribution of tyrosine kinase inhibitors in living cells with quantitative hyperspectral stimulated Raman scattering. Nature Chemistry. 6 (7), 614-622 (2014).
  15. Zhang, L., et al. Spectral tracing of deuterium for imaging glucose metabolism. Nature Biomedical Engineering. 3 (5), 402-413 (2019).
  16. Tsai, P. S., et al. Principles, design, and construction of a two-photon laser-scanning microscope for in vitro and in vivo brain imaging. In Vivo Optical Imaging of Brain. Frostig, R. D., et al. , CRC Press. 113-171 (2002).
  17. Francis, A., Berry, K., Chen, Y., Figueroa, B., Fu, D. Label-free pathology by spectrally sliced femtosecond stimulated Raman scattering (SRS) microscopy. PLoS One. 12 (5), 0178750(2017).
  18. Figueroa, B., et al. Broadband hyperspectral stimulated Raman scattering microscopy with a parabolic fiber amplifier source. Biomedical Optics Express. 9 (12), 6116-6131 (2018).
  19. Kong, L., et al. Multicolor stimulated Raman scattering microscopy with a rapidly tunable optical parametric oscillator. Optics Letters. 38, 145-147 (2013).
  20. He, R., et al. Dual-phase stimulated Raman scattering microscopy for real-time two-color imaging. Optica. 4 (1), 44-47 (2017).
  21. Pence, I. J., Kuzma, B. A., Brinkmann, M., Hellwig, T., Evans, C. L. Multi-window sparse spectral sampling stimulated Raman scattering microscopy. Biomedical Optics Express. 12 (10), 6095-6114 (2021).
  22. Wei, M., et al. Volumetric chemical imaging by clearing-enhanced stimulated Raman scattering microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (14), 6608-6617 (2019).
  23. Wright, A. J., et al. Adaptive optics for enhanced signal in CARS microscopy. Optics Express. 15 (26), 18209-18219 (2007).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Tweekleuren SRSspectrale focusingbeeldvorming van de muizenhersenenreal time beeldvormingepi modus SRSRaman piekbeeldvormingpump probe microscopiehematoxyline eosin equivalent
Real-time, tweekleurige gestimuleerde Raman-verstrooiingsbeeldvorming van muizenhersenen voor weefseldiagnose
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.