Methodenartikel

Intraventriculaire medicijnafgifte en bemonstering voor onderzoek naar farmacokinetiek en farmacodynamiek

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63540

⸱

31 maart 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry & Pharmacology, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences, The University of Melbourne, 2Department of Microbiology, Biomedicine Discovery Institute, Monash University, 3UNC Eshelman School of Pharmacy, University of North Carolina, Chapel Hill

In dit artikel

Samenvatting

Toediening van therapieën rechtstreeks in het centrale zenuwstelsel is een manier om de bloed-hersenbarrière te omzeilen. Het huidige protocol demonstreert intracerebroventriculaire injectie voor daaropvolgende verzameling van hersenvocht en lichaamsorganen. Dit vergemakkelijkt het onderzoek naar de farmacokinetiek en farmacodynamiek van geneesmiddelen in diermodellen voor het ontwikkelen van nieuwe behandelingen.

Samenvatting

Hoewel de bloed-hersenbarrière (BBB) de hersenen beschermt tegen vreemde entiteiten, voorkomt het ook dat sommige therapieën het centrale zenuwstelsel (CZS) binnendringen om ziekten of infecties te verbeteren. Geneesmiddelen worden bij dieren en mensen rechtstreeks in het CZS toegediend om de BBB te omzeilen. Het huidige protocol beschrijft een unieke manier om herseninfecties te behandelen door middel van intraventriculaire toediening van antibiotica, d.w.z. polymyxines, de laatstelijnsantibiotica voor de behandeling van multiresistente Gram-negatieve bacteriën. Er werd een eenvoudig stereotactisch chirurgisch protocol ontwikkeld om bij ratten een geleidecanule te implanteren die tot in de laterale ventrikel reikte. Na een herstelperiode van 24 uur kunnen ratten bewust en herhaaldelijk worden geïnjecteerd via een canule die op de geleider wordt aangebracht. Injecties kunnen handmatig worden toegediend als een bolus of infusie met behulp van een micro-injectiepomp om een langzaam en gecontroleerd debiet te verkrijgen. De intraventriculaire injectie werd met succes bevestigd met de kleurstof Evans Blue. Cerebrospinale vloeistof (CSF) kan worden afgevoerd en de hersenen en andere organen kunnen worden verzameld. Deze benadering is zeer geschikt voor studies waarbij geneesmiddelen worden toegediend aan het CZS en de daaropvolgende beoordeling van de farmacokinetische en farmacodynamische activiteit.

Inleiding

De bloed-hersenbarrière (BBB) is een cruciaal beschermingsmechanisme voor het centrale zenuwstelsel (CZS). De selectief permeabele, anatomische barrière scheidt het circulerende bloed en zijn opgeloste stoffen van de extracellulaire vloeistof van de hersenen, waardoor wordt voorkomen dat de meeste moleculen de hersenen binnendringen 1,2,3,4, afhankelijk van hun grootte, lipofiliciteit 5 en de beschikbaarheid van een actief transportmechanisme 2.

Deze beschermende barrière is gunstig voor de effectieve regulatie van ingewikkelde hersenhomeostase en de gezondheid van het CZS 4,6. Het maakt het echter ook moeilijk om medicijnen af te leveren voor de behandeling van infecties in de hersenen of andere CZS-aandoeningen 4,7. Afgezien van het verstoren van de BBB met behulp van verschillende methoden 8,9, is de primaire benadering om de BBB te omzeilen het rechtstreeks in de hersenen af te leveren door het af te geven in het hersenvocht (CSF)4. Hoewel het een relatief invasieve praktijk is, is het met succes gebruikt om gerichte therapieën aan patiënten en proefdieren te leveren. Bij mensen kunnen geneesmiddelen worden toegediend in het intraventriculaire systeem of CSF en vervolgens worden bemonsterd met behulp van het Ommaya-reservoir, een reservoir dat zich onder de hoofdhuid bevindt, bevestigd aan een katheter die in de laterale ventrikel wordt ingebracht10,11. Vergelijkbare technieken zijn ontwikkeld bij proefdieren zoals knaagdieren om gelijkwaardige doelen te bereiken. Micro-osmotische pompen werden geïmplanteerd bij muizen 12,13,14,15 en ratten16,17 voor continue medicijnafgifte in het ventriculaire systeem of hersenparenchym. Daarnaast werden directe intracerebroventriculaire injecties uitgevoerd bij verdoofde muizen met behulp van een wegwerpnaald18,19 en bij bewuste ratten via een chirurgisch geïmplanteerde canule20,21,22,23. De toediening van geneesmiddelen aan het CZS is een methode van onschatbare waarde geweest om het begrip op verschillende gebieden te vergroten 20,24,25,26,27,28.

CZS-infecties zijn zo'n gebied dat dringend behoefte heeft aan nieuwe therapieën en een beter begrip van bestaande anti-infectieuze therapieën. CZS-infecties veroorzaakt door multiresistente Gram-negatieve bacteriën zijn bijzonder zorgwekkend7. Polymyxines zijn de laatstelijnsantibiotica die steeds vaker worden gebruikt om infecties als gevolg van deze 'superbacteriën' te behandelen29. Wanneer polymyxines intraveneus worden toegediend volgens de huidige doseringsrichtlijnen30, is hun penetratie in het CZS zeer laag, terwijl hogere doses het risico op nefrotoxiciteit verhogen. Daarom heeft intraveneuze polymyxinetherapie weinig nut om CZS-infecties te behandelen7. Het vaststellen van een veilig en effectief doseringsregime voor de toediening van polymyxines aan het CZS is een dringende onvervulde medische behoefte 31,32,33. Daarom werd dit protocol opgesteld en beschreven met een focus op het rechtstreeks injecteren van antibiotica in het lips van ratten. Het kan echter worden gebruikt om elk geneesmiddel toe te dienen dat niet neurotoxisch is en waarbij therapeutische concentraties in kleine hoeveelheden kunnen worden toegediend (bijv. tot 10 μL bij ratten). De beschreven technieken kunnen ook worden aangepast om verschillende hersengebieden aan te pakken en meerdere injecties toe te dienen.

Het huidige protocol presenteert een eenvoudige operatie- en injectietechniek die een efficiënte farmacokinetiek en distributie na ICV-toediening van geneesmiddelen mogelijk maakt. De operatie omvat het implanteren van een geleidecanule. Omdat het een minder invasieve procedure is dan de implantatie van een micro-osmotische pomp 12,13,14,15,16,17, is dit een geavanceerde optie die geschikt is voor de kortdurende toediening van geneesmiddelen in CSF. Dit protocol is vereenvoudigd en kan 24 uur na de operatie zeer hoge overlevingspercentages en stabiele lichaamsgewichten opleveren, wat een verbetering is ten opzichte van bestaande methoden34. Na de operatie kregen ratten bij bewustzijn een handmatige bolus ICV-injectie of een langzamere toediening met behulp van een micropomp om de piekplasmaconcentraties te verlagen. Tegelijkertijd konden ze zich vrij bewegen in hun kooi. Om veilige en effectieve doseringsschema's voor geneesmiddelen vast te stellen, werden vervolgens monsters van CSF, hersenen, ruggenmerg, nier, plasma, enz. gebruikt om de farmacokinetiek en de distributie van geneesmiddelen na toediening van intracerebroventriculaire (ICV) te bestuderen. De distributie van geneesmiddelen kan ook visueel worden onderzocht, bijvoorbeeld met behulp van immunohistochemie of matrix-geassisteerde laserdesorptie/ionisatie massaspectrometriebeeldvorming (MALDI-MSI). Indien nodig kan een bilaterale canule worden geïmplanteerd, bijvoorbeeld om medicijnen te injecteren die zich anders eenzijdig in beide hemisferen zouden verspreiden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten werden uitgevoerd volgens de Australische code voor de verzorging en het gebruik van dieren voor wetenschappelijke doeleinden. Experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie van de Universiteit van Melbourne (aanvraag #1914890). 8-14 weken oude mannelijke en vrouwelijke Sprague-Dawley-ratten werden gebruikt voor de experimenten.

1. Stereotactische chirurgie voor canulatie van het laterale ventrikel

  1. Gebruik tijdens de operatie geautoclaveerde wattenstaafjes en chirurgische lakens.
  2. Stel het volgende in voor de operatie.
    1. Stel een stereotactisch frame, een anesthesietoedieningssysteem, medicijnen, chemicaliën en ondersteunende materialen in (zie materiaaltabel). Reinig het stereotactische frame, de glasvezellichtbron, de handboormachine, enz. met 80% ethanol.
    2. Week de 22 G geleidecanule en de bijbehorende dummycanule (zie materiaaltabel) in 80% ethanol voor sterilisatie.
      OPMERKING: De fabrikant heeft de 22 G-geleider en de dummycanule voorgesneden tot een lengte van ~4 mm onder het voetstuk.
    3. Steriliseer de operatie-instrumenten (zie Materiaaltabel) met behulp van de warmteparelsterilisator gedurende 20 s en spuit vervolgens met 80% ethanol. Plaats de gesteriliseerde instrumenten op het steriele laken.
    4. Bereid een hersteldoos voor (een rattenhuisvestingsdoos bekleed met een onderpad) waarbij de helft van de doos over een verwarmingskussen wordt geplaatst.
  3. Voer de operatie uit.
    1. Schroef de met ethanol gereinigde 22 G geleidecanule in de canulehouder op het stereotactische frame.
    2. Plaats de rat in een inductiekamer (300 mm x 200 mm, zie materiaaltabel) en induceer anesthesie met 5% isofluraan bij 1 l/min zuurstof.
    3. Zodra de rat diep verdoofd is (geen pedaalreflex), verplaatst u de rat naar het stereotactische frame en verlaagt u het isofluraan tot 2%-3% in 1 l/min zuurstof voor onderhoud via de neuskegel. Haak de tanden aan de bijtstang en trek de neuskegel voorzichtig over de neus - trek de rat voorzichtig terug om te controleren of deze goed vastzit.
    4. Breng beschermend oogglijmiddel aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
    5. Injecteer carprofen (5 mg/kg), buprenorfine (0,05 mg/kg) in zoutoplossing en 3 ml zoutoplossing subcutaan (s.c.) voor pijnbestrijding en om het herstel na de operatie te bevorderen.
    6. Knijp in de tenen om te controleren op pedaalreflex. Eenmaal afwezig, bevestig je de schedel van de rat in het frame. Plaats een oorstang in de gehoorgang en draai deze vast. Herhaal aan de andere kant.
    7. Beweeg de oorbalken zijwaarts om ervoor te zorgen dat de nummers op de oorbalken aan beide kanten gelijk zijn. Het hoofd mag niet bewegen wanneer het op de schedel drukt.
    8. Scheer de bovenkant van het hoofd met een tondeuse. Veeg het haar weg met een tissue en een zoutoplossing. Breng indien nodig opnieuw oogglijmiddel aan op beide ogen om uitdroging te voorkomen.
    9. Veeg de hoofdhuid af met 4% chloorhexidine en alcoholische huidbereidingsoplossing, met behulp van steriele wattenstaafjes voor elke stap (zie Materiaaltabel). Begin in het midden van de schedel en beweeg in cirkels naar buiten toe totdat al het oppervlak is schoongemaakt.
    10. Injecteer ~150 μL ropivacaïne (1%) s.c. (zie Materiaaltabel) langs de beoogde incisieplaats.
    11. Gebruik het scalpelmes om een incisie van 10-15 mm te maken langs de middellijn van het hoofd, van tussen de ogen tot aan de basis van de schedel.
    12. Gebruik de wattenstaafjes en het scalpel om bindweefsel weg te schrapen en de schedel bloot te leggen.
    13. Dompel een steriel wattenstaafje in een 3% waterstofperoxide-oplossing en breng het aan op het oppervlak van de schedel. Wacht 5 s totdat de chemische stof met de huid reageert en maak het gebied vervolgens schoon met een droog wattenstaafje.
    14. Breng voor de tweede keer 3% waterstofperoxide aan. Hierdoor komen de hechtlijnen van de schedel duidelijker naar voren. Wacht 10 s totdat de chemische stof met de huid reageert en maak het gebied vervolgens schoon met een droog wattenstaafje. Wassen met zoutoplossing en drogen met een schoon wattenstaafje.
    15. Breng voorzichtig een kleine hoeveelheid Super etch-gel aan op een wattenstaafje en breng het vervolgens aan op het oppervlak van de schedel. Dit creëert een poreuzer oppervlak waar het tandcement zich aan kan hechten.
    16. Breng een royale hoeveelheid zoutoplossing aan op de schedel om het superetsmiddel af te wassen en droog het af met een schoon wattenstaafje.
    17. Identificeer het bregma en markeer het met de viltstift.
    18. Boor een inkeping voor de ankerschroef op een plek die de plaatsing van de geleidecanule niet belemmert.
      OPMERKING: Als de rechter laterale ventrikel is gecanuleerd, boor dan op de linkerhersenhelft en naar achteren ten opzichte van de ventrikel.
    19. Houd de boor in een hoek van ~75°-80° ten opzichte van de schedel en boor langzaam een inkeping met een diepte van ongeveer de helft van de dikte van de schedel. Gebruik zoutoplossing op een wattenstaafje om botstof weg te vegen.
    20. Steek de schroef voorzichtig in door deze met een tang stevig in de inkeping te houden en met de schroevendraaier in de schedel te schroeven, zodat u geen schedel breekt. Test na elke volledige omwenteling of de schroef goed vastzit.
    21. Controleer of de schedel plat is. Gebruik de beweegbare armen van het frame om de geleidecanule zo te positioneren dat deze de schedel bij bregma raakt. Zet de DV (dorsaal-ventrale) die de coördinaten van het Z-vlak vertegenwoordigt op nul door op de knop op de framebesturingsmonitor te drukken.
    22. Breng de geleidecanule (lengte 22 G en 4 mm) omhoog met behulp van de beweegbare armen van het frame en beweeg deze naar lambda. Laat het zakken zodat het het oppervlak van de schedel raakt en noteer het DV-display opnieuw.
      OPMERKING: Het verschil tussen DV bij bregma en DV bij lambda moet minder dan 0.2 mm zijn. Stel indien nodig de neuskegel dienovereenkomstig af, d.w.z. beweeg de kop van de rat naar behoefte omhoog of omlaag en herhaal de metingen.
    23. Beweeg de geleidecanule terug om bregma aan te raken en zet alle drie de coördinaten weer op nul: DV, AP (anterieur-posterieur) en ML (mediaal-lateraal) door op de knoppen op de monitor te drukken.
    24. Verplaats de geleidecanule naar de vooraf ingestelde coördinaten naar keuze.
      OPMERKING: Voor canulatie van de rechter laterale ventrikel bij een volwassen rat van 300-350 g werden de volgende coördinaten gebruikt: -0,7 mm AP, -1,4 mm ML en -4,00 mm DV (dezelfde lengte als de geleidecanule).
    25. Markeer de uiteindelijke positie van de canule door het uiteinde van de canule in te kleuren met de markeerstift en deze vervolgens naar het schedeloppervlak te laten zakken om de positie aan te raken en te markeren.
    26. Boor een gat met een diameter van 2,3 mm voor de 22 G geleidecanule door de booras in een rechte verticale positie te houden, d.w.z. in een hoek van 90° ten opzichte van de scull. Zorg ervoor dat u langzaam en geleidelijk dieper in de schedel gaat, d.w.z. vermijd boren in hersenweefsel.
      NOTITIE: Laat indien nodig de canule met behulp van de mobiele stereotactische arm in het gat zakken om te testen of de canule met succes kan worden geplaatst of dat er verder moet worden geboord.
    27. Zodra de canule in de hersenen is neergelaten, tilt u deze weer op, brengt u voorzichtig superlijm aan op de onderkant van het plastic voetstuk van de canule en laat u de canule terug in het gat zakken met behulp van de mobiele arm van het stereotactische frame.
    28. Laat op zijn plaats om de lijm te laten uitharden.
    29. Meng tijdens het wachten tandheelkundig oplosmiddel en poeder (zie materiaaltabel) in een weegschaal. Giet tandheelkundig cementpoeder in de weegboot, gebruik een spuit van 1 ml om ~300 μL oplosmiddel toe te voegen en meng met dezelfde spuit totdat deze dikker wordt en een bruikbare consistentie heeft. Voeg indien nodig meer poeder toe om de viscositeit te verhogen of meer oplosmiddel om de viscositeit te verminderen.
    30. Maak de canule los van de canulehouder met behulp van de speciale schroef en til de arm voorzichtig op.
      OPMERKING: De canule moet in een hoek van 90° op de schedel worden gelijmd.
    31. Breng het verse tandcement aan op de blootgestelde schedel door het in de wegwerpspuit van 1 ml te trekken en rond de canule aan te brengen. Vermijd tandheelkundig cement op de huid of canuleopening. Laat het een paar seconden opstijven, afhankelijk van de consistentie.
    32. Wanneer het tandcement dikker wordt, gebruikt u een spatel om meer tandheelkundig cement aan te brengen en vormt u de laatste kopbevestiging die de schroef volledig bedekt.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u de canule niet te veel bedekt, zodat de dummycanule nog kan worden vastgeschroefd. Verwijder overtollig tandcement van de huid.
    33. Breng een steriele dummycanule in zodra het tandcement droog en stevig is.
    34. Schakel het isofluraan uit, maak de oorstangen los, verwijder de rat uit het frame en plaats deze in de herstelbox.
    35. Zodra het dier ~15-30 minuten is hersteld, huisvest je het in een schone behuizingsdoos.
      OPMERKING: Na de operatie moeten ratten alleen worden gehuisvest. Overweeg om standaard roosterkooitoppen waar de voedseltrechter in de kooi zakt te vervangen door speciale hoog verhoogde roosterkooitoppen om het risico op interferentie met de hoofdbevestiging te minimaliseren. U kunt ook alle delen van de kooi blokkeren die veel lager zijn dan de opfokhoogte van het dier.
    36. Vul de monitoringchecklist in en controleer volgens de monitoringrichtlijnen die in het protocol worden beschreven.
      NOTITIE: Overweeg om wat voedselpellets op de grond te leggen om ze gemakkelijker te bereiken. Als het het experiment niet verstoort, kan extra pijnverlichting worden gegeven in zoet voedsel ter vervanging van extra sc-injecties na de operatie, bijv. Buprenorfine gemengd met zoete notenchocoladepasta 35,36,37. In dit geval werd een deel van hetzelfde snoepje als beloning voor en na de operatie verstrekt om voedselneofobie te voorkomen bij het aanbieden van pijnverlichting. De notenpasta kan worden geleverd op tape die aan de wand van de kooi is bevestigd.
    37. Voorraad meer dummycanules dan geleidecanules of injectiecanules, omdat ze verloren kunnen gaan tussen het beddengoed van de dierenkooi als ze per ongeluk loskomen. Vervang in een dergelijk geval de canule door een nieuwe, steriele dummycanule.

2. ICV-injecties

  1. Bereid het geneesmiddel en het vehiculum voor, bijv. 30 mg/ml Polymyxine B (zie materiaaltabel) in 0,9% steriele zoutoplossing. Houd het injectievolume tussen 5-10 μl bij volwassen ratten met een lichaamsgewicht tussen 300-400 g.
  2. Weeg de rat minimaal 24 uur na de operatie en transporteer hem naar de behandelkamer.
  3. Bereken het injectievolume aan de hand van het lichaamsgewicht van de rat.
  4. Verwijder het deksel van de kooi en schroef de dummycanule los.
    OPMERKING: Ratten zitten meestal stil als ze ze voorzichtig in hun kooi houden en hebben geen fixatie nodig. Een theedoek kan gebruikt worden bij een nieuwsgierige of nerveuze rat of een kriebel van de jukbeenderen.
  5. Bevestig voor een bolusinjectie PE-50-slang (zie materiaaltabel) met een lengte van ten minste 40 cm aan een gasdichte microspuit van 10 μl door het ene uiteinde van de slang over de vaste of verwijderbare naald op de spuit te trekken en zorg voor een goede afdichting. Bevestig de gemonteerde injectorcanule aan het andere uiteinde van de slang.
    1. Zuig de benodigde hoeveelheid op via de canule. Steek de canule in de geleider totdat deze is geplaatst en injecteer. Zodra alle vloeistof is geïnjecteerd, houdt u de zuiger van de spuit nog minstens een minuut op zijn plaats om terugstromen te voorkomen.
  6. Voor een langzamere toedieningssnelheid injecteert u de medicijnen met behulp van een micro-injectiepomp (zie materiaaltabel).
    1. Gebruik eerst gefilterd water en een wegwerpspuit van 1 ml met een opzuignaald van 23 g om de PE-50-slang volledig te vullen. Verwijder vervolgens de wegwerpspuit van de optreknaald en vervang deze door de microspuit.
    2. Trek 1-3 μL terug om een kleine maar zichtbare luchtbel te creëren. Bereid vervolgens de benodigde hoeveelheid medicijnen op. Markeer eventueel de luchtbel met een stift om de medicijnstroom beter zichtbaar te maken. Vergrendel de spuit op zijn plaats op de pomp.
      NOTITIE: Zorg voor de juiste instellingen voor het gebruikte medicijn en de gebruikte apparatuur, d.w.z. stel de toedieningssnelheid en de inwendige diameter van de gebruikte spuit in volgens de gebruikershandleiding.
  7. Zodra alle vloeistof is geïnjecteerd, stopt u de pomp als deze niet automatisch stopt. Laat de naald nog minstens een minuut inbrengen om terugstromen te voorkomen.
  8. Verwijder langzaam de injectorcanule en schroef de geleidecanule erop.
  9. Reinig de apparatuur door ethanol en gedemineraliseerd water elk drie keer op te zuigen en uit te werpen.

3. CSF en weefselbemonstering

  1. Vervoer de rat naar een behandelkamer.
  2. Plaats de rat in de inductiekamer en induceer anesthesie met 5% isofluraan in 2 l/min zuurstof totdat de ademhaling is vertraagd (~ 5 min).
  3. Verplaats de rat naar het stereotactische frame en behoud hetzelfde niveau van diepe anesthesie door de neuskegel.
  4. Controleer op pedaalreflex. Eenmaal afwezig, bevestig je de schedel in het frame met behulp van de oorstangen.
    OPMERKING: Dit kan een eenvoudiger stereotactisch frame zijn zonder display, afgeronde oorstangen of beweegbare armen. Dit is een niet-herstelprocedure; Het enige noodzakelijke kenmerk zijn eventuele oorstangen voor ratten.
  5. Draai met behulp van de neuskegel de neus van de rat ongeveer 45° naar beneden om de nek bloot te stellen aan een goede werkhouding.
  6. Voel met een kleine, botte, gebogen schaar aan de schedel en beweeg naar achteren naar het einde van de schedel. Snijd in deze positie de buitenste spierlaag dwars door de middellijn van de nek, ongeveer 2-3 cm lang. Snijd voorzichtig door alle andere spierlagen.
    1. Gebruik een klein veeroprolmechanisme om de wond open te houden en goed zicht te bieden. Knip totdat het cisterna magna membraan zichtbaar is. Gebruik een wattenstaafje om voorzichtig meer huid te verwijderen.
  7. Als er een bloeding optreedt, gebruik dan gaas om het bloeden schoon te maken en te stoppen.
  8. Gebruik indien nodig kleine reepjes opgerold weefsel en plaats deze rond de cisterna magna om te voorkomen dat bloed het CSF besmet.
    OPMERKING: Om het succes van injectie met kleurstof te bevestigen, injecteert u 2-3 μl 1,1% Evans Blue-kleurstof (zie materiaaltabel) in de verdoofde rat voordat u liza verzamelt met behulp van de aangebrachte canule en een wegwerpspuit van 1 ml.
  9. Om het gereedschap voor te bereiden op het extraheren van CSF, vult u de spuit met ~500 μL gefilterd water, bevestigt u een 23 G opzuignaald en trekt u de slang over de naald. Bevestig een getrokken glazen pipet aan het andere uiteinde van de slang.
  10. Om CSF te extraheren, steekt u de getrokken pipet langzaam in de blootgestelde cisterna magna.
    OPMERKING: CSF zal langzaam en passief in de pipet stromen en actief worden opgezogen met behulp van de spuit. Als de kleurstof wordt geïnjecteerd, wordt het CSF blauw gekleurd (Figuur 1).
  11. Voeg de CSF toe aan een gelabelde buis en plaats deze onmiddellijk op droogijs. CSF kan dan worden bewaard bij -80 °C.
  12. Verzamel ander weefsel dat van belang is voor analyse. Verzamel voor plasma ten minste 3 ml hartbloed.
    1. Leg de diep verdoofde rat op zijn rug en open de borstholte om het hart bloot te leggen. Gebruik een hemostaat om de ribbenkast vast te klemmen en plaats deze op de keel van het dier om de zichtbaarheid te verbeteren. Gebruik een weefseltang met haken om de rechterventrikel vast te houden en breng een wegwerpspuit van 5 ml met een naald van 18 G in de linkerventrikel parallel aan het septum. Zuig langzaam bloed op in de spuit. Zodra er 3-5 ml bloed is verzameld, verwijdert u de naald uit het hart.
  13. Haal de naald uit de spuit en plaats deze in een scherpe container. Breng het bloed over in gehepariniseerde buisjes en draai gedurende 15 minuten bij 2.739 x g en 4 °C voordat u het bovenstaande opvangt met een pipet van 200 μL en snel invriest op droogijs.
  14. Euthanaseer de rat door het hart met een schaar te verwijderen. Sluit de isofluraantoevoer af.
  15. Verzamel alle andere buikorganen die van belang zijn, zoals de nier of milt. Identificeer het orgaan, houd het orgaan van interesse vast met een weefseltang met haken, til het op en knip eventuele hulpstukken door. Plaats het orgel in een gelabelde buis en vries het in op droogijs.
  16. Om de hersenen te verwijderen, onthoofdt u het dier met een scherpe, grote schaar door aan de basis van de schedel af te knippen. Trek de hoofdsteun met de hand los. Snijd door de resterende huid die de schedel bedekt.
  17. Knip met een dissectorschaar de schedel op de middellijn van de basis tot lambda, d.w.z. snijd het supraoccipitale bot doormidden. Gebruik een hemostaat om een helft vast te pakken en weg te knijpen. Herhaal aan de andere kant om het cerebellum volledig bloot te leggen.
  18. Ga verder met het snijden langs de sagittale hechting tot aan het voorhoofdsbeen. Gebruik een hemostaat om elk van de pariëtale botten weg te knijpen. Snijd indien nodig het voorhoofdsbeen verder door en verwijder meer bot om de bulbus olfactorius bloot te leggen.
  19. Houd het hoofd ondersteboven en wrik de hersenen voorzichtig los met een spatel, waarbij je ze losmaakt van de optische en trigeminuszenuwen door ze met de spatel door te snijden. Verzamel de hersenen in een buis en bevries op droogijs.
  20. De hersenventrikels worden blauw gekleurd als de kleurstof wordt geïnjecteerd. Gebruik een wegwerpmesje om de hersenen op de injectieplaats te snijden (Figuur 2A,B) en ~1 cm posterieur (Figuur 2C) om de kleurstofverdeling in de ventrikels te onderzoeken.
  21. Om het ruggenmerg te verwijderen, legt u de wervelkolom bloot door de huid langs de middellijn van het dorsale oppervlak van de rat te snijden. Snijd de gewervelde kolom weg door er een bilaterale incisie omheen te maken en deze dwars door te snijden aan het caudale uiteinde van het lumbale ruggenmerg.
  22. Knip de lamina bilateraal langs de kolom met een schaar totdat het hele ruggenmerg bloot ligt. Til het ruggenmerg aan het ene uiteinde op, bijvoorbeeld het rostrale uiteinde, en trek het eruit door de ruggenmergzenuwen in caudale richting te splijten totdat alle zenuwen zijn doorgesneden. Verzamel het ruggenmerg in een buis en bevries op droogijs.
    OPMERKING: Weeg alle buisjes voor en na het verzamelen van organen voor gegevensanalyse. Indien nodig en aangewezen kan het ventriculaire systeem worden gewassen na het verzamelen van liver- en hersencellen om achtergebleven geneesmiddelen in de ventriculaire compartimenten te verwijderen. Gebruik een spuit van 1 ml gevuld met zoutoplossing die aan de slang is bevestigd en een injectorcanule en breng deze in de geleidecanule in. Injecteer 2-3 ml zoutoplossing. De zoutoplossing moet uit de opening in de cisterna magna komen. Gidscanules, dummycanules en schroeven kunnen worden hergebruikt door ze 24 uur in aceton te weken, gevolgd door intrekken en reinigen met medisch reinigingsmiddel en water. Eenmaal gedroogd kan achtergebleven tandcement worden verwijderd met een fijne tang.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het gepresenteerde chirurgische protocol is zeer succesvol, met getrainde chirurgen die een overlevingspercentage van >99,8% bereiken en dieren die na de operatie een stabiel lichaamsgewicht vertonen op dag 1, vergeleken met hun gewicht vóór de operatie op dag 0 (gemiddelde ± SD van 315,8 g ± 42,1 g voor dag 0 en 314,1 g ± 43,0 g voor dag 1, figuur 3).

Voordat CSF wordt verzameld, kan een injectie van 1,1% Evans Blue-kleurstof in ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Onderzoekers en clinici gebruiken ICV-injecties om het beschermende mechanisme van de BBB te omzeilen en medicijnen rechtstreeks in het CZS af te leveren 12,18,19,21,24. Het huidige werk is een compleet ICV-protocol voor het efficiënt afleveren van geneesmiddelen in het CZS en het extraheren van CSF voor farmacokinetische anal...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken de Biomedical Science Animal Facility van de Universiteit van Melbourne voor het verstrekken en verzorgen van dieren. Dit onderzoek werd ondersteund door een onderzoekssubsidie van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases van het National Institute of Health (R01 AI146241, GR en TV). JL is een Principal Research Fellow van de Australian National Health Medical Research Council (NHMRC). De inhoud valt uitsluitend onder de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van het National Institute of Allergy and Infectious Diseases of het National Institute of Health.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AcetoneTerumo, JapanSS+01T
5 mL spuitenTerumo, JapanSS+05S
AcetoneMerck, Duitsland67641
BankbeschermersHalyard, VS2765-C
BetadineMundipharma, Nederland1015695
Buprenorfine; TemgesicClifford Hallam Healthcare, Australië1238366
CarprofenZoetis, Australië10001132
ChlorhexidineTasman Chemicals, Australië890401
Chux superwipes (of gelijkwaardig)Chux, Australiën/ageautoclaveerd
Kniptangenn/an/a
WattenstaafjesLP Italiana, Italië112191geautoclaveerd
Tandcementpoeder (Vertex Self cure poeder)Henry Schein, VSVX-SC500GVD5
Tandcementoplosmiddel (Vertex Self cure vloeistof)Henry Schein, VSVX-SC250MLLQ
Wegwerpspuiten: 18 G, 26 G, 30 GTerumo, JapanNN+2525RL
Wegwerpchirurgische mesjesWestlab, Australië663-255
Dissectie schaarF.S.T.14082-09
Dummy canulesBio Scientific, AustraliëC313DC/SPCgesneden tot 4,05 om de gidscanule te passen
Ethanol 80%Merck, Australië10107
Evan's blauwe kleurstofSigmaE2129 - 50G
Ogen smeringClifford Hallam Healthcare, Australië2070491
FiltpenSharpie, VSD-4236
Vezel optische lichtbronn/an/a
Afgeplatte naald (18 G) of gelijkwaardig om superlijm aan te brengenn/an/a
Getrokken glaspipettenHirschmann Laborgeraete, Duitsland9100175
Glas spuit 10 uLHamilton, VS701 LT en 1701 LT
Gids canulesBio Scientific, AustraliëC313G/SPC22 G, 4 mm onder het voetstuk gesneden voor laterale ventrikel canule in volwassen Sprague Dawley ratten
Haemostaat
Warmtekraal sterilisatorInotech, ZwitserlandIS-250
Warmtepadn/an/a
Waterstofperoxide 3%Perrigo, Australië11383
Inductiekamer (Perspex 300 mm x 200 mm)n/an/a
Injector canuleBio Scientific, AustraliëC313I/SPCgesneden om te passen op de 4 mm canule + 0,5 mm projectie
IsofluraanClifford Hallam Healthcare, Australië2093803
Isofluraan verdamper en geschikt afvoersysteemn/an/a
Middelgrote weegschalenn/an/a
Metalen spatelMet-App, Australiën/a
Micro spuitpompNew Era, VSNE-300
MicroboorRWD Life Science Co, China87001
Polymyxine BBeta Pharma, China86-40302
Protein LoBind buizen, 0,5 mLEppendorf, DuitslandZ666491
Ropivacaïne 1%; NaropinAstraZeneca, UKPS09634
Schaar, grootF.S.T.14511-15
Schaar, kleinF.S.T.14079-10
Schroevendraaiern/an/a
SchroevenMr. Specs, Australiën/a
Stereotactisch frameRWD Life Science Co, Chinan/aNoodzakelijke onderdelen: ratten oor beugels, tandstaaf, anesthesie neuskoker, arm met digitaal display (X, Y, Z) en canule houder
Steriele zoutoplossing 0,9%Baxter, VSAHB1323
Super etch (37% fosforzuur) gelSDI Limited, Australië8100045
SuperlijmUHU, Duitslandn/a
Weefseltang met hakenF.S.T.11027-12
Slang, PE-50Bio Scientific, AustraliëC313CT

Referenties

  1. Goldmann, E. E. Vitalfärbung am Zentralnervensystem. Beitrag zur Physio-Pathologie des Plexus chorioideus und der Hirnhäute. Königl. Akademie der Wissenschaften. , Berlin. (1913).
  2. Koziara, J. M., Lockman, P. R., Allen, D. D., Mumper, R. J. The blood-brain barrier and brain drug delivery. Journal of Nanoscience and Nanotechnology. 6 (9-10), 2712-2735 (2006).
  3. Davson, H. Review lecture. The blood-brain barrier. The Journal of Physiology. 255 (1), 1-28 (1976).
  4. Pandit, R., Chen, L., Götz, J. The blood-brain barrier: Physiology and strategies for drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 165-166, 1-14 (2020).
  5. Oldendorf, W. H., Hyman, S., Braun, L., Oldendorf, S. Z. Blood-brain barrier: Penetration of morphine, codeine, heroin, and methadone after carotid injection. Science. 178 (4064), 984-986 (1972).
  6. Abbott, N. J., Patabendige, A. A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  7. Velkov, T., Dai, C., Ciccotosto, G. D., Cappai, R., Hoyer, D., Li, J. Polymyxins for CNS infections: Pharmacology and neurotoxicity. Pharmacology & Therapeutics. 181, 85-90 (2018).
  8. Martin, J. A., Maris, A. S., Ehtesham, M., Singer, R. J. Rat Model of blood-brain barrier disruption to allow targeted neurovascular therapeutics. Journal of Visualized Experiments. (69), e50019(2012).
  9. KrolI, R. A., Neuwelt, E. A., Neuwelt, E. A. Outwitting the blood-brain barrier for therapeutic purposes: Osmotic opening and other means. Neurosurgery. 42 (5), 1083-1099 (1998).
  10. Wei, B., Qian, C., Liu, Y., Lin, X., Wan, J., Wang, Y. Ommaya reservoir in the treatment of cryptococcal meningitis. Acta Neurologica Belgica. 117 (1), 283-287 (2017).
  11. Zubair, A., Jesus, O. D. Ommaya reservoir. StatPearls [Internet]. , StatPearls Publishing. Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK559011/ (2021).
  12. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. Journal of Visualized Experiments. (75), e50326(2013).
  13. Ajoy, R., Chou, S. -Y. Studying the hypothalamic insulin signal to peripheral glucose intolerance with a continuous drug infusion system into the mouse brain. Journal of Visualized Experiments. (131), e56410(2018).
  14. Sajadi, A., Provost, C., Pham, B., Brouillette, J. Neurodegeneration in an animal model of chronic amyloid-beta oligomer infusion is counteracted by antibody treatment infused with osmotic pumps. Journal of Visualized Experiments. (114), e54215(2016).
  15. Rauschenberger, L., Knorr, S., Volkmann, J., Ip, C. W. Implantation of osmotic pumps and induction of stress to establish a symptomatic, pharmacological mouse model for DYT/PARK-ATP1A3 dystonia. Journal of Visualized Experiments. (163), e61635(2020).
  16. Cooper, J. D., Heppert, K. E., Davies, M. I., Lunte, S. M. Evaluation of an osmotic pump for microdialysis sampling in an awake and untethered rat. Journal of Neuroscience Methods. 160 (2), 269-275 (2007).
  17. Sharma, R. K., et al. Microglial cells impact gut microbiota and gut pathology in angiotensin II-induced hypertension. Circulation Research. 124 (5), 727-736 (2019).
  18. Kim, H. Y., Lee, D. K., Chung, B. -R., Kim, H. V., Kim, Y. Intracerebroventricular injection of amyloid-β peptides in normal mice to acutely induce alzheimer-like cognitive deficits. Journal of Visualized Experiments. (109), e53308(2016).
  19. Fukushima, A., Fujii, M., Ono, H. Intracerebroventricular treatment with resiniferatoxin and pain tests in mice. Journal of Visualized Experiments. (163), e57570(2020).
  20. Niaz, N., et al. Intracerebroventricular injection of histamine induces the hypothalamic-pituitary-gonadal axis activation in male rats. Brain Research. 1699, 150-157 (2018).
  21. Yokoi, H., Arima, H., Murase, T., Kondo, K., Iwasaki, Y. Intracerebroventricular injection of adrenomedullin inhibits vasopressin release in conscious rats. Neuroscience Letters. 216 (1), 65-70 (1996).
  22. Savci, V., Gürün, S., Ulus, I. H., Kiran, B. K. Intracerebroventricular injection of choline increases plasma oxytocin levels in conscious rats. Brain Research. 709 (1), 97-102 (1996).
  23. Sunter, D., Hewson, A. K., Dickson, S. L. Intracerebroventricular injection of apelin-13 reduces food intake in the rat. Neuroscience Letters. 353 (1), 1-4 (2003).
  24. Moreau, C., et al. Intraventricular dopamine infusion alleviates motor symptoms in a primate model of Parkinson's disease. Neurobiology of Disease. 139, 104846(2020).
  25. Calvo, P. M., de la Cruz, R. R., Pastor, A. M. A single intraventricular injection of VEGF leads to long-term neurotrophic effects in axotomized motoneurons. eNeuro. 7 (3), (2020).
  26. Choi, C. R., Ha, Y. S., Ahn, M. S., Lee, J. S., Song, J. U. Intraventricular or epidural injection of morphine for severe pain. Neurochirurgia. 32 (6), 180-183 (1989).
  27. Zhong, L., Shi, X. -Z., Su, L., Liu, Z. -F. Sequential intraventricular injection of tigecycline and polymyxin B in the treatment of intracranial Acinetobacter baumannii infection after trauma: A case report and review of the literature. Military Medical Research. 7 (1), 23(2020).
  28. Gross, P. M., Weaver, D. F. A new experimental model of epilepsy based on the intraventricular injection of endothelin. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 22, Suppl 8 282-287 (1993).
  29. Nang, S. C., Azad, M. A. K., Velkov, T., Zhou, Q. Rescuing the last-line polymyxins: Achievements and challenges. Pharmacological Reviews. 73 (2), 679-728 (2021).
  30. Tsuji, B. T., et al. International Consensus Guidelines for the Optimal Use of the Polymyxins: Endorsed by the American College of Clinical Pharmacy (ACCP), European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID), Infectious Diseases Society of America (IDSA), International Society for Anti-infective Pharmacology (ISAP), Society of Critical Care Medicine (SCCM), and Society of Infectious Diseases Pharmacists (SIDP). Pharmacotherapy. 39 (1), 10-39 (2019).
  31. Velkov, T., Roberts, K. D., Nation, R. L., Thompson, P. E., Li, J. Pharmacology of polymyxins: New insights into an "old" class of antibiotics. Future Microbiology. 8 (6), 711-724 (2013).
  32. Nation, R. L., et al. Dosing guidance for intravenous colistin in critically-ill patients. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 64 (5), 565-571 (2017).
  33. Nation, R. L., Velkov, T., Li, J. Colistin and polymyxin B: Peas in a pod, or chalk and cheese. Clinical Infectious Diseases: An Official Publication of the Infectious Diseases Society of America. 59 (1), 88-94 (2014).
  34. Fornari, R. V., et al. Rodent stereotaxic surgery and animal welfare outcome improvements for behavioral neuroscience. Journal of Visualized Experiments. (59), e3528(2012).
  35. Molina-Cimadevila, M. J., Segura, S., Merino, C., Ruiz-Reig, N., Andrés, B., de Madaria, E. Oral self-administration of buprenorphine in the diet for analgesia in mice. Laboratory Animals. 48 (3), 216-224 (2014).
  36. Goldkuhl, R., Hau, J., Abelson, K. S. P. Effects of voluntarily-ingested Buprenorphine on plasma corticosterone levels, body weight, water intake, and behaviour in permanently catheterised rats. In Vivo. 24 (2), Athens, Greece. 131-135 (2010).
  37. Hestehave, S., Munro, G., Pedersen, T. B., Abelson, K. S. P. Antinociceptive effects of voluntarily ingested Buprenorphine in the hot-plate test in laboratory rats. Laboratory Animals. 51 (3), 264-272 (2017).
  38. Faesel, N., Schünemann, M., Koch, M., Fendt, M. Angiotensin II-induced drinking behavior as a method to verify cannula placement into the cerebral ventricles of mice: An evaluation of its accuracy. Physiology & Behavior. 232, 113339(2021).
  39. Elsevier. Neurotoxicity. Neurotoxicity | Elsevier Enhanced Reader. , (2021).
  40. Vuillemenot, B. R., Korte, S., Wright, T. L., Adams, E. L., Boyd, R. B., Butt, M. T. Safety evaluation of CNS administered biologics-study design, data interpretation, and translation to the clinic. Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 152 (1), 3-9 (2016).
  41. Cerebrospinal fluid dynamics and intracranial pressure elevation in neurological diseases. , Available from: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC6456952/ (2021).
  42. Nau, R., Sörgel, F., Eiffert, H. Penetration of drugs through the blood-cerebrospinal fluid/blood-brain barrier for treatment of central nervous system infections. Clinical Microbiology Reviews. 23 (4), 858-883 (2010).
  43. Quagliarello, V. J., Ma, A., Stukenbrok, H., Palade, G. E. Ultrastructural localization of albumin transport across the cerebral microvasculature during experimental meningitis in the rat. The Journal of Experimental Medicine. 174 (3), 657-672 (1991).
  44. Reinhardt, V. Common husbandry-related variables in biomedical research with animals. Laboratory Animals. 38 (3), 213-235 (2004).
  45. Morton, L. D., Sanders, M., Reagan, W. J., Crabbs, T. A., McVean, M., Funk, K. A. Confounding factors in the interpretation of preclinical studies. International Journal of Toxicology. 38 (3), 228-234 (2019).
  46. Bailey, J. Does the stress of laboratory life and experimentation on animals adversely affect research data? A critical review. Alternatives to laboratory animals: ATLA. 46 (5), 291-305 (2018).
  47. Moberg, G. P., Mench, J. A. The Biology of Animal Stress: Basic Principles and Implications for Animal Welfare. , CABI. (2000).
  48. Russel, W. M. S., Burch, R. L. The principles of humane experimental technique principles. , Methuen & Co LTD. (1959).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

bloed hersenbarri recentraal zenuwstelselfarmacokinetische studiestereotaxische chirurgiegeleidecanulemicroinjectiepompafname van cerebrospinale vloeistofbehandeling van herseninfecties
Video binnenkort beschikbaar

Gerelateerde artikelen