Dit protocol presenteert de operationele details van cecal ligatie en punctie (CLP) in een muismodel van sepsis. CLP is een van de meest gebruikte technieken om een diermodel van sepsis te maken. Daarom is een gestandaardiseerd CLP-protocol vereist voor het verkrijgen van betrouwbare onderzoeksresultaten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Evaluatie van een betrouwbare biomarker in een cecale ligatie en punctie-geïnduceerd muismodel van sepsis
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Sepsis is een ernstige levensbedreigende en zich snel ontwikkelende ziekte die jaarlijks wereldwijd miljoenen sterfgevallen veroorzaakt. Onderzoekers hebben enorme inspanningen geleverd om de pathofysiologie van sepsis op te helderen met behulp van verschillende diermodellen; het muismodel van sepsis geïnduceerd door cecale ligatie en punctie (CLP) wordt veel gebruikt in laboratoria. De drie technische aspecten die van invloed zijn op de ernst en repliceerbaarheid van het CLP-model zijn het percentage ligumligum, de grootte van de naald die wordt gebruikt voor cecal-punctie en het volume uitwerpselen dat in de buikholte wordt geperst. De snelle en specifieke diagnose van sepsis is een cruciale factor die de uitkomst beïnvloedt. De gouden standaard voor sepsisdiagnose is microbiële cultuur; dit proces is echter tijdrovend en soms onnauwkeurig. De detectie van sepsis-specifieke biomarkers is snel, maar de bestaande biomarkers zijn onbevredigend vanwege een korte halfwaardetijd, niet-specificiteit en onvoldoende gevoeligheid. Daarom is er dringend behoefte aan een betrouwbare biomarker van sepsis in de vroege stadia. Eerdere publicaties suggereren dat overmatige neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) voorkomen bij sepsis. Citrullinated histon H3 (CitH3), als een NET-component, is verhoogd, zowel bij septische dieren als patiënten, en de aanwezigheid van CitH3 is een betrouwbare diagnostische biomarker van sepsis. De huidige studie was gericht op het beschrijven van een gestandaardiseerd muismodel van CLP-geïnduceerde sepsis en het vaststellen van een betrouwbare bloedbiomarker van sepsis. Ons werk kan bijdragen aan de vroege en nauwkeurige diagnose van sepsis in de toekomst.
Inleiding
Sepsis wordt gedefinieerd als levensbedreigende orgaandisfunctie veroorzaakt door een ontregelde gastheerrespons op infectie1, en septische shock is de belangrijkste doodsoorzaak in ernstige gevallen van sepsis2. Sepsis en septische shock veroorzaken elk jaar wereldwijd miljoenen sterfgevallen3. De sleutel tot het verbeteren van de uitkomst van patiënten met sepsis is het snel starten van behandelingen zoals antibiotica4. De gouden standaardmethode voor de diagnose van sepsis is microbiële cultuur; microbiële cultuur is echter tijdrovend en kan leiden tot vals-positieve en vals-negatieve resultaten, die de klinische betekenis sterk beperken5. Het is dus zeer wenselijk om een bloedbiomarker van sepsis te identificeren. Procalcitonine wordt erkend als een ideale sepsis biomarker, maar heeft een beperkte diagnostische werkzaamheid omdat het niet in staat is om sepsis te onderscheiden van steriele ziekten6.
Muis cecal ligatie en punctie (CLP) wordt vaak gebruikt om een model van sepsis te maken in wetenschappelijk onderzoek. CLP is een van de meest gebruikte sepsismodellen omdat het polymicrobiale peritonitis nabootst en zowel pro-inflammatoire als ontstekingsremmende immuunresponsen activeert7. Het is algemeen aanvaard dat CLP een klinisch relevanter sepsismodel creëert dan alternatieve technieken, zoals de injectie van bacterieel endotoxine. Daarom wordt CLP beschouwd als het klassieke sepsismodel voor gebruik in onderzoek8. Een groot nadeel van CLP is echter de reproduceerbaarheid, omdat de ernst van het model wordt beïnvloed door verschillende factoren, zoals het percentage ligumligum, de naaldgrootte, het aantal puncties en de laparotomietechniek. Daarom is het noodzakelijk om het CLP-geïnduceerde sepsismodel te standaardiseren. De huidige studie beschrijft de protocoldetails van het CLP-geïnduceerde sepsismodel om de gestandaardiseerde procedure te tonen en de reproduceerbaarheid ervan te vergroten.
De ontstekingsreactie treedt op in het vroege stadium van sepsis, waarbij neutrofielen overmatige hoeveelheden oxidanten en proteasen afgeven die orgaanschade veroorzaken8. Een belangrijke factor in de pathofysiologie van sepsis is de vorming van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's), die nucleaire en cytosolische componenten zoals DNA, citrullinated histonen en antimicrobiële proteïnasen vrijgeven9. Recente studies suggereren dat overmatige generatie van NET's de pathologie van sepsis bemiddelt; ondertussen oefent een afname van NET's, door enzymatische remming van peptidyl arginine deiminase (PAD) door chemicaliën zoals YW3-56 of Cl-amidine, een pro-overlevingseffect uit in muismodellen van sepsis10,11. Citrullinated histon H3 (CitH3) werd geïdentificeerd als een sepsis-specifiek eiwit in 201112, en latere publicaties hebben aangetoond dat de circulerende CitH3-concentratie een betrouwbare diagnostische biomarker is van sepsis 13,14. CitH3 wordt beschouwd als een gevoeligere en langdurige biomarker dan procalcitonine en is specifieker in het onderscheiden van sepsis dan inflammatoire cytokines13.
In deze studie hebben we een betrouwbare diagnostische biomarker van sepsis geëvalueerd in een CLP-geïnduceerd muismodel van sepsis.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die zijn goedgekeurd door de Animal Review Committee in het Xiangya Hospital en de Central South University (nr. 202103149).
1. Voorbereiding
- Selecteer mannelijke C57BL/6J-muizen (gewicht: 20-25 g; leeftijd: 8-12 weken) en huis gedurende 3 dagen voordat u procedures uitvoert.
- Weeg de muis.
- Verdoof de muis met 1,5% isofluraan door inhalatie en knijp in de tenen om de diepte van de anesthesie te controleren.
- Bevestig de muis op het verwarmingskussen. Breng ontharingscrème aan op de buik en laat het niet langer dan 1 min staan voordat je de crème en het haar verwijdert.
OPMERKING: De normale lichaamstemperatuur moet worden gehandhaafd door tijdens de operatie een warme pad onder de verdoofde muis te plaatsen.
2. Werking
- Bereid steriele chirurgische instrumenten voor die geschikt zijn voor knaagdierchirurgie. Draag steriele handschoenen, een gezichtsmasker en een chirurgische japon om aseptische omstandigheden te garanderen.
- Desinfecteer de buikhuid minstens drie keer met jodiumdoekjes. Bedek het operatieve operatiegebied met steriele chirurgische gordijnen.
- Gebruik een steriele chirurgische schaar om een incisie van ongeveer 2 cm in de buikwand langs de linea alba te maken.
OPMERKING: Beschadig de organen niet. - Identificeer en isoleer de blindedarm uit de peritoneale holte met een steriel pincet.
- Ligate 75% van het volume van de blindedarm met 4-0 zijden hechtingen. Ligate de mesenteriale bloedvaten niet.
OPMERKING: Het percentage van de blindedarm dat ligeert, bepaalt de ernst van sepsis. - Prik de blindedarm door één doorgaande perforatie (twee gaten) te creëren met een naald van 21 G (van de ene kant door de cecalwand naar de andere kant) in het midden tussen het staarteinde en de ligatieset.
- Gooi de naald weg. Knijp voorzichtig een klein druppeltje uitwerpselen uit de blindedarm door de penetratiegaten.
OPMERKING: De hoeveelheid uitwerpselen die in de peritoneale holte wordt geperst, moet consistent zijn, omdat dit ook de ernst van sepsis bepaalt. Stappen 2.5-2.7 moeten worden overgeslagen voor schijnmuizen. - Plaats de blindedarm voorzichtig in de buikholte.
- Sluit de buikspier en de huid afzonderlijk met 6-0 zijden hechtingen.
- Desinfecteer de incisie met jodium.
- Injecteer ketoprofen (5 mg/kg) in het kwadrant linksonder in de buik om de blindedarm te vermijden. Plaats de muis op een warme pad totdat deze volledig hersteld is van de verdoving.
- Plaats de muis in een kooi in een temperatuurgecontroleerde ruimte (22 °C) en geef gratis toegang tot voedsel en water. Controleer de muis elke 6 uur gedurende de eerste week postoperatief.
- Euthanaseer de muis door een overdosis koolstofdioxide wanneer de symptomen van sepsis voldoen aan de vooraf gedefinieerde eindpunten.
3. Behandeling
- Verdeel muizen willekeurig in de schijngroep, CLP-groep, CLP + YW3-56-groep (figuur 2a) en CLP + Cl-amidinegroep (figuur 1).
OPMERKING: De schijngroep onderging dezelfde procedures als de CLP-groepen, behalve CLP. YW3-56 (5 mg/kg) of Cl-amidine (40 mg/kg) werd toegediend via peritoneale injectie 1 uur na stap 2.9 bij het hechten van de spier- en huidlaag. - Monsteroogst
- Oogst perifeer bloed uit de retrobulbaire plexus15 24 uur na de operatie.
- Bereid het serum door centrifugatie (1.000 x g, 5 min) en bewaar het bij -80 °C tot gebruik.
- Meet de CitH3-concentratie met behulp van een indirecte sandwich ELISA-kit zoals eerder beschreven13.
- Bekleed het anti-CitH3 monoklonale antilichaam op een 96-well plaat om het CitH3-eiwit te vangen.
- Behandel het serum met DNase I (150 eenheid/ml, 37° gedurende 1 uur) en incubeer in de putjes (20 μL, kamertemperatuur).
- Voeg anti-CitH3 polyklonaal antilichaam (0,33 μg/ml, 100 μL, 2 h) toe om het gevangen CitH3-eiwit te detecteren.
- Incubeer het anti-konijn peroxidase-gelabelde secundaire antilichaam (0,02 μg / ml, 100 μl, 1 uur) in de putjes.
- Ontwikkel na grondig wassen de putten met 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (100 μL, 20 min).
OPMERKING: Verdere protocoldetails van de ELISA-kit zijn te vinden in de vorige publicatie13.
- Statistische analyse
- Voer één manier ANOVA uit om de verschillen tussen de drie groepen te analyseren, gevolgd door Bonferroni post hoc testen voor meerdere vergelijkingen. Gebruik statistische software om de analyse uit te voeren. p-waarden van 0,05 of minder werden als significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Zoals te zien is in figuur 2A, werd er geen CitH3 gedetecteerd in de schijngroep door western blotting. De CitH3-serumconcentratie nam significant toe na CLP, en deze toename werd geblokkeerd door de remming van NET-vorming via de toediening van YW3-56, een PAD-remmer10. Figuur 2B toont de serumCitH3-concentraties bepaald door ELISA. Na 24 uur na CLP was de serumconcentratie van CitH3 verhoogd in de CLP-groepen in vergelijking me...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
CLP introduceert pathogenen in de buik om een preklinisch model van sepsis te creëren. Bij het uitvoeren van CLP is het belangrijk om steriele omstandigheden te gebruiken om de interferentie van exogene bacteriën te elimineren en om nauwkeurige doseringen van anesthetica te gebruiken16. De drie technische aspecten van CLP die van invloed zijn op de ernst en repliceerbaarheid van het sepsismodel zijn het percentage van de ligumligum, de grootte van de naald die wordt gebruikt voor cecal-punctie en ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
Geen belangenconflicten aangegeven.
Dankbetuigingen
We bedanken professor Wang Wei en dokter Liu Shuai voor hun hulp bij de experimenten. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de Young Research Funding van het Xiangya Hospital, Central South University (nr. 2019Q10), van de National and Science Foundation van de provincie Hunan (nr. 2020JJ4902) en van de National Natural Science Foundation of China (nr. 82202394).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 21G naald | |||
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine | R&D Systems Inc | DY999 | |
| anti-CitH3 monoklonaal antilichaam | laboratorium zelf ontwikkeld | ||
| anti-CitH3 polyklonaal antilichaam | Abcam | ab5103 | |
| anti-konijn secundair antilichaam | Jackson ImmunoResearch | 111-035-003 | |
| C57BL/6 muizen | Xiangya School of Medicine, Central South University | ||
| Cl-amidine | Sigma Aldrich | SML2250 | |
| ontharingscrème | |||
| Dnase I | Sigma Aldrich | 11284932001 | |
| isofluraan | Sigma-Aldrich | 26675-46-7 | |
| ketoprofen | Sigma Aldrich | PHR1375 | |
| zijde hechtingen (4-0 & 6-0) | |||
| chirurgische instrumenten | |||
| YW3-56 | GLPBIO | GC48263 |
Referenties
- Singer, M., et al. The third international consensus definitions for sepsis and septic shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 801-810 (2016).
- Shankar-Hari, M., et al. Developing a new definition and assessing new clinical criteria for septic shock: For the Third International Consensus Definitions for Sepsis and Septic Shock (Sepsis-3). JAMA. 315 (8), 775-787 (2016).
- Fleischmann-Struzek, C., et al. Incidence and mortality of hospital- and ICU-treated sepsis: results from an updated and expanded systematic review and meta-analysis. Intensive Care Medicine. 46 (8), 1552-1562 (2020).
- Evans, L., et al. Surviving sepsis campaign: international guidelines for management of sepsis and septic shock 2021. Intensive Care Medicine. 47 (11), 1181-1247 (2021).
- Hughes, J. A., Cabilan, C. J., Williams, J., Ray, M., Coyer, F. The effectiveness of interventions to reduce peripheral blood culture contamination in acute care: a systematic review protocol. Systematic Reviews. 7 (1), 216(2018).
- Kibe, S., Adams, K., Barlow, G. Diagnostic and prognostic biomarkers of sepsis in critical care. The Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 66, 33-40 (2011).
- Dejager, L., Pinheiro, I., Dejonckheere, E., Libert, C. Cecal ligation and puncture: the gold standard model for polymicrobial sepsis. Trends in Microbiology. 19 (4), 198-208 (2011).
- Hotchkiss, R., Karl, I. The pathophysiology and treatment of sepsis. The New England Journal of Medicine. 348 (2), 138-150 (2003).
- Madhi, R., Rahman, M., Taha, D., Morgelin, M., Thorlacius, H. Targeting peptidylarginine deiminase reduces neutrophil extracellular trap formation and tissue injury in severe acute pancreatitis. Journal of Cellular Physiology. 234 (7), 11850-11860 (2019).
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Liang, Y., et al. Inhibition of peptidylarginine deiminase alleviates LPS-induced pulmonary dysfunction and improves survival in a mouse model of lethal endotoxemia. European Journal of Pharmacology. 833, 432-440 (2018).
- Deng, Q., et al. Citrullinated histone H3 as a therapeutic target for endotoxic shock in mice. Frontiers in Immunology. 10, 2957(2019).
- Li, Y. Q., et al. Identification of citrullinated histone H3 as a potential serum protein biomarker in a lethal model of lipopolysaccharide-induced shock. Surgery. 150 (3), 442-451 (2011).
- Pan, B., et al. CitH3: a reliable blood biomarker for diagnosis and treatment of endotoxic shock. Scientific Reports. 7 (1), 8972(2017).
- Park, Y., et al. An integrated plasmo-photoelectronic nanostructure biosensor detects an infection biomarker accompanying cell death in neutrophils. Small. 16 (1), 1905611(2020).
- Harikrishnan, V. S., Hansen, A. K., Abelson, K. S. P., Sorensen, D. B. A comparison of various methods of blood sampling in mice and rats: Effects on animal welfare. Laboratory Animals. 52 (3), 253-264 (2018).
- Brook, B., et al. A controlled mouse model for neonatal polymicrobial sepsis. Journal of Visualized Experiments. (143), e58574(2019).
- Rittirsch, D., Huber-Lang, M., Flierl, M., Ward, P. Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture. Nature Protocols. 4 (1), 31-36 (2009).
- Baker, C. C., Chaudry, I. H., Gaines, H. O., Baue, A. E. Evaluation of factors affecting mortality rate after sepsis in a murine cecal ligation and puncture model. Surgery. 94 (2), 331-335 (1983).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
