Isolatie en karakterisering van de immuuncellen van micro-ontleedde muischoroïde plexussen

Samenvatting

Deze studie maakt gebruik van flowcytometrie en twee verschillende gating-strategieën op geïsoleerde perfused muizen hersenen choroïde plexussen; dit protocol identificeert de belangrijkste immuuncelsubsets die deze hersenstructuur bevolken.

Samenvatting

De hersenen worden niet langer beschouwd als een orgaan dat geïsoleerd functioneert; accumulerend bewijs suggereert dat veranderingen in het perifere immuunsysteem indirect de hersenfunctie kunnen vormen. Op het grensvlak tussen de hersenen en de systemische circulatie zijn de choroïde plexussen (CP), die de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière vormen, gemarkeerd als een belangrijke plaats van periferie-naar-hersencommunicatie. CP produceert het hersenvocht, neurotrofe factoren en signaalmoleculen die de homeostase van de hersenen kunnen vormen. CP zijn ook een actieve immunologische niche. In tegenstelling tot het hersenparenchym, dat onder fysiologische omstandigheden voornamelijk door microglia wordt bevolkt, vat de heterogeniteit van CP-immuuncellen de diversiteit in andere perifere organen samen. De CP-immuunceldiversiteit en -activiteit veranderen met veroudering, stress en ziekte en moduleren de activiteit van het CP-epitheel, waardoor indirect de hersenfunctie wordt gevormd. Het doel van dit protocol is om murine CP te isoleren en ongeveer 90% van de belangrijkste immuunsubsets te identificeren die ze bevolken. Deze methode is een hulpmiddel om CP-immuuncellen te karakteriseren en hun functie te begrijpen bij het orkestreren van periferie-naar-hersencommunicatie. Het voorgestelde protocol kan helpen ontcijferen hoe CP-immuuncellen indirect de hersenfunctie moduleren in de gezondheid en over verschillende ziekteomstandigheden.

Inleiding

Sinds de ontdekking van de bloed-hersenbarrière door Paul Erhlich in de late ^19e eeuw, worden de hersenen beschouwd als vrijwel gescheiden van de andere organen en de bloedbaan. Toch is het afgelopen decennium het concept ontstaan dat de hersenfunctie wordt gevormd door verschillende biologische factoren, zoals darmmicrobiota en systemische immuuncellen en signalen1,2,3,4. Tegelijkertijd zijn andere hersengrenzen zoals hersenvliezen en choroïde plexussen (CP) geïdentificeerd als interfaces van actieve immuun-hersenkruispraat in plaats van inerte barrièreweefsels5,6,7,8.

De CP vormen de bloed-cerebrospinale vloeistofbarrière, een van de grenzen die de hersenen en de periferie scheiden. Ze bevinden zich in elk van de vier ventrikels van de hersenen, d.w.z. de derde, de vierde en beide laterale ventrikels, en grenzen aan gebieden die betrokken zijn bij neurogenese, zoals de subventriculaire zone en subgranulaire zone van de ^hippocampus3. Structureel zijn de CP samengesteld uit een netwerk van fenestrated bloedcapillairen omsloten door een monolaag van epitheelcellen, die onderling verbonden zijn door strakke en hechte juncties9,10. Belangrijke fysiologische rollen van het CP-epitheel omvatten de productie van hersenvocht, dat de hersenen spoelt uit afvalmetabolieten en eiwitaggregaten, en de productie en gecontroleerde bloed-naar-hersenpassage van verschillende signaalmoleculen, waaronder hormonen en neurotrofe factoren11,12,13. Uitgescheiden moleculen van CP vormen de activiteit van de hersenen, d.w.z. door neurogenese en microgliale functie te moduleren14,15,16,17,18,19, waardoor CP cruciaal is voor hersenhomeostase. CP houdt zich ook bezig met verschillende immuunactiviteiten; terwijl het belangrijkste immuunceltype in het hersenparenchym onder niet-pathologische omstandigheden microglia is, is de diversiteit van CP-immuuncelpopulaties net zo breed als in perifere ^organen3,7, wat suggereert dat verschillende kanalen van immuunregulatie en signalering aan het werk zijn bij de CP.

De ruimte tussen de endotheel- en epitheelcellen, het CP-stroma, wordt voornamelijk bevolkt door grensgeassocieerde macrofagen (BAM), die pro-inflammatoire cytokines en moleculen tot expressie brengen die verband houden met de presentatie van antigeen als reactie op ^{ontstekingssignalen3}. Een ander subtype van macrofagen, de epiplexuscellen van Kolmer, zijn aanwezig op het apicale oppervlak van het CP-epitheel20. CP stroma is ook een niche voor dendritische cellen, B-cellen, mestcellen, basofielen, neutrofielen, aangeboren lymfoïde cellen en T-cellen die meestal effectorgeheugen T-cellen zijn die antigenen van het centrale zenuwstelsel kunnen herkennen7,21,22,23,24. Bovendien verandert de samenstelling en activiteit van immuuncelpopulaties bij de CP bij systemische of hersenverstoring, bijvoorbeeld tijdens veroudering10,14,15,21,25, ^microbiota perturbatie7, ^stress26 en ^ziekte27,28. Met name werden deze veranderingen gesuggereerd om indirect de hersenfunctie te vormen, d.w.z. een verschuiving van CP CD4 ⁺ T-cellen naar Th2-ontsteking treedt op bij hersenveroudering en triggert immuunsignalering van de CP die verouderingsgerelateerde cognitieve achteruitgang kan vormen14,15,21,25,29 . Het verlichten van de eigenschappen van de CP-immuuncellen zou dus cruciaal zijn om hun regulerende functie op CP-epitheelfysiologie en -secretie beter te begrijpen en daardoor hun indirecte impact op de hersenfunctie onder gezonde en ziekteomstandigheden te ontcijferen.

CP zijn kleine structuren die slechts een paar immuuncellen bevatten. Hun isolatie vereist microdissectie na een voorbereidende stap van perfusie; immuuncellen in de bloedbaan zouden anders belangrijke verontreinigingen vormen. Dit protocol heeft tot doel de myeloïde en T-celsubsets van de CP te karakteriseren met behulp van flowcytometrie. Deze methode identificeert ongeveer 90% van de immuuncelpopulaties die muis-CP samenstellen onder niet-inflammatoire omstandigheden, in overeenstemming met recent gepubliceerde werken met behulp van andere methoden om immuun CP-heterogeniteit te ontleden7,10,28. Dit protocol kan worden toegepast om veranderingen in het CP-immuuncelcompartiment te karakteriseren met ziekte en andere experimentele paradigma's in vivo.

Protocol

Alle procedures zijn in overeenstemming met de richtlijnen van de Europese Commissie voor de behandeling van proefdieren, richtlijn 86/609/EEG. Ze werden goedgekeurd door de ethische commissies nr. 59, door de CETEA / CEEA nr. 089, onder het nummer dap210067 en APAFIS # 32382-2021070917055505 v1.

1. Voorbereiding van de materialen

1. Bewaar alle antilichamen (materiaaltabel) bij 4 °C, beschermd tegen blootstelling aan licht.
2. DAPI-stamoplossing (1 mg/ml): Resuspend het poeder in PBS^-/- (Table of Materials), aliquot, en bewaren bij -20 °C.
3. DAPI-werkoplossing (0,1 mg/ml): Verdun DAPI-stamoplossing met PBS^-/- in een verhouding van 1:10.
4. Magnetisch geactiveerde celsorteringsbuffer (MACS): Bereid 2 mM ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) en 0,5% runderserumalbumine (BSA) (Materiaaltabel) in PBS^-/-.
5. Collagenase IV stockoplossing (20 E/μL): Resuspend het poeder in PBS^+/+ (Table of Materials), aliquot, en bewaren bij -20 °C.
   OPMERKING: Collagenase IV vereist _mgCl2 om volledig actief te zijn; collagenase IV-oplossing niet bevriezen en ontdooien.
6. Anesthetisch-analgetische oplossing: Meng 150 μL ketamine (150 mg/kg), 25 μl xylazine (5 mg/kg) en 330 μl buprecare (0,1 mg/kg) in 1 ml PBS^-/-.
   OPMERKING: Bereid extemporeus een anesthetisch-analgetische oplossing voor en bewaar deze niet langer dan een dag.
7. Heparine-oplossing (100 E/ml): Resuspend het poeder in PBS^-/-.
8. Bereid het infusie-inzetsysteem voor dat een buis verbindt met een decanter Erlenmeyer gevuld met PBS^-/-. Sluit een naald van 23 G aan op het uiteinde van de infuusbuis. Open de infusie-inzet en laat de PBS lopen totdat er geen bubbels in de buis zitten.
9. Bereid de verrekijkerloep voor die is uitgerust met een lampje.

2. Huisvesting van C57BL/6 muizen

1. Gebruik voor de analyse van CP-myeloïde of T-cellen vier muizen voor elk en pool de vier CP (twee van elke laterale ventrikel, de derde ventrikel en de vierde ventrikel CP; voor acht muizen in totaal). Het niet poolen van CP brengt het risico met zich mee dat de zeldzame immuunpopulaties in CP niet worden gedetecteerd vanwege hun lage abundantie.
2. Laat de muizen minstens 7 dagen acclimatiseren voorafgaand aan een experiment. Houd de muizen onder pathogeenvrije omstandigheden bij constante temperatuur en vochtigheid, in een licht/donkercyclus van 12/12 uur of 14/10 uur, met water en standaard pelletvoer ad libitum.

3. PBS-perfusie en hersendissectie

1. Weeg elke muis en injecteer intraperitoneaal 10 μL/g van de anesthetisch-analgetische mixoplossing (stap 1.6).
2. Wacht ongeveer 30 minuten op efficiënte analgesie (controleer op de diepte van de anesthesie door in de cijfers van de muis te knijpen).
3. Plaats de verdoofde muis plat op zijn rug, op de dissectiesteun en plak zijn handpalmen vast aan de dissectiesteun.
4. Knijp in de huid van het dier met een tang en gebruik een schaar, open de buik, het middenrif en de thorax om het hart bloot te leggen.
   OPMERKING: Wanneer de thorax wordt geopend, worden de hersenen anoxisch. Men moet nauwkeurig en snel doorgaan met de volgende stappen van de perfusie.
5. Injecteer 20 μL van 100 E/ml heparine-oplossing rechtstreeks in de linker ventrikel.
6. Maak met een fijne schaar een incisie van ten minste 3 mm in het rechteratrium om het bloed uit het lichaam te laten stromen.
7. Breng onmiddellijk daarna de 23 G-naald in die aan het uiteinde van de infuusbuis is geplaatst door de punt van de linker ventrikel.
8. Open het infusiesysteem maximaal en wacht op volledige perfusie: Met behulp van een naald van 23 G, met een stroomsnelheid van ongeveer 6 ml /min, is de perfusie voltooid in 3 minuten.
   OPMERKING: De gelijkmatige verkleuring van organen zoals de lever getuigt van perfusie-werkzaamheid.
9. Sluit het infusiesysteem en verwijder de naald uit de hartkamer.
10. Verwijder de tape van de handpalmen van de muis. Plaats de muis in een ventrale positie.
11. Knijp de huid van het dier met een tang en gebruik een schaar, verwijder de huid van de bovenkant van het hoofd van de ogen naar de oren.
12. Knip met behulp van een schaar de schedel eerst tussen de ogen en vervolgens zijdelings van elk oog naar het ruggenmerg net boven de kauwspieren. Gebruik hiervoor de extremiteit van de schaar en ga voorzichtig te werk om te voorkomen dat de hersenen met de schaar worden beschadigd.
13. Open de schedel met een tang door deze vanaf het uiteinde tussen de ogen te knijpen.
14. Gebruik een schaar om het ruggenmerg door te knippen en de hersenen met een tang te extraheren, plaats hun twee punten aan de laterale kant van de hersenen om het te kantelen en plaats het in een petrischaal gevuld met ijskoude PBS ^{+ / +}. De CP worden dan direct opgehaald.
    OPMERKING: Controleer op verkleuring van de hersenen om de werkzaamheid van de perfusie te verifiëren.

4. Dissectie van de Choroid Plexus uit de hersenen

1. Plaats de dorsale kant van de hersenen naar boven in de petrischaal en onder de doelen van de binoculaire loepen.
2. Met behulp van een tang om de hersenen op hun plaats te houden, steekt u de twee uiteinden van een andere tang door de middellijn tussen de hemisferen naar beneden.
3. Gebruik de tang om de cortex met het callosum en de hippocampus weg te trekken van het septum, waardoor de laterale ventrikel en een deel van de derde ventrikel worden blootgesteld.
4. Identificeer de laterale CP als een lange sluier die de laterale ventrikel bekleedt die aan beide uiteinden affakkelt. Gebruik de twee uiteinden van een dunne tang om de laterale CP te vangen. Zorg ervoor dat u het driehoekige achterste deel verzamelt dat verborgen kan zijn door de achterste plooi van de hippocampus.
5. Trek de cortex met het corpus callosum en de hippocampus van de contralaterale hemisfeer weg van het septum om de hele derde ventrikel en de tegenovergestelde laterale ventrikel bloot te leggen.
6. Verzamel met fijne tang de derde CP, die kan worden geïdentificeerd als een korte structuur met een korrelig oppervlakteaspect.
7. Verzamel de andere laterale CP.
8. Steek de twee uiteinden van een tang naar beneden tussen het cerebellum en de middenhersenen. Maak het cerebellum los van de pons en medulla om de vierde ventrikel bloot te leggen.
9. Identificeer de vierde CP als een lange bolvormige structuur met een korrelig oppervlakteaspect dat de vierde ventrikel van het laterale rechtereinde naar het linkereinde tussen het cerebellum en het medulla bekleedt. Verzamel de vierde CP met fijne tang.
   OPMERKING: Silaan-basis coating van tang kan kleverigheid van CP op tang voorkomen.
10. Herhaal stap 3.1-4.9 voor elk van de andere zeven muizen. In de tussentijd kan de verzamelde CP tijdelijk worden bewaard in een buis die op ijs wordt geplaatst.

5. Voorbereiding van monsters voor flowcytometrie-analyse

1. Vul de buis met alle ontlede CP tot 750 μL PBS^+/+.
   OPMERKING: De afzetting van ontleed CP met dunne tang in de buis brengt een klein volume PBS ^+/+. Vul het bestaande volume liever aan tot 750 μL dan het te verwijderen en te vervangen door verse 750 μL PBS ^+/+ om mogelijk verlies van het CP-weefsel te voorkomen.
2. Voeg 15 μL collagenase IV-stamoplossing van 20 E/μL toe (zie stap 1.5) voor een eindconcentratie van 400 E/ml.
   OPMERKING: DNAse I (150 μg/ml) kan overmatige celklontering voorkomen.
3. Incubeer CP met Collagenase IV bij 37 °C onder milde agitatie (300 RPM) gedurende 45 min.
4. Pipetteer voorzichtig ongeveer 10 keer op en neer om de CP-dissociatie te voltooien.
5. Vul de CP-buis tot 1,5 ml met MACS-buffer (zie recept stap 1.4) om de collagenase IV-activiteit te stoppen.
   OPMERKING: Collagenase IV-activiteit wordt gestopt bij lage temperatuur en geremd door serumalbumine.
6. Centrifugeer de cellen bij 500 x g, gedurende 5 minuten, bij 4 °C. Gooi het supernatant weg en was de cellen met 1,5 ml MACS-buffer.
7. Centrifugeer de cellen bij 500 x g gedurende 5 minuten, bij 4 °C. Gooi de supernatant- en resuspendcellen weg in 220 μL MACS-buffer.
8. Scheid een aliquot van 10 μL van de celsuspensie om te worden gebruikt als niet-gekleurde controle (volgende stap 5.18).
9. Scheid een aliquot van 10 μL van de celsuspensie om te worden gebruikt als DAPI-mono-gekleurde controle (volgende stap 5.12).
10. Preïnculeer de resterende 200 μL met anti-muis CD16/CD32 blokkerend antilichaam (1:100) gedurende 20 minuten, bij 4 °C, om niet-specifieke Fc-gemedieerde interacties te blokkeren.
11. Splits de cellen in twee buizen van 100 μL (één voor analyse van myeloïde cellen, de andere voor analyse van T-cellen) (volgende stap 5.14).
12. Neem het monster met 10 μL cellen voor de DAPI-mono-gekleurde controle (stap 5.9) en vul het tot 100 μL met MACS-buffer (volgende stap 5.14).
13. Bereid elf nieuwe buisjes met 100 μL MACS voor het antilichaam mono-gekleurd (stap 5.14.4) en alle gekleurde controles (stap 5.14.5) en voeg een druppel compensatieparels toe aan elk.
    OPMERKING: De compensatieregelaars maken het mogelijk om de spanning van fluorescerende detectielaser in te stellen en de potentiële niet-specifieke signaaldetectie van fluorescerende kleurstof in de andere kanalen te beoordelen die verder worden gecompenseerd.
14. Antilichaam incubatie van monsters:
    1. Myeloïde monster: Voeg 0,1 mg/ml DAPI (1:100) toe (zie stap 1.3), FITC anti-muis CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-muis CD11b (1:100), APC anti-muis _CX3CR1 (1:100), BV711 anti-muis Ly6C (1:100), PE anti-muis F4/80 (1:100) en APC-Cy7 anti-muis IA-IE (1:100).
    2. T-cellenmonster: voeg 0,1 mg/ml DAPI (1:100), FITC anti-muis CD45 (1:100), PE-Dazzle 594 anti-muis CD11b (1:100), APC anti-muis TCRβ (1:100), PE anti-muis CD8a (1:100) en APC-Cy7 anti-muis CD4 (1:50) toe.
    3. DAPI-mono-gekleurde controle (vanaf stap 5.12): Voeg 0,1 mg/ml DAPI (1:100) toe.
    4. Antilichaam mono-gekleurde compensatie kralen: Voeg elk van de negen eerder gebruikte antilichamen voor myeloïde en T-cellen monsters (dezelfde verdunning), afzonderlijk (één voor elke buis) toe aan de negen buizen met de kralen.
       OPMERKING: De mono-gekleurde compensatieregelaars maken het mogelijk om positieve fluorescentiepieken te bepalen voor elk van de gebruikte fluorescerende markers tijdens de compensatiestap. De analysator vergelijkt ze met het negatieve signaal dat wordt waargenomen in de niet-gekleurde cp-cellen van de controle.
    5. Antilichaam all-stained compensatie kralen: Voeg alle antilichamen die worden gebruikt voor myeloïde kleuring toe aan de ene buis en die gebruikt voor T-cellen kleuring aan een andere.
       OPMERKING: De volledig gekleurde compensatieregelaars maken het mogelijk om de spanning van elke fluorescerende laserdetectie in te stellen en de potentiële niet-specifieke signaaldetectie van fluorescerende kleurstof in de andere kanalen te beoordelen.
    6. Incubeer gedurende 30-45 minuten op ijs, beschermd tegen blootstelling aan licht.
15. Vul alle buizen tot 1,5 ml met MACS-buffer. Centrifugeer de cellen en compensatieparels bij 500 x g, gedurende 5 minuten, bij 4 °C.
16. Gooi het supernatant weg en was de cellen en compensatieparels in 1,5 ml MACS-buffer.
17. Centrifugeer de cellen en compensatieparels bij 500 x g, gedurende 5 minuten, bij 4 °C. Gooi het supernatant weg.
18. Resuspend de cellen en compensatieparels in 500 μL MACS-buffer. Vul onbevlekte controle (stap 5.8) tot 500 μL met MACS-buffer.
19. Filter elke buis met CP-cellen door een zeef van 70 μm (onbevlekte CP, DAPI mono-gekleurde controle en myeloïde en T-cellenmonsters).

6. Flowcytometrie

OPMERKING: De flowcytometer die in dit protocol wordt gebruikt, is uitgerust met de volgende 5 lasers: een 355 nm UV-laser, een 405 nm Violette laser, een 488 nm Blauwe laser, een 561 nm Geel-Groene laser en een 637 nm Rode laser.

1. Voer de dagelijkse kwaliteitscontroles op de cytometer uit met behulp van de cytometer setup, tracking (CST) interface en de CST-controleparels om consistentie tussen analyses, instrumentkwaliteit en consistente doelfluorescentie-intensiteiten te garanderen.
2. Om het flowcytometrie-experiment op te zetten, maakt u een nieuw experiment met bivariate plots en histogrammen. Zorg voor de opname van een forward scatter area (FSC-A) en side scatter area (SSC-A) plots en histogram plots voor elke kleur om de acquisitie te monitoren.
3. Definieer de celmorfologie door de PMT-spanning in te stellen voor FSC-A- en SSC-A-parameters op niet-gekleurde cp-cellen.
4. Definieer de spanningen van elke fluorescerende marker door de negatieve pieken van de fluorochromen op niet-gekleurde cp-cellen en de positieve pieken van de fluorochrooms in te stellen met behulp van compensatieparels die met alle antilichamen zijn gekleurd en ervoor te zorgen dat de detectorsignalen niet van de schaal zijn en niet te sterk worden gedetecteerd in andere kanalen.
5. Maak een compensatiematrix om elk van de eenkleurige compensatiebesturingselementen te analyseren. Controleer na het gateneren van geschikte FSC-A / SSC-A-populaties enkele bevlekte controles op histogramplots en registreer compensatiecontroles. Nadat u alle enkelvlekke monsters hebt geregistreerd, berekent u de compensatiematrix.
6. Noteer alle gedetecteerde gebeurtenissen voor zowel myeloïde als T-celpopulaties.

7. CP myeloïde cellen gating

1. Selecteer FSC-A vs. SSC-A en gate voor cellen (op basis van grootte).
2. Maak een dochterpoort voor afzonderlijke cellen met FSC-A vs. voorwaartse strooihoogte (FSC-H).
3. Maak een dochterpoort voor levende cellen met DAPI vs. FSC-A om DAPI⁺ -cellen uit te sluiten.
4. Maak een dochterpoort voor CD45⁺ immuuncellen met CD45 vs. FSC-A.
5. Maak een dochterpoort van de CD45⁺ cellen en selecteer CD11b vs. F4/80, identificeer de volgende twee groepen: de CD11b⁺ F4/80⁺ en de CD11b⁺ F4/80^- populaties (volgende stap 7.8).
6. Maak een dochterpoort voor CD11b⁺ F4/80⁺ cellen en selecteer _CX3CR1 vs. IA-IE. Identificeer zowel _CX3CR1⁺ IA-IE⁺ BAM die verder worden aangeduid als CD11b⁺ F4/^80high _CX3CR1⁺ IA-IE⁺ BAM, als _CX3CR1⁺ IA-IE^- macrofagen.
7. Maak een dochterpoort voor CD11b⁺ F4/80⁺ _CX3CR1⁺ IA-IE^- macrofagen en selecteer F4/80 vs. CD11b. Identificeer zowel de CD11bhigh F4/^{80intermediate} als de CD11b⁺ F4/^80high populaties die verder CD11bhigh F4/^{80intermediate} _CX3CR1⁺ IA-IE^- Kolmer's epiplexus macrofagen en CD11b⁺ F4/^80high _CX3 worden genoemd CR1⁺ IA-IE^- BAM, respectievelijk.
   OPMERKING: CD11bhigh F4/^{80intermediate} _CX3CR1⁺ IA-IE^- en CD11b⁺ F4/^80high _CX3CR1⁺ IA-IE^- cellen verschenen een beetje vermengd tussen F4/^{80intermediate-F4}/^80high en CD11bhigh-CD11b⁺ niveaus.
8. Van de CD11b⁺ F4/80^- bevolking (stap 7.5), poort voor Ly6C vs. IA-IE. Selecteer zowel IA-IE⁺ Ly6C-populatie- als IA-IE^- Ly6C⁺ cellen die voornamelijk overeenkomen met monocyten/neutrofielen.
   OPMERKING: Een hoge aanwezigheid van IA-IE-Ly6C⁺ cellen weerspiegelt waarschijnlijk problemen in de perfusie-werkzaamheid van dieren zonder ontstekingsaandoening; hun overvloed moet laag zijn.
9. Maak een dochterpoort voor CD11b⁺ F4/80^- IA-IE⁺ Ly6C^- populatie en selecteer CD11b vs. _CX3CR1, identificeer zowel CD11bhigh CX3CR1low- als CD11b⁺ CX3CR1-populaties.

8. CP T-cellen gating

1. Selecteer FSC-A vs. SSC-A en gate voor cellen (op basis van grootte).
2. Maak een dochterpoort voor afzonderlijke cellen met FSC-A vs. voorwaartse strooihoogte (FSC-H).
3. Maak een dochterpoort voor levende cellen met DAPI vs. FSC-A om DAPI⁺ -cellen uit te sluiten.
4. Maak een dochterpoort voor CD45⁺ immuuncellen met CD45 vs. FSC-A.
5. Maak een dochterpoort van de CD45⁺ cellen en selecteer TCRβ vs. CD11b. Sluit CD11b⁺ myeloïde cellen uit en selecteer TCRβ⁺ CD11b^- T cellen populatie.
6. Maak een dochterpoort voor TCRβ⁺ CD11b-populatie en selecteer CD4 vs. CD8a. Identificeer zowel CD8^- CD4⁺ T-cellen als CD8⁺ CD4^{- T-cellen}.

Resultaten

De hier gepresenteerde flowcytometrieanalyses onthulden met succes de belangrijkste subsets van myeloïde en T-cellen (respectievelijk figuur 1 en figuur 2) en hun relatieve totale aantal per muis op een zeer reproduceerbare manier (figuur 3).

De flowcytometrie-analyse van myeloïde cellen toonde aan dat CP wordt bevolkt door CD11b ⁺ _CX3CR1 ⁺ F4 / ^80high BAM, die ...

Discussie

Studies gericht op het begrijpen van de immunologische bijdragen aan hersenhomeostase en -ziekte hebben zich voornamelijk gericht op cellen die zich in het hersenparenchym bevinden, waarbij hersengrenzen zoals CP worden verwaarloosd, die niettemin cruciale bijdragen leveren aan de ^{hersenfunctie2,3}. De analyse van immuuncelpopulaties bij CP is een uitdaging vanwege de kleine omvang van CP, lage aantallen residente immuuncellen en gecompliceerde toegang tot dit wee...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
anti-mouse CD16/CD32	BD Biosciences	553142	Flow cytometry antibody
Albumine, bovijn	MP Biomedicals	160069	Blocking reagent
APC anti-mouse CX3CR1	BioLegend	149008	Flow cytometry antibody
APC anti-mouse TCRb	BioLegend	109212	Flow cytometry antibody
APC-Cy7 anti-mouse CD4	BioLegend	100414	Flow cytometry antibody
APC-Cy7 anti-mouse IA-IE	BioLegend	107628	Flow cytometry antibody
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer	BD Biosciences		Flow cytometry analyzer
BV711 anti-mouse Ly6C	BioLegend	128037	Flow cytometry antibody
Collageenase IV	Gibco	17104-019	Enzyme om CP weefsel te dissociëren
DAPI	Thermo Scientific	62248	Live/dead marker
EDTA			Ionenchelator
fijne schaar	FST	14058-11	Dissectietool
FITC anti-mouse CD45	BioLegend	103108	Flow cytometry antibody
Flow controller infuus aansluiting	CareFusion	RG-3-C	Bloedperfusie aansluiting
FlowJo software	BD Biosciences		Analysesoftware
pincetten	FST	11018-12	Dissectietool
Heparine	Sigma-Aldrich	H3149-10KU	Anticoagulans
Imalgene	Boehringer Ingelheim		Ketamine, anestheticum
OneComp eBeads	Invitrogen	01-1111-42	Controlebeadjes om compensatie te realiseren
PBS-/-	Gibco	14190-094	Buffer
PBS+/+	Gibco	14040-091	Buffer
PE anti-mouse CD8a	BioLegend	100708	Flow cytometry antibody
PE anti-mouse F4/80	BioLegend	123110	Flow cytometry antibody
PE-Dazzle 594 anti-mouse CD11b	BioLegend	101256	Flow cytometry antibody
Rompun	Bayer		Xylazine, anestheticum
dunne pincetten	Dumoxel Biology	11242-40	Dissectietool
Vetergesic	Ceva		Buprenorfine, analgeticum