Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Elektrofysiologische methoden voor het meten van fotopigmentniveaus in Drosophila-fotoreceptoren

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63514

⸱

2 juni 2022

 ,  , 
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

In dit artikel

Samenvatting

We presenteren een protocol om bi-stabiele fotopigmenten elektrofysiologisch te karakteriseren: (i) het benutten van de ladingsverplaatsingen binnen de fotopigmentmoleculen na fotonabsorptie en hun enorme hoeveelheid in de fotoreceptoren, en (ii) het benutten van de absorptie-spectraverschillen van rhodopsine en metarhodopsine fotopigmenttoestanden. Deze protocollen zijn nuttig om te screenen op mutaties die bi-stabiele fotopigmentsystemen beïnvloeden.

Samenvatting

Het Drosophila G-eiwit-gekoppelde fotopigment rhodopsine (R) bestaat uit een eiwit (opsine) en een chromofoor. Het activeringsproces van rhodopsine wordt geïnitieerd door fotonabsorptie-inducerende isomerisatie van de chromofoor, waardoor conformatieveranderingen van het opsine worden bevorderd en resulteert in een tweede donkerstabiele fotopigmenttoestand (metarhodopsine, M). Onderzoek van dit bi-stabiele fotopigment met behulp van willekeurige mutagenese vereist eenvoudige en robuuste methoden voor het screenen van gemuteerde vliegen. Daarom zijn verschillende methoden ontworpen voor het meten van verminderingen van functionele fotopigmentniveaus. Een dergelijke methode maakt gebruik van de ladingsverplaatsingen in het fotopigment na fotonabsorptie en de enorme hoeveelheden fotopigmentmoleculen die tot expressie komen in de fotoreceptoren. Dit elektrische signaal, genaamd de vroege receptorpotentiaal (of vroege receptorstroom), wordt gemeten met een verscheidenheid aan elektrofysiologische methoden (bijv. Elektroretinogram en hele celopnamen) en is lineair evenredig met functionele fotopigmentniveaus. De voordelen van deze methode zijn de hoge signaal-ruisverhouding, directe lineaire meting van fotopigmentniveaus en onafhankelijkheid van fototransductiemechanismen stroomafwaarts tot rhodopsine- of metarhodopsineactivering. Een aanvullende elektrofysiologische methode genaamd prolonged depolarizing afterpotential (PDA) maakt gebruik van de bi-stabiliteit van Drosophila fotopigment en de absorptie-spectrale verschillen van vlieg R- en M-pigmenttoestanden. De PDA wordt geïnduceerd door intens blauw licht, waarbij verzadigde hoeveelheden rhodopsine worden omgezet in metarhodopsine, wat resulteert in het falen van lichtresponsbeëindiging voor een langere tijd in het donker, maar het kan worden beëindigd door metarhodopsine naar rhodopsine conversie met behulp van intens oranje licht. Omdat de PDA een robuust signaal is dat een massale fotopigmentconversie vereist, leiden zelfs kleine defecten in de biogenese van het fotopigment tot gemakkelijk gedetecteerde abnormale PDA. Defecte PDA-mutanten leidden inderdaad tot de identificatie van nieuwe signaaleiwitten die belangrijk zijn voor fototransductie.

Inleiding

De lichtgeactiveerde rhodopsine (R), een G-eiwit-gekoppelde receptor (GPCR), bestaat uit een 7 transmembraaneiwit (opsine) en een chromofoor. In Drosophila melanogaster (fruitvlieg) induceert fotonabsorptie isomerisatie van de 11-cis-3-OH-retinale chromofoor tot all-trans-3-OH-retinal1, waardoor de conformationele verandering van de rhodopsine naar metarhodopsine wordt bevorderd (M, figuur 1A). In tegenstelling tot gewervelde rhodopsine dissocieert de overheersende fractie van ongewervelde chromofoor zich niet van het opsine, wat resulteert in de fysiologisch actieve donkerstabiele pigmenttoestand M. Op zijn beurt induceert extra fotonabsorptie door de all-trans-3-OH-retinale chromofoor isomerisatie van de chromofoor 2,3, waardoor de R-pigmenttoestand wordt gegenereerd met de 11-cis-3-OH-retinale chromofoor. De R-toestand is een donker, stabiel en fysiologisch niet-actief fotopigment. Naast de extreem snelle fotonregeneratieroute van de chromofoor4, net als gewervelde fotopigmenten, bestaat er een alternatieve enzymatische langzame route voor chromofoorregeneratie bij ongewervelde dieren, waarbij sommige stadia worden uitgevoerd in retinale cellen rond de fotoreceptorencellen 5,6.

Drosophila heeft grote voordelen als modelorganisme voor het bestuderen van ongewervelde fotoreceptoren. Met name de toegankelijkheid van het preparaat en het vermogen om moleculaire genetica toe te passen hebben Drosophila tot een krachtig modelsysteem gemaakt7. Daarom zijn er verschillende in vivo en ex vivo experimentele methoden vastgesteld voor het bestuderen van fototransductie in het algemeen en fotopigmentniveaus in het bijzonder. De eenvoudigste in-vivo methode maakt gebruik van de relatief grote extracellulair geregistreerde spanningsrespons op het licht van het Drosophila-oog. Dienovereenkomstig roept lichtstimulatie een elektrische spanningsrespons op in het hele oog die kan worden gemeten met behulp van extracellulaire elektroretinogram (ERG) -opname, die ~ 3 ordes van grootte groter is dan de ERG-respons op licht van gewervelde ogen 8,9. De Drosophila ERG-respons is robuust en gemakkelijk te verkrijgen, waardoor het een handige methode is voor het identificeren van afwijkingen in lichtrespons als gevolg van mutaties. De ERG-reactie op licht ontstaat voornamelijk uit de fotoreceptoren, pigmentcellen (glia) en secundaire neuronen van de lamina (zie figuur 1B). De belangrijkste componenten van de ERG zijn (i) de extracellulaire spanningsrespons van de fotoreceptoren, (ii) de "aan" en "uit" transiënten aan het begin en einde van de lichtprikkel die voortkomen uit de lamina neuronen (figuur 2A, inzet, AAN, UIT), (iii) de langzame respons van de gliacellen (figuur 2A, inzet, pijlen), en (iv) de korte en voorbijgaande respons, als gevolg van ladingsverplaatsing tijdens fotopigmentactivering die voorafgaat aan de ON-transiënte10 (figuur 2C [inzet], D, E). Deze korte respons bestaat uit twee fasen (M1 en M2, figuur 2C [inzet]) en kan alleen worden geïnduceerd door extreem sterke lichtstimulatie, die tegelijkertijd miljoenen fotopigmentmoleculen activeert. Het wordt niet waargenomen onder blauwe stimulatie (figuur 2D, blauw spoor) noch in mutanten met sterk verlaagde fotopigmentniveaus (figuur 2E, rood spoor), maar de amplitude is licht verbeterd in een mutant die plc-activiteit elimineert (figuur 2E, oranje spoor). De M1-fase is een typisch ERP van de vlieg die ontstaat door de activering van M in de fotoreceptoren. De M1-fase, die een positieve polariteit heeft (intracellulair), geeft een neurotransmitter op de normale manier vrij in een teken-omkerende synaps en activeert de lamina-neuronen, die reageren op de fotoreceptor-depolarisatie door de synaptisch versterkte M2-fase te genereren. Zowel de M1- als de M2-fase weerspiegelen dus M-activering10,11.

De depolarisatie van de fotoreceptor genereert de cornea-positieve "aan" transiënt, voortkomend uit de teken-omkerende synaps tussen het fotoreceptor axon en de monopolaire neuronen van de lamina 10,11 (figuur 1B). De langzame opkomst en het verval van de ERG ontstaan door de depolarisatie van de pigmentcellen (figuur 2A, inzet, pijlen) voornamelijk als gevolg van K+ efflux van de fotoreceptorcellen12 via de transiënte receptorpotentiaal (TRP) en TRP-achtige (TRPL) kanalen 13,14,15. Deze langzame kinetische componenten maskeren en vervormen grotendeels de golfvorm van de fotoreceptorrespons in vergelijking met intracellulaire of hele celopnamen van de fotoreceptorrespons op licht 9,10. Bovendien kan bij zeer sterke verlichting een extra transiënte respons worden waargenomen, die voorafgaat aan en gedeeltelijk fuseert met de transiënt "aan", (figuur 2C [inzet],D,E). Dit signaal is rechtstreeks afkomstig van de massale activering van het fotopigment10.

Verschillende lichtregimeprotocollen met behulp van neutrale dichtheid (ND) en kleurfilters, evenals sterke lichtgevende flitsen, zijn ontwikkeld om het oog in het algemeen en de fototransductiecascade in het bijzonder te onderzoeken. Deze protocollen zijn ook gebruikt om de eigenschappen van het fotopigment te onderzoeken.

Het intensiteitsresponsprotocol meet de piekamplitude van de ERG-spanningsrespons van het hele oog op toenemende lichtintensiteiten (figuur 2A,B). Dit protocol helpt bij het detecteren van veranderingen in de gevoeligheid van de fotoreceptorcellen voor licht9.

Het langdurige depolariserende afterpotentiële (PDA) protocol maakt gebruik van de verschillen in de absorptiespectra van rhodopsine en metarhodopsine dat in Drosophila een massale fotopigmentconversie van R naar zijn fysiologisch actieve en donkerstabiele intermediaire M-toestand2 mogelijk maakt. In de ERG-spanningsrespons wordt een relatief korte puls van verzadigingslicht gegeven en wordt de resulterende spanningsrespons geregistreerd. Onder deze voorwaarde wordt een plafond (omkeerpotentiaal) bereikt door het depolarisatiesignaal omdat activering van een fractie van een procent van de enorme hoeveelheid rhodopsinemoleculen (~ 1 x 108) voldoende is om het plafond te bereiken. De aanwezigheid van de fototransductiecomponenten in grote overvloed zorgt ervoor dat dit plafond zelfs in mutanten wordt bereikt met een aanzienlijke concentratievermindering of subtiele storing van de fototransductiecomponenten. Deze situatie sluit de isolatie van deze mutanten uit. Pak et al. introduceerden de PDA-screening7 op zoek naar een betrouwbare en onthullende test om visuele mutanten te isoleren. In Drosophila wordt de PDA-respons tot stand gebracht door het genetisch verwijderen van het rode screeningpigment, wat fotopigmentconversie mogelijk maakt, en de toepassing van blauw licht, dat bij voorkeur wordt geabsorbeerd door rhodopsine (figuur 3A) en dus resulteert in een grote nettoconversie van de R naar de M-fotopigmenttoestand. De beëindiging van de fototransductie wordt op het niveau van het fotopigment verstoord door een grote nettoconversie van R naar M, wat op zijn beurt resulteert in aanhoudende excitatie lang nadat het licht is uitgeschakeld (figuur 2C, figuur 4A [boven]). Tijdens de PDA-periode zijn de fotoreceptoren minder gevoelig voor volgende testlichten en gedeeltelijk ongevoelig (geïnactiveerd). De PDA detecteert zelfs kleine defecten in rhodopsinebiogenese en test de maximale capaciteit van de fotoreceptorcel om excitatie gedurende een langere periode te behouden. Omdat het strikt afhankelijk is van de aanwezigheid van hoge concentraties rhodopsine, scoort het gemakkelijk voor gebrekkige aanvulling van de fototransductiecomponenten. Opmerkelijk is dat het PDA-scherm veel nieuwe en zeer belangrijke visuele mutanten heeft opgeleverd (besproken in Pak et al.7). De PDA-mutanten geïsoleerd door Pak et al.7 zijn dus nog steeds uiterst nuttig voor het analyseren van het drosophila visuele systeem.

De PDA wordt geïnduceerd in Drosophila door blauw licht te verzadigen, wat resulteert in continue depolarisatie lang na lichtverschuiving (figuur 4A [boven]). Na het verzadigen van PDA-inducerend blauw licht, blijven de perifere fotoreceptoren (R1-6) continu actief in het donker met hun maximale capaciteit en bereiken ze verzadiging. Extra verzadigde blauwe lichten tijdens de PDA produceren gedurende vele seconden geen extra respons in R1-6-cellen, maar induceren een respons in R7-8-cellen die op de PDA wordt gesuperponeerd. De gesuperponeerde reacties worden verklaard door de verschillende absorptiespectra van de fotopigmenten die in deze cellen tot expressie komen (R7-8)16. De PDA kan worden onderdrukt door de fotoconversie van M terug naar R met verzadigingsoranje licht (figuur 4A [boven]). Het vermogen van de PDA om de fotoreceptorcellen naar hun maximale actieve capaciteit te brengen, een situatie die niet kan worden bereikt door intens wit licht, verklaart waarom het een belangrijk hulpmiddel is geweest om te screenen op visuele mutanten van Drosophila. Dit komt omdat het de detectie mogelijk maakt van zelfs kleine defecten in eiwitten die betrokken zijn bij de biogenese van normale fotopigmentniveaus17,18. Twee groepen PDA-defecte mutanten zijn geïsoleerd: noch inactivatie noch afterpotentiële (nina) mutanten en inactivatie, maar geen napotentiële (ina) mutanten. Het fenotype van de eerste is een gebrek aan een PDA en de bijbehorende inactivatie als gevolg van een grote verlaging van de fotopigmentspiegels (figuur 4A [midden]). Het fenotype van de laatste vertoont inactivatie, maar geen donkere depolarisatie na blauw licht als gevolg van een nog onbekend mechanisme in de mutant met normale rhodopsinespiegels maar zonder eiwitten die interageren met de TRP-kanalen (figuur 4A [onder]).

De PDA komt voort uit het verschil in de hoeveelheid fotopigment ten opzichte van arrestine (ARR2), dat M-activiteit 19,20,21 bindt en beëindigt (figuur 1A). Bij Drosophila-fotoreceptoren is de hoeveelheid van het fotopigment ongeveer vijf keer groter dan de hoeveelheid ARR219. ARR2-niveaus zijn dus onvoldoende om alle M-moleculen te inactiveren die worden gegenereerd door een grote netto fotoconversie van R naar M, waardoor een overmaat aan M constant actief is in het donker 17,19,20,22,23. Dit mechanisme verklaart de eliminatie van de PDA-respons door mutaties of door carotenoïddeprivatie24,25, waardoor het fotopigmentniveau afneemt, maar geen invloed heeft op de arrestinespiegels. Bovendien verklaart deze verklaring ook de fenotypen van null ARR2 (arr23) mutant allel21, waarin PDA kon worden bereikt bij ~10-voudige dimmer blauwlichtintensiteiten 19,20,21 (figuur 4B,C). De PDA is geen uniek kenmerk van vliegenfotoreceptoren en komt voor bij elke geteste soort met een donker stabiel M-spectrum met een absorptiespectrum dat verschilt van dat van de R-toestand, waardoor voldoende fotoconversie van het fotopigment van de R naar de M-toestand mogelijk is. Een grondig onderzochte soort waarbij de PDA-fenomenologie werd ontdekt, is de barnakel (Balanus) fotoreceptor, waarbij het absorptiespectrum van de R-toestand zich in een langere golflengte bevindt dan de M-toestand2 (figuur 3B). Dienovereenkomstig induceert oranjerood licht, in tegenstelling tot de situatie in de vlieg, oranjerood licht een PDA, terwijl blauw licht de PDA2 onderdrukt.

Het early receptor potential (ERP) protocol maakt gebruik van de ladingsverplaatsing die optreedt tijdens R- of M-activering. Het visuele pigment is een integraal onderdeel van het oppervlaktemembraan van het signaleringscompartiment van zowel gewervelde als ongewervelde membranen3. Dienovereenkomstig gaat het activeringsproces waarbij de fotopigmentmoleculen van de ene tussentoestand naar de volgende veranderen, gepaard met een ladingsverplaatsing 4,26. Omdat de fotopigmentmoleculen elektrisch parallel aan de membraancapaciteit4 zijn uitgelijnd, genereert een snelle gesynchroniseerde conformatieverandering een snelle polarisatieverandering van het oppervlaktemembraan, die bij vliegen optreedt in het signaleringscompartiment dat bestaat uit een stapel van ~ 30.000-50.000 microvilli genaamd rhabdomere. Deze polarisatie ontlaadt vervolgens passief door de membraancapaciteit van het cellichaam totdat het celmembraan even gepolariseerd is. Het ERP is de extracellulaire registratie van de ladingsverplaatsing. Het intracellulair geregistreerde ERP manifesteert het extracellulaire ERP geïntegreerd door de tijdconstante van het celmembraan 4,27,28. De stroom die wordt geactiveerd door de verplaatsing van de visuele pigmentlading kan ook worden gemeten in hele-cel spanningsklemopnamen29,30 (figuur 5A-D), met als groot voordeel (in vroege receptorstroom (ERC) opnames) van het minimaliseren van het effect van membraancapaciteit op de kinetiek van het signaal.

De protocolsectie beschrijft hoe ERG-metingen van Drosophila eye9 en ERC-metingen kunnen worden uitgevoerd door hele-celopnamen van Drosophila geïsoleerde ommatidia31,32. We beschrijven ook specifieke protocollen die worden gebruikt om fototransductie in het algemeen en fotopigmenten in het bijzonder te onderzoeken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Het meten van de intensiteitsresponsrelatie, langdurige depolariserende afterpotentiële (PDA) en de vroege receptorpotentiaal (ERP) met behulp van het elektroretinogram

  1. Geschikte opfokomstandigheden voor D. melanogaster bereiding
    1. Raise D. melanogaster vliegt in flessen met standaard gele maïs bevattend voedsel in een incubator die op een temperatuur van 24 °C wordt gehouden en in een 12 uur donkere/lichte cyclus
    2. Houd de vliegenflessen ten minste 24 uur voorafgaand aan het experiment in het donker.
  2. Algemene installatie
    1. Bereid opnamepipetten voor door 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) met vezels gevulde borosilicaatglascapillairen te trekken (figuur 6L, O). De weerstand van de pipetten moet 5-10 MΩ zijn; elke geschikte trekker kan worden gebruikt.
    2. Bekleed twee zilveren draden met AgCl2 en steek 0,25 mm zilverdraad in een 3 M KCl-oplossing die is aangesloten op een op maat gemaakte 5 V-voeding.
    3. Steek elke gecoate zilverdraad in de elektrodehouders (figuur 6N).
    4. Vul het glazen capillair met gefilterde Ringer's oplossing (zie tabel 1) met een langwerpige tipspuit (figuur 6M).
    5. Steek de draadelektrode in het glazen capillair. Zorg ervoor dat de oplossing in het capillair in contact komt met de zilverdraad.
    6. Plaats de elektrodehouders (figuur 7P, N) in de twee elektrodemicromanipators (figuur 7G).
  3. Procedure voor het voorbereiden van de vlieg op elektrische opnames
    OPMERKING: Om de vlieg onder aan het donker aangepaste omstandigheden te houden, gebruikt u alleen gedimde rode lichtverlichting tijdens de volgende stappen.
    1. Verdoof de vliegen in de fles met CO2-gas met behulp van het vliegenslapersysteem (figuur 6A, B) en giet ze in de slaapcontainer.
    2. Kies één vlieg en houd hem voorzichtig bij zijn vleugel met een scherp pincet. Bedek de rest van de vliegen met een petrischaaltje.
    3. Plaats de vlieg op de vlieghouder in de juiste richting liggend op zijn kant, met zijn rug naar de hand (figuur 6P).
    4. Zet de voeding van de soldeerbout AAN. Stel de stroom in op ~2,25 A. Deze stroom moet de 0,25 mm platina-iridiumfilament verwarmen tot ~55-56 °C (zie Aanvullend bestand).
    5. Plaats een druppel was met een lage smelttemperatuur (~55-56 °C) op de soldeerbout (figuur 6F).
    6. Til de vlieg met een pincet van zijn vleugels en bevestig zijn vleugels aan de vlieghouder (figuur 6I) met behulp van de soldeerbout.
    7. Verbind met behulp van de soldeerbout de rug van de vlieg met was op het standaardoppervlak (figuur 6P).
    8. Laat de punt van de soldeerbout op het verbindingspunt van de poten zakken en smelt de was om alle poten samen te bedekken (figuur 6P).
    9. Plaats een kleine druppel was tussen het hoofd en de rug in het nekgebied (figuur 6P).
      OPMERKING: Wees extra voorzichtig om oververhitting van de vliegenkop te voorkomen. Zorg ervoor dat de vlieg goed is gefixeerd en niet in staat is om te bewegen tijdens het experiment; kleine bewegingen kunnen artefacten in de opnames creëren. Zorg ervoor dat de luchtpijpopeningen (ademhalingsinlaten) in de thorax en buik niet bedekt zijn met was.
    10. Plaats de vliegenhouder (figuur 7Q) in een donkere kooi van Faraday op een magneetblok (figuur 7I) en zorg ervoor dat de vlieg zich op ~5 mm van het uiteinde van de lichtgeleider bevindt (figuur 7L).
    11. Plaats de opname-elektrode (figuur 7P) boven het oog van de vlieg en de grondelektrode (figuur 7N) over de bovenrug van de vlieg met behulp van de micromanipulators.
    12. Plaats de grondelektrode in de achterkant van de vlieg met behulp van de micromanipulators.
    13. Plaats de opname-elektrode in de buitenste periferie van het oog van de vlieg, bij voorkeur met behulp van de micromanipulators.
      OPMERKING: Na het inbrengen van de elektrode in het oog, zal een klein kuiltje worden waargenomen; trek de elektrode naar boven zonder deze uit het oog te verwijderen totdat het kuiltje verdwijnt. De elektroden kunnen ook worden ondergedompeld in kleine druppeltjes elektrodegelei die op de romp en het oog worden aangebracht.
  4. Intensiteit-respons protocol
    1. Plaats een oranje filter (590 edge filter) voor de hogedruk Xenon lamp. Gebruik een groot (zes ordes van grootte) dempend ND-filter (neutral density).
    2. Wacht 60 s in het donker en geef een 5 s lichtpuls.
    3. Vervang het ND-filter door een minder dempend ND-filter in stappen van één orde van grootte.
    4. Wacht 60 s in het donker en geef een tweede 5 s lichtpuls.
    5. Herhaal stap 1.4.1.-1.4.4, waarbij de lichtintensiteit geleidelijk wordt verhoogd met minder dempende ND-filters (de laatste puls moet worden gegenereerd zonder ND-filter). Zorg ervoor dat u de reeks ND-filters in de juiste richting gebruikt, beginnend bij grote demping en het bereiken van lage demping.
  5. PDA-protocol (dit protocol kan alleen worden uitgevoerd op witoogvliegen)
    1. Geef een 5 s lichtpuls van maximale intensiteit met behulp van een oranje filter (590 rand filter, om maximaal fotopigment om te zetten naar de R-toestand).
    2. Vervang het oranje filter door een breedband blauw (BP450/40 nm) filter en geef drie 5 s lichtpulsen op maximale intensiteit.
      OPMERKING: Het is ook mogelijk om een lange continue maximale intensiteit blauwe lichtpuls te geven totdat een steady-state spanningsrespons is bereikt.
    3. Wacht 60 s in het donker, vervang het blauwe filter door het vorige oranje filter en geef twee 5 s lichtpulsen met intervallen van 60 s.
  6. ERP/M-potentiaalprotocol voor het meten van het foto-evenwichtsspectrum van M (dit protocol kan alleen worden uitgevoerd op witoogvliegen10,25)
    1. Geef een continue blauwe (bandpass (BP) 450/40 nm) lichtpuls totdat een steady-state spanningsrespons wordt bereikt, die de maximale hoeveelheid fotopigment van de R-toestand omzet in de M-toestand van R1-6-cellen.
    2. Geef een korte (<3 ms) intense lichtflits van een golflengte tussen 350-700 nm (het bekende absorptiespectrum van R1-6 cellen fotopigment) met behulp van smalle (~ 20 nm) bandpassfilters en meet de piekamplitude van de M1-fase van de M-potentiaalrespons (die de metarhodopsineabsorptie bij deze specifieke golflengte bij foto-evenwicht 10,25 weerspiegelt).
      OPMERKING: Voor synchrone activering van een grote pool van fotopigmentmoleculen is een korte, intense lichtflits vereist, zodat het fotonengehalte in korte tijd wordt verpakt. De M-potentiaal bestaat uit twee componenten: M1 (corneanegatieve fase), die de ladingsverplaatsing van de metarhodopsine in de fotoreceptor weerspiegelt, en M2 (corneapositieve fase11,33), die de versterkte M1-respons van de fotoreceptoren in de lamina 9,10,11 weerspiegelt . Elk van deze componenten kan worden geïdentificeerd en gemeten. Het verdient echter de voorkeur om de M1-potentiaal te meten, omdat het een directe lineaire manifestatie is van de M-niveaus. Als M2 wordt gebruikt, zorg er dan voor dat de amplitude binnen het lineaire bereik ligt door milde carotenoïde deprivatie24,25 te gebruiken.
    3. Geef opnieuw een continue blauwe (BP450/40 nm) lichtpuls, gevolgd door een korte (<1 ms) intense lichtflits van een andere golflengte.
    4. Herhaal dit protocol totdat het volledige absorptiespectrum van M bij foto-evenwicht is gedekt.

2. ERC-protocol voor het meten van het actiespectrum van R- en de M-toestanden van R1-6-cellen met behulp van spanningsklemregistraties voor hele cellen

OPMERKING: Voor een gedetailleerd protocol voor het gebruik van spanningsklemopnamen voor hele cellen, zie Katz et al.34. De M-potentiaal gebruikt de ERG alleen om de activering van de M-toestand te meten omdat de bijdrage van de R-toestand wordt onderdrukt door de membraancapaciteit. Daarentegen meet de ERC de activering van zowel R (positieve ERC) als M (negatieve ERC) toestanden omdat spanning-klemregistraties het effect van membraancapaciteit wegnemen (zie inleiding).

  1. Converteer het fotopigment naar de gewenste toestand (R of M). Voor R naar M conversie, eerst, pas de vliegen aan door een korte (<1 ms) adaptieve blauwe (BP450/40 nm) flits. Geef voor M naar R-conversie een korte adaptieve oranje (OG590 edge filter) flitser.
  2. Geef een korte lichtflits (<1 ms) van een golflengte tussen 350-700 nm en meet de maximale negatieve of positieve amplitude van de ERC-respons, die de M/R-absorptie op deze specifieke golflengte weerspiegelt.
    OPMERKING: Voor synchrone activering van een grote pool van fotopigmentmoleculen is een korte, intense lichtflits vereist om het fotonengehalte in korte tijd te verpakken. De maximale fotopigmentconversie van R naar M door blauwe flits kan ~80% van de totale fotopigmentmoleculen bereiken vanwege de overlap in het absorptiespectrum van R en M (figuur 3A). Daarom heeft de ERC bij golflengten onder ~550 nm twee componenten: een negatieve fase die de respons van de metarhodopsine weerspiegelt en een positieve fase die de respons van de resterende rhodopsine weerspiegelt. De ERC is lineair afhankelijk van de lichtintensiteit (figuur 5D). Om de spectrale gevoeligheid van R- en M-toestanden af te leiden, moet elke fase van de ERC worden genormaliseerd op de verschillende golflengten voor gelijke energie29.
  3. Herhaal stap 2.1.-2.2. met behulp van flitsen van verschillende golflengten.
  4. Plot de genormaliseerde positieve en negatieve ERC als functie van de golflengte.
    OPMERKING: De sterke lichtflits induceert een enorme stroom door de lichtgevoelige kanalen, wat leidt tot metabole stress op de fotoreceptor, wat op zijn beurt lichtonafhankelijke kanaalopening veroorzaakt. De ERC wordt over deze constitutieve stroom heen gelegd.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 2 illustreert de robuustheid en het gemak van het gebruik van de ERG-techniek. Het is robuust omdat het wordt opgenomen in de vrijwel intacte vlieg door een eenvoudige techniek van extracellulaire spanningsregistraties die een eenvoudige elektrofysiologische opstelling vereisen. De robuustheid manifesteert zich door het verkrijgen van opnames van lichtresponsen met relatief grote amplitudes (in het millivolt-bereik), zelfs wanneer mutaties de lichtrespons sterk verminderen of vervorme...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het grote voordeel van het gebruik van de Drosophila-fotoreceptorvoorbereiding is de toegankelijkheid, het gemak en de nauwkeurigheid van lichtstimulatie en, belangrijker nog, het vermogen om de kracht van moleculaire genetica toe te passen7. Uitgebreide genetische studies hebben Drosophila vastgesteld als een uiterst nuttig modelsysteem voor de genetische dissectie van complexe biologische processen7. De relatief eenvoudige structuur van het Drosophil...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Israel Science Foundation (ISF) en de United States-Israel Binational Science Foundation (BSF). Wij danken de heer Anatoly Shapochnikov voor de bouw van de wasfilamentkachel.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 mL spuit met verlengde puntFiguur 6M
1 ruwe pincetDumont #5, Standaard0,1 mm x 0,06 mm, lengte 110 mm, Inox (Figuur 6H)
2 condensorlenzen
A/D converterMolecular DeviceDigidata 1200Mogelijke vervanger: elke digidata van molecular devices (bijv. 1440A) - Figuur 7C
VersterkerAlmost perfect electronicsMogelijke vervanger: Warner instruments- IE251A of IE-210 (komt met headstage)- Figuur 7D
Anti-vibratie tafelNewportVW-3036-OPT-01Figuur 7H
KapillairenHarvard ApparatusBorosilikatiet glas capillairen1 mm x 0,58 mm (Figuur 6O)
ClampexMolecular DeviceSoftware
CO2 tank
Koud lichtbronSchottKL1500 LCDFiguur 6C
Delicate doekjesKimtechKimwipes (Figuur 6K)
Elektrode houderGeschikt voor capillair O.D. 1 mm (Figuur 6N, Figuur 7N, en Figuur 7P)
Faraday kooiZelf gemaaktElektromagnetische ruis afscherming en zwarte voorkant gordijn (Figuur 7K)
Filter (Kleur)SchottOG590, Edge filterFiguur 7S
Filter (Kleur)SchottBP450/40 nmFiguur 7S
Filter (Kleur)Blazers550 nmFiguur 7S
Filter (Kleur) voor koude lichtbronSchottRG630Figuur 6C
Filter (Hitte)SchottKG3Figuur 7S
Filters (Neutraal dichtheidsfilter)Chroma6,5,4,3,2,1,0,5,0,3Figuur 7S
Flash Lamp systeemHoneywellFiguur 7U
Fly sleeper systeem met injectorInject + maticFiguur 6A-B
Lamp voedingPTILPS-220Figuur 7W
Licht detectorZelf gemaaktFototransistor (Figuur 7O)
Lichtgeleider3 mm diameter, 1,3 m lang (Figuur 7L,M)
LichtbronHogedruk ozon-vrije 75 W Xenon lamp (werkend op 50 W), mogelijke vervanger: Cairn research- OptoLED (Figuur 7R)
Laag temperatuur smeltwasZelf gemaaktBestaat uit een mengsel van bijenwas (Tm≈62 °C) en paraffine op ~3:1 om een smelttemperatuur van ~55–56 °C te bereiken (Figuur 6J)
Magnetische standaard voor vliegenZelf gemaaktFiguur 6I en Figuur 7Q
Micro-elektrode voorversterker systeem met head-stageAlmost perfect electronicsImpedantie tester (Figuur 7G)
Micromanipulator (mechanisch grof)Tritech Research, NarishigeM-2
Micromanipulator (mechanisch fijn)Leitz MicrosystemsLeitz Mechanical MicromanipulatorFiguur 7F
pCLAMPMolecular DeviceSoftware
Petrischaal60 mm
Puls generatorAMPIMaster 8Figuur 7A
Redux crème voor elektrocardiografieParker LaboratoriesRedux Electrolyte Crème
Shutter driverUniblitz, Vincent AssociatesVCM-D1 Single Channel Uni-stableFiguur 7V
Shutter systeemUniblitz, Vincent AssociatesLS2 2 mm Uni-stable ShuttersFiguur 7V
ZilverdraadWarner Instruments0,25–1 mm diameter, moet gechloridiseerd worden
Soldeerbout samengesteld uit een platina-iridium gloeidraad0,25 mm diameter (Figuur 6F)
Stereoscopische zoom MicroscoopNikonSMZ-2BFiguur 6D
Stereoscopische zoom MicroscoopWildWild M5Met 6, 12, 25 en 50 vergrotingsstanden (Figuur 7E)
Spuit filtersMillex22 µm PVDF filter
Verticale pijpzetpullerSutter/ NarishigeModel P-97/PP-830Gebruik ofwel verticale of horizontale puller, naar keuze (Figuur 6L)
Was filament verwarmerZelf gemaaktZie figuur S1 (Figuur 6E-G)
Xenon Flash Lamp systeemDr. Rapp OptoElectronicJML-C2Figuur 7X

Referenties

  1. Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
  2. Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668(1983).
  3. Hamdorf, K. Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).
  4. Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
  5. Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
  6. Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
  7. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  8. Pak, W. L. Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).
  9. Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
  10. Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
  11. Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
  12. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  13. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  14. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  15. Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
  16. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
  17. Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
  18. Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
  19. Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
  20. Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
  21. Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
  22. Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
  23. Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
  24. Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
  25. Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
  26. Cone, R. A., Cobbs, W. H. Rhodopsin cycle in the living eye of the rat. Nature. 221 (5183), 820-822 (1969).
  27. Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
  28. Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
  29. Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
  30. Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
  31. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
  32. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  33. Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
  34. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627(2017).
  35. Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
  36. Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
  37. Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
  38. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
  39. Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
  40. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Vroeg receptorpotentieelverlengd depolariserend napotentieelelektroretinogram registratiewhole cell registratiefototransductie mutantenrhodopsine metarhodopsinegenetische screening
Elektrofysiologische methoden voor het meten van fotopigmentniveaus in Drosophila-fotoreceptoren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.