Methodenartikel

Onderzoek naar biomoleculaire interactie tussen de moleculaire chaperonne Hsp90 en zijn clienteiwit kinase Cdc37 met behulp van field-effect biosensing-technologie

DOI:

10.3791/63495

⸱

31 maart 2022

 ,  ,  ,  , 
1The Azrieli Faculty of Medicine in the Galilee, Bar-Ilan University, 2Asian Liver Center, Department of Surgery, Stanford University School of Medicine

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Field-effect biosensing (FEB) is een labelvrije techniek voor het detecteren van biomoleculaire interacties. Het meet de elektrische stroom door de grafeen biosensor waaraan de bindende doelen worden geïmmobiliseerd. De FEB-technologie werd gebruikt om biomoleculaire interacties tussen Hsp90 en Cdc37 te evalueren en er werd een sterke interactie tussen de twee eiwitten gedetecteerd.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomoleculaire interacties spelen een veelzijdige rol in tal van cellulaire processen door functioneel relevante biologische gebeurtenissen te reguleren en te coördineren. Biomoleculen zoals eiwitten, koolhydraten, vitamines, vetzuren, nucleïnezuren en enzymen zijn fundamentele bouwstenen van levende wezens; ze verzamelen zich in complexe netwerken in biosystemen om een groot aantal levensgebeurtenissen te synchroniseren. Eiwitten maken meestal gebruik van complexe interactoomnetwerken om hun functies uit te voeren; daarom is het verplicht om dergelijke interacties te evalueren om hun belang in cellen op zowel cellulair als organismeniveau te ontrafelen. Om dit doel te bereiken, introduceren we een snel opkomende technologie, field-effect biosensing (FEB), om specifieke biomoleculaire interacties te bepalen. FEB is een benchtop, labelvrije en betrouwbare biomoleculaire detectietechniek om specifieke interacties te bepalen en maakt gebruik van hoogwaardige elektronische biosensoren. De FEB-technologie kan interacties in het nanomolaire bereik volgen vanwege de biocompatibele nanomaterialen die op het biosensoroppervlak worden gebruikt. Als proof of concept werd de eiwit-eiwitinteractie (PPI) tussen heat shock protein 90 (Hsp90) en celdelingscyclus 37 (Cdc37) opgehelderd. Hsp90 is een ATP-afhankelijke moleculaire chaperonne die een essentiële rol speelt bij het vouwen, stabiliteit, rijping en kwaliteitscontrole van veel eiwitten, waardoor meerdere vitale cellulaire functies worden gereguleerd. Cdc37 wordt beschouwd als een eiwitkinase-specifieke moleculaire chaperonne, omdat het specifiek eiwitkinasen voor Hsp90 herkent en rekruteert om hun stroomafwaartse signaaltransductieroutes te reguleren. Als zodanig wordt Cdc37 beschouwd als een co-chaperonne van Hsp90. De chaperonnekinaseroute (Hsp90/Cdc37-complex) is hypergeactiveerd bij meerdere maligniteiten die cellulaire groei bevorderen; daarom is het een potentieel doelwit voor kankertherapie. De huidige studie toont de efficiëntie van feb-technologie met behulp van het Hsp90/Cdc37-modelsysteem. FEB detecteerde een sterke PPI tussen de twee eiwitten (KD-waarden van 0,014 μM, 0,053 μM en 0,072 μM in drie onafhankelijke experimenten). Kortom, het VBO is een labelvrij en kosteneffectief PPI-detectieplatform, dat snelle en nauwkeurige metingen biedt.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biomoleculaire interacties:
Eiwitten zijn essentiële onderdelen van organismen en nemen deel aan tal van moleculaire routes zoals celmetabolisme, celstructuur, celsignalering, immuunresponsen, celadhesie en meer. Hoewel sommige eiwitten hun functie(s) onafhankelijk uitvoeren, interageren de meeste eiwitten met andere eiwitten met behulp van een bindende interface om de juiste biologische activiteit te coördineren1.

Biomoleculaire interacties kunnen voornamelijk worden geclassificeerd op basis van de verschillende structurele en functionele kenmerken van betrokken eiwitten2, bijvoorbeeld op basis van de eiwitoppervlakken, de complexe stabiliteit of de persistentie van interacties3. Het identificeren van essentiële eiwitten en hun rol in biomoleculaire interacties is van vitaal belang voor het begrijpen van biochemische mechanismen op moleculair niveau4. Momenteel zijn er verschillende benaderingen om deze interacties5 te detecteren: in vitro6, in silico7, in levende cellen8, ex vivo9 en in vivo10 met elk zijn eigen sterke en zwakke punten.

De in vivo assays worden uitgevoerd met behulp van het hele dier als een experimenteel hulpmiddel11, ende ex vivo assays worden uitgevoerd op weefselextracten of hele organen (bijv. Hart, hersenen, lever) in een gecontroleerde externe omgeving door minimale veranderingen in natuurlijke omstandigheden te bieden. De meest voorkomende toepassing van in vivo en ex vivo studies is het evalueren van de farmacokinetiek, farmacodynamiek en toxiciteitseffecten van potentiële farmacologische agentia vóór proeven bij mensen door hun algehele veiligheid en werkzaamheid te waarborgen12.

Biomoleculaire interacties kunnen ook worden gedetecteerd in levende cellen. Beeldvorming van levende cellen stelt ons in staat om dynamische interacties te observeren terwijl ze de reacties van een bepaalde biochemische route uitvoeren13. Bovendien kunnen detectietechnieken, zoals bioluminescentie of fluorescentieresonantie-energieoverdracht, informatie geven over waar en wanneer deze interacties plaatsvinden in de cel14. Hoewel detectie in levende cellen cruciale details biedt, vertrouwen deze detectiemethoden op optica en labels, die mogelijk niet de inheemse biologie weerspiegelen; ze zijn ook minder gecontroleerd dan in vitro methoden en vereisen gespecialiseerde expertise om15 uit te voeren.

De in silico computationele methoden worden voornamelijk gebruikt voor grootschalige screening van doelmoleculen vóór de in vitro experimenten. Computationele voorspellingsmethoden, computergebaseerde databases, moleculaire docking, kwantitatieve structuur-activiteitsrelaties en andere moleculaire dynamica-simulatiebenaderingen behoren tot de gevestigde in silico-tools 16. In vergelijking met moeizame experimentele technieken kunnen de in silico-tools gemakkelijk voorspellingen doen met een hoge gevoeligheid, maar met verminderde nauwkeurigheid in voorspellende prestaties17.

In vitro assays worden uitgevoerd met micro-organismen of biologische moleculen buiten hun standaard biologische context. Het weergeven van biomoleculaire interacties door middel van in vitro methoden is van cruciaal belang voor het begrijpen van eiwitfuncties en de biologie achter het complexe netwerk van celfuncties. De voorkeurstestmethodologie wordt gekozen op basis van de intrinsieke eigenschappen van het eiwit, kinetische waarden en de wijze en intensiteit van interacties18,19.

De interactie Hsp90/Cdc37:
De chaperonne-kinaseroute, die Hsp90 en Cdc37 verbindt, is een veelbelovend therapeutisch doelwit in de tumorbiologie20. Hsp90 speelt een centrale rol in de controle van de celcyclus, eiwitassemblage, celoverleving en signaalroutes. Eiwitten die afhankelijk zijn van Hsp90 voor hun functies worden geleverd aan Hsp90 voor complexatie via een co-chaperonne, zoals Cdc37. Het Hsp90/Cdc37-complex regelt de vouwing van de meeste eiwitkinasen en dient als hub voor een groot aantal intracellulaire signaleringsnetwerken21. Het is een veelbelovend antitumordoel vanwege de verhoogde expressie in verschillende maligniteiten, waaronder acute myeloblastische leukemie, multipel myeloom en hepatocellulair carcinoom22,23.

Veelgebruikte in vitro biomoleculaire interactie detectietechnieken
Co-immunoprecipitatie (co-IP) is een techniek die vertrouwt op antigeen-antilichaamspecificiteit om biologisch relevante interacties te identificeren24. Het belangrijkste nadeel van deze methode is het onvermogen om interacties met lage affiniteit en kinetische waarden te detecteren24. Biofysische methoden zoals isotherme titratiecalorimetrie (ITC), oppervlakteplasmonresonantie (SPR), biolaaginterferometrie (BLI) en FEB-technologie hebben de voorkeur om de kinetische waarden te bepalen.

ITC is een biofysische detectiemethode gebaseerd op de bepaling van bindingsenergie samen met een volledige thermodynamica-analyse om biomoleculaire interacties te karakteriseren25. Het belangrijkste voordeel van ITC is dat het geen etikettering of fixatie van het doeleiwit vereist. De belangrijkste problemen die ITC ondervindt, zijn de hoge concentratie doeleiwit die nodig is voor één experiment en de moeilijkheid om niet-covalente complexen te analyseren als gevolg van kleine bindende enthalpies26. Zowel SPR als BLI zijn labelvrije biofysische technieken die afhankelijk zijn van de immobilisatie van het doelmolecuul op het sensoroppervlak, gevolgd door daaropvolgende injecties van de analyt over het geïmmobiliseerde doel27,28. In SPR worden veranderingen in de brekingsindex tijdens biomoleculaire interacties gemeten27; in BLI wordt de interferentie in gereflecteerd licht in real-time geregistreerd als een verandering in golflengte als functie van tijd28. Zowel SPR als BLI delen gemeenschappelijke voordelen van het aanbieden van hoge specificiteit, gevoeligheid en detectiemogelijkheden29. In beide methoden wordt het doeleiwit geïmmobiliseerd op biosensoroppervlakken en daarom kan er enig verlies zijn van de oorspronkelijke conformatie van het doelwit, waardoor het moeilijk is om onderscheid te maken tussen specifieke versus niet-specifieke interacties30. BLI gebruikt dure wegwerpbare glasvezelbiosensoren om het doelwit te immobiliseren en is daarom een kostbare techniek31. In vergelijking met deze gevestigde biomoleculaire detectietools biedt FEB-technologie een betrouwbaar en labelvrij platform door lage nanomolelarconcentraties te gebruiken voor biomoleculaire detectie in realtime met kinetische karakterisering. De FEB-technologie overwint ook de borrelende uitdagingen in ITC en is kosteneffectiever in vergelijking met SPR of BLI.

De op veldeffecttransistor (FET) gebaseerde biosensoren is een opkomend veld voor het detecteren van biomoleculaire interacties door gevarieerde biomedische toepassingen aan te bieden. In het FET-systeem worden doelen geïmmobiliseerd naar de biosensorchips en interacties worden gedetecteerd door veranderingen in geleiding32. Het unieke kenmerk waarmee rekening moet worden gehouden bij de ontwikkeling van een efficiënte elektronische biosensor zijn de fysisch-chemische eigenschappen zoals de semi-geleidende aard en chemische stabiliteit van het coatingmateriaal dat wordt gebruikt om het sensoroppervlak te fabriceren33. Conventionele materialen zoals silicium die voor FET worden gebruikt, hebben de gevoeligheid van sensoren beperkt omdat het oxidelagen vereist die ingeklemd zitten tussen het transistorkanaal en een specifieke omgeving voor een goede werking34. Bovendien zijn siliciumtransistors gevoelig voor zoutrijke omgevingen, waardoor het moeilijk is om biologische interacties in hun natuurlijke omgeving te meten. De op grafeen gebaseerde biosensor wordt gepresenteerd als een alternatief omdat het een uitstekende chemische stabiliteit en elektrisch veld biedt. Aangezien grafeen een enkele atomaire laag koolstof is, is het zowel extreem gevoelig als een halfgeleider en chemisch compatibel met biologische oplossingen; beide kwaliteiten zijn wenselijk om compatibele elektronische biosensoren te genereren35. Het opmerkelijke ultrahoge laadpotentieel van biomoleculen dat wordt geboden door biosensoren met grafeencoating, leidt tot de ontwikkeling van op grafeen gebaseerde biosensoren FEB-technologie.

Principe van FEB-technologie: FEB is een labelvrije biomoleculaire detectietechniek die de elektrische stroom meet door de grafeenbiosensor waaraan de bindingsdoelen worden geïmmobiliseerd. Interacties tussen het geïmmobiliseerde eiwit en de analyt resulteren in veranderingen in de stroom die in realtime worden gemonitord, waardoor nauwkeurige kinetische metingenmogelijk zijn 36.

Instrumentatie: Het FEB-systeem bestaat uit een grafeenveldeffecttransistor (gFET) sensorchip en een elektronische lezer die gedurende het hele experiment een constante spanning toepast (figuur 1). De analyt wordt in oplossing aangebracht op het doeleiwit dat op het biosensoroppervlak is geïmmobiliseerd. Wanneer een interactie optreedt, wordt een verandering in de stroom gemeten en in realtime geregistreerd. Naarmate de analytconcentratie toeneemt, zal ook de fractie van gebonden analyt toenemen, waardoor hogere wisselingen in de stroom ontstaan. Met behulp van de geautomatiseerde analysesoftware die bij het instrument wordt geleverd (Tabel van materialen), wordt I-Respons gemeten en geregistreerd in termen van biosensing units (BU)37. I-Respons wordt gedefinieerd als de verandering in de stroom (I) door de biosensorchip gemeten in real-time bij de interactie van het geïmmobiliseerde doelwit met de analyt. De geautomatiseerde analysesoftware van het VBO kan zowel de I-Respons als de C-Respons op dynamische interactiegebeurtenissen analyseren, waarbij de C-Respons de veranderingen in de capaciteit (C) registreert. De variaties in zowel de I-Respons als de C-Respons komen direct overeen met de fractie van gebonden analyt en kunnen verder worden geanalyseerd om KD-waarden te genereren. De standaardvoorkeur van de geautomatiseerde analysesoftware is I-Response.

figure-introduction-1
Figuur 1: Overzicht van de experimentele opstelling. (A) Op grafeen gebaseerde chip en een elektronische lezer. (B) Een overzicht van de chipcomponenten. De chip is bevestigd aan twee elektroden die stroom leveren aan het systeem. Het oppervlak van de chip is bedekt met grafeen, dat bij activering het doelwit kan binden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Methodologie:
In eerste instantie wordt de geactiveerde biosensorchip in het FEB-apparaat ingebracht (figuur 1), gevolgd door de uitvoering van de onderstaande stappen: (1) Kalibratie: Het experiment begint met systeemkalibratie met behulp van 1x fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS; pH = 7,4) om de basislijn equilibratierespons te creëren. (2) Associatie: De analyt wordt in de chip geïntroduceerd en de I-respons wordt gemonitord totdat de bindingsverzadiging is bereikt. (3) Dissociatie: De analyt wordt gedissocieerd met behulp van 1x PBS. (4) Regeneratie: Restanten van de analyt worden verwijderd met behulp van 1x PBS. (5) Wassen: In totaal worden vijf wasbeurten uitgevoerd met behulp van 1x PBS voor het grondig verwijderen van de gebonden en ongebonden analyten uit de chip.

Analyse:
Data-analyse wordt uitgevoerd met behulp van de volledig geautomatiseerde software die bij het instrument wordt geleverd. De geautomatiseerde analysesoftware genereert een Hill fit plot met eenKD-waarde . De Hill fit plot beschrijft de associatie van een analyt met het doeleiwit als functie van analytconcentraties. De concentratie waarbij een half-maximale respons wordt bereikt, is evenredig met de KD-waarde . Een lageKD-waarde vertegenwoordigt een hoge bindingsaffiniteit en vice versa.

Om de gegevens verkregen uit het VBO-experiment te valideren, worden I-responsen geëxtraheerd uit elk uitleespunt voor elke analytconcentratie met behulp van de data review/export software en kunnen ze worden geëxporteerd naar andere statistische analysesoftware (zie Tabel met materialen) zoals hieronder uitgelegd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

OPMERKING: De recombinante eiwitten die in deze studie werden gebruikt, Hsp90 en Cdc37, werden commercieel verkregen (zie Tabel met materialen).

1. Chip activering

OPMERKING: Alle materialen die in het experiment moeten worden gebruikt, worden vermeld in de tabel met materialen. Filtreer alle bereide oplossingen door een steriel filter van 0,2 μm.

  1. Bereid 1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide (EDC) oplossing door 2 mg EDC toe te voegen aan 2,5 ml 1 M 2-(N-morfolino) ethaansulfonzuur (MES) buffer (pH = 6,0) in een buis van 15 ml. Bereid N-Hydroxysulfosuccinimide (sulfo-NHS)-oplossingen door 6 mg sulfo-NHS toe te voegen aan 2,5 ml MES-buffer van 1 M (pH = 6,0) in een afzonderlijke buis van 15 ml. Vul 50 μL van elke oplossing in onafhankelijke buizen en bewaar bij -20 °C voor toekomstig gebruik.
  2. Meng gelijke volumes EDC-zandsulfosfo-NHS-oplossing (50 μL EDC + 50 μL sulfo-NHS) door op en neer te pipetteren (geen vortex gebruiken).
    OPMERKING: De gemengde oplossing van EDC/sulfo-NHS moet binnen 30 minuten worden gebruikt om effectieve cross-linking te behouden voor een goede chipfunctionalisatie.
  3. Plaats de door het bedrijf geleverde biosensorchip (5,7 cm x 2,4 cm; zie Materialentabel) in een glazen petrischaaltje met deksel. Alle functionalisatiestappen die betrokken zijn bij chipactivering worden voorgesteld om in de petrischaal te worden uitgevoerd. Breng 50 μL van 1 M MES-buffer (pH = 6,0) aan op de biosensorchip, incubeer gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en zuig vervolgens de buffer op.
  4. Breng onmiddellijk 50 μL EDC/sulfo-NHS-oplossing aan op de sensorchip. Dek de petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig EDC/sulfo-NHS-oplossing uit de chip.
  5. Spoel de chip eenmaal af met 50 μL van 1 M MES-buffer (pH = 6,0); de MES-buffer opzuigen.

2. Doel eiwit immobilisatie

  1. Spoel de chip 2x af met 50 μL van 1x PBS (pH = 7,4). Zuig de PBS uit de chip en voeg het doelmolecuul Hsp90 (50 μL; 500 nM) toe.
    OPMERKING: Buffermismatch kan het hele experiment verpesten; daarom is het belangrijk om vóór het experiment ervoor te zorgen dat het doelmolecuul zich in dezelfde buffer bevindt als die welke wordt gebruikt voor kalibratie (bijv. 1x PBS (pH = 7,4)). Voer indien nodig een bufferuitwisseling uit door nachtelijke dialyse vóór het experiment. In dit experiment werd nachtelijke dialyse uitgevoerd voor beide recombinante eiwitten, Hsp90 en Cdc37, tegen 1x PBS (pH = 7,4; zie Tabel met materialen) met een goede bufferuitwisseling bij 4 °C. De concentratie van het doelmateriaal (Hsp90 in dit geval) kan variëren afhankelijk van verschillende experimentele protocollen en de aard van doelmaterialen (eiwit/peptide/liganden).
  2. Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de oplossing met het doelmolecuul op en spoel 3x met 50 μL 1x PBS (pH = 7,4). Zuig de 1x PBS (pH = 7,4) oplossing uit de chip.
  3. Voeg 50 μL Quench 1 (3,9 mM amino-PEG5-alcohol in 1x PBS (pH = 7,4)) oplossing toe aan de chip. Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig de Quench 1-oplossing uit de chip.
  4. Voeg 50 μL Quench 2 (1 M ethanolamine (pH = 8,5)) oplossing toe aan de chip. Dek de glazen petrischaal af en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Zuig Quench 2-oplossing uit de chip en spoel de chip 5x met 50 μL 1x PBS, waarbij de laatste PBS-druppel op de sensor achterblijft.

3. Voorbereiding van analytmonsters

  1. Bereid analytverdunningsreeksen voor Cdc37 voor in het gewenste concentratiebereik. Voor het eerste experiment werden de volgende concentraties gebruikt: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM en 5.000 nM. Voor het tweede experiment werd een andere set concentraties gebruikt, variërend van 0,4 nM tot 200 nM.
  2. Ontwerp het experiment om ten minste acht verschillende analytconcentraties op te nemen om een betrouwbare KD-waarde te verkrijgen. bereid de verschillende verdunningen van het analyte-eiwit in dezelfde buffer als die welke wordt gebruikt voor kalibratie en doeleiwit; hier is het 1x PBS (pH = 7,4).

4. Laden van de geactiveerde biosensorchip in het FEB-apparaat

OPMERKING: Het FEB-apparaat bestaat uit een lezer met LED-lichtindicaties en een cartridge om de biosensorchip in te brengen.

  1. Na doeleiwitimmobilisatie plaatst u de geactiveerde chip in de cartridge van het apparaat, die via USB op een computer is aangesloten. Na het inbrengen van de chip wordt een groen LED-lampje op de lezer weergegeven dat aangeeft dat het FEB-apparaat klaar is voor het experiment. Installeer de geautomatiseerde software (zie Materiaaltabel) die door het bedrijf wordt geleverd op de computer waarop het FEB-apparaat is aangesloten, om het experiment stap voor stap te volgen zoals hieronder beschreven.

5. Voer het experiment uit

  1. Druk op de module Experiment uitvoeren op de geautomatiseerde software en kies 10 punten met regeneratie of een ander gewenst protocol. Vul de volgende gegevens in: naam van de operator, naam van het experiment, datum (bijv. Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); regeneratiebuffer (bijv. PBS-buffer); geïmmobiliseerd doel (bijv. Hsp90); analyt in oplossing (bijv. Cdc37). Zie aanvullende figuur S1 voor nadere bijzonderheden.
  2. Druk op de knop Experiment starten die in de software wordt weergegeven en volg de instructies die door de geautomatiseerde software worden weergegeven zoals hieronder beschreven.
    OPMERKING: De software is volledig geautomatiseerd, gebruiksvriendelijk en begeleidt de gebruiker stap voor stap tijdens het experiment. Er verschijnt een pop-upvenster op het scherm met instructies om verder te gaan bij elke stap van het experiment. De software geeft instructies voor elke repetitieve stap achtereenvolgens van kalibratie, analytassociatie, dissociatie, regeneratie en wassen (5x) voor elke analytconcentratie gedurende het experiment.
  3. Voer instrumentkalibratie uit. Zuig hiervoor de resterende PBS-oplossing uit de chip en breng 50 μL kalibratiebuffer aan (1x PBS; pH = 7,4). Druk op de knop Doorgaan en wacht 5 minuten totdat de kalibratiestap is voltooid. De software geeft het eindpunt weer dat is bepaald voor de kalibratiestap (5 min) met een waarschuwingsalarm voor follow-up.
  4. Voer vervolgens een analytassociatie uit. Om dit te doen, zuigt u de kalibratiebuffer uit de chip en past u 50 μL van de laagste analytconcentratie (25 nM Cdc37) toe. Druk op de knop Doorgaan en wacht 5 minuten totdat de koppelingsstap is voltooid. De software toont het eindpunt voor de koppelingsstap (5 min) met een waarschuwingsalarm om door te gaan.
  5. Voer een analytdissociatie uit. Om dit te doen, zuigt u de analytoplossing uit de chip en brengt u 50 μL van de dissociatiebuffer aan (1x PBS; pH = 7,4). Druk op de knop Doorgaan en wacht 5 minuten totdat de duur van de dissociatiestap (5 min) is voltooid. De software toont het eindpunt voor de dissociatiestap (5 min) met een waarschuwingsalarm voor follow-up.
  6. Voer vervolgens chipregeneratie uit. Zuig de dissociatieoplossing van de chip aan en breng 50 μL regeneratiebuffer aan (1x PBS; pH = 7,4). Druk op de knop Doorgaan en wacht 30 s totdat de duur van de regeneratiestap (30 s) is voltooid. De software toont het eindpunt voor de regeneratiestap (30 s) met een waarschuwingsalarm voor follow-up.
  7. Was ten slotte de chip. Zuig de regeneratieoplossing uit de chip en breng 50 μL wasbuffer (1x PBS; pH = 7,4) aan op de chip. Zuig de oplossing uit de chip en herhaal dit 5x. Laat de laatste druppel wasbuffer op de chip zitten en druk op de knop Doorgaan en wacht 30 s totdat de duur van de wasstap is voltooid in het softwaredisplay.
    OPMERKING: De software geeft het eindpunt voor de wasstap (30 s) weer met een waarschuwingsalarm om door te gaan met de volgende cyclus van het experiment.
  8. Herhaal de stappen voor elke gebruikte analytconcentratie; de vijf stappen van kalibratie, analytassociatie, dissociatie, regeneratie en wassen (5x) vormen één cyclus. Voor het hier getoonde experiment voerden we 10 cycli uit voor 10 analytconcentraties (variërend van 25 nM tot 5.000 nM of 0,4 nM tot 200 nM; Figuur 2).

6. Analyse

  1. Druk op de knop Analyse boven aan de geautomatiseerde analysesoftware aan het einde van het experiment. Er verschijnt een weergavevenster met alle experimentele punten. Controleer in het venster of de analytconcentraties die voor het voorgeschreven protocol worden gebruikt, correct zijn.
  2. Druk op de knop Analyse uitvoeren om deKD-waarde automatisch te genereren. De software genereert een Hill fit plot door de analytconcentraties uit te zetten tegen de overeenkomstige I-Responsen waaruit de dissociatieconstante bij evenwicht, KD-waarde , wordt berekend.
  3. Exporteer de onbewerkte gegevens voor analyse in andere statistische analysesoftware met behulp van de gegevensbeoordelings- / exportsoftware zoals hieronder beschreven.
    1. Kopieer het R1R-bestand dat automatisch aan het einde van het experiment is gemaakt (bijvoorbeeld Hsp90 + Cdc37 14.03.2021) naar een nieuwe map op het bureaublad. Open de door het bedrijf geleverde software voor gegevensbeoordeling/-export (zie aanvullende figuur S2A).
    2. Klik op Gegevensverwerking > R1R-bestanden verwerken > OK op het startscherm van de software voor gegevensbeoordeling / -export.
    3. Selecteer de map met R1R-bestanden die in stap 6.3.1 op het bureaublad zijn gemaakt. en druk op de knop OK . Hiermee wordt een kopie van de oorspronkelijke R1R-gegevens gemaakt om de gegevens te bekijken en te bewerken zonder het oorspronkelijke bestand te overschrijven.
    4. Druk op het pictogram voor gegevensverwerking dat te zien is op het startscherm van de software voor gegevensbeoordeling/-export. Druk op Load Processed R1R Files > OK. Selecteer dezelfde map die is gemaakt in stap 6.3.1 met verwerkte R1R-bestanden. Druk op OK. Bij deze stap is de map met de experimentbestanden klaar om te worden gecontroleerd.
    5. Druk in het startscherm van software voor gegevensbeoordeling/-export op Gegevensanalyse. Selecteer Kalibratie > bewerkte R1R-bestanden kalibreren > OK (zie Aanvullende figuur S2B). Deze stap kalibreert alle gegevenspunten volgens de eerste kalibratiestap om een basislijn te maken.
    6. Druk in het startscherm van software voor gegevensbeoordeling/-export op Gegevensanalyse. Selecteer R1R-bestanden controleren en bewerken > OK. Controleer de gegevenspunten, verwijder punten of voeg stappen toe met de knop Verwijderen/Stap toevoegen . Zorg ervoor dat alle stappen zich op de juiste plaats bevinden, bijvoorbeeld de kalibratiestap bevindt zich op de basislijn, de koppelingsstap bevindt zich op de piek (zie Aanvullende afbeelding S3) en druk vervolgens op de knop Opslaan om alle aangebrachte wijzigingen op te slaan.
    7. Druk in het startscherm van software voor gegevensbeoordeling/-export op Gegevensanalyse. Selecteer Gegevens analyseren/plotten, kies de stappen die u wilt exporteren (zie Aanvullende afbeelding S4). Voeg elke koppelingsstap (bijvoorbeeld stap 2, stap 7, enzovoort) toe nadat u de kalibratiestap (bijvoorbeeld stap 1, stap 6, enzovoort) hebt afgetrokken van de exportlijst voordat u de gegevens exporteert.
    8. Druk op Deze gegevens exporteren. De software genereert een spreadsheetbestand met de I-respons voor elk analytconcentratiegegevenspunt van elke transistor (als alle transistors werken, hebben we drie verschillende I-responswaarden voor elk concentratiepunt). Gebruik dit spreadsheetbestand om de gegevens in de statistische software verder te analyseren.
  4. Open de statistische analysesoftware. Maak een XY-tabel met drie Y-waarden; druk op Maken. De gegevens voor deze tabel (X-, Y-waarden) worden gekopieerd uit het spreadsheetbestand dat is gemaakt in stap 6.3.8. De x-as komt overeen met de analytconcentratie (afhankelijk van de gebruikte concentratie) en de drie Y-waarden komen overeen met de I-responsen, verkregen uit de door het bedrijf geleverde Data Review/Export-software .
  5. Druk op Deze gegevens analyseren. Kies XY-analyses > niet-lineaire regressie (curve fit) > bindingsverzadiging > één site > totaal. De software analyseert automatisch de gegevens, genereert de KD-waarde en maakt een grafiek van de gegevenspunten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Resultaten van experiment 1:
Het doeleiwit Hsp90 (500 nM) werd geïmmobiliseerd naar de chip volgens het doelimmobilisatieprotocol zoals hierboven beschreven. Voor het eerste experiment werden 10 concentraties van het analyteiwit Cdc37, variërend van 25 nM tot 5.000 nM, bereid op basis van de beschikbare gegevens in de literatuur (zie tabel 1).

De stappen van het experiment kunnen in realtime worden gevolgd door de veranderingen in de I-respons te volgen (

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie werd de haalbaarheid van het gebruik van de FEB-technologie (een real-time kinetische karakteriseringsbenadering) geëvalueerd om de biomoleculaire interactie tussen Hsp90 en Cdc37 te bepalen. Het eerste verkennende experiment (eerste experiment) suggereerde dat het kiezen van de juiste analytconcentraties een cruciaal onderdeel van het experiment is en dat het experiment moet worden ontworpen door concentratiepunten boven en onder de KD-waarde op te nemen, die werden voorspeld op basis van de ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten, financieel of anderszins.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door een subsidie van de Binational Science Foundation (BSF) aan S.K.S. en N.Q.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Automated analysis softwareAgile plus software, Cardea (Nanomed)NA
CAS-nummer: NA		Aangeduid in de tekst als de geautomatiseerde analysesoftware geleverd bij het instrument. Genereert geautomatiseerde analyse.
COOH-BPU (Biosensing Processing Unit)Agile plus software, Cardea (Nanomed)NA
CAS-nummer: NA		biosensorchip
Data review softwareDatalign 1.0, Cardea (Nanomed)NA
CAS-nummer: NA		Aangeduid als de geleverde datareviewsoftware in de tekst. Wordt geleverd met het instrument en maakt het mogelijk om de informatiegegevenspunten te bekijken en te exporteren.
DialysiszakCelluSep,  MembraanfiltratieproductenT2-10-15
CAS-nummer: NA		T2-slangen (6.000-8.000 MWCO), (10 mm fw, 6,4 mm Ø, 0,32 ml/cm, 15 m)
EDC (1-Ethyl-3-(3-dimethylamino propyl) carbodiimide)Cardea (Nanomed)EDC160322-02
CAS-nummer: 25952-53-8		Witte poeder
ITC (Isothermal titration calorimetry) systeemMicrocal-PEAQ-ITC (Malvern, United Kingdom)NA
CAS-nummer: NA
MES (2-(N-morpholino) eetaansulfonzuur) bufferMerckM3671-50G
CAS-nummer: 4432-31-9		Witte poeder
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide) chipsCardea (Nanomed)NA
CAS-nummer: NA		Op grafeen gebaseerde chip
PBS (Fosfaat-gebufferde zoutoplossing) X 10Bio-Lab001623237500 
CAS-nummer: 7758-11-4		Vloeibare transparante oplossing
PipetThermo Scientific11855231
CAS-nummer: NA		Finnpipette F3 5-50 µL, geel
Quench 1 (3,9 mM amino-PEG5-alcohol in 1 X PBS)Cardea (Nanomed)0105-001-002-001
CAS-nummer: NA		Vloeibare, transparante oplossing
Quench 2 (1 M ethanolamine (pH=8,5))Cardea (Nanomed)0105-001-003-001
CAS-nummer: NA		Vloeibare, transparante oplossing
Recombinant eiwit Cdc37Abcamab256157
CAS-nummer: NA
Recombinant eiwit Hsp90 betaAbcamab80033
CAS-nummer: NA
SpreadsheetExcel, Microsoft officeNA
CAS-nummer: NA
Statistisch softwareGraphPad, PrismNA
CAS-nummer: NA		Aangeduid als de andere statistische software. Sigma plot, phyton of andere statistische programma's kunnen ook worden gebruikt
Sulfo-NHSCardea (Nanomed)NHS160321-07
CAS-nummer: 106627-54-7		Witte poeder
TipsAlex roodLC 1093-800-000
CAS-nummer: NA		Tip 1-200 µl, in bulk, 1.000 stuks

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tuncbag, N., Gursoy, A., Guney, E., Nussinov, R., Keskin, O. Architectures and functional coverage of protein-protein interfaces. Journal of Molecular Biology. 381 (3), 785-802 (2008).
  2. Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein–protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
  3. Magliery, T. J., et al. Detecting protein-protein interactions with a green fluorescent protein fragment reassembly trap: Scope and mechanism. Journal of the American Chemical Society. 127 (1), 146-157 (2005).
  4. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  5. Nguyen, T. N., Goodrich, J. A. Protein-protein interaction assays: Eliminating false positive interactions. Nature Methods. 3 (2), 135-139 (2006).
  6. Fernández-Suárez, M., Chen, T. S., Ting, A. Y. Protein-protein interaction detection in vitro and in cells by proximity biotinylation. Journal of the American Chemical Society. 130 (29), 9251-9253 (2008).
  7. Jiang, M., Niu, C., Cao, J., Ni, D. -A., Chu, Z. In silico-prediction of protein–protein interactions network about MAPKs and PP2Cs reveals a novel docking site variants in Brachypodium distachyon. Scientific Reports. 8 (1), 15083(2018).
  8. Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nature Biotechnology. 27 (10), 941-945 (2009).
  9. Wang, W., Goodman, M. T. Antioxidant property of dietary phenolic agents in a human LDL-oxidation ex vivo model: Interaction of protein binding activity. Nutrition Research. 19 (2), 191-202 (1999).
  10. Xing, S., Wallmeroth, N., Berendzen, K. W., Grefen, C. Techniques for the analysis of protein-protein interactions in vivo. Plant Physiology. 171 (2), 727-758 (2016).
  11. Qvit, N., Disatnik, M. -H., Sho, E., Mochly-Rosen, D. Selective phosphorylation inhibitor of delta protein kinase C–Pyruvate dehydrogenase kinase protein–protein interactions: Application for myocardial injury in vivo. Journal of the American Chemical Society. 138 (24), 7626-7635 (2016).
  12. Alam, M. N., Bristi, N. J., Rafiquzzaman, M. Review on in vivo and in vitro methods evaluation of antioxidant activity. Saudi Pharmaceutical Journal. 21 (2), 143-152 (2013).
  13. Paulmurugan, R., Gambhir, S. S. Novel fusion protein approach for efficient high-throughput screening of small molecule–mediating protein-protein interactions in cells and living animals. Cancer Research. 65 (16), 7413-7420 (2005).
  14. Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening: BRET versus FRET. Trends in Pharmacological Sciences. 23 (8), 351-354 (2002).
  15. Deriziotis, P., Graham, S. A., Estruch, S. B., Fisher, S. E. Investigating protein-protein interactions in live cells using bioluminescence resonance energy transfer. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (87), e51438(2014).
  16. Ekins, S., Mestres, J., Testa, B. In silico pharmacology for drug discovery: Methods for virtual ligand screening and profiling. British Journal of Pharmacology. 152 (1), 9-20 (2007).
  17. Valerio, L. G. Application of advanced in silico methods for predictive modeling and information integration. Expert Opinion on Drug Metabolism & Toxicology. 8 (4), 395-398 (2012).
  18. Piehler, J. New methodologies for measuring protein interactions in vivo and in vitro. Current Opinion in Structural Biology. 15 (1), 4-14 (2005).
  19. Ideker, T., Sharan, R. Protein networks in disease. Genome Research. 18 (4), 644-652 (2008).
  20. Lu, H., et al. Recent advances in the development of protein–protein interactions modulators: mechanisms and clinical trials. Signal Transduction and Targeted Therapy. 5 (1), 213(2020).
  21. Jarosz, D. Hsp90: A global regulator of the genotype-to-phenotype map in cancers. Advances in Cancer Research. 129, 225-247 (2016).
  22. Johnson, V. A., Singh, E. K., Nazarova, L. A., Alexander, L. D., McAlpine, S. R. Macrocyclic inhibitors of Hsp90. Current Topics in Medicinal Chemistry. 10 (14), 1380-1402 (2010).
  23. Mahalingam, D., et al. Targeting HSP90 for cancer therapy. British Journal of Cancer. 100 (10), 1523-1529 (2009).
  24. Stewart, A., Fisher, R. A. Co-Immunoprecipitation: Isolation of protein signaling complexes from native tissues. Methods in Cell Biology. 112, 33-54 (2012).
  25. Pierce, M. M., Raman, C. S., Nall, B. T. Isothermal titration calorimetry of protein-protein interactions. Methods. 19 (2), San Diego, Calif. 213-221 (1999).
  26. Paketurytė, V., et al. Inhibitor binding to carbonic anhydrases by isothermal titration calorimetry. Carbonic Anhydrase as Drug Target. , Springer International Publishing. 79-95 (2019).
  27. Grote, J., Dankbar, N., Gedig, E., Koenig, S. Surface plasmon resonance/mass spectrometry interface. Analytical Chemistry. 77 (4), 1157-1162 (2005).
  28. Kumaraswamy, S., Tobias, R. Label-free kinetic analysis of an antibody–antigen interaction using biolayer interferometry. Methods in Molecular Biology. , 165-182 (2015).
  29. Wallner, J., Lhota, G., Jeschek, D., Mader, A., Vorauer-Uhl, K. Application of bio-layer interferometry for the analysis of protein/liposome interactions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 72, 150-154 (2013).
  30. Singh, A. N., Ramadan, K., Singh, S. Experimental methods to study the kinetics of protein–protein interactions. Advances in Protein Molecular and Structural Biology Methods. , 115-124 (2022).
  31. Frenzel, D., Willbold, D. Kinetic titration series with biolayer interferometry. PLoS One. 9 (9), 106882(2014).
  32. Vu, C. -A., Chen, W. -Y. Field-effect transistor biosensors for biomedical applications: Recent advances and future prospects. Sensors. 19 (19), 4214(2019).
  33. Bergveld, P. A critical evaluation of direct electrical protein detection methods. Biosensors & Bioelectronics. 6 (1), 55-72 (1991).
  34. Lowe, B. M., Sun, K., Zeimpekis, I., Skylaris, C. K., Green, N. G. Field-effect sensors – from pH sensing to biosensing: sensitivity enhancement using streptavidin–biotin as a model system. The Analyst. 142 (22), 4173-4200 (2017).
  35. Goldsmith, B. R., et al. Digital biosensing by foundry-fabricated graphene sensors. Scientific Reports. 9 (1), 434(2019).
  36. Afsahi, S., et al. Novel graphene-based biosensor for early detection of Zika virus infection. Biosensors and Bioelectronics. 100, 85-88 (2018).
  37. Afsahi, S. J., et al. Towards novel graphene-enabled diagnostic assays with improved signal-to-noise ratio. MRS Advances. 2 (60), 3733-3739 (2017).
  38. Roe, S. M., et al. The mechanism of Hsp90 regulation by the protein kinase-specific cochaperone p50cdc37. Cell. 116 (1), 87-98 (2004).
  39. Gaiser, A. M., Kretzschmar, A., Richter, K. Cdc37-Hsp90 complexes are responsive to nucleotide-induced conformational changes and binding of further cofactors. The Journal of Biological Chemistry. 285 (52), 40921-40932 (2010).
  40. Popescu, A. I., Găzdaru, D. M., Chilom, C. G., Bacalum, M. Biophysical interactions: Their paramount importance for life. Romanian Reports in Physics. 65 (3), 1063-1077 (2013).
  41. Surya, S., Abhilash, J., Geethanandan, K., Sadasivan, C., Haridas, M. A profile of protein-protein interaction: Crystal structure of a lectin-lectin complex. International Journal of Biological Macromolecules. 87, 529-536 (2016).
  42. Velazquez-Campoy, A., Freire, E. ITC in the post-genomic era...? Priceless. Biophysical Chemistry. 115 (23), 115-124 (2005).
  43. Concepcion, J., et al. Label-free detection of biomolecular interactions using bioLayer interferometry for kinetic characterization. Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. 12 (8), 791-800 (2009).
  44. Helmerhorst, E., Chandler, D. J., Nussio, M., Mamotte, C. D. Real-time and label-free bio-sensing of molecular interactions by surface plasmon resonance: A laboratory medicine perspective. The Clinical Biochemist. Reviews. 33 (4), 161-173 (2012).
  45. Jacob, N. T., et al. Synthetic molecules for disruption of the MYC protein-protein interface. Bioorganic & Medicinal Chemistry. 26 (14), 4234-4239 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Hsp90 Cdc37 interactieeiwit eiwitinteractielabelvrije detectiebiosensorchipdissociatieconstantechipfunctionalisering

Gerelateerde artikelen