Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Oprichting van diepe onderkoelde circulatoire arrestatie bij ratten

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63571

⸱

16 december 2022

 , 
1Department of Cardiopulmonary Bypass, National Center for Cardiovascular Disease and Fuwai Hospital, State Key Laboratory of Cardiovascular Medicine, Chinese Academy of Medical Science, Peking Union Medical College

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert de vaststelling van diepe hypothermische circulatiestilstand bij ratten, die kan worden toegepast om systemisch ontstekingsreactiesyndroom, ischemie / reperfusieletsel, oxidatieve stress, neuro-inflammatie, enz. Te onderzoeken.

Samenvatting

Diepe hypothermische circulatoire arrestatie (DHCA) wordt routinematig toegepast tijdens operaties voor complexe aangeboren hartaandoeningen en aortaboogaandoeningen. De huidige studie heeft tot doel een methode te bieden voor het vaststellen van DHCA bij ratten. Om de impact van het DHCA-proces op vitale functies te evalueren, werd een ratmodel met een normale temperatuur cardiopulmonale bypass (CPB) zonder circulatoire arrestatie gebruikt als controle. Zoals verwacht leidde DHCA tot een significante daling van de lichaamstemperatuur en de gemiddelde arteriële bloeddruk. De bloedgasanalyse gaf aan dat DHCA de melkzuurspiegels verhoogde, maar de pH van het bloed en de concentraties van hemoglobine, hematocriet, Na +, Cl−, K + en glucose niet beïnvloedde. Bovendien toonden de resultaten van de transmissie-elektronenmicroscopie, vergeleken met de CPB-ratten met een normale temperatuur, een lichte toename van hippocampale autofagosomen bij de DHCA-ratten.

Inleiding

Diepe onderkoelde circulatoire arrestatie (DHCA) wordt sinds 1953 gebruikt bij hartchirurgie1. DHCA omvat het verlagen van de kerntemperatuur van de patiënt tot diep onderkoelde niveaus (15-22 ° C) voordat de bloedtoevoer naar het lichaam wereldwijd wordt onderbroken2. De circulatiestilstand kan zorgen voor een relatief bloedeloos operatieveld. Diepe onderkoeling vermindert het metabolisme, vooral in de hersenen en myocardium, wat een effectieve methode is om te beschermen tegen ischemie3. DHCA wordt vaak toegepast tijdens operaties voor complexe aangeboren hartaandoeningen, aortaboogaandoeningen en zelfs nier- of bijniertumoren met een vena cava-trombus 4,5. Daarom biedt het opstellen van DHCA-diermodellen een belangrijke referentie voor de verfijning van de procedure en de preventie van complicaties in klinische omgevingen.

Hoewel modellen kunnen worden vastgesteld met hoektanden6, konijnen7 en andere dieren, heeft het de voorkeur om ratten te gebruiken vanwege hun bruikbaarheid en lage kosten. Het DHCA-rattenmodel werd in 2006 voor het eerst beschreven door Jungwirth et al.8. Het bleek dat de duur van de circulatiestilstand een impact had op de neurologische uitkomsten. Sindsdien zijn DHCA-rattenmodellen breed onderzocht. Er is verduidelijkt dat DHCA systemisch ontstekingsreactiesyndroom (SIRS)9 kan veroorzaken. In latere studies ontdekten farmacologen dat de DHCA-gerelateerde neuro-inflammatie geïnduceerd door SIRS kon worden verzwakt door resveratrol10 en triptolide11. Ons team ontdekte ook dat DHCA-gerelateerde neuro-inflammatie kon worden verzwakt door het koud-induceerbare RNA-bindende eiwit12 te remmen. In het cardiovasculaire systeem heeft superoxide dismutase een cardioprotectief effect op ischemie / reperfusie (I / R) -verwondingen tijdens DHCA13. Deze resultaten breidden het begrip van DHCA-gerelateerde pathofysiologische processen uit en boden nieuwe richtingen voor het verbeteren van de resultaten van DHCA. De resultaten met betrekking tot endotoxemie, oxidatieve stress en autofagie na DHCA zijn echter niet overtuigend. DHCA gebruikt dezelfde operationele technologie als de cardiopulmonale bypass (CPB)14, maar de managementstrategie is anders en de stappen om DHCA te genereren verschillen tussen verschillende teams 8,9,10,11. De huidige studie heeft tot doel een methode te bieden voor het vaststellen van de DHCA-procedure bij ratten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De protocollen ondergingen een institutionele beoordeling en kregen goedkeuring van de Institutional Animal Care and Use Committee, Fuwai Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (FW-2021-0005). Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren gepubliceerd door de National Institutes of Health.

OPMERKING: Mannelijke Sprague-Dawley-ratten (gewicht: 500-600 g, leeftijd: 12-14 weken) werden gehouden onder standaard laboratoriumomstandigheden met vrije toegang tot voedsel en water. De ratten werden willekeurig ingedeeld in twee groepen (n = 6, elke groep): de DHCA-groep en de normale temperatuur CPB-groep (NtCPB-groep).

1. Voorbereidende werkzaamheden

  1. Steriliseer de chirurgische instrumenten (tang, schaar, microtang, een elektrocoagulator, een scheerapparaat, enz.) vóór het experiment (figuur 1).
  2. Zorg voor de beschikbaarheid van de verbruiksartikelen, waaronder 2-0 zijde, een canule van 16 G (endotracheale katheter), een canule van 22 G, een zelfgemaakte canule van 16 G (intraveneuze katheter met meerdere openingen), injectiespuiten, gaas en tape.
    OPMERKING: Gebruik voor de zelfgemaakte canule van 16 G een scalpel om twee of drie openingen met een diameter van 2 mm aan de punt van de canule te snijden, wat zal helpen om de veneuze drainage soepeler te maken.
  3. Zorg voor de beschikbaarheid van sevofluraan, 2% lidocaïne, zoutoplossing, heparine (5 IE / ml, 250 IE / ml), epinefrine (40 μg / ml), noradrenaline (20 μg / ml), hydroxyethylzetmeel en bicarbonaat.
  4. Zorg ervoor dat de DHCA-circuits een reservoir bevatten (aangepast van Murphy's druppelaar), een rolpomp, een warmtewisselaar, een membraanoxygenator, verbindingsbuizen en een watertank (figuur 2). Sluit het circuit aan en meng 12 ml hydroxyethylzetmeel met 1 ml heparinenatrium (250 IE) en 1 ml zoutoplossing. Bereid het circuit voor met 14 ml van de aanzuigoplossing met de rollenpomp voorzichtig draaiend (10-40 ml / min).
    OPMERKING: Het reservoir wordt omgevormd van een bloedtransfusieapparaat met Murphy's druppelaar. Het veneuze instroomgedeelte van de druppelaar blijft op 10-15 cm en het veneuze uitlaatgedeelte blijft op 10 cm.

2. Anesthesie en cannulatie

  1. Verdoof de ratten met 2% -3% sevofluraan en test vervolgens op het ontbreken van de conjunctivale reflex en spierontspanning nadat de rat het bewustzijn verliest.
    OPMERKING: De conjunctivale reflex verwijst naar de onmiddellijke sluiting van het ooglid wanneer het hoornvlies wordt aangeraakt. Gebruik een wattenstaafje om het hoornvlies iets aan te raken. Wanneer de anesthesiediepte voldoende is, zullen de oogleden niet sluiten.
  2. Voer endotracheale intubatie uit met een canule van 16 G nadat de conjunctivale reflex is verdwenen en er geen spierweerstand is waargenomen. Sluit de buis aan op een ventilator en stel de parameters in door op de knoppen op de ventilator te klikken (getijdenvolume: 1,0-1,2 ml / 100 g, hartslag: 80 slagen per minuut [bpm], I: E = 1: 1, geïnspireerde zuurstoffractie: 60%).
  3. Leg een elektrische verwarmingsdeken onder de rat en bevestig de rat met tape. Breng oogheelkundige zalf aan op de ogen om uitdroging te voorkomen. Scheer het haar op het linker inguinale gebied, het rechter cervicale gebied en de staart met een scheerapparaat. Desinfecteer vervolgens de huid drie keer met jodium en alcohol.
  4. Controleer de diepte van de anesthesie voordat u naar de volgende stappen gaat. Als de ademhalingsfrequentie hoger is dan die van de beademingsmachine (80 bpm), of als er spierstijfheid is, verhoog dan de outputconcentratie van sevofluraan.
    OPMERKING: Wanneer de diepte van de anesthesie voldoende is, moet het ademhalingsritme worden gesynchroniseerd met de beademingsmachine en moeten de spieren volledig ontspannen zijn zonder spanning. Controleer de diepte van de anesthesie elke 30 minuten om ervoor te zorgen dat de rat tijdens de procedure geen terugkeer van het bewustzijn ervaart.
  5. Gebruik een scalpel om de huid in het linker liesgebied (ongeveer 1 cm) te snijden en ontleed de spier en het weefsel zachtjes om de linker femorale ader en slagader bloot te leggen. Scheid de slagader zorgvuldig.
  6. Cannuleer een intraveneuze katheter van 22 G in de linker femorale slagader. Ligate de slagader en katheter met een 2-0 zijde (op het gebied van cannulatie). Gebruik zoutoplossing-bevattende heparine (5 UI / ml) om de canule te spoelen om stolling te voorkomen. Sluit de katheter aan op de druksensor om de bloeddruk te controleren.
  7. Snijd de huid van de staart (ongeveer 1,5 cm) en gebruik vervolgens een scalpel om de oppervlakkige fascia van de staartslagader te snijden om de staartslagader bloot te leggen, die zich in het midden van het chirurgische veld bevindt.
  8. Cannuleer de staartslagader met een intraveneuze katheter van 22 G. Ligate de slagader en katheter met een 2-0 zijde (op het gebied van cannulatie). Gebruik zoutoplossing-bevattende heparine (5 UI /ml) om de katheter te spoelen om stolling te voorkomen.
    OPMERKING: Bij het cannuleren van de intraveneuze katheter houdt de linkerhand de slagader / ader met een tang vast en de rechterhand doorboort de slagader / ader met de naald in de katheter en plaatst vervolgens de canule in de slagader.
  9. Snijd de huid op de rechter halsader (ongeveer 2 cm) en scheid vervolgens de spier en het weefsel om de ader bloot te leggen. Breng een 16 G zelfgemaakte multi-opening intraveneuze katheter in de rechter externe halsader en plaats deze voorzichtig in de rechter inferieure vena cava of het rechter atrium.
    OPMERKING: De linker femorale ader en slagader bevinden zich onder het oppervlak van het linker inguinale gebied. De ader is dikker dan de slagader en de bloedkleur van de slagaders is felrood. De rechter halsader bevindt zich in het midden van het rechter cervicale gebied; wanneer de huid wordt doorgesneden en de spieren worden gescheiden, is de ader te zien (ongeveer 0,3-0,4 cm breed). Wanneer de punt van de katheter het rechter atrium raakt, zal de golf van bloeddruk fluctueren. Dan, na het een beetje terugtrekken van de katheter, zal de punt van de katheter in de superieure vena cava zitten.
  10. Dien heparinenatrium (500 IE/kg) toe via de rechter externe ader. Bedek elk gecannuleerd gebied met vochtig gaas om besmetting te voorkomen.
    OPMERKING: Plaats een doos onder de operatietafel om deze ongeveer 40 cm te verhogen.

3. Dhca-initiatie

  1. Sluit het DHCA-circuit eerst aan op de katheter in de staartslagader en houd het pompdebiet op 1-2 ml/min. Verbind vervolgens het reservoir met de katheter in de rechter externe halsader. Zorg ervoor dat er altijd een bloedspiegel van ongeveer 1 cm in het reservoir zit.
  2. Zet het waterreservoir aan en stel eerst de watertemperatuur in op 37 °C.
  3. Nadat de bloeddruk stabiel is, verhoogt u voorzichtig de pompstroom tot 80-100 ml / kg / min om het bloed te pompen.

4. Koeling

  1. Stel de kamertemperatuur in op ongeveer 20 °C. Doe ijsblokjes in wegwerphandschoenen en plaats ze vervolgens op het hoofd en de zijkanten van de rat. Pas de temperatuur van de tank in realtime aan op basis van de rectale temperatuur van de ratten.
  2. Verzamel 0,1 ml bloed uit de linker dijbeenslagader en plaats het op de bloedgasmachine voor bloedgasanalyse. Wijzig de relevante parameters van de ventilator op de juiste manier op basis van de resultaten van de bloedgasanalyse (bijv. PaCO2).
    OPMERKING: De hartslag en bloeddruk kunnen veranderen en het pompdebiet moet dienovereenkomstig worden aangepast. De temperatuurgradiënt tussen de watertank en de rat moet minder dan 10 °C zijn. Zorg ervoor dat de temperatuur binnen 30 minuten kan worden verlaagd tot 15-20 °C. Het normale bereik van PaCO2 is 35-45 mmHg. Als de bloedgasuitslagen een lagere PaCO2 laten zien, kan men het getijdenvolume verlagen en vice versa.

5. Diepe onderkoelde circulatiestilstand

  1. Wanneer de rectale temperatuur daalt tot 15-20 °C, verwissel dan de wegwerphandschoenen (die ijs bevatten) om ervoor te zorgen dat diepe onderkoeling tijdens de circulatiestop behouden blijft.
  2. Stop de rolpomp, houd het reservoir in contact met de omgeving en laat het bloed langzaam uit de externe halsader naar het reservoir lopen.
  3. Let op de bloeddrukgolfvorm. Wanneer de bloeddruk en de hartslag 0 zijn, stopt u de drainage en houdt u het reservoir gesloten. Zet de ventilator uit.
    OPMERKING: De duur van de circulatiestilstand varieert afhankelijk van het doel van het experiment.

6. Warming-up en reperfusie

  1. Verwijder alle wegwerphandschoenen en verhoog de kamertemperatuur tot 25 °C. Herstel de membraanoxygenatorventilatie terwijl de veneuze drainagebuis wordt geknipt. Zet de rollerpomp aan om ervoor te zorgen dat het bloed in het reservoir langzaam teruggaat naar het lichaam van de rat.
  2. Zet de ventilator aan. Zodra het bloedniveau in het reservoir op 1 cm blijft, maakt u de drainagebuis los en voert u het bloed langzaam af van het rechteratrium naar het reservoir.
  3. Schakel de verwarmingslamp, het verwarmingskussen en de watertank in. Stel eerst de temperatuur van het waterreservoir in op 25 °C en pas vervolgens de uitlaattemperatuur tijdig aan op basis van de rectale temperatuur van de rat.
    OPMERKING: De verwarmingslamp moet worden gericht op de grote bloedvaten in de thoracale holte van de rat en moet op een bepaalde afstand worden gehouden om te voorkomen dat de weefsels worden verbrand. Let op het temperatuurverschil tussen de uitlaattemperatuur en de rectale temperatuur van de rat (<10 °C). Test indien nodig het bloedgas en pas vervolgens de ventilatorparameters dienovereenkomstig aan en dien bicarbonaat, elektrolyten, enz. Toe.
  4. Verwijder de verwarmingslamp nadat de rectale temperatuur is teruggekeerd naar 34 °C.
    OPMERKING: Deze stap, als een voortzetting van het snelle opwarmproces, moet langzaam zijn. In dit stadium kunnen de apparatuurparameters van de sevofluraanverdamper, mechanische ventilator en rolpomp worden hersteld tot het niveau aan het begin van het CPB.

7. Het CPB spenen

  1. Verlaag langzaam en geleidelijk het debiet van de rolpomp en pas de veneuze drainagesnelheid aan totdat het debiet daalt tot 1 ml / min.
    OPMERKING: Elke aanpassing van het debiet moet gedurende 3-5 minuten in acht worden genomen.
  2. Houd het reservoir in contact met de omgeving (door de reservoirdop eraf te halen). Infundeer het resterende bloed in het circuit met een stroomsnelheid van 1 ml / min.
  3. Stop de membraanoxygenatie en de rolpomp.
  4. Euthanaseer de rat na een periode van mechanische beademing onder diepe anesthesie.
    OPMERKING: Dit is een terminale procedure. De duur tussen het spenen van het CPB en euthanasie varieert afhankelijk van de verschillende onderzoeksprotocollen. Vergeet niet om de wonden te desinfecteren met jodium en alcohol en vervolgens elk gecannuleerd gebied te bedekken met vochtig gaas om besmetting vóór euthanasie te voorkomen. Verhoog de outputconcentratie van sevofluraan om de diepte van de anesthesie te vergroten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Als controlegroep vertoonden de cpb-ratten met normale temperatuur (NtCPB) zonder circulatoire arrestatie een stabiele gemiddelde arteriële bloeddruk (MAP) en lichaamstemperatuur gedurende de hele procedure, terwijl de MAP van de DHCA-ratten afnam tijdens de hartstilstand (p < 0,01, figuur 3A). De temperatuur van de DHCA-ratten daalde snel tijdens de koelfase en herstelde zich geleidelijk tijdens de opwarmfase. Bij het spenen van de ratten van de DHCA-circuits keerde de temperatuur ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Cannulatie is de meest fundamentele procedure voor het vaststellen van DHCA bij ratten. Vóór cannulatie zal het weken van de slagader met 0,5 ml 2% lidocaïne het gemakkelijker maken om te cannuleren. Na cannulatie is heparinisatie met 500 IE/kg heparine via de uitwendige halsader noodzakelijk om microtrombusvorming te voorkomen17. We hebben herhaaldelijk ontdekt dat deze dosis heparine het doel van een geactiveerde stollingstijd (ACT) >480 s kan bereiken. De opwarmperiode is het moeilijks...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Liang Zhang voor het helpen verzamelen van de videogegevens tijdens het experiment. Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant nummer: 82070479) en de Fundamental Research Funds for the Central Universities (Grant number: 3332022128).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Heat ExchangerXi’an Xijing Medical Appliance Co., LtdAnimal-M
Membrane OxygenatorDongguan Kewei Medical Instrument Co., Ltd.Micro-M
MonitorChengdu Techman Co., LtdBL-420s
Roller PumpChangzhou Prefluid Technology Co.,LtdBL100
SD RatHFK Bioscience Co.,Ltd./
SevofluraneMaruishi Pharmaceutical Co. LtdH20150020
ShaverHangzhou Huayuan Pet Products Co.,Ltd./
VaporizerSPACECABS/
VentilatorShanghai Alcott Biotech Co., LtdALC-V8S
Water TankMaquet Critical Care ABJostra HCU20-600

Referenties

  1. Lewis, F. J., Taufic, M. Closure of atrial septal defects with the aid of hypothermia; experimental accomplishments and the report of one successful case. Surgery. 33 (1), 52-59 (1953).
  2. Miler, R. D., et al. Miller's Anesthesia., eighth edition. , Saunders. Philadephia, US. (2015).
  3. Gocoł, R., et al. The role of deep hypothermia in cardiac surgery. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (13), 7061(2021).
  4. Zhu, P., et al. The role of deep hypothermic circulatory arrest in surgery for renal or adrenal tumor with vena cava thrombus: A single-institution experience. Journal of Cardiothoracic Surgery. 13 (1), 85(2018).
  5. Poon, S. S., Estrera, A., Oo, A., Field, M. Is moderate hypothermic circulatory arrest with selective antegrade cerebral perfusion superior to deep hypothermic circulatory arrest in elective aortic arch surgery. Interactive Cardiovascular and Thoracic Surgery. 23 (3), 462-468 (2016).
  6. Giuliano, K., et al. Inflammatory profile in a canine model of hypothermic circulatory arrest. Journal of Surgical Research. 264, 260-273 (2021).
  7. Wang, Q., et al. Hyperoxia management during deep hypothermia for cerebral protection in circulatory arrest rabbit model. ASAIO Journal. 58 (4), 330-336 (2012).
  8. Jungwirth, B., et al. Neurologic outcome after cardiopulmonary bypass with deep hypothermic circulatory arrest in rats: Description of a new model. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 131 (4), 805-812 (2006).
  9. Engels, M., et al. A cardiopulmonary bypass with deep hypothermic circulatory arrest rat model for the investigation of the systemic inflammation response and induced organ damage. Journal of Inflammation. 11, 26(2014).
  10. Chen, Q., Sun, K. P., Huang, J. S., Wang, Z. C., Hong, Z. N. Resveratrol attenuates neuroinflammation after deep hypothermia with circulatory arrest in rats. Brain Research Bulletin. 155, 145-154 (2020).
  11. Chen, Q., Lei, Y. Q., Liu, J. F., Wang, Z. C., Cao, H. Triptolide improves neurobehavioral functions, inflammation, and oxidative stress in rats under deep hypothermic circulatory arrest. Aging. 13 (2), 3031-3044 (2021).
  12. Liu, M., et al. A novel target to reduce microglial inflammation and neuronal damage after deep hypothermic circulatory arrest. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 159 (6), 2431-2444 (2020).
  13. Pinto, A., et al. The extracellular isoform of superoxide dismutase has a significant impact on cardiovascular ischaemia and reperfusion injury during cardiopulmonary bypass. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 50 (6), 1035-1044 (2016).
  14. Hirao, S., Masumoto, H., Itonaga, T., Minatoya, K. A recovery cardiopulmonary bypass model without transfusion or inotropic agents in rats. Journal of Visualized Experiments. (133), e56986(2018).
  15. Ha, J. Y., Kim, J. S., Kim, S. E., Son, J. H. Simultaneous activation of mitophagy and autophagy by staurosporine protects against dopaminergic neuronal cell death. Neuroscience Letters. 561, 101-106 (2014).
  16. Yamamoto, A., Yue, Z. Autophagy and its normal and pathogenic states in the brain. Annual Review of Neuroscience. 37, 55-78 (2014).
  17. You, X. M., et al. Rat cardiopulmonary bypass model: Application of a miniature extracorporeal circuit composed of asanguinous prime. Journal of Extra-Corporeal Technology. 37 (1), 60-65 (2005).
  18. Chen, Q., Lei, Y. Q., Liu, J. F., Wang, Z. C., Cao, H. Beneficial effects of chlorogenic acid treatment on neuroinflammation after deep hypothermic circulatory arrest may be mediated through CYLD/NF-κB signaling. Brain Research. 1767, 147572(2021).
  19. Li, Y. A., et al. Differential expression profiles of circular RNAs in the rat hippocampus after deep hypothermic circulatory arrest. Artificial Organs. 45 (8), 866-880 (2021).
  20. Linardi, D., et al. Slow versus fast rewarming after hypothermic circulatory arrest: effects on neuroinflammation and cerebral oedema. European Journal of Cardiothoracic Surgery. 58 (4), 792-780 (2020).
  21. Engelman, R., et al. The Society of Thoracic Surgeons, The Society of Cardiovascular Anesthesiologists, and The American Society of ExtraCorporeal Technology: Clinical practice guidelines for cardiopulmonary bypass--Temperature management during cardiopulmonary bypass. Annals of Thoracic Surgery. 100 (2), 748-757 (2015).
  22. Jenke, A., et al. AdipoRon attenuates inflammation and impairment of cardiac function associated with cardiopulmonary bypass-induced systemic inflammatory response syndrome. Journal of the American Heart Association. 10 (6), 018097(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Cardiopulmonale bypassratmodelbloedgasanalysegemiddelde arteriële drukhippocampale autofagosomentransmissie-elektronenmicroscopieneuroinflammatiesystemische ontstekingsreactielichaamstemperatuur
Oprichting van diepe onderkoelde circulatoire arrestatie bij ratten
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.