Methodenartikel

Een celtraceringsinjectie gebruiken om de oorsprong van neointimavormende cellen in een sacculair zijwandmodel van een rat te onderzoeken

1.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63580

⸱

16 maart 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurosurgery, Kantonsspital Aarau, 2Cerebrovascular Research Group, Department for BioMedical Research, University of Bern, 3Institute of Pathology Laenggasse, 4Department of Neurosurgery, Neurocenter and Regenerative Neuroscience Cluster, Inselspital, Bern University Hospital, University of Bern, 5Faculty of Medicine, University of Bern

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

We voerden een éénpunts, lipofiele cel-tracer-injectie uit om endotheelcellen te volgen, gevolgd door een arteriotomie en hechting van zijwandaneurysma's op de abdominale rataorta. Neointima-vorming leek afhankelijk van de bovenliggende slagader in gedecellulariseerde aneurysmata en werd bevorderd door de rekrutering uit aneurysmawandcellen in vitale celrijke wanden.

Samenvatting

Microchirurgisch knippen creëert een daaropvolgende barrière van bloedtoevoer naar intracraniale aneurysma's, terwijl endovasculaire behandeling afhankelijk is van neointima- en trombusvorming. De bron van endotheelcellen die de endoluminale laag van de neointima bedekken, blijft onduidelijk. Daarom was het doel van deze studie om de oorsprong van neo-intima-vormende cellen na celtracerinjectie te onderzoeken in het reeds gevestigde Helsinki rat microchirurgische zijwandaneurysmamodel.

Zijwandaneurysma's werden gemaakt door gedecellulariseerde of vitale arteriële zakjes end-to-side aan de aorta te hechten bij mannelijke Lewis-ratten. Vóór arteriotomie met aneurysma-hechting werd een cel-traceretinjectie met CM-Dil-kleurstof uitgevoerd in de geklemde aorta om endotheelcellen in het aangrenzende vat te labelen en hun proliferatie tijdens follow-up (FU) te volgen. Behandeling gevolgd door coiling (n = 16) of stenting (n = 15). Bij FU (7 dagen of 21 dagen) ondergingen alle ratten fluorescentieangiografie, gevolgd door aneurysma-oogst en macroscopische en histologische evaluatie met immunohistologische celtellingen voor specifieke interessegebieden.

Geen van de 31 aneurysma's was gescheurd bij follow-up. Vier dieren stierven vroegtijdig. Macroscopisch residuele perfusie werd waargenomen bij 75,0% opgerold en 7,0% van de gestenteerde ratten. De hoeveelheid cel-tracer-positieve cellen was significant verhoogd in gedecellulariseerde stents in vergelijking met opgerolde aneurysma's met betrekking tot trombus op dag 7 (p = 0,01) en neointima op dag 21 (p = 0,04). Er werden geen significante verschillen gevonden in trombus of neointima in vitale aneurysma's.

Deze bevindingen bevestigen slechtere genezingspatronen in opgerolde in vergelijking met gestenteerde aneurysma's. Neointima-vorming lijkt vooral afhankelijk van de bovenwortel in gedecellulariseerde aneurysma's, terwijl het wordt ondersteund door de rekrutering van aneurysmawandcellen in vitale celrijke wanden. In termen van vertaling kan stentbehandeling meer geschikt zijn voor sterk gedegenereerde aneurysma's, terwijl coiling alleen voldoende kan zijn voor aneurysma's met meestal gezonde vaatwanden.

Inleiding

Subarachnoïdale bloeding veroorzaakt door de breuk van een intracranieel aneurysma (IA) is een verwoestende neurochirurgische aandoening geassocieerd met hoge morbiditeit en mortaliteit 1,2,3,4. Naast microchirurgisch knippen, dat direct endotheel-naar-endotheelcontact biedt, hebben endovasculaire apparaten de afgelopen decennia steeds belangrijker geworden voor de behandeling van gescheurde en incidenteel ontdekte IA's. De genezingsreactie bij endovasculair behandelde IA's hangt voornamelijk af van neointimavorming en trombusorganisatie. Beide zijn synergetische processen, afhankelijk van de celmigratie van het aangrenzende vat en de aneurysmawand. 5 Tot op heden blijft de oorsprong van endotheelcellen in neo-intimavorming van endovasculair behandelde aneurysma's onduidelijk. Er is een voortdurend debat in de literatuur over de bron waaruit neo-intima-vormende cellen worden gerekruteerd.

Door gebruik te maken van een cel-tracer injectie van CM-Dil kleurstof (zie de Tabel van Materialen) in de abdominale aorta van ratten, wilden we de rol van endotheelcellen, afkomstig uit de ouderslagader, in neointimavorming op twee verschillende FU-tijdstippen (dag 7 en dag 21) analyseren (figuur 1). Een voordeel van het model is de directe lokale cel-tracer incubatie in vivo in een bovenliggende slagader voorafgaand aan de aneurysma hechting, waardoor FU op latere tijdstippen mogelijk is. In vivo injectietechnieken, zoals cell-tracer incubatie, zijn niet beschreven in de literatuur. Een voordeel van deze techniek is de directe, éénpunts, intraoperatieve, in vivo injectie, die het model robuust en reproduceerbaar maakt.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Veterinaire ondersteuning werd uitgevoerd volgens institutionele richtlijnen. De experimenten werden goedgekeurd door de Lokale Ethische Commissie, Zwitserland (BE 60/19). De ARRIVE-richtlijnen en 3R-principes zijn strikt gevolgd 6,7. Eenendertig mannelijke Lewis-ratten, 12 weken oud en met een gewicht van 492 ± 8 g, werden opgenomen. Huisvest alle ratten bij een kamertemperatuur van 23 °C en een licht/donkercyclus van 12 uur. Zorg voor gratis toegang tot water en pellets. Statistische analyses zijn uitgevoerd met behulp van de niet-parametrische Wilcoxon-Mann-Whitney U-test. Waarschijnlijkheidswaarden (p) van ≤ 0,05 en/of ≤ 0,01 werden als significant beschouwd.

1. Preoperatieve fase-algemene voorbereiding en anesthesiologische aspecten

  1. Randomiseer ratten in spoel- of stentbehandelingsgroepen (figuur 2) via een webgebaseerd randomisatiesysteem. Voer nu een preoperatief klinisch onderzoek uit van alle dieren die gepland zijn voor een operatie naast een rustige, aseptische operatiekamer met een kamertemperatuur van 23 ± 3 °C. Analyseer het gedrag van de dieren en inspecteer de slijmvliezen en turgor als onderdeel van het preoperatieve klinische onderzoek.
  2. Noteer het gewicht van elk dier.
  3. Incubeer voorafgaand aan de operatie de arteriële zakjes van donorratten in 0,1% natriumdodecylodylsulfaat gedurende 10 uur bij 37 °C om gedecellulariseerde aneurysma's te verkrijgen8. Verzamel deze zakjes van donordieren een paar dagen voor de operatie.
    1. Bereid de volledige lengte van de abdominale aorta voor met microscisors en een tang en breng 6-0 niet-absorbeerbare ligaturen aan met een interval van 3-4 mm.
    2. Direct vitale aneurysma's intraoperatief genereren door een eerder geligeerd arterieel vatzakje uit het thoracale deel van een donordier9. Voer thoracotomie uit met een schaar en chirurgische tang op het aangegeven FU-tijdstip en laat het vatzakje op de gewenste lengte los.
  4. Implanteer de buidel direct in de ontvanger en oogst het aneurysma van het donordier voor verdere macroscopische analyse en histologische verwerking.
  5. Voor anesthesie-inductie plaatst u alle ratten in een schone doos voorzien van zuurstof (O2) tot bewustzijnsverlies na 5-10 minuten. Verdoving ratten met een subcutane (SC) injectie van een mengsel van fentanyl 0,005 mg/kg, medetomidine 0,15 mg/kg en midazolam 2 mg/kg.
    OPMERKING: Dit zorgt voor een chirurgisch vlak van ten minste 45 minuten.
  6. Controleer de diepte van de anesthesie door de afwezigheid van de pedaalontwenningsreflex.
  7. Plaats de ratten in rugligging en scheer het thoracoabdominale deel met een elektrisch scheerapparaat.
  8. Fixeer de 4 poten van de ratten met tape op een bord, bedekt met een verwarmingskussen dat is aangesloten op een automatisch regulerende rectale sonde. Plaats de rectale sonde in de anus van de rat om de gewenste temperatuur van 37 °C te handhaven met behulp van het verwarmingskussen.
  9. Installeer nu een sensor op het rechterachterbeen die is aangesloten op een geautomatiseerd systeem voor het intraoperatief controleren van vitale functies.
  10. Bedek de neus en mond van de rat met een gezichtsmasker. Als langdurige anesthesie nodig is, start isofluraan (1,0-2,0% getitreerd om te effecteren in 100% O2).
  11. Desinfecteer het chirurgische veld met povidon-jodium of afwisselende ontsmettingsmiddelen en drapeer het chirurgische veld op een steriele manier.
  12. Breng voor perianesthetische zorg een steriel oogheelkundig glijmiddel aan op de ogen en bedek ze met een ondoorzichtig foliemasker om uitdroging en schade door de chirurgische lamp te voorkomen.
  13. Voer tijdens de operatie continu zuurstof via het gezichtsmasker, controleer de lichaamstemperatuur en geef warmte met behulp van een verwarmingskussen, waardoor normothermie wordt gehandhaafd.
  14. Controleer continu andere vitale functies (opgezette pols en ademhaling, hart- en ademhalingsfrequentie en zuurstofverzadiging).

2. Operatieve fase - cel-tracer injectie

OPMERKING: De gedetailleerde chirurgische benadering in het Helsinki rat microchirurgische zijwandaneurysma model9 en technieken voor coil- en stent-implantatie worden elders beschreven 8,10,11.

  1. Bewaar de fluorescerende lipofiele celtracer de hele tijd bij ≤ -20 °C, beschermd tegen licht.
  2. Voer de operatie uit door de aorta van de rat en de ader van de caval voor te bereiden, gevolgd door de scheiding van beide, evenals proximale en distale tijdelijke klemming van de aorta.
    OPMERKING: Deze techniek is eerder beschreven9.
    1. Klem de proximale en distale delen van de aorta vast met twee tijdelijke titanenklemmen.
  3. Plaats een microswab met paarse vulling elk onder de proximale en distale delen van de aorta voor een betere visualisatie van de slagader.
  4. Bescherm nu de buik met nat gaas.
  5. Los op de dag van de operatie 2 μL van de celtracer op door te pipetteren in 1 ml fosfaatbuffered saline (PBS).
  6. Breng het mengsel over in een spuit van 1 ml met een steriele canule van 27-1/2 g (0,4 x 13 mm).
    OPMERKING: Zorg ervoor dat u blootstelling aan licht vermijdt tijdens het uitvoeren van stap 2.5 en 2.6.
  7. Doe het licht in de operatiekamer uit. Terwijl u onder een microscoop kijkt, voert u de eenpuntsinjectie uit in het middelste ventrale deel van de aorta met behulp van een microtang en injecteert u zorgvuldig 1 ml gehepariniseerde 0,9% zoutoplossing.
  8. Injecteer de celtracer voorzichtig (video 1) en schakel ook onmiddellijk de operatiemicroscoop uit. Nogmaals, bescherm de buik met nat gaas.
  9. Laat de kleurstof minstens 15 min incuberen. Schakel na de incubatietijd de microscoop en de verlichting van de operatiekamer in.
  10. Voer de longitudinale arteriotomie en hechting van het aneurysma uit, zoals elders beschreven11.
    1. Gebruik microforceps en microscisors om de arteriotomie uit te voeren, zodat de lengte het gemiddelde is van de diameter van het geoogste aneurysma (stap 1.3). Om de juiste lengte te garanderen, plaatst u het aneurysma naast de aorta voordat u arteriotomie uitvoert. Hecht het aneurysma met 8-10 enkele hechtingen met behulp van een niet-absorbeerbare 10-0 hechting en verwijder voorzichtig de tijdelijke klemmen - die distaal beginnen - onder continue irrigatie met heparinized zoutoplossing. Sluit de wond op een gelaagde manier. Let op, gebruik een coil packing dichtheid van 1 cm.
      OPMERKING: De techniek van coil- of stent-implantatie is elders beschreven 8,10.

3. Postoperatieve fasemonitoring en analgetische zorg

  1. Draai aan het einde van de operatie de anesthesie om met een SC-injectiemengsel van buprenorfine 0,05 mg / kg, atipamezol 0, 75 mg / kg en flumazenil 0, 2 mg / kg. Laat elk geopereerd dier herstellen in een schone kooi totdat het volledig wakker is en warm, indien nodig, met een verwarmingslamp.
  2. Dien gedurende 3 dagen 1 mg/kg meloxicam (één injectie of orale toepassing per dag) en buprenorfine (0,05 mg/kg viermaal daags) SC toe. Geef buprenorfine 's nachts continu in het drinkwater met dezelfde dosering: 6 ml buprenorfine 0,3 mg/ml, 360 ml drinkwater, 10 ml 5% glucose.
  3. In de onmiddellijke postoperatieve fase, huisvest elk dier in een enkele kooi voor bescherming. Hergroepeer de dieren na 24 uur.
  4. Als een rat na sc-injectie onrustig of agressief gedrag vertoont, dien dan overdag buprenorfine toe in het drinkwater.
  5. Zorg voor zacht voer op de vloer van de kooi om het voeren en herstel postoperatief te ondersteunen.
  6. Observeer en verzorg alle dieren volgens het welzijns- en pijnscoreblad.
  7. Dien indien nodig rescue analgesia SC (meloxicam 1 mg/kg en 0,05 mg/kg buprenorfine) toe.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In totaal werden 31 dieren opgenomen in de laboratoriumomgeving: 27 ratten werden opgenomen in de uiteindelijke statistische analyse; 4 ratten stierven vroegtijdig (12,9% sterftecijfer). Intraoperatief was de opgezette adem significant (p = 0,03) verminderd bij stent- (12,9 μm ± 0,7) in vergelijking met met spoel behandelde (13,5 μm ± 0,6) ratten. Fluorescentieangiografie werd uitgevoerd voor elke rat aan het einde van de laatste FU. Reperfusie was geïndiceerd bij alle 6 met spoel behandelde dieren, terwijl repe...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Deze studie toont aan dat neo-intimavorming wordt gemedieerd via endotheelcellen afkomstig uit de bovenwortel van het aneurysmacomplex, maar wordt ondersteund door de rekrutering van cellen afgeleid van de aneurysmawand in vitale aneurysma's. Niettemin blijft de rol van circulerende voorlopercellen bij de genezing van aneurysma's controversieel12,13. In totaal werden 31 mannelijke Lewis-ratten in dit onderzoek opgenomen; slechts 4 stierven vroegtijdig (12,9% ster...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs zijn als enige verantwoordelijk voor het ontwerp en de uitvoering van de gepresenteerde studie en verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Alessandra Bergadano, DVM, PhD, voor de toegewijde supervisie op de gezondheid van dieren op de lange termijn. Dit werk werd ondersteund door de onderzoeksfondsen van de Research Council, Kantonsspital Aarau, Aarau, Zwitserland, en de Zwitserse nationale wetenschappelijke stichting SNF (310030_182450).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-0 resorbable sutureEthicon Inc., USAVCP428G
4-0 non-absorbable sutureB. Braun, GermanyG0762563
6-0 non-absorbable sutureB. Braun, GermanyC0766070
9-0 non-absorbable sutureB. Braun, GermanyG1111140
AtipamezolArovet AG, Zwitserland
Bandpass filter blueThorlabsFD1Bany other
Bandpass filter greenThorlabsFGV9any other
Bipolar forcepsany other
Bicycle spotlightany other
Board (20 x 10 cm)any other
BuprenorfineIndivior, Zwitserland1014197
CameraSony NEX-5R, Sony, Tokyo, Japan
Cannula (27-1/2 G)any other
Cell count softwareImage-J version 1.52n, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, https://imagej.nih.gov/ij/
CellTracker CM-Dil dyeThermoFisher SCIENTIFIC, USAC7000
Coil-DeviceStyker, Kalamazoo, MI, USA2 cm of Target 360 TM Ultra, 2-mm diameter
Desinfectieany other
Eye-lubricantany other
FentanylSintetica, S.A., Zwitserland98683any generic
FlumazenilLabatec-Pharma, Zwitserland
FluoresceïneCuratis AG5030376any generic
Fluorescence microscopeOlympus BX51, Hamburg, Duitsland; Cell Sens Dimension Imaging software v1.8
Foil maskany other
Glucose (5%)any other
Heating padHomeothermic Control Unit, Harvard, Edenbridge, Engelandany other
Isotone natriumchloride-oplossing (0,9%)Fresenius KABI336769any generic
Isofluraanany generic
Longuettesany other
MeloxicamBoehringer IngelheimP7626406any generic
MedetomidineVirbac, ZwitserlandQN05CM91
Micro needle holderany other
MidazolamRoche, Zwitserland
Monitoring-systeemStarr Life Sciences Corp., 333 Allegheny Ave, Oakmont, PA 15139, Verenigde Staten
Needle holderany other
O2-Face maskany other
Operation microscopeOPMI, Carl Zeiss AG, Oberkochen, Duitslandany other
Oxygenany other
Rectale temperatuursondeany other
ScalpelSwann-Morton210any other
Small animal shaverany other
Smartphoneany other
Sodium dodecyl sulfate (0,1%)Sigma-Aldrich11667289001
Soft feedEmeraid Omnivoreany generic
Soft tissue forcepsany other
Soft tissue spreaderany other
Stainless steel sponge bowlsany other
Stent-DeviceBiotroni, Bülach, Zwitserlandmodified magmaris device, AMS with polymer coating, 6-mm length, 2-mm diameter
Steriele micro swabsany other
Straight and curved microforcepsany other
Straight and curved microscissorsany other
Straight and curved forcepsany other
Surgery drapeany other
Surgical scissorsany other
Syringes 1 mL, 2 mL, and 5 mLany other
Tapeany other
Vascular clip applicatorB. Braun, GermanyFT495T
Yasargil titan standard clip (2x)B. Braun Medical AG, Aesculap, ZwitserlandFT242Ttijdelijk

Referenties

  1. Vergouwen, M. D., et al. Definition of delayed cerebral ischemia after aneurysmal subarachnoid hemorrhage as an outcome event in clinical trials and observational studies: proposal of a multidisciplinary research group. Stroke. 41 (10), 2391-2395 (2010).
  2. Macdonald, R. L., et al. Preventing vasospasm improves outcome after aneurysmal subarachnoid hemorrhage: rationale and design of CONSCIOUS-2 and CONSCIOUS-3 trials. Neurocritical Care. 13 (3), 416-424 (2010).
  3. Wanderer, S., et al. Levosimendan as a therapeutic strategy to prevent neuroinflammation after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Journal of Neurointerventional Surgery. , (2021).
  4. Wanderer, S., et al. Aspirin treatment prevents inflammation in experimental bifurcation aneurysms in New Zealand White rabbits. Journal of Neurointerventional Surgery. 14 (2), 189-195 (2021).
  5. Gruter, B. E., et al. Patterns of neointima formation after coil or stent treatment in a rat saccular sidewall aneurysm model. Stroke. 52 (3), 1043-1052 (2021).
  6. Kilkenny, C., et al. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. British Journal of Pharmacology. 160 (7), 1577-1579 (2010).
  7. Tornqvist, E., et al. Strategic focus on 3R principles reveals major reductions in the use of animals in pharmaceutical toxicity testing. PLoS One. 9 (7), 101638(2014).
  8. Nevzati, E., et al. Aneurysm wall cellularity affects healing after coil embolization: assessment in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 12 (6), 621-625 (2020).
  9. Marbacher, S., et al. The Helsinki rat microsurgical sidewall aneurysm model. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (92), e51071(2014).
  10. Nevzati, E., et al. Biodegradable magnesium stent treatment of saccular aneurysms in a rt model - introduction of the surgical technique. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), e56359(2017).
  11. Gruter, B. E., et al. Testing bioresorbable stent feasibility in a rat aneurysm model. Journal of Neurointerventional Surgery. 11 (10), 1050-1054 (2019).
  12. Kadirvel, R., et al. Cellular mechanisms of aneurysm occlusion after treatment with a flow diverter. Radiology. 270 (2), 394-399 (2014).
  13. Li, Z. F., et al. Endothelial progenitor cells contribute to neointima formation in rabbit elastase-induced aneurysm after flow diverter treatment. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (5), 352-357 (2013).
  14. Marbacher, S., et al. Intraluminal cell transplantation prevents growth and rupture in a model of rupture-prone saccular aneurysms. Stroke. 45 (12), 3684-3690 (2014).
  15. Frosen, J., et al. Contribution of mural and bone marrow-derived neointimal cells to thrombus organization and wall remodeling in a microsurgical murine saccular aneurysm model. Neurosurgery. 58 (5), 936-944 (2006).
  16. Marbacher, S., Niemela, M., Hernesniemi, J., Frosen, J. Recurrence of endovascularly and microsurgically treated intracranial aneurysms-review of the putative role of aneurysm wall biology. Neurosurgical Review. 42 (1), 49-58 (2019).
  17. Frosen, J. Smooth muscle cells and the formation, degeneration, and rupture of saccular intracranial aneurysm wall--a review of current pathophysiological knowledge. Translational Stroke Research. 5 (3), 347-356 (2014).
  18. Fang, X., et al. Bone marrow-derived endothelial progenitor cells are involved in aneurysm repair in rabbits. Journal of Clinical Neuroscience. 19 (9), 1283-1286 (2012).
  19. Morel, S., et al. Sex-related differences in wall remodeling and intraluminal thrombus resolution in a rat saccular aneurysm model. Journal of Neurosurgery. , 1-14 (2019).
  20. Gruter, B. E., et al. Fluorescence video angiography for evaluation of dynamic perfusion status in an aneurysm preclinical experimental setting. Operative Neurosurgery. 17 (4), 432-438 (2019).
  21. Marbacher, S., Strange, F., Frosen, J., Fandino, J. Preclinical extracranial aneurysm models for the study and treatment of brain aneurysms: A systematic review. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 40 (5), 922-938 (2020).
  22. Ravindran, K., et al. Mechanism of action and biology of flow diverters in the treatment of intracranial aneurysms. Neurosurgery. 86, Suppl 1 13-19 (2020).
  23. Marbacher, S., et al. Loss of mural cells leads to wall degeneration, aneurysm growth, and eventual rupture in a rat aneurysm model. Stroke. 45 (1), 248-254 (2014).
  24. Morosanu, C. O., et al. Neurosurgical cadaveric and in vivo large animal training models for cranial and spinal approaches and techniques - systematic review of current literature. Neurologia i Neurochirurgia Polska. 53 (1), 8-17 (2019).
  25. Wanderer, S., et al. Arterial pouch microsurgical bifurcation aneurysm model in the rabbit. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (159), e61157(2020).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Neointimavormingrat aneurysmamodelendotheelcellenzijwandaneurysmagedecellulariseerd aneurysmafluorescentie angiografiecoilbehandelingstentbehandelingimmunohistologische evaluatie

Gerelateerde artikelen