Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken

4.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63509

⸱

11 februari 2022

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Reed College, 2Committee on Development, Regeneration, and Stem Cell Biology, University of Chicago, 3Department of Cell and Developmental Biology, University College London

In dit artikel

Samenvatting

Het artikel legt uit hoe de ogen chirurgisch kunnen worden verwijderd van levende zebravislarven als de eerste stap om te onderzoeken hoe retinale input de groei en ontwikkeling van het optische tectum beïnvloedt. Daarnaast biedt het artikel informatie over larvale anesthesie, fixatie en hersendissectie, gevolgd door immunohistochemie en confocale beeldvorming.

Samenvatting

Zebravissen vertonen opmerkelijke levenslange groei en regeneratieve vermogens. Gespecialiseerde stamcelniches die tijdens embryogenese zijn vastgesteld, ondersteunen bijvoorbeeld de continue groei van het hele visuele systeem, zowel in het oog als in de hersenen. Gecoördineerde groei tussen het netvlies en het optische tectum zorgt voor nauwkeurige retinotopische mapping als nieuwe neuronen worden toegevoegd in de ogen en hersenen. Om na te gaan of retinale axonen cruciale informatie leveren voor het reguleren van tectale stam- en voorlopercelgedrag zoals overleving, proliferatie en / of differentiatie, is het noodzakelijk om geïnnerveerde en gedenerveerde tectale kwabben binnen hetzelfde dier en tussen dieren te kunnen vergelijken.

Chirurgische verwijdering van één oog van levende larvale zebravissen gevolgd door observatie van het optische tectum bereikt dit doel. De bijbehorende video laat zien hoe je larven kunt verdoven, wolfraamnaalden elektrolytisch kunt slijpen en ze kunt gebruiken om één oog te verwijderen. Het laat vervolgens zien hoe hersenen van vaste zebravislarven kunnen worden ontleed. Ten slotte biedt de video een overzicht van het protocol voor immunohistochemie en een demonstratie van het monteren van gekleurde embryo's in agarose met een laag smeltpunt voor microscopie.

Inleiding

Het doel van deze methode is om te onderzoeken hoe retinale input de groei en ontwikkeling van het optische tectum, het visuele verwerkingscentrum in het zebravisbrein, beïnvloedt. Door één oog te verwijderen en vervolgens de twee zijden van het optische tectum te vergelijken, kunnen tectale veranderingen binnen hetzelfde monster worden waargenomen en genormaliseerd, waardoor vergelijking tussen meerdere monsters mogelijk is. Moderne moleculaire benaderingen in combinatie met deze techniek zullen inzicht geven in de mechanismen die ten grondslag liggen aan de groei en ontwikkeling van visuele systemen, evenals axonale degeneratie en regeneratie.

Sensorische systemen - visueel, auditief en somatosensorisch - verzamelen informatie van externe organen en geven die informatie door aan het centrale zenuwstelsel, waardoor "kaarten" van de externe wereld in de middenhersenen worden gegenereerd 1,2. Visie is de dominante sensorische modaliteit voor bijna alle gewervelde dieren, inclusief veel vissen. Het netvlies, het neurale weefsel in het oog, verzamelt informatie met een neuronaal circuit dat voornamelijk bestaat uit fotoreceptoren, bipolaire cellen en retinale ganglioncellen (RGC's), de projectieneuronen van het netvlies. RGC's hebben lange axonen die hun weg vinden over het binnenoppervlak van het netvlies naar de oogzenuwkop, waar ze fasciculeren en samen door de hersenen reizen, uiteindelijk eindigend in het visuele verwerkingscentrum in de dorsale middenhersenen. Deze structuur wordt het optische tectum genoemd bij vissen en andere niet-zoogdiergewervelde dieren en is homoloog aan de superieure colliculus bij zoogdieren3.

Het optische tectum is een bilateraal symmetrische meerlagige structuur in de dorsale middenhersenen. Bij zebravissen en de meeste andere vissen ontvangt elke kwab van het optische tectum alleen visuele input van het contralaterale oog, zodat de linker oogzenuw eindigt in de rechter tectale kwab en de rechter oogzenuw eindigt in de linker tectalkwab4 (figuur 1). Net als zijn tegenhanger bij zoogdieren, de superieure colliculus, integreert het optische tectum visuele informatie met andere sensorische inputs, waaronder auditie en somatosensatie, waarbij verschuivingen in visuele aandacht en oogbewegingen zoals saccades 1,5,6 worden geregeld. In tegenstelling tot de superieure colliculus van zoogdieren genereert het optische tectum echter voortdurend nieuwe neuronen en glia uit een gespecialiseerde stamcelniche in de buurt van de mediale en caudale randen van de tectale kwabben die de tectale proliferatiezone7 worden genoemd. Het behoud van proliferatieve voorlopercellen in het optische tectum en andere regio's van het centrale zenuwstelsel draagt gedeeltelijk bij aan de opmerkelijke regeneratieve capaciteit die is gedocumenteerd bij zebravissen8.

Eerder onderzoek naar de hersenen van blinde of eenogige vissen onthulde dat de grootte van het optische tectum recht evenredig is met de hoeveelheid retinale innervatie die het ontvangt 9,10,11. Bij volwassen grotvissen, waarvan de ogen degenereren in vroege embryogenese, is het optische tectum merkbaar kleiner dan dat van nauw verwante, waargenomen oppervlaktevissen9. Cave fish eye degeneratie kan worden geblokkeerd door de endogene lens te vervangen door een lens van een oppervlaktevis tijdens embryogenese. Wanneer deze eenogige grotvissen volwassen worden gemaakt, bevat de geïnnerveerde tectale kwab ongeveer 10% meer cellen dan de niet-geïnnerveerde tectale kwab9. Evenzo was bij larvale killivissen die werden geïncubeerd met chemische behandelingen om ogen van verschillende groottes binnen hetzelfde individu te genereren, de kant van het tectum met meer innervatie groter en bevatte meer neuronen10. Bewijs van oogzenuwverpletteringsexperimenten bij volwassen goudvissen geeft aan dat innervatie proliferatie bevordert, waarbij de proliferatie van tectale cellen afneemt wanneer innervatie werd verstoord11.

Om deze klassieke studies te bevestigen en uit te breiden, bieden verschillende recente rapporten gegevens die suggereren dat proliferatie in reactie op innervatie, althans gedeeltelijk, wordt gemoduleerd door de BDNF-TrkB-route12,13. Veel open vragen over de groei en ontwikkeling van optische tectum blijven bestaan, waaronder hoe een zich ontwikkelend sensorisch systeem omgaat met letsel en axondegeneratie, welke cellulaire en moleculaire signalen retinale input mogelijk maken om de groei van het optische tectum te reguleren, wanneer deze mechanismen actief worden, en of innervatie-gekoppelde proliferatie en differentiatie het netvlies en zijn doelweefsel in staat stellen om groeisnelheden te coördineren en nauwkeurige retinotopische mapping te garanderen. Bovendien zijn er veel grotere vragen over activiteitsafhankelijke ontwikkeling die kunnen worden aangepakt door het visuele systeem van zebravissen te ondervragen met chirurgische benaderingen zoals hieronder beschreven.

Om de cellulaire en moleculaire mechanismen te onderzoeken waarmee neurale activiteit, met name uit visuele input, de overleving en proliferatie van cellen verandert, vergelijkt de beschreven benadering direct geïnnerveerde en gedenervateerde tectale kwabben (figuur 1) binnen individuele zebravislarven. Deze methode maakt het mogelijk om RGC axondegeneratie in het optische tectum te documenteren en te bevestigen dat het aantal mitotische cellen correleert met innervatie.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schetsen van zebravislarven voor en na eenzijdige oogverwijdering. (A) Tekening van 5 dpflarven gezien onder een ontleedmicroscoop. Elke larve is ingebed in agarose met een laag smeltpunt en zijdelings georiënteerd voordat een wolfraamnaald met een scherpe, gehaakte punt wordt gebruikt om het oog naar boven te scheppen (linkeroog in dit voorbeeld). (B) Tekening van het dorsale beeld van een larve van 9 dpf als gevolg van de in A afgebeelde operatie. Slechts drie sterk geschematiseerde RGC-axonen uit het rechteroog worden getoond die zich defasciculeren en verbinden met neuronen in de linker tectalkwab. Afkortingen: dpf = dagen na de bevruchting; dps = dagen na de operatie; RGC = retinale ganglioncellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De methoden in dit artikel zijn uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen en goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committees van Reed College en University College London. Zie de tabel met materialen voor details over zebravissoorten die in deze studie worden gebruikt.

1. Bereid materialen en gereedschappen voor

  1. Maak oplossingen.
    1. Maak embryomedium (E314) door een voorraad van 60x te verdunnen (300 mM NaCl, 10,2 mM KCl, 20 mM CaCl 2-dihydraat en 20 mM MgCl2-hexahydraat in gedeïoniseerd water, geautoclaveerd en bewaard bij kamertemperatuur). Voeg 160 ml 60x E3 toe aan 10 l gedeïoniseerd water. Bewaren bij kamertemperatuur.
    2. Maak 1% laag smeltpunt (LMP) agarose in E3. Los 1 g LMP agarose op in 100 ml E3 door 1-2 minuten op hoog vermogen in de magnetron te koken. Aliquot gesmolten agarose in 1,7 ml microfugebuizen en bewaren bij 4 °C. Kook in een waterbad en houd in een warmteblok van 40 °C wanneer het klaar is voor gebruik voor inbedding.
    3. Maak Marc's Modified Ringers (MMR15) isotone oplossing door een 10x bouillon te verdunnen (1 M NaCl, 20 mM KCl, 10 mM MgSO4, 20 mM CaCl 2-dihydraat, 50 mM HEPES, pH aangepast tot 7,5 met 10 M NaOH, vervolgens geautoclaveerd en bewaard bij kamertemperatuur). Voeg 10 ml 10x MMR toe aan 90 ml gedeïoniseerd water.
  2. Giet Sylgard-platen volgens de instructies van de fabrikant, zodat ze enkele dagen kunnen worden ingesteld en gedroogd16.
  3. Elektrolytisch slijpen wolfraamnaalden (protocol gewijzigd van 17).
    1. Bereid eerst een KOH-oplossing van 10% (w / v) door 200 ml gedeïoniseerd water toe te voegen aan een glazen pot met brede mond en een schroefdeksel. Roer er langzaam 20 g KOH pellets door.
      OPMERKING: Deze bijtende oplossing is sterk exotherm. Draag handschoenen en oogbescherming en roer de oplossing in de capuchon.
    2. Knip een 2-3 cm lengte wolfraamdraad en steek deze in de naaldhouder.
    3. Sluit de kathode- en anodedraden aan op de voeding. Bevestig de krokodillenclip aan het einde van de kathodedraad aan een gedeeltelijk rechtgetrokken paperclip en steek de paperclip in de KOH-oplossing en bevestig deze aan de zijkant van de pot.
    4. Bevestig vervolgens de krokodillenclip van de anodedraad aan de hals van de naaldhouder. Schakel de stroom in (tot ~ 20 V) en dompel de wolfraamdraad in de KOH-oplossing, trek de draad onder een hoek uit de oplossing om de draad elektrolytisch te slijpen tot een fijne punt.
      OPMERKING: Bubbels komen uit de paperclip naarmate de reactie vordert.
    5. Controleer de punt van de naald onder de ontleedmicroscoop om er zeker van te zijn dat deze scherp genoeg is.
    6. Spoel de naald af met gedeïoniseerd water om alle KOH-resten te verwijderen. Maak van tevoren verschillende naalden en bewaar ze tot de larvale operaties en dissecties.
  4. Maak kamerdia's voor het afbeelden van zebravisspecimens met een rechtopstaande confocale microscoop.
    1. Verkrijg glazen microscoopglaasjes en tweedelige epoxyhars (zie de tabel met materialen). Meng de epoxy volgens de instructies op de verpakking en verf dikke ringen of rechthoeken op de glasplaten. Laat de glaasjes voor gebruik minstens 24 uur uitharden en drogen in de kap.

2. Embryo's verzamelen en fokken

  1. Koppel volwassen mannelijke en vrouwelijke vissen van de gewenste genotypen in kweekbakken in de late namiddag / vroege avond. De volgende ochtend, nadat ze hebben gebroed, verzamel je nieuw bevruchte eieren met een gaaszeef en breng je ze over naar E3 in petrischalen van 100 mm.
  2. Incubeer de embryo's bij ~27,5 °C met een 14 uur lichte/10 uur donkere cyclus tot de dag van de operatie. Verander E3 dagelijks of indien nodig.
  3. Voer de larven eenmaal per dag met een druppelaar vol geoogste raderdiertjes, beginnend op 5 dagen na de bevruchting (dpf) of een dag na de operatie. Nadat de larven enkele uren hebben gegeten, verandert u de E3 om eventuele resterende raderdiertjes en afvalproducten te verwijderen.
    OPMERKING: Voer geen larven op de dag van de operatie.

3. Bereid larven voor op een operatie

  1. Gebruik op de dag van de operatie een glazen Pasteur-pipet met brede boring om 10-15 larven over te brengen naar een petrischaal van 35 mm gevuld met verse E3.
  2. Verdoven de larven door 3-5 druppels van 0,4% w/v Tricaïne-oplossing (0,4 g Tricaïne opgelost in 210 mM Tris, pH 9; eindoplossing aangepast tot een pH van 7,4 indien nodig18) toe te voegen aan de schaal voor een eindconcentratie van ~0,0015% w/v Tricaïne. Zoek naar een gebrek aan reactie op aanraking om te bepalen of de larven voldoende zijn verdoofd. Als ze na ~ 3 minuten nog steeds reageren op aanraking, voeg dan nog 2-3 druppels van 0,4% w / v Tricaine-oplossing toe en beoordeel opnieuw.
    OPMERKING: In dit stadium van ontwikkeling is het mogelijk om de bloedstroom en hartslag naast de beweeglijkheid onder de ontleedmicroscoop te controleren.
  3. Immobiliseer de verdoofde zebravislarven door ze in te bedden in 1% LMP-agarose opgelost in E3.
    1. Plaats eerst het deksel van een petrischaaltje van 35 mm met de voorkant naar boven onder de ontleedmicroscoop. Neem vervolgens een larve omhoog in een glazen Pasteur-pipet met smalle boring met slechts een kleine hoeveelheid E3.
    2. Zuig vervolgens ~200 μL gesmolten, warm (~40 °C) 1% LMP agarose in de pipet met de larve. Spuit ten slotte de larve en agarose op het omgekeerde petrischaaldeksel.
    3. Gebruik een doffe wolfraamnaald om de larve snel maar voorzichtig te manoeuvreren zodat deze zijdelings is, met één oog naar boven gericht. Wacht tot de agarose is ingesteld (~ 5 min).
      OPMERKING: Als de agarose uithardt terwijl de larve niet lateraal is, bevrijdt u deze van de agarose (zoals beschreven in stap 5) en brengt u deze terug naar de schaal met E3 en tricaine.

4. Oogverwijdering

  1. Zodra de agarose is ingesteld en de larve zijdelings is gepositioneerd, gebruikt u de punt van een zeer fijne, elektrolytisch geslepen wolfraamnaald om de huid rond het oog te doorboren en de rand van de oogbaan te volgen.
  2. Schuif vervolgens de rand van de naald (niet de punt) onder het oog vanaf de temporale ventrale kant van het oog. Gebruik gecontroleerde druk om het oog uit de oogkas te halen.
  3. Gebruik een zeer fijne chirurgische tang om het oog te verwijderen door in de oogzenuw te knijpen en het oog van mediaal naar lateraal te duwen. U kunt ook gewoon dorsaal en vooraan op het oog blijven drukken met de zijkant van de naald, uiteindelijk door de oogzenuw snijden en het oog loslaten.
    OPMERKING: Als andere weefsels dan het oog per ongeluk worden gestoken tijdens de operatie, doodt u de larve snel en humaan door snelle onthoofding.

5. Postoperatieve zorg tot experimenteel eindpunt

  1. Na succesvolle oogverwijdering, bedek de agarose met MMR-oplossing.
  2. Bevrijd elke larve van de agarose door voorzichtig een wolfraamnaald rond hun hoofd en vervolgens rond hun lichaam te borstelen terwijl ze het deksel van de petrischaal met een tang stabiliseren.
  3. Breng de eenogige larven over in een petrischaaltje van 35 mm met MMR aangevuld met een verdunning van 1:100 van een penicilline/streptomycine cocktail. Incubeer de embryo's bij ~27,5 °C met een 14 uur lichte/10 uur donkere cyclus.
    OPMERKING: Deze isotone oplossing van MMR aangevuld met antibiotica helpt in eerste instantie de larvale genezing en overleving. Elk gerecht kan tot 15 herstellende larven bevatten.
  4. Breng de larven de volgende dag terug naar de E3. Voer vanaf de middag na de operatie larven (~ 6 dpf en ouder) eenmaal per dag met een druppelaar vol geoogste raderdiertjes. Nadat de larven enkele uren hebben gegeten, verander je de E3 om eventuele resterende raderdiertjes en afvalproducten te verwijderen.

6. Larven fixeren

  1. Zodra de larven het gewenste ontwikkelingsstadium voor analyse hebben bereikt, verdooft u ze met een dodelijke dosis tricaïne (~ 0,4% eindconcentratie) totdat hun hart is gestopt.
  2. Pipetteer tot 30 larven per microfugebuis van 1,5 ml. Verwijder overtollige E3 en voeg vervolgens 0,5-1 ml fixatieve oplossing (4% paraformaldehyde (PFA) en 4% sucrose in fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)) toe om het weefsel te fixeren. Incubeer de larven een nacht bij 4 °C.
  3. Was de larven de volgende dag met PBS door het fixeermiddel te verwijderen en de larven 3-4 keer af te spoelen met PBS. Bewaar de larven bij 4 °C gedurende maximaal 7 dagen vóór de dissectie.

7. Larven ontleden om hersenen te onthullen (aangepast van 15)

  1. Hang de vaste larven in PBS-druppeltjes op een Sylgard-plaat onder een ontleedmicroscoop. Zet ze zijdelings vast door twee wolfraampennen (meestal oude wolfraamnaalden die minder dan 2 cm zijn) door het notochord te plaatsen, met één pin net achter het gepigmenteerde gebied dat het aorta-gonade-mesonephros (AGM) -gebied bedekt en een andere in lijn met het einde van de dooierverlenging.
    OPMERKING: Plaats de wolfraampennen in zo min mogelijk pogingen omdat het weefsel bij elke punctie brokkeliger wordt.
  2. Gebruik een zeer scherpe wolfraamnaald en naaldscherpe tang om de hersenen bloot te leggen door in deze volgorde het oog (de ogen), het oor, de kaak, het spijsverteringskanaal en de dorsale schedelhuid te verwijderen.
    1. Verwijder eerst het oog met behulp van een techniek die vergelijkbaar is met de chirurgische oogverwijdering in stap 4. Maak vervolgens de larve los en draai hem naar de andere kant, zodat het andere oog toegankelijk is en herhaalt. U kunt ook de naald door de kaak naar de andere kant prikken en het oog verwijderen zonder los te maken.
      OPMERKING: Ogen kunnen op dit punt worden verzameld als analyse van dit weefsel gewenst is (vergelijkbaar met 19).
    2. Gebruik vervolgens de wolfraamnaald om van de temporale naar de ventrale kant van het oor te krabben. Breng in dezelfde actie/beweging de naald achteraan naar de kaak en trek zachtjes naar voren totdat het oor en de kaak zijn verwijderd.
    3. Gebruik een tang om de ventrale organen en eventuele resterende dooier eruit te trekken.
    4. Maak ten slotte een ondiepe incisie in de dorsale schedelhuid in de buurt van de kruising tussen de achterhersenen en het ruggenmerg. Til de huid op met de tang en trek deze vooraan en rond het telencephalon. Als dit te moeilijk blijkt, begin dan bij de eerste incisie in de achterhersenen en trek de huid eerst zijdelings en vervolgens ventraal en anterieur, waarbij u er goed op let dat u de laterale randen van het tectum niet krabt.
      OPMERKING: Omdat de middenhersenen het object van studie zijn, kan de achterhersenen worden doorgesneden; een diepe incisie kan echter leiden tot onthoofding.
    5. Verwijder eventueel achtergebleven weefsel met een tang. Maak de larve los en breng over naar PBS in een microfugebuis van 1,5 ml.
      OPMERKING: Laat de staart aan de hersenen vastzitten voor een betere zichtbaarheid bij het uitvoeren van wholemount-protocollen.

8. Uitdroging en opslag van de hersenen

  1. Verwijder PBS uit de hersenen en voeg 1 ml PBS toe met 0,1% TritonX-100 (PBST). Incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
  2. Verwijder de PBST en vervang deze door een 50:50 methanol:PBST oplossing. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Was de hersenen tweemaal met 100% methanol (MeOH) gedurende 5 minuten elk bij kamertemperatuur.
  4. Bewaar de hersenen in 100% MeOH bij -20 °C gedurende ten minste 16 uur voordat immunohistochemie of andere wholemount-procedures worden uitgevoerd.
    OPMERKING: Hersenen kunnen tot 2 jaar in MeOH worden bewaard bij -20 °C.

9. Immunohistochemie

OPMERKING: Gevestigde protocollen voor veel nuttige wholemount-technieken bij zebravissen zijn te vinden op ZFIN20. Dit manuscript geeft voorbeelden van het vergelijken van eenogige en tweeogige larven die immuungekleurd waren met antilichamen die ofwel het rode fluorescerende eiwit (RFP) herkennen, dat tot expressie komt in axonen van de oogzenuw in de Tg[atoh7:RFP] -lijn (figuur 2), of gefosforyleerde histon H3 (PH3), die mitotische cellen benadrukt (figuur 3). Een standaard immunohistochemisch protocol voor hele embryo's en larven wordt hieronder samengevat.

  1. Rehydrateer eerst de larvale hersenen met een gesorteerde reeks MeOH:PBST-wasbeurten bij kamertemperatuur door de monsters gedurende 5 min in 50:50 MeOH:PBST te broeden, vervolgens in 30:70 MeOH:PBST gedurende 5 minuten en eindigend met 3 wasbeurten PBST.
  2. Om de hersenen te permeabiliseren, incubeer ze in PBST aangevuld met proteïnase K (PK) in een eindconcentratie van 20 μg / ml PK gedurende 30 minuten bij 37 °C. Bewaar aliquots van 10 mg/ml PK bij -20 °C en ontdooi ze voor gebruik.
  3. Verwijder de PK-oplossing en spoel het resterende enzym weg door de hersenen 3 keer in 15 minuten met PBST te spoelen.
  4. Refixeer de gepermeabiliseerde hersenen door ze gedurende 20 minuten bij 25 °C (of kamertemperatuur) in 4% PFA te incuberen. Verwijder vervolgens PFA en spoel het resterende fixeermiddel weg door de hersenen 3 keer gedurende 15 minuten te spoelen met PBST.
  5. Vervang de laatste PBST-spoeling door vers gemaakte immunoblocking (IB) buffer (10% normaal geitenserum en 1% DMSO in PBST) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende ten minste 1 uur.
  6. Verdun primaire antilichamen in IB-buffer met de juiste concentratie (bijv. 1:500 voor RFP en 1:300 voor PH3-antilichamen).
  7. Verwijder de IB-buffer uit de hersenen en vervang deze door de primaire antilichaamverdunning. Incubeer 's nachts bij 4 °C op een orbitale shaker met zacht wiegen. Zorg ervoor dat buizen stevig op hun zijkanten rusten.
  8. Verwijder de volgende ochtend de primaire antilichaamoplossing met een micropipette, spoel een paar keer in PBST en was vervolgens de hersenen in PBST bij kamertemperatuur gedurende 4 x 30 minuten.
    OPMERKING: Primaire antilichaamverdunningen kunnen eenmaal binnen ~ 7 dagen worden hergebruikt als ze bij 4 °C worden bewaard.
  9. Spoel de hersenen in IB-buffer terwijl secundaire antilichamen in IB-buffer worden verdund met de juiste concentratie (bijv. 1:500 voor Alexa-fluor 568 anti-konijn).
  10. Verwijder de IB-buffer en vervang deze door de secundaire antilichaamverdunning. Incubeer 's nachts bij 4 °C op een orbitale schudder met zacht wiegen van de buizen die op hun zijkant rusten.
  11. Verwijder de volgende ochtend de secundaire antilichaamoplossing, spoel met PBST en was vervolgens de hersenen in PBST bij kamertemperatuur gedurende 4 x 30 minuten.
  12. Counterstain met 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) of ToPro3 (1:5.000 in PBST bij 4 °C 's nachts).
  13. Breng de volgende ochtend de larvale hersenen over in PBS en ga verder met de onderstaande montage- en beeldvormingsstappen.

10. Montage en beeldvorming

  1. Bevestig een kamerschuif in het deksel van een petrischaaltje van 100 mm met vacuümvet.
  2. Breng de immunosivijn en verwerkte larven over naar een putplaat of depressieglaasje om ze met een ontleedmicroscoop te bekijken.
  3. Monteer de larven op de kamerglijbaan in kolommen van 1% LMP agarose.
    1. Gebruik een glazen Pasteur-pipet en plaats één larve op de kamerplaat en zet zo min mogelijk PBS af. Bedek met dezelfde pipet de larve met gesmolten 1% LMP agarose (~40 °C).
    2. Trek met een stompe wolfraamnaald of -tang de agarose in een kolom en positioneer de larve vervolgens zo symmetrisch mogelijk, met het dorsale oppervlak zichtbaar.
    3. Herhaal deze procedure voor de resterende larven.
    4. Zodra de agarose is gelled, bedek je het met een paar druppels PBS en plaats je het vervolgens op het podium van de confocale microscoop.
  4. Lijn de objectieflens uit met het monster, richt de microscoop scherp met doorgelaten licht en verlicht het monster met de juiste lasers.
    OPMERKING: In dit voorbeeld werden golflengten van 405 nm en 568 nm gebruikt om respectievelijk DAPI en RFP te prikkelen.
  5. Pas de versterking, offset en laservermogen aan door de schuifbalken naar een geschikt niveau te verplaatsen ten opzichte van het signaal en de gebruikte detector. Controleer de histogrammen voor elk kanaal en klik op de indicatorknop voor de verzadigingstoestand boven de afbeelding om het belichtingsniveau te meten, om ervoor te zorgen dat geen van de pixels verzadigd is en dat de signaal-ruisverhouding hoog is. Voor een voorbeeld van optimale confocale beeldvormingsparameters voor cellulaire en subcellulaire resolutie binnen zebravissen, zie 21.
  6. Stel de boven- en ondergrenzen van de stapel z-vlakken in met behulp van het scrollwiel op de muis om de boven- en onderkant van het monster te vinden. Klik op de boven- en onderlimiet voor het verkrijgen van afbeeldingen en activeer vervolgens de z-stack-opname door op de knop Nu uitvoeren te klikken.
    OPMERKING: Afhankelijk van hoe symmetrisch de hersenen zijn gemonteerd, zal de totale z-diepte voor een 9 dpf larvale zebravishersenen ~ 150-200 μm zijn.
  7. Verwerk en kleur de afbeeldingen met kleurenblinde toegankelijkheid in gedachten (gebruik bijvoorbeeld blauw en oranje of magenta en groen voor tweekleurenafbeeldingen). Stel opzoektabellen in de software in die wordt gebruikt om de afbeeldingen vast te leggen of beeldverwerkingssoftware zoals Photoshop van Adobe.
  8. In Photoshop worden color raw-fotomicrografen opgeslagen als 8-bits TIFF (Tagged Image File Format) door (i) de afbeeldingsmodus te converteren naar RGB en (ii) de optie Curven te openen onder de afbeelding | Pas menu's aan en schuif vervolgens (iii) de juiste gekleurde lichtopbrengsten naar 0 of 255 niveaus om de gewenste kleur te bereiken. Als u bijvoorbeeld een groen signaal wilt bereiken, selecteert u het rode kanaal en schuift u de uitvoer naar 0; selecteer vervolgens het blauwe kanaal en schuif de uitvoer ook naar 0 . Evenzo, om een magenta-signaal te bereiken, selecteert u het groene kanaal en schuift u de uitvoer naar 0; laat de rode en blauwe kanalen zoals ze zijn.
    OPMERKING: Soortgelijke stappen kunnen worden uitgevoerd in het gratis Gnu Image Manipulation Program (GIMP).
  9. Kwantificeer handmatig het aantal cellen dat een specifieke marker weergeeft met behulp van de plug-in voor celtellers in ImageJ22, beschikbaar onder Analyseren in het menu Plug-ins. Voorbeelden van het gebruik van ImageJ voor het tellen van cellen zijn te vinden in vele tutorials, waaronder 23.
  10. Genereer grafische weergaven van gegevens in statistische software zoals RStudio (zie aanvullende gegevens voor . Rmd-bestand).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Om te bevestigen of de oogverwijdering voltooid was en te beoordelen hoe het optische tectum verandert, werden operaties uitgevoerd in de Tg[atoh7:RFP]-stam, die alle RGC's labelt met een op het membraan gerichte RFP en dus alle axonen die uit het netvlies projecteren en de oogzenuw vormen24. Hoewel het gebruik van deze stam niet absoluut noodzakelijk is, maakt het eenvoudige observatie en visualisatie van de oogzenuw termini in de optische tectum neuropil mogelijk. Andere benaderingen vo...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De technieken die in dit artikel worden beschreven, illustreren een van de vele benaderingen voor het bestuderen van de ontwikkeling van visuele systemen van gewervelde dieren bij zebravissen. Andere onderzoekers hebben methoden gepubliceerd om het embryonale netvlies te ontleden en genexpressieanalyses19 uit te voeren of neuronale activiteit in het optische tectum30 te visualiseren. Dit artikel biedt een benadering voor het onderzoeken hoe differentiële retinale input het ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

Financiering voor dit werk werd voornamelijk ondersteund door start-upfondsen van Reed College tot KLC, Helen Stafford Research Fellowship-fondsen tot OLH en een Reed College Science Research Fellowship tot YK. Dit project begon in het lab van Steve Wilson als een samenwerking met HR, die werd ondersteund door een Wellcome Trust Studentship (2009-2014). We bedanken Máté Varga, Steve Wilson en andere leden van het Wilson-lab voor de eerste discussies over dit project, en we bedanken in het bijzonder Florencia Cavodeassi en Kate Edwards, die KLC als eersten leerden hoe ze embryo's in agarose konden monteren en hersendissecties van zebravissen konden uitvoeren. We bedanken ook Greta Glover en Jay Ewing voor hun hulp bij het in elkaar zetten van ons wolfraam naaldslijpapparaat.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Uitrusting en benodigdheden:
FokkerijbakkenAquaneeringZHCT100
Dow Corning hoog vacuüm vetSigma of gelijkwaardige leverancierZ273554
Erlenmeyer kolven (125 mL)Voor het maken van Marc's Modified Ringers (MMR) met antibiotica voor incubatie na de operatie.
Fijne pincetten - Dumont #5Fine Science Tools (FST)11252-20
Glazen Pasteur pipettenDWK Lifescience63A53 & 63A53WTVoor het pipetteren van embryo's en larven.
Glasmijt voor microscopieVWR of gelijkwaardige leverancier48311-703Standaard glazen microscoopglazen kunnen bij veel verschillende laboratoriumleveranciers worden besteld.
Glaswerk inclusief afgemeten flessen en afgemeten cilindersVoor het maken en opslaan van oplossingen.
2-delig epoxyharsACE Hardware of andere gelijkwaardige leverancier van Gorilla Glue of gelijkwaardig0,85 oz spuithttps://www.acehardware.com/departments/paint-and-supplies/tape-glues-and-adhesives/glues-and-epoxy/1590793
Microcentrifugebuis (1,7 mL)VWR of gelijkwaardige leverancier22234-046
Met nikkel beplaat pin houder (17 cm lengte)Fine Science Tools (FST)26018-17Om wolfraamdraad vast te houden tijdens het slijpen en uitvoeren van operaties/dissecties.
Nylon gaas theezeef of gelijkwaardigAli Express of gelijkwaardigVoor het oogsten van zebravis eieren na het paaien; https://www.aliexpress.com/item/1005002219569756.html
PaperclipVoor Tungsten naald slijpapparaat.
Petrischalen 100 mmFischer Scientific of gelijkwaardige leverancier50-190-0267
Petrischalen 35 mmFischer Scientific of gelijkwaardige leverancier08-757-100A
Pipet pompSP Bel-Art of gelijkwaardigF37898-0000
Kaliumhydroxide (KOH)Sigma909122Voor Tungsten naald slijpapparaat. Maak een 10% w/v oplossing van KOH in de kap door pellets toe te voegen aan gedeïoniseerd water.
Voeding (variabele spanning)Voor Tungsten naald slijpapparaat. Elke voeding met variabele spanning zal werken (zelfs een die voor gelelektroforese wordt gebruikt).
Sylgard 184 Elastomer kitDow Corning3097358
Wolfraamdraad (0,125 mm diameter)World Precision Instruments (WPI)TGW0515Slepen om oog te verwijderen en larven te dissecteren.
Temperatuurregelbare hitteblokThe Lab Depot of gelijkwaardige leverancierBSH1001 of BSH1002Vooraf ingesteld op 40-42 °C.
Breedmond glazen pot met deksel (bijv. schone jam- of salsapot)Voor Tungsten naald slijpapparaat.
Draad met alligator clip kabelsVoor Tungsten naald slijpapparaat.
Microscopen:
DissectiemicroscoopElk type zal werken, maar het hebben van instelbare getransmetteerde licht op een gespiegelde basis wordt geprefereerd.
Laser scanning confocale microscoopHoog NA, 20-25x water dompel objectief lens wordt aanbevolen.
Microscoop controle en beeldvastlegging software (NIS-Elements van Nikon) wordt hier gebruikt, maar elke confocale microscoop zal werken.
Reagentia voor operaties en dissecties:
Calciumchloride dihydraatSigmaC7902Voor Marc's Modified Ringers (MMR) en embryo medium (E3).
HEPESSigmaH7006Voor Marc's Modified Ringers (MMR).
Laag smeltpunt agaroseInvitrogen16520-050Maak 1% in embryo medium (E3) of Marc's Modified Ringers (MMR).
Magnesiumchloride hexahydraatSigma1374248Voor embryo medium (E3).
MagnesiumsulfaatSigmaM7506Voor Marc's Modified Ringers (MMR).
ParaformaldehydeElectron Microscopy Sciences19210Verdun 8% (w/v) stock met 2x geconcentreerd PBS (verdund uit 10x PBS stock).
Penicilline/StreptomycineSigmaP4333-20MLVerdun 1:100 in Marc's Modified Ringers.
Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tablettenDiagnostic BioSystemsDMR E404-01Maak 10x stock in gedeïoniseerd water, autoclaveer en bewaar op kamertemperatuur. Verdun tot 1x werkconcentratie.
KaliumchlorideSigmaP3911Voor Marc's Modified Ringers (MMR) en embryo medium (E3).
NatriumchlorideSigmaS9888Voor Marc's Modified Ringers (MMR) en embryo medium (E3).
NatriumhydroxideSigmaS5881Maak 10 M en gebruik om de pH van MMR aan te passen tot 7,4.
SucroseSigmaS9378
Tricaine-SPentair100G #TRS1Recept: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE
Reagentia voor immunohistochemie:
Alexafluor 568 getagd secundair antilichaam om konijn IgG te detecterenInvitrogenA-11011Gebruik bij een 1:500 verdunning voor immunohistochemie van gehele mount.
DAPI of ToPro3Invitrogen1306 of T3605Maak 1 mg/mL oplossingen in DMSO

Referenties

  1. Butler, A. B., Hodos, W. Optic tectum. Comparative Vertebrate Neuroanatomy: Evolution and Adaptation. , John Wiley & Sons, Inc. 311-340 (2005).
  2. Cang, J., Feldheim, D. A. Developmental mechanisms of topographic map formation and alignment. Annual Review of Neuroscience. 36 (1), 51-77 (2013).
  3. Basso, M. A., Bickford, M. E., Cang, J. Unraveling circuits of visual perception and cognition through the superior colliculus. Neuron. 109 (6), 918-937 (2021).
  4. Burrill, J. D., Easter, S. S. Development of the retinofugal projections in the embryonic and larval zebrafish (Brachydanio rerio). The Journal of Comparative Neurology. 346 (4), 583-600 (1994).
  5. Nona, S. Regeneration in the goldfish visual system. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-goldfish-visual-system/ (2021).
  6. Sauve, Y., Gaillard, F. Regeneration in the visual system of adult mammals. Webvision: The Organization of the Retina and Visual System. , Available from: https://webvision.med.utah.edu/book/part-x-repair-and-regeneration-in-the-visual-system/regeneration-in-the-visual-system-of-adult-mammals/ (2021).
  7. Cerveny, K. L., Varga, M., Wilson, S. W. Continued growth and circuit building in the anamniote visual system. Developmental Neurobiology. 72 (3), 328-345 (2012).
  8. Lindsey, B. W., et al. Midbrain tectal stem cells display diverse regenerative capacities in zebrafish. Scientific Reports. 9 (1), 4420(2019).
  9. Soares, D., Yamamoto, Y., Strickler, A. G., Jeffery, W. R. The lens has a specific influence on optic nerve and tectum development in the blind cavefish Astyanax. Developmental Neuroscience. 26 (5-6), 308-317 (2004).
  10. White, E. L. An experimental study of the relationship between the size of the eye and the size of the optic tectum in the brain of the developing teleost, Fundulus heteroclitus. Journal of Experimental Zoology. 108 (3), 439-469 (1948).
  11. Raymond, P., Easter, S., Burnham, J., Powers, M. Postembryonic growth of the optic tectum in goldfish. II. Modulation of cell proliferation by retinal fiber input. The Journal of Neuroscience. 3 (5), 1092-1099 (1983).
  12. Sato, Y., Yano, H., Shimizu, Y., Tanaka, H., Ohshima, T. Optic nerve input-dependent regulation of neural stem cell proliferation in the optic tectum of adult zebrafish. Developmental Neurobiology. 77 (4), 474-482 (2017).
  13. Hall, Z. J., Tropepe, V. Visual experience facilitates BDNF-dependent adaptive recruitment of new neurons in the postembryonic optic tectum. The Journal of Neuroscience. 38 (8), 2000-2014 (2018).
  14. Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish. , Oxford University Press. (2002).
  15. Cold Spring Harbor Protocols. Marc's modified Ringer's (MMR) (10X, pH 7.4). Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  16. Turner, K. J., Bracewell, T. G., Hawkins, T. A. Anatomical dissection of zebrafish brain development. Brain Development. 1082, 197-214 (2014).
  17. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bulletin of the World Health Organization. 32 (1), 143-144 (1965).
  18. ZFIN Tricaine recipe. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/pages/362220023/TRICAINE (2018).
  19. Zhang, L., Leung, Y. F. Microdissection of zebrafish embryonic eye tissues. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (40), e2028(2010).
  20. ZFIN protocols. , Available from: https://zfin.atlassian.net/wiki/spaces/prot/overview (2021).
  21. Engerer, P., Plucinska, G., Thong, R., Trovò, L., Paquet, D., Godinho, L. Imaging subcellular structures in the living zebrafish embryo. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (110), e53456(2016).
  22. ImageJ with batteries included. Fiji. , Available from: https://figi.sc/ (2021).
  23. O'Brien, J., Hayder, H., Peng, C. Automated quantification and analysis of cell counting procedures using ImageJ plugins. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (117), e54719(2016).
  24. Poggi, L., Vitorino, M., Masai, I., Harris, W. A. Influences on neural lineage and mode of division in the zebrafish retina in vivo. The Journal of Cell Biology. 171 (6), 991-999 (2005).
  25. Karlstrom, R. O., et al. Zebrafish mutations affecting retinotectal axon pathfinding. Development. 123 (1), 427-438 (1996).
  26. Harvey, B. M., Baxter, M., Granato, M. Optic nerve regeneration in larval zebrafish exhibits spontaneous capacity for retinotopic but not tectum specific axon targeting. PLOS ONE. 14 (6), 0218667(2019).
  27. Robles, E., Filosa, A., Baier, H. Precise lamination of retinal axons generates multiple parallel input pathways in the tectum. Journal of Neuroscience. 33 (11), 5027-5039 (2013).
  28. Vargas, M. E., Barres, B. A. Why Is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annual Review of Neuroscience. 30 (1), 153-179 (2007).
  29. Hughes, A. N., Appel, B. Microglia phagocytose myelin sheaths to modify developmental myelination. Nature Neuroscience. 23 (9), 1055-1066 (2020).
  30. de Calbiac, H., Dabacan, A., Muresan, R., Kabashi, E., Ciura, S. Behavioral and physiological analysis in a zebrafish model of epilepsy. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (176), e58837(2021).
  31. Adams, S. L., Zhang, T., Rawson, D. M. The effect of external medium composition on membrane water permeability of zebrafish (Danio rerio) embryos. Theriogenology. 64 (7), 1591-1602 (2005).
  32. Fredj, N. B., et al. Synaptic activity and activity-dependent competition regulates axon arbor maturation, growth arrest, and territory in the retinotectal projection. Journal of Neuroscience. 30 (32), 10939-10951 (2010).
  33. Alberio, L., et al. A light-gated potassium channel for sustained neuronal inhibition. Nature Methods. 15 (11), 969-976 (2018).
  34. Kay, J. N., Finger-Baier, K. C., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. Retinal ganglion cell genesis requires lakritz, a zebrafish atonal homolog. Neuron. 30 (3), 725-736 (2001).
  35. Gnuegge, L., Schmid, S., Neuhauss, S. C. F. Analysis of the activity-deprived zebrafish mutant macho reveals an essential requirement of neuronal activity for the development of a fine-grained visuotopic map. The Journal of Neuroscience. 21 (10), 3542-3548 (2001).
  36. Jeffery, W. R. Astyanax surface and cave fish morphs. EvoDevo. 11 (1), 14(2020).
  37. Sieger, D., Peri, F. Animal models for studying microglia: The first, the popular, and the new. Glia. 61 (1), 3-9 (2013).
  38. Svahn, A. J., et al. Development of ramified microglia from early macrophages in the zebrafish optic tectum. Developmental Neurobiology. 73 (1), 60-71 (2013).
  39. Herzog, C., et al. Rapid clearance of cellular debris by microglia limits secondary neuronal cell death after brain injury in vivo. Development. 146 (9), (2019).
  40. Chen, J., Poskanzer, K. E., Freeman, M. R., Monk, K. R. Live-imaging of astrocyte morphogenesis and function in zebrafish neural circuits. Nature Neuroscience. 23 (10), 1297-1306 (2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Optisch tectumretinale axonenneurale ontwikkelingdissectie van de hersenenimmunohistochemielive-cell imagingWalleriaanse degeneratiestamcelniches
Oogverwijdering bij levende zebravislarven om innervatie-afhankelijke groei en ontwikkeling van het visuele systeem te onderzoeken
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.