Methodenartikel

Imaging-guided bioreactor voor het genereren van bio-technisch luchtwegweefsel

DOI:

10.3791/63544

⸱

6 april 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Stevens Institute of Technology, 2Department of Biomedical Engineering, Columbia University, 3Department of Cell Biology, State University of New York Downstate Medical Center, 4Department of Cardiothoracic Surgery, Stanford University

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het protocol beschrijft een beeldvormingsgerichte bioreactor die de selectieve verwijdering van het endogene epitheel uit de rattenluchtpijp en homogene verdeling van exogene cellen op het lumenoppervlak mogelijk maakt, gevolgd door langdurige in vitro kweek van het celweefselconstruct.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhaaldelijk letsel aan luchtwegweefsel kan de longfunctie aantasten en chronische longziekte veroorzaken, zoals chronische obstructieve longziekte. Vooruitgang in regeneratieve geneeskunde en bioreactortechnologieën bieden mogelijkheden om in het laboratorium gekweekte functionele weefsel- en orgaanconstructies te produceren die kunnen worden gebruikt om geneesmiddelen te screenen, ziekten te modelleren en weefselvervangingen te manipuleren. Hier wordt een geminiaturiseerde bioreactor in combinatie met een beeldvormingsmodaliteit beschreven die in situ visualisatie van het binnenste lumen van geëxplanteerde rattenluchtpijp mogelijk maakt tijdens in vitro weefselmanipulatie en -kweek. Met behulp van deze bioreactor demonstreert het protocol beeldgeleide selectieve verwijdering van endogene cellulaire componenten met behoud van de intrinsieke biochemische kenmerken en ultrastructuur van de luchtwegweefselmatrix. Verder worden de levering, uniforme verdeling en daaropvolgende langdurige kweek van exogene cellen op het gedecellulariseerde luchtweglumen met optische monitoring in situ getoond. De resultaten benadrukken dat de beeldvormingsgeleide bioreactor mogelijk kan worden gebruikt om de generatie van functionele in vitro luchtwegweefsels te vergemakkelijken.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het luminale oppervlak van de luchtwegen wordt bekleed door een laag epitheel dat voornamelijk bestaat uit multiciliated, club, goblet en basale stamcellen 1,2. De epitheellaag dient als een primair afweermechanisme van de long en fungeert als een biofysische barrière die het onderliggende luchtwegweefsel beschermt tegen ingeademde pathogenen, deeltjes of chemische gassen. Het beschermt het luchtwegweefsel via meerdere mechanismen, waaronder intercellulaire tight junction-vorming, mucociliaire klaring en antimicrobiële en antioxiderende secretie 3,4. Het defecte luchtwegepitheel wordt geassocieerd met verwoestende aandoeningen van de luchtwegen, zoals chronische obstructieve longziekte (COPD)5, primaire ciliaire dyskinesie (PCD)6 en cystische fibrose (CF)7.

Vooruitgang in lung-on-chip (LOC) -technologie biedt een kans om de ontwikkeling van menselijke longen te bestuderen, verschillende longziekten te modelleren en nieuwe therapeutische materialen te ontwikkelen in strak gereguleerde in vitro omgevingen. Luchtwegepitheel en endotheel kunnen bijvoorbeeld aan weerszijden van een dun, poreus membraan worden gekweekt om het gas na te bootsen dat longweefsel uitwisselt, waardoor getrouwe ziektemodellering en drugstestsmogelijk zijn 8. Evenzo zijn in vitro ziektemodellen gemaakt om luchtwegaandoeningen in vitro te modelleren, zoals COPD9 en cystic fibrosis10. Een grote uitdaging van LOC-apparaten is echter het samenvatten van de complexe driedimensionale (3D) architectuur van het longweefsel en dynamische cel-weefselmatrixinteracties in vitro11.

Onlangs zijn innovatieve tissue engineering-methodologieën ontwikkeld die manipulatie van ex vivo longweefselsmogelijk maken 12. Met behulp van deze methoden kunnen gedenudeerde allogene of xenogene weefseltransplantaten worden bereid door de endogene cellen uit het longweefsel te verwijderen via chemische, fysische en mechanische behandelingen13. Bovendien biedt de bewaarde inheemse weefsel extracellulaire matrix (ECM) in de gedecellulariseerde longsteigers de fysio-mimetische structurele, biochemische en biomechanische signalen voor geïmplanteerde cellen om zich te hechten, te prolifereren en te differentiëren14,15.

Hier wordt een beeldvormingsgestuurd bioreactorsysteem gerapporteerd dat is gemaakt door LOC- en tissue engineering-technologieën te combineren om in vitro weefselmanipulatie en kweek van geëxplanteerde tracheale weefsels van ratten mogelijk te maken. Met behulp van deze luchtwegweefselbioreactor toont het protocol selectieve verwijdering van de endogene epitheelcellen zonder de onderliggende subepitheliale cellulaire en biochemische componenten van het luchtwegweefsel te verstoren. Vervolgens tonen we de homogene verdeling en onmiddellijke afzetting van de nieuw gezaaide exogene cellen, zoals mesenchymale stamcellen (MSC's), op het ontslankte luchtweglumen door de celbelaste collageen I pre-gel-oplossing in te brengen. Bovendien wordt door gebruik te maken van het micro-optische beeldvormingsapparaat dat in de bioreactor is geïntegreerd, ook de visualisatie van het luchtpijplumen tijdens epitheelverwijdering en endogene celafgifte gedaan. Verder wordt aangetoond dat de luchtpijp en nieuw geïmplanteerde cellen gedurende 4 dagen in de bioreactor kunnen worden gekweekt zonder merkbare celdood en weefselafbraak. We stellen ons voor dat het op beeldvorming gebaseerde bioreactorplatform, de op dunne film gebaseerde de-epithelisatietechniek en de celafgiftemethode die in deze studie wordt gebruikt, nuttig kunnen zijn voor het genereren van luchtwegweefsels voor in vitro ziektemodellering en screening van geneesmiddelen.

De bioreactor bevat een rechthoekige kamer die is aangesloten op een programmeerbare spuitpomp, perfusiepomp en ventilator voor het kweken van geïsoleerde rattenluchtpijp. De bioreactor beschikt over in- en uitgangen die zijn aangesloten op de luchtpijp of de weefselkweekkamer om reagentia (bijv. kweekmedia) afzonderlijk te leveren aan de interne en externe ruimtes van de luchtpijp (figuur 1). Een op maat gemaakt beeldvormingssysteem kan worden gebruikt om het inwendige van de in vitro gekweekte rattentrui op cellulair niveau te visualiseren (figuur 2). Het endogene epitheel van de luchtpijp wordt verwijderd via de instillatie van een op detergenten gebaseerde decellularisatieoplossing gevolgd door trillingsondersteund luchtwegwassen (figuur 3). Hydrogel-oplossing, zoals type I collageen, wordt gebruikt als een leveringsvoertuig voor het zaaien van exogene cellen uniform en onmiddellijk over het ontnuchterde luchtpijplumen (figuur 4). Alle materialen die zijn gebruikt om de bioreactor te bouwen en de experimenten uit te voeren, zijn opgenomen in de tabel met materialen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het onderstaande dierweefselprotocol is goedgekeurd door de dierenwelzijnsrichtlijn en -voorschriften van het Institute for Animal Care and Use Committee (IACUC) van het Stevens Institute of Technology en voldoet aan de richtlijnen van de National Institutes of Health (NIH) voor het gebruik van proefdieren.

1. Ontwerp en bouw van beeldvormingsgeleide rattenluchtpijpbioreactor

  1. Ontwerpen en fabriceren van ratten luchtpijp bioreactor
    1. Maak een CAD-model (computerondersteund ontwerp) van de bioreactorkamer met een relevant ontwerp, zoals inlaten, uitlaten en weefselkweek, met behulp van CAD-generatorsoftware. Gebruik voor dit onderzoek de geometrie en afmetingen in figuur 1A-C. De tutorial van CAD generator software is te vinden in 16,17.
    2. Exporteer het gegenereerde CAD-model naar een CNC-besturingssoftware (Computer Numerical Control) en snijd het polytetrafluorethyleen (PTFE) plastic met behulp van een CNC-machine om de bioreactorkamer te maken. De tutorial van de CNC-besturingssoftware is te vinden in18.
      OPMERKING: Naast PTFE kunnen andere plastic materialen, zoals polyethyleen met ultrahoog moleculair gewicht (UHMWPE) en polyetherimide, worden gebruikt om de kweekkamer te fabriceren.
    3. Steriliseer alle bioreactorcomponenten, zoals Luer-adapters en -schroeven, om besmetting van de weefsels en cellen die in het apparaat zijn gekweekt te voorkomen. Monteer alle bioreactorcomponenten in de belangrijkste weefselkweekkamer in een schone omgeving (figuur 1A).
  2. Constructie van een op een lens gebaseerd beeldapparaat met gradiëntindex (GRIN)
    1. Om het in-situ beeldvormingsapparaat te maken, plaatst u een buislens in een stapelbare lensbuis en bevestigt u deze met een bevestigingsring. Monteer de lensbuis op een wetenschappelijke CMOS-camera via een C-mount adapter.
    2. Gebruik software, zoals Micro-Manager, om de camera te bedienen en foto's en video's te verkrijgen. Richt een object op een grote afstand (bijvoorbeeld 10 m van de camera) en pas de afstand tussen de buislens en de beeldsensor van de camera aan totdat een scherp beeld van het object op het computerscherm wordt gevormd door de beeldbewerkingssoftware die wordt gebruikt.
    3. Monteer een filterlens op een dichroïsche spiegel met dubbele rand met superresolutie en een laser op het apparaat met behulp van optische kooisysteemcomponenten, waaronder montagestang, kooiplaat met schroefdraad en kooikubus.
    4. Sluit de objectieflens (20x) aan op het apparaat. Monteer een GRIN-lens (diameter = 500 μm) aan het distale uiteinde van de lensbuis via de XY-vertaler. Pas de afstand tussen de GRIN-lens en de objectieflens aan om scherpgestelde microscopische beelden te vormen (figuur 2A,B).

2. Isolatie van de rattenluchtpijp

  1. Ontsmet het operatiegebied en steriliseer de chirurgische instrumenten met behulp van een autoclaaf bij 121 °C gedurende 30 minuten voorafgaand aan de operatie.
  2. Plaats een rat in de inductiekamer en lever 2,5% isofluraan gedurende 15 minuten met behulp van een kleine verdamper om het dier te verdoven. Beoordeel de anesthesiediepte door middel van een pedaalreflex. Om dit te doen, knijp stevig in de teen en bevestig dat het dier niet reageert op de teenknijp.
  3. Verwijder na anesthesie het isofluraan uit de kamer en dien 1 ml 1.000 eenheid / ml heparine toe via de laterale staartader om bloedstolling in de pulmonale vasculatuur te voorkomen.
  4. Om het dier te euthanaseren, stelt u het dier nog eens 15-20 minuten bloot aan 5% isofluraan. Verwijder het dier uit de inductiekamer en plaats het op de operatieplank in een rugligging met het gezicht naar boven.
  5. Bevestig de rat op de operatieplank door de benen en staart te immobiliseren met plakband. Steriliseer vervolgens de nek- en borstregio's van de rat met 70% isopropylalcohol (IPA). Open de buikholte door een incisie van 3-4 cm te maken met een schaar in de huid.
    OPMERKING: Pas op dat je de huid niet diep snijdt door de uiteinden van de schaar naar boven te richten.
  6. Transect de inferieure vena cava (IVC) met behulp van de schaar en bevestig de euthanasie door exsanguinatie.
  7. Voer de tracheotomie uit door een incisie te maken met een schaar in de middellijn van de nek en de luchtpijp bloot te leggen. Voer thoracotomie in de middellijn uit door een incisie in de borstwand te maken en tussen de ribben te snijden om het luchtpijpuiteinde te bereiken dat verbonden is met de long. Gebruik vervolgens een biceps en schaar om beide uiteinden van de luchtpijp te knippen en de luchtpijp te isoleren.
  8. Spoel na isolatie de luchtpijp af met 20 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (1x PBS). Breng de luchtpijp over naar de bioreactor met behulp van gesteriliseerde biceps. Bevestig de twee uiteinden van de luchtpijp aan de Luer-connector met behulp van een 4-0 hechtdraad.
  9. Lever 5 ml kweekmedium aan de bioreactorkamer met behulp van de programmeerbare spuitpomp door de slang die is aangesloten op de bioreactorkamer met een debiet van 5 ml / min.
    OPMERKING: Het kweekmedium bestaat uit Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM), recombinant humaan FGF-basisch (0,1 ng/ml), foetaal runderserum (FBS, 10%) en antibioticum-antimycotisch (1%).
  10. Sluit het deksel van de bioreactor goed af met het acryl plastic deksel en de schroeven. Sluit de bioreactorkamerbuizen met de mannelijke/vrouwelijke Luer-pluggen om de doorstroming van het kweekmedium in de slang te voorkomen.

3. Beeldvormingsgeleide verwijdering van het luchtpijpepitheel

  1. Om het luchtpijplumen in een helder veld of fluorescerend te visualiseren, plaatst u de bioreactor op het beeldvormingsstadium (figuur 3A).
  2. Bereid carboxyfluoresceïne succinimidylester (CFSE) oplossing (concentratie: 100 μM) in de CFSE cel etiketteerkit door de CFSE-oplossing te verdunnen met 1x PBS.
    OPMERKING: De concentratie van de oorspronkelijke CFSE-oplossing is 10 mM (in dimethylsulfoxide (DMSO)).
  3. Injecteer 500 μL van de CFSE-oplossing door de luchtpijp via de spuitpomp door de slang die is aangesloten op de luchtpijpcanule met een debiet van 5 ml/min. Stop de pomp wanneer de CFSE-oplossing de luchtpijp vult. Wacht 10 minuten en was vervolgens het luchtpijplumen door infusie van 10 ml 1x PBS met behulp van de spuitpomp om het resterende niet-geïncorporeerde CFSE-reagens te verwijderen.
  4. Plaats het distale beelduiteinde van de GRIN-lens in de luchtpijp via de Luer-connector die aan het ene uiteinde van de luchtpijp is bevestigd. Beweeg vervolgens voorzichtig de GRIN-lens in de luchtpijp totdat het luchtpijpoppervlak is scherpgesteld en maak foto's en video's in een helder veld of fluorescentie met een vergroting van 20x.
  5. Voor het vastleggen van bright-field beelden in de Micro-Manager software volgt u de onderstaande stappen.
    1. Breng wit licht door de kooikubus om het luchtpijplumen te verlichten. Klik op het live-pictogram om het luminale oppervlak van de luchtpijp in realtime weer te geven. Gebruik Imaging Setting > Exposure (ms) om de belichtingstijd te wijzigen in de gewenste waarde. In deze studie lag de gebruikte blootstellingstijd in het bereik van 10 ms en 50 ms.
    2. Als u het contrast en de helderheid van afbeeldingen wilt aanpassen, gebruikt u het venster Histogram en Intensiteit schalen om zwart-witpijlen te verplaatsen op het eindpunt van de interactieve histogramweergave. U kunt ook de optie Auto Stretch gebruiken waarmee de software de helderheid en het contrast automatisch kan aanpassen aan optimale niveaus.
    3. Klik op het snap-pictogram om de afbeelding te bevriezen. Gebruik vervolgens Instelling > Afbeeldingen exporteren als Verplaatst om de afbeeldingen in het gewenste formaat op te slaan. U kunt ook Setting > ImageJ gebruiken om de afbeelding rechtstreeks naar de ImageJ-software te exporteren en op te slaan.
  6. Om foto's en video's in fluorescerende modus te verkrijgen, verlicht u het luchtpijplumen met CFSE-specifiek laserlicht (CFSE: excitatiegolflengte: 488 nm, emissiegolflengte: 515 nm) door de kooikubus. Volg de stappen 3.5.2-3.5.3 om de afbeeldingen te verkrijgen. Verwijder na het maken van foto's en video's voorzichtig de GRIN-lens uit de luchtpijp.
  7. Voer de-epithelisatie uit zoals hieronder beschreven.
    1. Bereid 2% natriumdodecylodeylsulfaat (SDS) decellularisatieoplossing in gedestilleerd (DI) water. Instilleer 50 μL SDS door de luchtpijp met een debiet van 6,3 ml/min, door de spuitpomp door de luchtpijpcanule te gebruiken om een dunne film van de wasmiddeloplossing op het luchtpijplumen te genereren.
    2. Sluit de slangverbindingen van de bioreactor met behulp van mannelijke/vrouwelijke Luer-pluggen en breng de bioreactor over naar een incubator. Laat het VIB gedurende 10 minuten bij 37 °C in de luchtpijp verblijven. Breng nog eens 50 μL SDS-oplossing door de luchtpijp en incubeer gedurende 10 minuten.
    3. Verwijder gelyseerd epitheel en SDS door het luchtpijplumen te irrigeren met 500 μL 1x PBS via een spuitpomp met een debiet van 10 ml / min gedurende 3x. Plaats de bioreactor op een shaker en laat de bioreactor mechanisch trillen met een frequentie van 20 Hz en een verplaatsingsamplitude van ongeveer 0,3 mm om het loslaten van met SDS behandelde epitheelcellen van het luchtpijplumen fysiek te bevorderen.
      OPMERKING: In dit onderzoek werd de shaker op maat gemaakt door een subwooferluidspreker, een subwooferplaatversterker en een versnellingsmeter te assembleren. Een sinusoïdale golfvorm werd gegenereerd door een computer en via de versterker in de shaker ingevoerd, terwijl de reactie van de shaker werd gemonitord via de versnellingsmeter (figuur 3B). Bovendien kunnen conventionele shakers, zoals elektromagnetische en traagheidsschudders, worden gebruikt om het losmaken van de cellen te bevorderen. Stel hiervoor de frequentie en versnelling van de shaker in op respectievelijk 20 Hz en 0,5 g (gelijk aan 0,3 mm verplaatsingsamplitude).
    4. Breng tweemaal 500 μL 1x PBS door het lumen van de luchtpijp om resterende SDS en celresten te verwijderen terwijl de luchtpijp mechanisch trilt. Evalueer na de epitheelverwijderingsprocedure de klaring van de epitheellaag door de intensiteit van CVSE te meten met behulp van het GRIN-lensbeeldvormingsapparaat zoals in stap 3.6 (figuur 3C).

4. Voorbereiding van het luchtpijpweefsel voor verdere analyses

  1. Om de verwijdering van het epitheel te bevestigen, voert u verdere weefselanalyses uit, zoals hematoxyline en eosine (H & E) kleuring, trichroom, pentachroom en immunostaining. Verwijder hiervoor de luchtpijp uit de bioreactor en bevestig deze 's nachts in 30 ml 4% neutrale gebufferde paraformaldehyde-oplossing in 1x PBS (pH = 7,4) bij 4 °C.
  2. Droog het vaste luchtpijpweefsel uit en sluit het in door de onderstaande stappen te volgen.
    1. Was na fixatie het luchtpijpweefsel met 10 ml 1x PBS, breng de luchtpijp over op 30 ml 70% alcohol en houd het een nacht op 4 °C. Snijd de luchtpijp met een scherp mes in kleine cilindrische secties (~5 mm) en steek de weefselsecties in de weefselinsluitcassettes (lengte x breedte x hoogte: 4 cm x 2,5 cm x 0,5 cm). Bewaar twee luchtpijpsecties in elke cassette.
    2. Droog de secties uit in een reeks isopropylalcohol (IPA) -oplossingen - 85%, 90%, 95%, 100% - gedurende 1 uur in 30 ml van elke oplossing. Verwijder de vorige oplossing voordat u de volgende oplossing toevoegt.
    3. Dompel de cassettes na voltooiing gedurende 2 uur onder in 30 ml reinigingsmiddel (bijv. Xyleen) om de IPA-oplossing volledig uit de weefselsecties te verplaatsen. Voer deze stap uit in een zuurkast met de juiste ventilatie.
    4. Dompel de cassettes gedurende 2 uur onder in paraffine en sluit ze vervolgens 's nachts in paraffine bij 4 °C in. Snijd vervolgens de in paraffine ingebedde weefsels in dunne secties (5-8 μm) met behulp van een microtoomapparaat voor de H & E, trichrome, pentachrome en immunostaining.
  3. Om de weefsels voor te bereiden op scanning elektronenmicroscopie (SEM) analyse, fixeert u de luchtpijp in 30 ml 2,5% glutaaraldehyde-oplossing in 1x PBS (pH = 7,4) bij 4 °C gedurende de nacht. Droog vervolgens het vaste luchtpijpweefsel uit voor SEM door de onderstaande stappen te volgen.
    1. Spoel na fixatie het luchtpijpweefsel af met 10 ml 1x PBS. Knip het luchtpijpweefsel in de lengterichting in kleine halve cilindersecties (lengte: ~ 5 mm) met een schaar en steek de weefselsecties in de cassettes.
    2. Droog de secties in een reeks IPA-oplossingen - 35%, 50%, 70%, 85%, 95% en 100% - gedurende 10 minuten uit in 30 ml van elke oplossing. Verwijder de vorige oplossing voordat u de volgende oplossing toevoegt.
    3. Voer een op hexamethyldisilazane (HMDS) gebaseerde droogmethode uit door de weefsels onder te dompelen in de volgende oplossingen: 100% IPA: HMDS (2:1; v/v) gedurende 10 minuten, gevolgd door 100% IPA: HMDS (1:2; v/v) gedurende 10 minuten en ten slotte 100% HMDS gedurende de nacht.
      OPMERKING: HMDS is giftig. Werk onder een zuurkast tijdens alle droogstappen.
    4. Verwijder de weefsels uit de HMDS-oplossing en laat ze gedurende 1 uur drogen onder de zuurkast. Monteer het gedeelte op aluminium pinstompjes met behulp van een carbon dubbelzijdige geleidende tape of zilvergeleidende pasta voor SEM-beeldvorming.

5. Homogene verdeling van exogene cellen over het gedenudeerde tracheale lumen

  1. Bereid een gede-epithelialiseerde rattenluchtpijp voor met behulp van het protocol in stap 3. Ontdooi bevroren mesenchymale stamcellen (MSC's) gedurende 30 s in een waterbad van 37 °C.
    OPMERKING: In deze studie gebruikten we mesenchymale stamcellen (MSC's) als modelcel om de verdeling van exogene cellen op de gede-epithelialiseerde luchtpijp te laten zien. Idealiter kunnen primaire luchtwegepitheelcellen, basale cellen of geïnduceerde-menselijke pluripotente cellen (iPSC's) worden gebruikt voor epitheelregeneratiedoeleinden.
  2. Tel de cellen met een hemocytometer en bereid een celoplossing met een concentratie van 5 x 106 cellen / ml. Label de cellen fluorescerend door de cellen te incuberen met 2 ml CFSE-oplossing (concentratie: 100 μM) bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten. Spoel de cellen met 5 ml 1x PBS gedurende 3x en resuspend de cellen in vers kweekmedium in een eindconcentratie van 3 x 107 cellen/ml.
  3. Bereid hydrogel pre-gel oplossing als een voertuig voor celafgifte. Gebruik voor deze studie collageen I als een leveringsvoertuig voor MSCs-cellen en volg de instructies van de fabrikant om de pre-gel te bereiden. Om bijvoorbeeld 3,6 mg / ml collageen pre-gel te verkrijgen, mengt u een deel van de gekoelde neutralisatieoplossing met negen delen van het collageen van de rattenstaart in een steriele buis van 1,5 ml. Pipetteer het mengsel vervolgens voorzichtig op en neer voor voldoende menging.
    OPMERKING: Andere biocompatibele hydrogels kunnen worden gebruikt in plaats van collageen I volgens de studie en de behoeften van de gebruiker.
  4. Zodra de hydrogeloplossing is bereid, voegt u de cellen snel toe aan de oplossing met de gewenste concentratie (bijv. 5 x 106 cellen /ml). Om een uniform cel-hydrogelmengsel te verkrijgen, mengt u de cellen en de geloplossing door voorzichtig te pipetteren met een micropipette.
  5. Bevestig het ene uiteinde van de luchtpijp in de bioreactor aan een programmeerbare spuitpomp via een Luer-connector. Lever 5 ml vers kweekmedium bij 37 °C in de bioreactorkamer om het buitenoppervlak van de luchtpijp te bedekken met behulp van de spuitpomp met een debiet van 5 ml/min.
  6. Dien een bolus van 10 μL van het cel-hydrogelmengsel toe aan de gede-epitheelvormige luchtpijp in de bioreactor met behulp van de spuitpomp met een stroomsnelheid van 5 ml/min om een cel-hydrogellaag op het luchtpijplumen te genereren (figuur 4).
  7. Plaats de bioreactor na celinjectie in een steriele celkweekincubator bij 37 °C en 5% CO2 voor gelation. Voor collageen I vindt de gelation plaats in 30 min.
  8. Om de verdeling van geïmplanteerde cellen te visualiseren, steriliseert u de GRIN-lens door af te vegen met 70% IPA of ethanol en plaatst u de bioreactor op de beeldvormingsfase. Maak indien nodig foto's en video's in zowel bright-field- als fluorescentiemodi.
  9. Na 30 minuten celzaaien, infundeer 1 ml kweekmedium in het luchtpijplumen met behulp van een spuitpomp met een debiet van 1 ml / min.
  10. Kweek de celgezaaide luchtpijp in de bioreactor in een incubator bij 37 °C gedurende de gewenste tijd. Voor langdurige kweek ververst u het kweekmedium in het luchtpijplumen en de bioreactorkamer elke 24 uur. Houd tijdens de celkweek de media in het lumen statisch en verander deze elke 24 uur, terwijl de media buiten de luchtpijp continu worden doordrenkt via een unidirectionele stroom bij 5 ml / min.
  11. Na het kweken van de cellen gedurende een bepaalde periode (bijv. 1 en 4 dagen in deze studie), verwijdert u de luchtpijp uit de bioreactor. Gebruik een schaar om de luchtpijp in de lengterichting in twee semi-cilindersecties (d.w.z. bovenste en onderste secties) te knippen op dag 1 en 4 van in vitro cultuur om de binnenoppervlakken bloot te leggen voor het bewaken van de celgroei en het berekenen van de celdichtheid. Gebruik een conventionele fluorescerende microscoop om de cellen op de binnenoppervlakken te visualiseren.
  12. Volg stap 3.5 en 3.6 om de afbeeldingen te verkrijgen met behulp van microbeheersoftware. Gebruik een fluoresceïne-isothiocyanaatfilter (FITC) om de CFSE-gelabelde cellen in fluorescentiemodus te visualiseren. Analyseer de beelden die door de fluorescerende microscoop zijn gemaakt en bereken celdichtheden op de bovenste en onderste secties met behulp van de ImageJ-software. Volg de onderstaande stappen om het aantal cellen en de celdichtheid te berekenen.
    1. Open een afbeelding in de ImageJ-software en converteer de afbeelding naar een binaire afbeelding (16-bits) met afbeelding > Type > 16-bits. Stel de afbeeldingsschaal in met de schaalbalk met behulp van Analyseren > Schaal instellen.
    2. Pas de drempel van de afbeelding aan om de structuren van de te tellen cellen te markeren. Gebruik Afbeelding > > drempel aanpassen. Gebruik Analyseren > Deeltjes analyseren om het aantal cellen te tellen. Bereken de dichtheid van de cellen door het aantal cellen te delen door het oppervlak van de afbeelding.
  13. Om de levensvatbaarheid na celzaaien te beoordelen, gebruikt u een cel levensvatbaarheidskit. Incubeer voor deze studie het luchtpijpweefsel en de cellen in de bioreactor bij 37 °C gedurende 6 uur en kleur de cellen met 4 mM calceïne-AM en 2 mM ethidium homodimeer-1 in 1 ml van 1x PBS bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
  14. Visualiseer na het spoelen met 1x PBS de cellen met behulp van een fluorescerende microscoop. Tel de levende en dode cellen met behulp van de stappen die worden beschreven in stap 5.12. Bereken de levensvatbaarheid van cellen als het percentage levende cellen (gekleurd met calceïne-AM) per totaal aantal cellen (zowel levende als dode cellen).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De op de GRIN-lens gebaseerde in-situ beeldvormingsmodaliteit kan visualisatie van het tracheale binnenlumen in situ mogelijk maken (figuur 5A). Met behulp van deze beeldvormingsmethode kunnen zowel heldere veld- als fluorescerende beelden van de inheemse en gede-epithelialiseerde trachea's worden verkregen (figuur 5B, C). Er werd geen fluorescerend signaal waargenomen van de inheemse luchtpijp voorafgaand aan CFSE-etikettering...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit werk creëerden we een beeldvormingsgeleide bioreactor die (i) monitoring van het luchtpijplumen in situ mogelijk maakt na de celverwijdering en exogene celafgifte en (ii) langdurige in vitro kweek van het celgezaaide luchtpijpweefsel. Met behulp van deze op maat gemaakte bioreactor demonstreerden we (i) selectieve verwijdering van de endogene epitheelcellen uit het luchtpijplumen met behulp van detergent en trillingsondersteunde luchtwegwas en (ii) uniforme verdeling van exogene cellen op het lum...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige financiële belangen te hebben.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek is gedeeltelijk ondersteund door het American Thoracic Society Foundation Research Program, de New Jersey Health Foundation en de National Science Foundation (CAREER Award 2143620) aan J.K.; en de National Institutes of Health (P41 EB027062) aan G.V.N.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1× PBSGibco, Thermo Fisher Scientific10-010-031
3-port connectorWorld Precision Instruments14048-20
4-port connectorWorld Precision Instruments14047-10
AccelerometerSTMicroelectronicsIIS3DWBTR
Achromatic doubletThorlabsAC254-150-A-ML
Aluminum pin stubTED PELLA16111
Antibiotic-antimycoticThermo Fisher Scientific15240062
Assembly rodThorlabsER1
Button head screwsMcMaster-Carr91255A274
Cage cubeThorlabsC4W
Carbon double-sided conductive tapeTED PELLA16073
CFSE labelling kitAbcamab113853
Citrisolv (clearing agent)Decon1061
C-mount adapterThorlabsSM1A9
Collagen IAdvanced BioMatrix5153
Conductive liquid silver paintTED PELLA16034
Dichroic mirrorSemrockDI03-R488Reflected laser wavelengths:  473.0 +- 2 nm 488.0 +3/-2 nm
Dulbecco's modified Eagle’s mediumGibco, Thermo Fisher Scientific11965118
Female luer bulkhead to hose barb adapterCole-ParmerEW-45501-30
Female luer to tubing barbCole-ParmerEW-45508-03
Female to male luer connectorCole-ParmerZY-45508-80
Fetal bovine serumGibco, Thermo Fisher Scientific10082147
Filter lensChroma Technology CorpET535/50m
Fluorescent microscopeNikonEclipse E1000 - D
Fusion 360Autodesk
Hex nutMcMaster-Carr91813A160
Hexamethyldisilazane (HMDS)Fisher ScientifcAC120585000
Imaging fiberSELFOC, NSG groupGRIN lens
LaserOpto EngineMDL-D-488-150mW
Lens tubesThorlabsSM1L40
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit (Invitrogen)Thermo Fisher ScientificL3224
MACH 3 CNC Control SoftwareNewfangled Solutions
Objective lensOlympusUCPLFLN20X
Peristaltic PumpCole ParmerL/S standard digital pump system
Recombinant human FGF-basicPeproTech100-18B
Retaining ringThorlabsSM1RR
Scientific CMOS cameraPCO PandaPCO Panda 4.2
Sodium dodecyl sulfateVWR97064-472
Solidworks (2019)Dassault Systèmes
Stackable lens tubeThorlabsSM1L10
Subwoofer plate amplifierDayton AudioSPA250DSP
Subwoofer speakerDayton AudioRSS21OHO-4Diafragma diameter: 21 cm
Syringe PumpWorld Precision InstrumentsAL-4000
Threaded cage plateThorlabsCP33
Threaded luer adapterCole-ParmerEW-45513-81
Tube lensThorlabsAC254-150-A-ML
Tygon TubingCole-Parmer13-200-110
XY TranslatorThorlabsCXY1

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Rackley, C. R., Stripp, B. R. Building and maintaining the epithelium of the lung. The Journal of Clinical Investigation. 122 (8), 2724-2730 (2012).
  2. Rayner, R. E., Makena, P., Prasad, G. L., Cormet-Boyaka, E. Optimization of Normal Human Bronchial Epithelial (NHBE) cell 3D cultures for in vitro lung model studies. Scientific Reports. 9 (1), 500(2019).
  3. Gohy, S., Hupin, C., Ladjemi, M. Z., Hox, V., Pilette, C. Key role of the epithelium in chronic upper airways diseases. Clinical and Experimental Allergy. 50 (2), 135-146 (2020).
  4. Ganesan, S., Comstock, A. T., Sajjan, U. S. Barrier function of airway tract epithelium. Tissue Barriers. 1 (4), 24997(2013).
  5. De Rose, V., Molloy, K., Gohy, S., Pilette, C., Greene, C. M. Airway epithelium dysfunction in cystic fibrosis and COPD. Mediators of Inflammation. 2018, 1309746(2018).
  6. Horani, A., Ferkol, T. W. Advances in the genetics of primary ciliary dyskinesia: Clinical implications. Chest. 154 (3), 645-652 (2018).
  7. Berical, A., Lee, R. E., Randell, S. H., Hawkins, F. Challenges facing airway epithelial cell-based therapy for cystic fibrosis. Frontiers in Pharmacology. 10, 74(2019).
  8. Shrestha, J., et al. Lung-on-a-chip: the future of respiratory disease models and pharmacological studies. Critical Reviews in Biotechnology. 40 (2), 213-230 (2020).
  9. Benam, K. H., et al. Small airway-on-a-chip enables analysis of human lung inflammation and drug responses in vitro. Nature Methods. 13 (2), 151-157 (2016).
  10. Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. , (2021).
  11. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (3), 211-224 (2006).
  12. Gilpin, S. E., Wagner, D. E. Acellular human lung scaffolds to model lung disease and tissue regeneration. European Respiratory Review. 27 (148), 180021(2018).
  13. Badylak, S. F., Taylor, D., Uygun, K. Whole-organ tissue engineering: decellularization and recellularization of three-dimensional matrix scaffolds. Annual Review of Biomedical Engineering. 13, 27-53 (2011).
  14. Gilpin, S. E., Charest, J. M., Ren, X., Ott, H. C. Bioengineering lungs for transplantation. Thoracic Surgery Clinics. 26 (2), 163-171 (2016).
  15. Calle, E. A., Leiby, K. L., Raredon, M. B., Niklason, L. E. Lung regeneration: steps toward clinical implementation and use. Current Opinion in Anaesthesiology. 30 (1), 23-29 (2017).
  16. Planchard, D. Engineering Design with SOLIDWORKS 2022: A Step-by-Step Project Based Approach Utilizing 3D Solid Modeling. , SDC Publications. (2022).
  17. Coward, C. A Beginner's Guide to 3D Modeling: A Guide to Autodesk Fusion 360. , No Starch Press. (2019).
  18. Meza, G., Carpio, C. D., Vinces, N., Klusmann, M. 2018 IEEE XXV International Conference on Electronics, Electrical Engineering and Computing (INTERCON. , 1-4 (2018).
  19. Crapo, P. M., Gilbert, T. W., Badylak, S. F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials. 32 (12), 3233-3243 (2011).
  20. Tchoukalova, Y. D., Hintze, J. M., Hayden, R. E., Lott, D. G. Tracheal decellularization using a combination of chemical, physical and bioreactor methods. The International Journal of Artificial Organs. 41 (2), 100-107 (2017).
  21. Partington, L., et al. Biochemical changes caused by decellularization may compromise mechanical integrity of tracheal scaffolds. Acta Biomaterialia. 9 (2), 5251-5261 (2013).
  22. Balestrini, J. L., et al. Production of decellularized porcine lung scaffolds for use in tissue engineering. Integrative Biology. 7 (12), 1598-1610 (2015).
  23. Taylor, D. A., Sampaio, L. C., Ferdous, Z., Gobin, A. S., Taite, L. J. Decellularized matrices in regenerative medicine. Acta Biomaterialia. 74, 74-89 (2018).
  24. Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (1), 84-91 (2014).
  25. Huang, S. X. L., et al. The in vitro generation of lung and airway progenitor cells from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 10 (3), 413-425 (2015).
  26. Kim, J., O'Neill, J. D., Dorrello, N. V., Bacchetta, M., Vunjak-Novakovic, G. Targeted delivery of liquid microvolumes into the lung. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (37), 11530-11535 (2015).
  27. Kim, J., O'Neill, J. D., Vunjak-Novakovic, G. Rapid retraction of microvolume aqueous plugs traveling in a wettable capillary. Applied Physics Letters. 107 (14), 144101(2015).
  28. O'Neill, J. D., et al. Decellularization of human and porcine lung tissues for pulmonary tissue engineering. The Annals of Thoracic Surgery. 96 (3), 1046-1056 (2013).
  29. Sengyoku, H., et al. Sodium hydroxide based non-detergent decellularizing solution for rat lung. Organogenesis. 14 (2), 94-106 (2018).
  30. Walters, M. S., et al. Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity. Respiratory Research. 14 (1), 135(2013).
  31. O'Neill, J. D., et al. Cross-circulation for extracorporeal support and recovery of the lung. Nature Biomedical Engineering. 1 (3), 0037(2017).
  32. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985(2019).
  33. Chen, J., et al. Non-destructive vacuum-assisted measurement of lung elastic modulus. Acta Biomaterialia. 131, 370-380 (2021).
  34. Dorrello, N. V., et al. Functional vascularized lung grafts for lung bioengineering. Science Advances. 3 (8), 1700521(2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Regeneratie van luchtwegweefselin situ beeldvormingdecellularisatie van de tracheamesenchymale stamcellencel hydrogelafgiftefluorescentiemicroscopieziektemodelleringtissue engineering

Gerelateerde artikelen