Dit protocol laat zien hoe een massaspectrometrische "vingerafdruk" van leukocyten cardiolipine kan worden verkregen voor de diagnose van het Barth-syndroom. De beoordeling van de verhoogde monolysocardiolipine tot cardiolipine ratio onderscheidt patiënten met barthsyndroom van controle hartfalen patiënten met 100% sensitiviteit en specificiteit.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Fingerprinting Cardiolipine in leukocyten door massaspectrometrie voor een snelle diagnose van het Barth-syndroom
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cardiolipine (CL), een dimerisch fosfolipide met vier vetzuurketens in zijn structuur, is de lipidemarker van mitochondriën, waarbij het een cruciale rol speelt in de werking van het binnenmembraan. De metaboliet monolysocardiolipin (MLCL) is fysiologisch bijna afwezig in het lipide-extract van dierlijke cellen en het uiterlijk ervan is het kenmerk van het Barth-syndroom (BTHS), een zeldzame en vaak verkeerd gediagnosticeerde genetische ziekte die ernstige cardiomyopathie in de kindertijd veroorzaakt. De hier beschreven methode genereert een "cardiolipine-vingerafdruk" en maakt een eenvoudige test van de relatieve niveaus van CL- en MLCL-soorten in cellulaire lipideprofielen mogelijk. In het geval van leukocyten is slechts 1 ml bloed nodig om de MLCL / CL-verhouding te meten via matrixondersteunde laserdesorptie-ionisatie - time-of-flight / massaspectrometrie (MALDI-TOF / MS) net binnen 2 uur na bloedonttrekking. De test is eenvoudig en kan gemakkelijk worden geïntegreerd in het routinewerk van een klinisch biochemisch laboratorium om te screenen op BTHS. De test toont 100% sensitiviteit en specificiteit voor BTHS, waardoor het een geschikte diagnostische test is.
Inleiding
Barth-syndroom (BTHS) is een zeldzame X-gebonden ziekte die wordt gekenmerkt door cardiomyopathie met vroege aanvang, myopathie van de skeletspieren, groeivertraging, neutropenie, variabele mitochondriale respiratoire ketendisfunctie en abnormale mitochondriale structuur 1,2,3,4,5. BTHS heeft een prevalentie van één geval per miljoen mannen met momenteel minder dan 250 bekende gevallen wereldwijd, hoewel het algemeen wordt aanvaard dat de ziekte ondergediagnosticeerd is 2,6
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Bloedmonsters van gezonde donoren en patiënten met hartfalen werden verzameld in het Policlinic Hospital van Bari (Italië), terwijl monsters van BTHS-patiënten werden verkregen door de National Health Service UK BTHS-kliniek in bristol Royal Hospital for Children (VK). Schriftelijke geïnformeerde toestemming van gezonde donoren, patiënten en ouders (indien van toepassing) en goedkeuringen door de respectieve ethische commissies werden verkregen.
OPMERKING: Indien niet onmiddellijk gebruikt, kan bloed (in K-EDTA gelbuis) worden bewaard bij 4 °C gedurende maximaal 24-48 uur.
1. Isolatie van leukocyten door de....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
In deze studie is een eenvoudige en snelle methode beschreven voor het isoleren van leukocyten uit 1 ml volbloed en het verkrijgen van CL-vingerafdrukken door MALDI-TOF/MS (zie figuur 2). Figuur 3 toont de vergelijking van representatieve CL-vingerafdrukken van leukocyten, verkregen van controlepersonen en BTHS-jonge jongens, in het CL- en MLCL-massabereik (m/z). Tabel 1 geeft een overzicht van CL- en MLCL-soorten die in deze massaspect.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Barth-syndroom is een aangeboren fout van het metabolisme en een levensveranderende aandoening die waarschijnlijk ondergediagnosticeerd is 2,6. Zoals eerder vermeld, kan een bijdragende factor het ontbreken van een eenvoudige diagnostische test zijn. Hier werd een eenvoudige en snelle methode beschreven om de MLCL/CL-verhouding door MALDI-TOF/MS in leukocyten te meten voor BTHS-screening. Bovendien zijn MALDI-TOF massaspectrometers wijd verspreid over klinis.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Alle auteurs verklaren dat de studie werd uitgevoerd in afwezigheid van een commerciële of financiële relatie die zou kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.
Dankbetuigingen
We zijn de mensen met BTHS en hun families dankbaar voor hun deelname aan ons onderzoek. We bedanken de Barth Syndrome Foundation US en de Barth Syndrome UK Trust voor hun steun en voor hun hulp bij het verzamelen van de bloedmonsters tijdens de jaarlijkse bijeenkomst in Bristol. Deze studie werd gefinancierd door Barth Syndrome Foundation US, Barth Italia Onlus en Apulia Region.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 750332 | Lipid standaard voor MALDI-TOF kalibratie |
| 1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin | Avanti Polar Lipids | 710335 | Lipid standaard voor MALDI-TOF kalibratie |
| 1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 878130 | Lipid standaard voor MALDI-TOF kalibratie |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-fosfaat | Avanti Polar Lipids | 830845 | Lipid standaard voor MALDI-TOF kalibratie |
| 1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-fosfo-(1′-rac-glycerol) | Avanti Polar Lipids | 840445 | Lipid standaard voor MALDI-TOF kalibratie |
| 1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serine | Avanti Polar Lipids | 840033 | Lipid standaard voor MALDI-TOF kalibratie |
| 2-Propanol, ACS reagens, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 190764 | |
| 9-Aminoacridine hemihydraat, 98% | Acros Organics | 134410010 | |
| Acetonitrile, ACS reagens, ≥99.5% | Merck Life Science S.r.l. | 360457 | |
| Chloroform, ACS reagens, ≥99.8% | Merck Life Science S.r.l. | 319988 | |
| Dextran van Leuconostoc spp. Mr 450.000-650.000 | Merck Life Science S.r.l. | 31392 | |
| Flex Analysis 3.3 | Bruker Daltonics | Software | |
| MALDI-TOF massaspectrometer Microflex LRF | Bruker Daltonics | ||
| Microsoft Excel | Microsoft Office | Software | |
| OmniPur 10X PBS Vloeibaar Concentraat | Merck Life Science S.r.l. | 6505-OP | |
| Kaliumchloride, ACS reagens, 99,0-100,5% | Merck Life Science S.r.l. | P3911 | |
| Natriumchloride, ACS reagens, ≥99,0% | Merck Life Science S.r.l. | S9888 |
Referenties
- Barth, P. G., et al. X-linked cardioskeletal myopathy and neutropenia (Barth syndrome): respiratory-chain abnormalities in cultured fibroblasts. Journal of Inherited Metabolic Disease. 19 (2), 157-160 (1996).
- Steward, C. G., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
