Methodenartikel

Een high-throughput comet assay-benadering voor het beoordelen van cellulaire DNA-schade

DOI:

10.3791/63559

⸱

10 mei 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Oxidative Stress Group, Dept. Cell Biology, Microbiology and Molecular Biology, College of Arts and Sciences, University of South Florida, 2Cepheid (Danaher Corp.), US Technical Operations, 3Department of Clinical Laboratory Sciences, College of Applied Medical Sciences, King Saud University, 4Department of Chemistry and Biochemistry, Institute of Environment, Florida International University, 5Leicester School of Allied Health Sciences, Faculty of Health and Life Sciences, De Montfort University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De komeettest is een populair middel om DNA-schade op te sporen. Deze studie beschrijft een benadering van het uitvoeren van dia's in representatieve varianten van de komeettest. Deze aanpak verhoogde het aantal monsters aanzienlijk, terwijl de looptijd van de test, het aantal diamanipulaties en het risico op schade aan gels afnam.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen worden voortdurend blootgesteld aan stoffen die afkomstig zijn uit de interne en externe omgevingen, die het DNA kunnen beschadigen. Deze schade kan een afwijkende celfunctie veroorzaken en daarom kan DNA-schade een cruciale rol spelen bij de ontwikkeling van, denkbaar, alle belangrijke menselijke ziekten, bijvoorbeeld kanker, neurodegeneratieve en hart- en vaatziekten en veroudering. Eencellige gel-elektroforese (d.w.z. de komeettest) is een van de meest voorkomende en gevoelige methoden om de vorming en reparatie van een breed scala aan soorten DNA-schade te bestuderen (bijv. Enkel- en dubbelstrengsbreuken, alkali-labiele sites, DNA-DNA-crosslinks en, in combinatie met bepaalde reparatie-enzymen, geoxideerde purines en pyrimidines), zowel in vitro als in vivo Systemen. De lage monsterdoorvoer van de conventionele test en de moeizame monsteropstelling zijn echter beperkende factoren voor de breedst mogelijke toepassing ervan. Nu het "scoren" van kometen steeds meer geautomatiseerd wordt, is de beperking nu de mogelijkheid om aanzienlijke aantallen komeetglijbanen te verwerken. Hier is een high-throughput (HTP) variant van de komeettest (HTP-komeettest) ontwikkeld, die het aantal geanalyseerde monsters aanzienlijk verhoogt, de looptijd van de test vermindert, het aantal individuele diamanipulaties, reagensvereisten en het risico op fysieke schade aan de gels vermindert. Bovendien is de voetafdruk van de elektroforesetank aanzienlijk verminderd door de verticale oriëntatie van de glijbanen en integrale koeling. Hier wordt ook een nieuwe benadering van het koelen van komeettestdia's gemeld, die gemakkelijk en efficiënt de stolling van de komeetgels vergemakkelijkt. Hier is de toepassing van deze apparaten op representatieve komeettestmethoden beschreven. Deze eenvoudige innovaties ondersteunen het gebruik van de komeettest en de toepassing ervan op studiegebieden zoals blootstellingsbiologie, ecotoxicologie, biomonitoring, toxiciteitsscreening / -testen, samen met het begrijpen van pathogenese.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cellen worden voortdurend blootgesteld aan stoffen die voortkomen uit de interne en externe omgevingen, die DNA kunnen beschadigen 1,2. Deze schade kan afwijkende celfunctie veroorzaken3, en daarom kan DNA-schade een cruciale rol spelen bij de ontwikkeling van veel belangrijke menselijke ziekten, bijvoorbeeld kanker, neurodegeneratieve en hart- en vaatziekten en veroudering4. De komeettest (ook wel single-cell gel elektroforese genoemd) is een steeds populairdere methode voor het detecteren en kwantificeren van cellulaire DNA-schade.

Op zijn eenvoudigst detecteert de alkalische komeettest (ACA) strengbreuken (SB; zowel enkel- als dubbel), samen met apurinische / apyrimidinische sites en alkali-labiele sites (ALS) die beide enkelstrengsbreuken worden onder alkalische omstandigheden5. De neutrale pH-komeettest kan frank enkel- en dubbelstrengsbreuken evalueren6. Bovendien kan de ACA, in combinatie met een aantal DNA-reparatie-enzymen, een aanzienlijk aantal soorten DNA-schade detecteren, bijvoorbeeld geoxideerde purines (geïdentificeerd door het gebruik van humaan 8-oxoguanine DNA-glycosylase 1; hOGG17); geoxideerde pyrimidines (met endonuclease III; EndoIII) en cyclobutaan pyrimidinedimeer (met behulp van T4 endonuclease V; T4endoV)8. De komeettest kan ook worden gebruikt om DNA-laesies te evalueren die worden geïnduceerd door crosslinking-middelen, zoals cisplatine 9,10,11. Zoals aangegeven door de formele naam van de test, d.w.z. eencellige gel-elektroforese, vertrouwt de test erop dat de cellen die worden geanalyseerd een eencellige suspensie zijn; meestal zijn dit gekweekte cellen, maar kunnen worden geïsoleerd uit volbloed12,13, of volbloed zelf kan worden gebruikt14,15. Als alternatief kan een eencellige suspensie worden gegenereerd uit vaste weefsels.

Afgezien van een paar uitzonderingen, met name de CometChip-rapporten van het Engleward-lab16, is het algehele komeettestprotocol niet dramatisch veranderd ten opzichte van het protocol dat oorspronkelijk werd beschreven door de uitvinders van de test (Östling en Johansson17 en Singh et al.18). De komeettest omvat tal van stappen (figuur 1). Veel van deze stappen omvatten de overdracht van de dunne, celbevattende agarose-gels, één dia tegelijk, en vormen daarom een risico op beschadiging of verlies van de gel, waardoor het succes van het experiment in gevaar komt. Bijgevolg kan de komeettest tijdrovend zijn, vooral als er een aanzienlijk aantal dia's wordt uitgevoerd. Doorgaans worden maximaal 40 dia's uitgevoerd in een grote (33 cm x 59 cm x 9 cm) elektroforesetank, die zich in een nog grotere bak met nat ijs bevindt voor koeling. Onlangs is gemeld dat de testduur kan worden verkort tot 1 dag door de duur van de lysisstap te verkorten en de dia's niet te drogen voordat de kleuring19 wordt gekleurd.

De huidige auteurs hebben eerder een nieuwe benadering van de high throughput alkaline comet assay (HTP ACA) gemeld, waarbij meerdere (batches van 25) komeettestmicroscoopglaasjes gelijktijdig kunnen worden gemanipuleerd tijdens het komeettestproces 20,21,22. Deze gepatenteerde aanpak minimaliseert het risico op schade aan of verlies van de monsterhoudende gels door de noodzaak om de microscoopglaasjes individueel te manipuleren te verwijderen en kan worden toegepast op alle varianten van de komeettest, die microscoopglaasjes gebruiken. De rek met dia's beschermt de gels tijdens de manipulaties en bijgevolg is de monsterverwerking sneller en efficiënter. De dia's kunnen ook elektroforese ondergaan in de rekken, gehouden in de verticale in plaats van horizontale oriëntatie. Dit, en integrale koeling, vermindert de voetafdruk van de elektroforesetank aanzienlijk en elimineert de behoefte aan nat ijs. Alles bij elkaar betekent dit een aanzienlijke verbetering ten opzichte van de conventionele procedure. De gebruikte apparatuur is afgebeeld in figuur 2. De hier beschreven protocollen, met behulp van deze nieuwe benadering, demonstreren de representatieve toepassing op gekweekte cellen en volbloed14 voor detectie van alkali-labiele sites (ALS), DNA-interstrengcrosslinks (ICL) en de substraten van verschillende DNA-reparatie-enzymen.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie werden in de handel verkrijgbare bloedmonsters gebruikt. In onze instelling is goedkeuring van de Institutional Review Board niet nodig voor het gebruik van commercieel verkrijgbaar bloed.

1. Voorbereiding van materialen voor de komeettest

  1. Voorbereiding van de microscoopglaasjes
    1. Giet 1% (g/v) normaal smeltpunt agarose [opgelost in dubbel gedestilleerd water (ddH2O)] in een buis van 50 ml en magnetron om de agarose op te lossen in de ddH2O. Bewaren bij 37 °C om stolling te voorkomen voorafgaand aan het coaten van glijden. Mocht er stolling optreden, gooi dan weg en bereid vers.
    2. Pre-coat microscoopglaasjes door de dia's in de buis van 50 ml te dopen die 1% (w / v) normaal smeltpunt agarose bevat.
    3. Veeg de achterkant van de dia's snel schoon nadat u de dia's hebt ondergedompeld.
      OPMERKING: Als u de achterkant van de dia's niet goed afveegt, neemt het achtergrondgeluid van de dia's tijdens de analysestap per microscoop toe.
    4. Label de gecoate dia met een permanente markering in de rechterbenedenhoek van het matgedeelte (figuur 3A). Dit laat zien welke kant van de dia voorgecoat is.
    5. Laat de agarose een nacht op kamertemperatuur uitharden en drogen.
    6. Wikkel de gedroogde dia's in tissuepapier en bewaar ze in een doos.

2. Bereiding van monsters

  1. Gekweekte cellen
    OPMERKING: Behandel eerst cellen met het schadelijke middel of de schadelijke stoffen voordat de komeettest wordt gestart. Voer vervolgens het volgende uit.
    1. Als de cellen aanhangend zijn, trypsinize de cellen om ze vrij te maken uit de celkweekkolf of celkweek petrischalen, met de juiste samenvloeiing van cellen. Neutraliseer trypsine door serumbevattende media toe te voegen.
    2. Breng de cellen over naar een buis van 50 ml, centrifugeer (bijv. voor HaCaTs, centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur), verwijder voorzichtig het supernatant en voeg 1 ml PBS toe aan de celpellet.
    3. Voer celtelling uit.
    4. Breng 30.000 cellen over naar een microcentrifugebuis van 1,5 ml en centrifugeer bij 7.607 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    5. Verwijder het supernatant voorzichtig en bewaar de celpellet op ijs in het donker voordat u de komeettest uitvoert.
      OPMERKING: Cellen moeten regelmatig worden getest op Mycoplasma-besmetting voorafgaand aan het uitvoeren van de komeettest om, naast andere effecten, de vorming van artefactuele DNA-schade en veranderde DNA-schaderespons te voorkomen, zoals elders gemeld23. Centrifugatieomstandigheden kunnen indien nodig worden gewijzigd, afhankelijk van het gebruikte celtype.
  2. Voorbereiding van gekweekte cellen voor reparatietest
    1. Kweekcellen in de celkweekkolf of petrischaaltjes.
    2. Was de cellen tweemaal met 1 ml PBS voordat u de cellen behandelt met schadelijke stoffen (bijv. voor BE-M17-cellen, behandel met 50 μM H2O2 gedurende 20 minuten) op ijs om te voorkomen dat de reparatie tijdens de behandeling optreedt.
    3. Was de cellen twee keer voorzichtig met 1 ml PBS om eventuele resterende schadelijke stoffen te verwijderen.
    4. Breng het celkweekmedium opnieuw in en laat de cellen gedurende verschillende duur herstellen (bijv. 0 min, 30 min, 2 h, 6 h, 24 h en 30 h) in een bevochtigde incubator (37 °C, 5% CO2).
    5. Verzamel op elk tijdstip 30.000 cellen in 10% dimethylsulfoxide (DMSO)-bevattend celkweekmedium en bewaar ze bij -80 °C.
    6. Voordat u de komeettest uitvoert, ontdooit u de cellen snel bij 37 °C in een waterbad en centrifugeert u ze bij 7.607 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    7. Verwijder het supernatant en bewaar de celkorrel op ijs voordat u de test uitvoert (d.w.z. vanaf stap 3).
  3. Bereiding van volbloed
    OPMERKING: De volgende methode heeft baat bij (i) een minimaal invasieve aanpak om een bloedmonster te verkrijgen, (ii) het niet vereisen van de isolatie van PBMC vóór de komeettest, en (iii) het toestaan van de bloedmonsters (met een volume < 250 μL) om te worden bewaard bij -80 °C, gedurende maximaal 1 maand (hoewel recenter bewijs suggereert dat langere opslag mogelijk is), zonder de noodzaak van cryopreservativa, en zonder risico of artefactuele schadevorming14. Ethische goedkeuring, of gelijkwaardig, kan nodig zijn voordat bloedmonsters van patiënten of dieren worden verkregen. Als alternatief kunnen commercieel verkrijgbare bloedmonsters worden gebruikt zoals in deze studie. In onze instelling is goedkeuring van de Institutional Review Board niet nodig voor het gebruik van commercieel verkrijgbaar bloed.
    1. Breng met behulp van een pipet volbloedmonsters (<250 μL) (Tabel met materialen) over in een verzamelbuis met een minimaal volume met 0,4 mg EDTA (per 250 μL bloed).
    2. Vries de bloedmonsters in bij -80 °C voordat u de HTP-komeettest uitvoert.
    3. Ontdooi opgeslagen bloedmonsters (<250 μL) bij kamertemperatuur, zonder verwarming.
    4. Breng 5 μL van het volbloed over naar microcentrifugebuizen voordat de komeettest wordt uitgevoerd (zie stap 3).

3. Cellyse

OPMERKING: Voer alle procedures op ijs uit.

  1. Gebruik 12.000 cellen of 2,5 μL volbloed per gel.
  2. Bereid 0,6% (w/v) laag smeltpunt agarose opgelost in PBS met behulp van een magnetron en plaats in een waterbad bij 37 °C om te voorkomen dat het stolt.
  3. Label het matte uiteinde van de voorgecoate dia's met de naam, datum en behandelingsinformatie van de onderzoeker met behulp van een permanente marker of potlood.
  4. Plaats een koelplaat op een vlakke bank en plaats de twee bevroren koelpakketten in de schuiflade onder het metalen oppervlak (zoals weergegeven in figuur 4)21.
  5. Plaats de glaasjes op de koelplaat en laat de dia's 1-2 minuten voorkoelen voordat u de 0,6% (w/v) laagsmeltpunt agarose-bevattende cellen toevoegt (stap 3.7).
    OPMERKING: Als u de dia's langer dan 1-2 minuten op de koelplaat laat liggen, kan condensatie op het schuifoppervlak ontstaan als gevolg van omgevingsvochtigheid. Dit kan ervoor zorgen dat de lage smeltpunt agarose gels minder stabiel zijn op de dia's.
  6. Dispergeer de pellet (stap 2.2.7) door vortexing. Zorg ervoor dat al het supernatant uit de pellet is verwijderd. Plaats de monsterbuizen (met daarin de gepelletiseerde cellen) direct terug op ijs.
    OPMERKING: Wanneer u de monsterhoudende buizen in de centrifuge plaatst, plaatst u deze met het scharnier naar buiten gericht, zodat de pellet aan deze kant van de buis wordt verzameld. Soms is het moeilijk om de pellet te zien en is het gemakkelijk om het los te maken tijdens het verwijderen van het supernatant. Door in deze richting met het buisdeksel te centrifugeren, kan men weten waar de celpellet zich zal bevinden.
  7. Resuspendeer de celpellet met 200 μL van 0,6% lage smeltpunt agarose (LMP agarose) en meng door op en neer te pipetteren zonder bellen te creëren. Breng vervolgens snel 80 μL LMP agarose-bevattende cellen over op een gekoelde dia en plaats snel een coverslip op de gel.
  8. Laat de gel 1-2 min op de koelplaat zetten.
  9. Bereid ondertussen een 500 ml werkoplossing van lysisbuffer (tabel 1) en giet deze in de lysisschaal (figuur 2).
  10. Zodra de gels zijn ingesteld, verwijdert u de coverslips snel door de schuif tussen duim en wijsvinger voorzichtig vast te houden en de coverslip van de gel te schuiven.
  11. Plaats de dia's met monsters in de diadrager (alle zwarte "puntmarkeringen" op dia's moeten in dezelfde richting zijn gericht wanneer ze in een drager worden geplaatst) (figuur 3B) en plaats vervolgens de schuifdrager in de lysisschaal (figuur 2).
  12. Sluit de deksel van de lysisschaal en bewaar de lysisschaal een nacht in de koelkast bij 4 °C of 30 minuten bij kamertemperatuur, afhankelijk van wat het beste past bij het tijdschema van de operator19.

4. Elektroforese

  1. Verwijder voorzichtig de schuifdrager uit de lysisschaal. Zorg ervoor dat u de gels niet verstoort.
  2. Plaats de schuifdrager voorzichtig in een voorgeladen afwasbak met ijskoude ddH2O en laat deze 30 minuten staan zodat de dia's volledig bedekt zijn met ddH2O.
  3. Plaats een bevroren koelpakket in de schuiflade onder de elektroforesetank om de optimale buffertemperatuur te handhaven.
  4. Voeg voorzichtig ijskoude elektroforese-werkoplossing (tabel 1) toe aan de elektroforesetank en breng de schuifdrager over in de elektroforesetank. Oriënteer de dia's zodanig dat hun heldere delen met de celbevattende gels (d.w.z. NIET de matte / etiketteringseinden) naar de kathode (rode elektrode) wijzen.
  5. Laat de dia's 20 minuten in de elektroforesetank zitten, zodat het DNA ontspant en tot rust komt. Houd de voeding tijdens deze stap uitgeschakeld.
  6. Plaats indien nodig een nieuwe bevroren koelverpakking om het koelen te maximaliseren.
  7. Voer elektroforese uit gedurende 20 minuten bij 1,19 V/cm, of welke omstandigheden dan ook zijn geoptimaliseerd.
    OPMERKING: Optimalisatie van de werkingsomstandigheden van de elektroforese en het volume van de buffer wordt aanbevolen voor elk laboratorium24. Het gebruik van slechts een enkele diadrager tijdens elektroforese veroorzaakt geen effect van dia's op de weerstand van de elektroforesebuffer en de auteurs zagen geen significant effect in de spanning of stroom toen het aantal dia's veranderde.
  8. Schakel de voeding uit, verwijder voorzichtig de schuifdrager uit de elektroforesetank en laat deze gedurende 30 s op tissuepapier uitlekken.
  9. Plaats de schuifdrager in de schaal met neutralisatiebuffer (tabel 1). Laat het 20 min staan.
  10. Haal de schuifdrager uit de neutralisatieschaal, plaats deze in de wasbak met ijskoude ddH2O en laat deze 20 min staan.
  11. Haal de schuifdrager uit het water en laat de glaasjes drogen in een incubator bij 37 °C gedurende 1 uur, of bij kamertemperatuur 's nachts, of niet drogen, afhankelijk van schema19 van de operator.
    OPMERKING: Als er geen droging is in stap 4.11, voert u de kleuringsstap uit vanaf 5.2.

5. Propidiumjodide (PI) kleuring

  1. Breng de schuifdrager over naar een wasbak met ijskoude ddH2O om de dia's te hydrateren en laat 30 minuten staan.
  2. Plaats de schuifdrager in een kleuringsschaal met 2,5 μg/ml propidiumjodide-oplossing.
    OPMERKING: Propidiumjodide is lichtgevoelig, dus behandel het in een donkerder gebied. Het is ook giftig.
  3. Sluit het deksel van de kleurschaal en incubeer deze gedurende 20 minuten in het donker bij kamertemperatuur.
  4. Breng de schuifdrager over in een aparte schaal en was deze gedurende20minuten met ijskoude ddH 2 O.
  5. Haal de schuifdrager uit de schaal en droog deze volledig in het donker, hetzij in een incubator van 37 °C of bij kamertemperatuur, afhankelijk van het schema of de voorkeur van de operator.
  6. Zodra de dia's volledig zijn gedroogd, verwijdert u ze uit de diadrager en bewaart u ze in een diavak in het donker totdat ze klaar zijn voor beeldanalyse.
    OPMERKING: De dia's blijven voor onbepaalde tijd leesbaar en kunnen indien nodig opnieuw worden gekleurd.

6. Enzym-gemodificeerde alkalische komeettest

OPMERKING: De enzymgemodificeerde alkalische komeettest maakt gebruik van een enzymbehandelingsstap na lysis, maar vóór elektroforese. De activiteit van het enzym veroorzaakt breuken in het DNA op plaatsen die substraten zijn voor het enzym. Alvorens deze test uit te voeren, moeten de enzymconcentratie en de duur van de enzymincubatie worden geoptimaliseerd.

  1. Na de cellyse (stap 3) glijden tweemaal met ijskoude ddH2O gedurende 20 minuten.
  2. Haal de schuifdrager uit het water en breng de dia's over in een lade bekleed met papieren handdoeken.
  3. Voeg 80 μL van het enzym toe bij de geoptimaliseerde concentratie (bijv. 3,2 U/ml hOGG1 voor BE-M17-cellen, verdund in enzymreactiebuffer) en bedek met een coverslip om het enzym over het gelbevattende monster te verspreiden.
  4. Incubeer de dia's bij 37 °C voor de geoptimaliseerde duur (bijv. 45 min voor hOGG1).
  5. Verwijder na de incubatie voorzichtig de coverslips en breng de dia's over naar de drager.
    OPMERKING: Was de dia's niet na enzymbehandeling; voer direct elektroforese uit stap 4.3 uit.

7. DNA-interstrengcrosslinks (ICL)-gemodificeerde alkalische komeettest

OPMERKING: Het concept van deze variant van de ICL-ACA is dat de aanwezigheid van ICL in DNA de elektroforetische migratie van beschadigd DNA zal vertragen, geïnduceerd na blootstelling aan een oxidatief gegenereerde belediging. In dit geval geldt: hoe korter de komeetstaart, hoe groter het aantal ICL 25,26,27,28.

  1. Behandel cellen met een reagens dat ICL induceert (bijv. cisplatine; zie aanvullend dossier).
  2. Stel de behandelde cellen bloot met een van de volgende middelen om voldoende strengbreuken te induceren om een komeetstaart van voldoende grootte te creëren (~ 20% staart-DNA): waterstofperoxide (50 μMH2 O 2 gedurende 30 minuten), ioniserende straling (2-5 Gy) of Ultraviolet B (UVB) (0,5 J / cm2).
  3. Produceer bovendien een positieve controle over de strengbreuk door een partij cellen te behandelen met hetzelfde middel en dezelfde dosis, zoals gebruikt in stap 7.2 (d.w.z. geen behandeling met ICL-inducerende stof).
  4. Centrifugeer de cellen op 7.607 x g gedurende 5 minuten, gooi het supernatant weg, was de celpellet driemaal met 1 ml PBS en verwerk zoals voor de alkalische komeettest (stappen 3-5).
  5. Bereken niveaus van DNA-interstrengkruiskoppeling met behulp van de onderstaande formule.
    figure-protocol-1
    OPMERKING: MOTM (Mean Olive Tail Moment) is een eindpunt van de komeettest dat veel wordt gebruikt bij het beschrijven van de ICL-gemodificeerde komeettest en wordt gedefinieerd als het product van de staartlengte en de fractie van het totale DNA in de staart (d.w.z. staartmoment = staartlengte x % van het DNA in de staart)29; TMdi: staartmoment van monsters die zijn behandeld met zowel crosslinkingmiddel als H2O2 (of een andere strengbrekerinductor); TMcu: staartmoment van monsters die niet met een verknopingsmiddel zijn behandeld en niet zijn behandeld met H2O2 (geen behandeling), en TMci: staartmoment van monsters die niet met een verknoopmiddel zijn behandeld, maar zijn behandeld met H2O2.

8. Komeetscores en data-analyse

OPMERKING: De term "komeet" is afgeleid van de beelden van beschadigde cellen wanneer ze onder een microscoop worden bekeken nadat de test is uitgevoerd (figuur 5). Onder elektroforeseomstandigheden migreert DNA in de onbeschadigde cellen grotendeels niet, maar blijft het in een sferoïde die komeet "kop" wordt genoemd. De aanwezigheid van strengbreuken zorgt er echter voor dat het DNA van de cel uit het hoofd kan migreren en een "staart" kan vormen, wat leidt tot een uiterlijk als een komeet (figuur 5). Hoe meer DNA in de staart, hoe meer schade er aanwezig is.

  1. Schakel de fluorescentiemicroscoop in met het PI (rode) filter (λ = 536/617 nm) en de software voor het scoren van komeettesten.
  2. Voeg een druppel water toe met een Pasteur pipet aan de gel en dek af met een coverslip.
  3. Plaats de dia's in de fluorescentiemicroscoop en "scoor" de kometen.
    OPMERKING: Scoren is een middel waarmee de kometen worden beoordeeld, om de hoeveelheid schade in elke komeet te bepalen. In grote lijnen kan dit worden bereikt door twee benaderingen te gebruiken, afhankelijk van de gekozen voorkeur van de gebruiker, hetzij met het oog (het meten van de grootte van de kometen op een schaal van nul tot vier) of door gebruik te maken van vrij verkrijgbare of in de handel verkrijgbare software30. Over het algemeen beoordelen beide benaderingen de grootte van de komeetstaart, hoewel een verscheidenheid aan komeetgerelateerde eindpunten kan worden bepaald. Als u de software gebruikt, klikt u op het midden van de komeetkop en wacht u totdat de software de komeet automatisch detecteert en vervolgens het gekozen eindpunt beoordeelt (figuur 5).
  4. Score 50 kometen per gel en 100 kometen per monster (d.w.z. elk monster dat overeenkomt met verschillende DNA-beschadigende behandelingen of hun replicaties).
  5. Repliceer de experimenten (n = 2) of verdrievoudig de experimenten (n = 3).
    OPMERKING: Als alleen n = 2 replicatie-experimenten worden uitgevoerd, kan statistische analyse niet worden uitgevoerd, maar als n = 3, voer dan de D'agostino-normaliteitstest uit. De meeste komeettestgegevens slagen niet voor een normaliteitstest. Gebruik in dit geval een niet-parametrische test (Kruskal-Wallis-test met Dunn's meervoudige vergelijkingstest en Mann-Whitney test significantie ingesteld op p < 0,05).

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Optimalisatie van de elektroforesespanning voor de HTP ACA
Menselijke keratinocyten (HaCaTs; Materiaaltabel) werden bestraald met verschillende doses ultraviolette A-straling (UVA) (5 of 10 J/cm2); Figuur 6A), UVB (0,5 of 1 J/cm2; Figuur 6B), of behandeld met 50 μM H2O2 (figuur 6C) om schade op te wekken. Drie verschillende spanningen van de elektroforese werden getest om de optimale spanning voor elektroforese te bepalen. De resultaten van alle drie de DNA-beschadigende behandelingen toonden aan dat, terwijl alle spanningen lineaire dosisresponsen genereerden, de meest gevoelige respons werd verkregen met 1,19 V / cm. HaCaTs vertoonden de hoogste baseline DNA-schade met 1,19 V/cm tijdens elektroforese in vergelijking met 1 V/cm en 1,09 V/cm (figuur 6A-C). Bovendien wordt bij 1,19 V/cm het grootste % staart-DNA gezien, na alle schadelijke behandelingen (figuur 6)31.

Detectie van DNA-schade in menselijk volbloed met behulp van Fpg gemodificeerde HTP ACA
Menselijk bloed (Tabel van Materialen) werd bestraald met verschillende doses van 10 J/cm2 UVA om schade op te wekken. Vier verschillende concentraties Fpg (1, 2, 4 of 8 U/ml) werden gebruikt om de optimale concentratie voor enzymbehandeling in HTP ACA te bepalen. De resultaten toonden aan dat de optimale niveaus van DNA-schade werden onthuld met 4 U / ml Fpg (figuur 7A). Representatieve komeetbeelden van door UVA bestraalde bloedmonsters (figuur 7B).

Detectie van DNA ICL in een representatieve eierstokkankercellijn met behulp van de ICL-gemodificeerde HTP ACA
Een cellijn van eierstokkanker (SKOV-3; Materiaaltabel) werd behandeld met combinaties van 200 μM cisplatine en/of daaropvolgende behandeling met 50 μM H2O2 gedurende 30 minuten op ijs. Er werd geen merkbare schade waargenomen in de onbelichte cellen (figuur 8A). Blootstelling aan H2O2 alleen al genereerde een significante MOTM (figuur 8B). Daarentegen vertoonden de cellen waarin ICL werd geïnduceerd een verminderde MOTM (figuur 8C)28.

Vorming en reparatie van cisplatine-geïnduceerde DNA ICL in een representatieve, eierstokkanker cellijn
De ICL-gemodificeerde HTP ACA werd gebruikt om het tijdsverloop te bepalen voor DNA ICL-vorming en -reparatie geïnduceerd door cisplatine in een eierstokkankercellijn (A2780; Tabel met materialen). De cellen werden behandeld met 100 μM cisplatine gedurende 1 uur en vervolgens geïncubeerd in cisplatinevrije media (RPMI 1640 medium aangevuld met 10% (v/v) foetaal runderserum (FBS)) voor een volgende tijdskuur. Op verschillende tijdstippen werd de ICL-gemodificeerde HTP ACA uitgevoerd om de niveaus van ICL vast te stellen (figuur 9)28. Er werden geen ICL gedetecteerd voorafgaand aan de behandeling met cisplatine. Na een enkele behandeling met 100 μM cisplatine namen de ICL-waarden echter significant toe, met een piek van 12 uur, waarna de niveaus na 30 uur weer tot nul daalden.

Correlatie tussen DNA ICL en DNA platina niveaus
Drie eierstokkankercellen werden behandeld met 100 μM cisplatine om verschillende niveaus van DNA-ICL te induceren, voorafgaand aan analyse door de ICL-gemodificeerde HTP ACA en inductief gekoppelde massaspectrometrie (ICP-MS; zie aanvullend bestand voor details). Zoals te zien is in figuur 10, werden verschillende niveaus van DNA-ICL geïnduceerd in de drie cellijnen, samen met verschillende niveaus van Pt in DNA. Een positieve correlatie (R2 = 0,9235) werd waargenomen tussen DNA ICL-niveaus en platinaconcentraties, wat wijst op de associatie tussen DNA-platinaniveaus en de overeenkomstige ICL28.

Base excisie reparatie in Mycoplasma-geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde BE-M17 cellen
Mycoplasma geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde BE-M17 cellen werden behandeld met 50 μM H2O2 gedurende 30 minuten en geïncubeerd met volledig medium (Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium aangevuld met 10% (v/v) FBS) voor verschillende duur (0 min, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 24 h, of 30 h) gedurende welke cellen mochten herstellen. Op elk tijdstip werden cellen verzameld en ingevroren bij -80 °C, in een 10% DMSO-bevattend medium, voordat de hOGG1-gemodificeerde HTP ACA werd uitgevoerd (stap 6). Na 30 minuten waren de niveaus van SB/ALS gedaald tot 21% TD (percentage staart-DNA) in de niet-geïnfecteerde cellen, terwijl de geïnfecteerde cellen 49% TD vertoonden (figuur 11A). Na ~15 uur waren de niveaus van SB/ALS teruggekeerd naar de uitgangswaarde in zowel geïnfecteerde als niet-geïnfecteerde cellen. Voor de geoxideerde purines vertoonde de niet-geïnfecteerde BE-M17 aanvankelijk een kleine toename van de schade, alvorens binnen 30 uur terug te keren naar de uitgangswaarde (figuur 11B). Daarentegen vertoonden de geïnfecteerde cellen een aanhoudende, significante toename van geoxideerde purines, die verhoogd bleven en zelfs na 30 uur niet terugkeerden naar de uitgangswaarden (figuur 11B)23.

figure-results-1
Figuur 1: Overzicht van de conventionele alkalische komeettestprocedure. (i) Een eencellige suspensie van gekweekte cellen of een monster van volbloed wordt gemengd met 0,6% (w/v) LMP-agarose. ii) Het cel/agarosemengsel wordt aangebracht op voorgecoate microscoopglaasjes en bedekt met deklip totdat het is gestold. (iii) De cellen worden 's nachts gelyseerd met behulp van een hoge pH-lysisbuffer, waarbij nucleoïde lichamen worden gevormd, voordat (iv) wordt gewassen met ddH2O. (v) Het cellulaire DNA ontspant zich in de hoge pH-elektroforesebuffer. De aanwezigheid van strengbreuken stelt het DNA in staat om te ontspannen en tot rust te komen, en onder elektroforese wordt het DNA uit het nucleoïde lichaam getrokken en een staart gevormd. De dia's worden vervolgens (vi) uitgelekt, gedroogd, (vii) geneutraliseerd en (viii) gewassen met ddH2O voordat (ix) een nacht wordt gedroogd. Dia's worden vervolgens (x) gerehydrateerd met ddH2O, (xi) gekleurd, (xii) gewassen en ten slotte (xiii) gescoord en geanalyseerd, meestal met behulp van fluorescerende microscopie en beeldanalysesoftware. Dit cijfer is overgenomen uit een eerdere publicatie20. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: De materialen waaruit het high-throughput komeetelektroforesesysteem bestaat. HTP-elektroforesetank, HTP-rekken en de vaat voor lysis, wassen, neutraliseren en kleuren worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: Representatieve beelden van een komeettestglaasje en HTP-rek (microscoopglaasje). (A) Voor een juiste oriëntatie wordt het voorgecoate vlak van de microscoopglaasje herkend door een zwarte stip in de rechterhoek van een microscoopglaasje. (B) De afbeelding van het HTP-rek illustreert hoe de dia's in een strakke verticale oriëntatie worden gehouden, met lipjes op de drager om de oriëntatie in de elektroforesetank te bevestigen. Elke drager is geschikt voor maximaal 25 dia's. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Weergave van de koelplaat met monsterglaasjes en diepvriesverpakkingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Screenshot van representatieve kometen genomen tijdens het scoren. HaCaTs (A) zonder behandeling en (B) behandeld met 1 J/cm2 UVB voorafgaand aan het uitvoeren van HTP ACA. De meeste softwarepakketten kunnen verschillende komeeteindpunten berekenen, maar de meest voorkomende zijn het % staart-DNA (voorkeur) of staartmoment op basis van deze afbeeldingen (blauw: begin van het hoofd, groen: midden van het hoofd en paars: einde van de staart). De schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Representatieve grafieken die het effect van elektroforesespanning op het percentage staart-DNA illustreren, bepaald met behulp van de HTP ACA. Cellen werden blootgesteld aan (A) 5 of 10 J/cm2 UVA, (B) 0,5 of 1,0 J/cm2 UVB, of (C) 50 μM H2O2 voorafgaand aan de HTP ACA, met de elektroforesespanning op 1, 1,09 of 1,19 V/cm. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van 200 bepalingen van n = 2 dubbele experimenten31. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Representatieve grafiek en komeetbeelden van menselijk bloed geanalyseerd door de Fpg gemodificeerde HTP ACA. Menselijke bloedmonsters werden bestraald met 10 J/cm2 UVA of schijnbestraald ('ctrl') op ijs voorafgaand aan de lysisstap. Verschillende concentraties Fpg (1, 2, 4 of 8 U/ml) werden gebruikt voor de enzymbehandeling voorafgaand aan elektroforese. (A) De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van 300 bepalingen uit n=3 experimenten. (B) Representatieve beelden van kometen voor elke concentratie Fpg in 10 J/cm2 UVA doorstraalde bloedmonsters. De schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Representatieve komeetbeelden ter illustratie van ICL-detectie na cisplatinebehandeling. (A) Controlecellen zonder enige behandeling, (B) cellen die alleen met H2O2 (50 μM) werden behandeld, (C) cellen die werden behandeld met H2O2 (50 μM) en cisplatine (200 μM), wat illustreert dat de staart korter is dan in (B), vanwege de aanwezigheid van ICL28. De schaalbalk is 10 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Demonstratie van de kinetiek van cisplatine-geïnduceerde ICL-vorming en -reparatie. A2780-cellen werden behandeld met 100 μM cisplatine in het kweekmedium gedurende 1 uur. Het cisplatine-bevattende medium werd vervolgens verwijderd en de cellen werden gekweekt voor verschillende tijdspunten, voor analyse door ICL-gemodificeerde HTP ACA. De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± SEM van n = 3 experimenten28. P < 0,0001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 10: Correlatie tussen DNA ICL en platina concentratie. DNA ICL werd bepaald door de ICL-gemodificeerde HTP ACA en platina niveaus werden gemeten door ICP-MS (met Single Quad-Kinetic Energy Discrimination, SQ-KED), in drie eierstokkankercellijnen. R2 = 0,9235. Zie aanvullend dossier voor ICP-MS-methodologie om platinaniveaus in DNA te kwantificeren28. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-11
Figuur 11: Een representatieve grafiek die DNA-schade en -herstel illustreert, bepaald door de hOGG1-gemodificeerde komeettest, in mycoplasma geïnfecteerde versus niet-geïnfecteerde BE-M17-cellen. Na behandeling met 50 μM H2O2 gedurende 30 minuten mochten cellen herstellen voor verschillende duur (0, 30 min, 1 h, 2 h, 6 h, 24 h of 30 h). De hOGG1-gemodificeerde HTP ACA werd gebruikt om (A) SB/ALS en (B) geoxideerde purines te meten in geïnfecteerde (rode datapunten) en niet-geïnfecteerde (zwarte datapunten) BE-M17 cellen. De gegevens vertegenwoordigen het gemiddelde van 200 bepalingen van n = 2 dubbele experimenten. Deze figuur is met toestemming overgenomen uit een eerdere publicatie23. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ReagensStock oplossingWerkende oplossing
Lysis buffer100 mM Na2EDTA, 2,5 M NaCl en 10 mM Tris Base in ddH2O; stel de pH in op 10 met 10 M NaOH1% Triton X-100 in lysis stock oplossing
Elektroforesebuffer10 M NaOH en 200 mM Na2EDTA in ddH2O300 mM NaOH en 1 mM Na2EDTA; pH > 13
Neutralisatiebuffer0,4 M Tris Base in ddH2O; stel de pH in op 7,5 met HCl
Kleuringsbuffer1 mg/ml propidiumjodide2,5 μg/ml propidiumjodide in ddH2O

Tabel 1: Samenstelling van de in HTP ACA gebruikte reagentia. De voorraad- en werkconcentraties van lysis, elektroforese, neutralisatie en kleuringsbuffers worden weergegeven.

Aanvullend dossier. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie toont de veelzijdigheid van de huidige apparatuur, die kan worden gebruikt om een hoge doorvoer te bereiken met een verscheidenheid aan representatieve, veel voorkomende varianten van de komeettest (d.w.z. alkalisch, enzymgemodificeerd, bloed en ICL, en andere varianten zullen ook geschikt zijn). Bovendien brengt de huidige aanpak verschillende voordelen met zich mee20,21: (a) de looptijd van de test wordt verminderd als gevolg van manipulatie van meerdere dia's parallel (de verwerkingstijd neemt met 60%) af; b) het risico op beschadiging van de gels en dus het risico voor het experiment wordt verminderd; c) de reagensvereisten worden verlaagd (het volume van de elektroforesetank is bijvoorbeeld kleiner dan de conventionele tank); d) het aantal dia's wordt verhoogd. Eén tank kan zorgen voor een toename van 20% in het aantal glijbanen in vergelijking met een enkele conventionele tank; meerdere elektroforesetanks kunnen echter worden uitgevoerd of slaved (d.w.z. meerdere tanks die worden bestuurd door een enkele voeding), parallel aan dezelfde voeding, en vereisen nog steeds een benchtop-voetafdruk die kleiner is dan een enkele conventionele tank met ijsbak; en (e) de voetafdruk van de tank wordt verminderd als gevolg van verticale oriëntatie van dia's en integrale koeling (bespaart laboratoriumruimte); de HTP-tank bestaat uit een hoogwaardige keramische koelbasis met een schuiflade die in één bevroren koelpakket past om een optimale buffertemperatuur te behouden zonder het proces in een koelcel te hoeven uitvoeren.

Bovendien biedt de door ons ontwikkelde koelplaat plaats aan 26 komeetglijbanen, maakt het een snelle stolling van het lage smeltpunt op de komeettestglaasjes mogelijk en vergemakkelijkt het gemakkelijk ophalen van de dia's nadat de agarose-gel is gestold. De bovenstaande innovaties maken het komeettestproces eenvoudiger en gemakkelijker.

Terwijl andere high-throughput benaderingen zijn ontwikkeld (bijv. 12-gel komeettest, CometChip of 96 mini-gelformaten)25, geven veel wetenschappers de voorkeur aan het gebruik van de conventionele microscoopglaasjes (waaronder de in de handel verkrijgbare voorgecoate dia's of andere gespecialiseerde dia's). De huidige aanpak is geschikt voor alle soorten microscoopglaasjes, waardoor experimenten met deze dia's kunnen worden opgeschaald door snellere diaverwerking en -verwerking. Zoals hierboven vermeld, brengt het HTP-komeetsysteem veel voordelen met zich mee, maar er is één opmerkelijke beperking: de huidige aanpak biedt slechts een toename van 20% in het aantal uitgevoerde monsters, vergeleken met een conventionele horizontale tank (hoewel de verwerking van dia's veel sneller is). De CometChip en 96 mini-gel formaten draaien een groter aantal monsters. Tot op heden weten we niet of de huidige aanpak geschikt is voor de CometChip- of 96 mini-gelformaten, hoewel we voorspellen dat dit het geval zal zijn. Zoals hierboven vermeld, kan het aantal monsters verder worden verhoogd door tanks op een enkele voeding te slaan. Zoals met alle benaderingen, is er nog steeds een kans op het verliezen of beschadigen van de gels tijdens het laden van monsters en het analyseren ervan onder de microscoop, maar dit is meer te wijten aan een fout van de operator, en de kans hierop wordt geminimaliseerd met de huidige aanpak.

Het gebruik van het HTP-komeetsysteem kan enorm helpen bij het analyseren van DNA-schade, waardoor het gebruik van de komeettest in een breed scala aan toepassingen wordt vergemakkelijkt, zoals moleculaire epidemiologie, mannelijke reproductieve wetenschap, genotoxicologische studies en milieutoxicologie. Dit geldt met name voor gebruikers die alle voordelen van verbeterde doorvoer en gebruiksgemak willen hebben, zonder af te stappen van de vertrouwde, kosteneffectieve, conventionele microscoopglaasjes.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr. Cooke en Dr. Karbaschi zijn uitvinders van drie verleende patenten met betrekking tot de hier beschreven technologieën.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het werk dat in deze publicatie wordt gerapporteerd, werd gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of Environmental Health Sciences van de National Institutes of Health onder toekenningsnummer: 1R41ES030274. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van de National Institutes of Health.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
22 x 22 mm glazen dekglasjesFisher Scientific, Hampton, NH, USA631-0124
A2780ECACC, 
Louis, MO,
USA		93112519
Geconcentreerd salpeterzuur (OptimaTM kwaliteit)Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USAA467-250
Fluorescentiemicroscoop uitgerust met een cameraZeiss, Jena, Duitsland
Verse menselijke volbloedZen Bio IncSER-WB10MLCommercieel menselijk volbloed monster
GraphPad PrismGraphPad Software, San Diego, CaliforniaSoftware voor data-analyse
HTP Comet Assay systeemCleaver ScientificCOMPAC- 50
Menselijke keratinocyten (HaCaTs)American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USAUit productieKan worden gekocht bij een ander bedrijf
ADDEXBIO TECHNOLOGIES
Cat# T0020001
Waterstofperoxide (H2O2)
30% in water		Fisher Scientific, Hampton, NH, USABP2633-500
ICP-MS
iCAP RQ ICP-MS systeem		Thermo Scientific,
Waltham, MA,
USA		IQLAAGGAAQFAQKMBIT
Afbeelding- en data-analyse softwarePerceptive Instrument,
Bury St Edmunds, Engeland,
UK		125525Gratis beeldanalysesoftware is beschikbaar, bijv. ImageJ
Interne standaardmixSPEX Certiprep,
Metuchen, NJ, USA		CL-ISM1-500Bismuth (isotoop gemonitord 209 Bi)-concentratie van 10 µg/mL in 5% HNO3
Agarose met laag smeltpuntInvitrogen
Waltham, MA, USA		P4864
Na2EDTA (dinatrium-ethyleendiaminetetra-acetaat)Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		E5134
NaCl (Natriumchloride)Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		S7653
NanoDrop OneThermo Scientific,
Waltham, MA,
USA		701-058108Nanodrop voor het meten van DNA-concentratie
Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure)Thermo Scientific, 
Waltham, MA,
USA		D11901Ultrapuur water (16 MΩ cm-1)
NaOH (Natriumhydroxide)Sigma Aldrich,
St. Louis, MO, USA		E5134
Agarose met normaal smeltpuntFisher Scientific,
Hampton, NH, USA		16520100Voor het voorcoaten van slides
OCI-P5XUniversity of Miami,
Miami, FL,
USA		N/ALive Tumor Culture Core facility leverde de cellen
Platinum (Pt) referentiestandaardSPEX Certiprep,
Metuchen, NJ, USA		PLPT3-2Y(1000 µg/mL in 10% HCl) bevat Bismuth
Propidiumjodide
(1,0 mg/mL in water)		Sigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		12-541BP486410ML
QIAamp DNA Mini KitQiagen
Valencia, CA,
USA		51304DNA extractie kit
Enkel-bevroren glazen microscoopglazenFisher Scientific,
Hampton, NH, USA		12-541B
SKOV3ECACC,
Louis, MO,
USA		91091004
Slide boxFisher Scientific,
Hampton, NH, USA		03-448-2Lichtdicht, om cellen te beschermen tegen de vorming van bijkomende schade (volgens de algemeen aanvaarde mening) en om vervaging van de fluorescente kleurstof te voorkomen
Slide Chilling plateCleaver Scientific,
Rugby, Engeland,
UK		CSL-CHILLPLATE
BehandelingsschaalCleaver Scientific,
Rugby, Engeland,
UK		STAINDISH4X
Tris-baseSigma Aldrich,
St. Louis, MO,
USA		93362
Triton X-100Fisher Scientific,
Hampton, NH, USA		BP151-500
Trypsine EDTA (0,5%)Invitrogen
Gibco,
Waltham, MA, USA		15400054
Verticale Slide CarrierCleaver Scientific,
Rugby, Engeland,
UK		COMPAC-25

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Lunec, J. Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal. 17 (10), 1195-1214 (2003).
  2. Barnes, J. L., Zubair, M., John, K., Poirier, M. C., Martin, F. L. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46 (5), 1213-1224 (2018).
  3. Evans, M. D., Cooke, M. S. Factors contributing to the outcome of oxidative damage to nucleic acids. Bioessays. 26 (5), 533-542 (2004).
  4. Evans, M. D., Dizdaroglu, M., Cooke, M. S. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance. Mutatation Research. 567 (1), 1-61 (2004).
  5. Miyamae, Y., et al. Detection of DNA lesions induced by chemical mutagens using the single-cell gel electrophoresis (comet) assay. 2. Relationship between DNA migration and alkaline condition. Mutatation Research. 393 (1-2), 107-113 (1997).
  6. Angelis, K. J., Dusinská, M., Collins, A. R. Single cell gel electrophoresis: detection of DNA damage at different levels of sensitivity. Electrophoresis. 20 (10), 2133-2138 (1999).
  7. Duarte, T. L., Cooke, M. S., Jones, G. D. Gene expression profiling reveals new protective roles for vitamin C in human skin cells. Free Radical Biology & Medicine. 46 (1), 78-87 (2009).
  8. Karbaschi, M., et al. Rescue of cells from apoptosis increases DNA repair in UVB exposed cells: implications for the DNA damage response. Toxicology Research. 4 (3), 725-738 (2015).
  9. Wu, J. H., Jones, N. J. Assessment of DNA interstrand crosslinks using the modified alkaline comet assay. Methods in Molecular Biology. 817, 165-181 (2012).
  10. Merk, O., Speit, G. Detection of crosslinks with the comet assay in relationship to genotoxicity and cytotoxicity. Environmental and Molecular Mutagenesis. 33 (2), 167-172 (1999).
  11. Spanswick, V. J., Hartley, J. M., Hartley, J. A. Measurement of DNA interstrand crosslinking in individual cells using the Single Cell Gel Electrophoresis (Comet) assay. Methods in Molecular Biology. 613, 267-282 (2010).
  12. Saha, D. T., et al. Quantification of DNA repair capacity in whole blood of patients with head and neck cancer and healthy donors by comet assay. Mutation Research. 650 (1), 55-62 (2008).
  13. Giovannelli, L., Pitozzi, V., Riolo, S., Dolara, P. Measurement of DNA breaks and oxidative damage in polymorphonuclear and mononuclear white blood cells: a novel approach using the comet assay. Mutatation Research. 538 (1-2), 71-80 (2003).
  14. Al-Salmani, K., et al. Simplified method for the collection, storage, and comet assay analysis of DNA damage in whole blood. Free Radical Biology & Medicine. 51 (3), 719-725 (2011).
  15. Akor-Dewu, M. B., et al. Leucocytes isolated from simply frozen whole blood can be used in human biomonitoring for DNA damage measurement with the comet assay. Cell Biochemistry and Function. 32 (3), 299-302 (2014).
  16. Ge, J., et al. CometChip: a high-throughput 96-well platform for measuring DNA damage in microarrayed human cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e50607(2014).
  17. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochemical and Biophysical Reseach Communications. 123 (1), 291-298 (1984).
  18. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research. 175 (1), 184-191 (1988).
  19. Karbaschi, M., et al. Evaluation of the major steps in the conventional protocol for the alkaline comet assay. International Journal of Molecular Sciences. 20 (23), 6072(2019).
  20. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Novel method for the high-throughput processing of slides for the comet assay. Scientific Reports. 4 (1), 7200(2014).
  21. Karbaschi, M., Cooke, M. S. Chilling apparatus. USA patent. , 10690574 (2020).
  22. Cooke, M. S., Karbaschi, M. Method and apparatus for performing electrophoresis. USA patent. , 20160195494 (2019).
  23. Ji, Y., Karbaschi, M., Cooke, M. S. Mycoplasma infection of cultured cells induces oxidative stress and attenuates cellular base excision repair activity. Mutatation Research. 845, 403054(2019).
  24. Møller, P., et al. Minimum Information for Reporting on the Comet Assay (MIRCA): recommendations for describing comet assay procedures and results. Nature Protocols. 15 (12), 3817-3826 (2020).
  25. Almeida, G. M., Duarte, T. L., Steward, W. P., Jones, G. D. Detection of oxaliplatin-induced DNA crosslinks in vitro and in cancer patients using the alkaline comet assay. DNA Repair (Amst). 5 (2), 219-225 (2006).
  26. Moneef, M. A., et al. Measurements using the alkaline comet assay predict bladder cancer cell radiosensitivity. British Journal of Cancer. 89 (12), 2271-2276 (2003).
  27. Bowman, K. J., et al. Comet assay measures of DNA damage are predictive of bladder cancer cell treatment sensitivity in vitro and outcome in vivo. International Journal of Cancer. 134 (5), 1102-1111 (2014).
  28. Abdulwahed, A. M. S. Investigation of DNA Damage and Genomic Organization in the Cellular Response to Platinum Chemotherapy. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).
  29. Olive, P. L., Banáth, J. P., Durand, R. E. Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the "comet" assay. Radiation Research. 122 (1), 86-94 (1990).
  30. Kumaravel, T. S., Vilhar, B., Faux, S. P., Jha, A. N. Comet Assay measurements: a perspective. Cell Biology and Toxicology. 25 (1), 53-64 (2009).
  31. Ji, Y. Formation and Repair of Environmetally-induced damage to Mitochondrial and Nuclear Genomess. , Florida International University. Doctor of Philosophy thesis (2020).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

High throughput assaygelelektroforesegenotoxiciteitsbeoordelingobjectglaashouderalkalische comet assaywaterstofperoxidebehandelingpropidiumjodidekleuringDNA crosslinks

Gerelateerde artikelen