Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Driedimensionaal, serumvrij kweeksysteem voor traanklierstamcellen

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63585

⸱

2 juni 2022

 ,  , 
1MOE Key Laboratory of Gene Function and Regulation, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University

In dit artikel

Samenvatting

De driedimensionale, serumvrije kweekmethode voor volwassen traanklier (LG) stamcellen is goed ingeburgerd voor de inductie van LG organoïde vorming en differentiatie in acinaire of ductaal-achtige cellen.

Samenvatting

Traanklier (LG) stamcel-gebaseerde therapie is een veelbelovende strategie voor traanklieraandoeningen. Het ontbreken van een betrouwbare, serumvrije kweekmethode om een voldoende aantal LG-stamcellen (LGSC's) te verkrijgen, is echter een obstakel voor verder onderzoek en toepassing. De driedimensionale (3D), serumvrije kweekmethode voor LGSC's voor volwassen muizen is goed ingeburgerd en wordt hier getoond. De LGSC's kunnen continu worden gepasseerd en geïnduceerd om te differentiëren tot acinaire of ductaalachtige cellen.

Voor de LGSC primaire cultuur werden de PG's van 6-8 weken oude muizen verteerd met dispase, collagenase I en trypsine-EDTA. Een totaal van 1 × 104 enkele cellen werden gezaaid in 80 μL matrix gel-lacrimal gland stem cell medium (LGSCM) matrix in elke put van een 24-well plaat, vooraf gecoat met 20 μL matrix gel-LGSCM matrix. Het mengsel werd gestold na incubatie gedurende 20 minuten bij 37 °C en 600 μL LGSCM toegevoegd.

Voor LGSC-onderhoud werden LGSC's die gedurende 7 dagen werden gekweekt, uitgesplitst in afzonderlijke cellen door dispase en trypsine-EDTA. De afzonderlijke cellen werden geïmplanteerd en gekweekt volgens de methode die werd gebruikt in de primaire cultuur van LGSC. LGSC's kunnen meer dan 40 keer worden gepasseerd en continu stam/ voorlopercelmarkers Krt14, Krt5, P63 en nestin uitdrukken. LGSC's gekweekt in LGSCM hebben zelfvernieuwingscapaciteit en kunnen in vitro en in vivo differentiëren in acinaire of ductaalachtige cellen.

Inleiding

Traanklier stamcellen (LGSCs) onderhouden traanklier (LG) celvernieuwing en zijn de bron van acinaire en ductale cellen. Daarom wordt LGSC-transplantatie beschouwd als een alternatieve benadering voor de behandeling van ernstige ontstekingsschade en waterig-deficiënte droge ogenziekte (ADDED)1,2,3. Verschillende kweekmethoden zijn toegepast om LGSC's te verrijken. Tiwari et al. scheidden en kweekten primaire LG-cellen met behulp van collageen I en matrixgel aangevuld met verschillende groeifactoren; de LG-cellen konden echter niet continu worden gekweekt4. Met behulp van tweedimensionale (2D) cultuur werden van LG afgeleide stamcellen van muizen geïsoleerd door You et al.5 en Ackermann et al. 6, gevonden om de stam / voorlopercelmarkergenen, Oct4, Sox2, Nanog en nestin, tot expressie te brengen en kan worden gesubcultureerd. Er zijn echter geen duidelijke aanwijzingen dat deze cellen kunnen differentiëren in acinaire of ductale cellen, en er is geen transplantatie-experiment om het differentiatiepotentieel in vivo te verifiëren.

Onlangs werden c-kit + dim / EpCAM + / Sca1-/ CD34-/CD45-cellen geïsoleerd uit muis-PG's door flowcytometrie, bleken LG-voorlopercelmarkers tot expressie te brengen, zoals Pax6 en Runx1, en gedifferentieerd in kanalen en acini in vitro. Bij muizen met ADDED kan orthotopische injectie met deze cellen beschadigde PG's herstellen en de secretoire functie van PG's2 herstellen. Het aantal stamcellen dat door deze methode werd geïsoleerd, was echter klein en er zijn geen geschikte kweekomstandigheden voor het uitbreiden van de geïsoleerde LGSC's. Samenvattend moet een passend kweeksysteem worden opgezet om volwassen LGSC's effectief te isoleren en te kweken met stabiele en continue uitbreiding voor de studie van LGSC's bij de behandeling van ADDED.

Organoïden afgeleid van stamcellen of pluripotente stamcellen zijn een groep cellen die histologisch vergelijkbaar zijn met de verwante organen en hun eigen vernieuwing kunnen behouden. Nadat de darmorganoïde van de muis in 2009 met succes werd gekweekt door Sato et al.7, werden organoïden uit andere organen achtereenvolgens gekweekt, op basis van het kweeksysteem van Sato, zoals galblaas8, lever9, pancreas10, maag11, borst12, long13, prostaat14 en speekselklier15 . Vanwege het hoge aandeel volwassen stamcellen vóór celdifferentiatie in organoïde cultuur, wordt de driedimensionale (3D) organoïde kweekmethode als optimaal beschouwd voor de isolatie en kweek van volwassen stamcellen van LG.

Een LGSC-kweeksysteem voor volwassen muizen werd in deze studie opgezet door de 3D, serumvrije kweekmethode te optimaliseren. Het is bewezen dat de LGSC's gekweekt uit zowel normale als TOEGEVOEGDE muizen een stabiel vermogen tot zelfvernieuwing en proliferatie vertoonden. Na transplantatie in de ADD-muis-PG's koloniseerden LGSCs de aangetaste PG's en verbeterden ze de traanproductie. Bovendien werden rode fluorescerende LGSC's geïsoleerd uit ROSA26mT/mG-muizen en gekweekt. Dit werk biedt een betrouwbare referentie voor LGSC-verrijking in vitro en LGSC-autograft in klinische toepassing voor TOEGEVOEGDE therapie.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle experimenten in dit protocol volgden de richtlijnen voor dierverzorging van de Ethische Commissie voor Dierproeven van Sun Yat-sen University. Alle celgerelateerde bewerkingen moeten worden uitgevoerd op de ultraschone werkbank in de celoperatiekamer. Alle bewerkingen met xyleen moeten worden uitgevoerd in zuurkasten.

1. LGSC primaire cultuur

  1. LG isolatie
    1. Verkrijg een 6-8 weken oude BALB / c mannelijke muis en snijd de huid achter het oor om de LG en het bindweefsel eromheen bloot te leggen. Pel het bindweefsel af door stompe dissectie met behulp van een pincet en verwijder de LG.
    2. Spoel de PG's tweemaal met 4 ml steriele 10 mM PBS-oplossing om bloed in een schaal van 6 cm te verwijderen. Dompel de PG's onder in een schaal van 6 cm met 4 ml 75% ethanol gedurende 10 s en spoel tweemaal onmiddellijk met 10 mM PBS.
  2. Verkrijg enkele cellen van LG
    1. Gebruik DE HEPES-bufferoplossing (50 mM HEPES/KOH, pH 7,4; 150 mM NaCl in ultrapuur water) om 25 U/ml dispase te bereiden. Bereid de 0,1% collagenase I oplossing met ultrapuur water.
    2. Snijd de PG's in kleine fragmenten (ongeveer 1 mm3), breng ze over naar een steriele centrifugebuis van 15 ml en behandel de weefsels met 500 μL 25 U/ml dispase en 500 μL 0,1% collagenase I gedurende 1 uur bij 37 °C.
    3. Gebruik 10 mM PBS om trypsine-EDTA-oplossing te bereiden (0,05 g/L trypsine, 0,04 g/L EDTA). Behandel de LG-fragmenten uit stap 1.2.2 met 1 ml 0,05% trypsine-EDTA gedurende 10 minuten bij 37 °C en dissociëer de fragmenten in afzonderlijke cellen door herhaaldelijk te pipetteren.
    4. Filtreer de suspensie door een filter van 70 μm, vang het filtraat op in een steriele centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 150 × g .
    5. Verwijder na centrifugatie het supernatant, voeg 10 ml 10 mM PBS toe om de celpellet te wassen en centrifugeer de suspensie.
    6. Herhaal stap 1.2.5, verwijder het supernatant en voeg 1 ml DMEM/F12 (1:1 mengsel van Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium en Ham's F-12) toe om de celpellets te resuspenderen.
  3. LGSC primaire cultuur
    1. Bereid het traanklierstamcelmedium (LGSCM) voor dat DMEM / F12, 1x N2-supplement, 1x B27-supplement, 2 mM glutaminevervanger, 0,1 mM NEAAs (niet-essentiële aminozuren), 50 ng / ml murine epidermale groeifactor (EGF), 100 ng / ml fibroblastgroeifactor 10 (FGF10), 10 ng / ml Wnt3A en 10 μM Y-27632 (ROCK-remmer) bevat.
    2. Voeg 20 μL matrixgel-LGSCM matrix (matrixgel: LGSCM = 1:1) toe aan het midden van de put van een 24-well plaat. Gebruik een pipetpunt om deze uit te breiden tot een cirkel (diameter 6-8 mm) en incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij 37 °C om de put voor te coaten.
    3. Gebruik een celteller om het celnummer te bepalen en voeg 40 μL LGSCM met in totaal 1 × 104 cellen toe aan 40 μL van de matrixgel. Meng ze voorzichtig met een pipet om een matrixgel-LGSCM mengsel te verkrijgen (matrix gel: LGSCM= 1:1).
    4. Gebruik een pipet om voorzichtig 80 μL van het mengsel over het voorgecoate gebied in elk putje van de 24-wellsplaat te laten vallen in stap 1.3.2.
    5. Incubeer het mengsel gedurende 20 minuten bij 37 °C en voeg 600 μL LGSCM toe.
    6. Verander het cultuurmedium in elke put eens in de twee dagen. Zoek na 7 dagen cultuur naar LGSC-bollen met een diameter van 100-300 μm onder de omgekeerde microscoop (oculair: 10x, objectief: 4x).
      OPMERKING: LGSC's kunnen in totaal meer dan 14 dagen worden gekweekt.
  4. Isoleer en kweek primaire LGSC's van ROSA26mT/mG muizen en DED muizen (NOD/ShiLtJ) volgens de hierboven beschreven stappen.

2. LGSC onderhoud en doorgang

  1. Haal het cultuurmedium goed uit de bolcultuur.
  2. Desaggregatie van de LGSC-bollen die gedurende 7 dagen zijn gekweekt door incubatie in 20 μL van 10 U/ml dispase en 100 μL van 10 mM PBS gedurende 30 minuten bij 37 °C.
  3. Breng de suspensie over in een centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 4 minuten op 150 × g . Verwijder het supernatant.
  4. Behandel de bollen met 1 ml 0,05% trypsine-EDTA gedurende 5 minuten bij 37 °C. Voeg 1 ml 0,05% trypsineremmer (TI) en pipet herhaaldelijk toe om het trypsine te neutraliseren en de bolletjes in afzonderlijke cellen te dissociëren.
  5. Centrifugeer op 150 × g gedurende 5 minuten en verwijder het supernatant om LGSC's in de pellet te verkrijgen. Voeg 1 ml LGSCM toe om de LGSC-pellet te resuspenderen.
  6. Plaats de afzonderlijke cellen zoals beschreven in stap 1.3.1 tot en met 1.3.6.

3. LGSC differentiatie

  1. Procedure 1: Verleng de kweektijd van LGSC's van 7 naar 14 dagen met het LGSC-kweeksysteem voor willekeurige differentiatie.
  2. Procedure 2: Verander de verhouding van het matrixgel-LGSCM-mengsel van 1:1 naar 1:2 aan het begin van de LGSC-cultuur voor de differentiatie van kanaalcellen. Zaai de LGSC's gedurende 14 dagen in de matrix voor inductie (zie stap 1.3).
  3. Procedure 3: Vervang na passage de LGSCM door het LGSCM-10% foetale runderserum (FBS) mengsel voor de differentiatie van acinaire cellen. Induceer differentiatie gedurende 14 dagen.

4. LG weefsel dehydratie

  1. Verkrijg LG-weefsels (stap 1.1.1) en spoel de PG's gedurende 2 minuten af met 4 ml steriele 10 mM PBS-oplossing in een schaal van 6 cm. Verplaats de weefsels naar 10% formalineoplossing voor fixatie gedurende 24 uur.
  2. Spoel de vaste weefsels met 10 mM PBS gedurende 2 minuten om het formaline te verwijderen en breng het weefsel over naar een weefselinsluitdoos. Plaats de insluitdoos in de automatische dehydrator.
  3. Gebruik de automatische dehydrator om de weefsels als volgt uit te drogen: 70% ethanol, 2 uur; 80% ethanol, 2 uur; 90% ethanol, 30 min; 95% ethanol, 30 min; absolute ethanol, 30min; absolute ethanol, 2 uur; absolute ethanol: 100% xyleen (1: 1) mengsel, 30 min; 100% xyleen, 30 min; 100% xyleen, 2 uur; 100% xyleen: paraffine (1: 1) mengsel, 30 min; paraffine, 2 uur; paraffine,3 u.

5. LG organoïde / bol uitdroging

  1. Verkrijg LG organoïden/bolletjes (stappen 2.1-2.3) in een microcentrifugebuis van 1,5 ml en spoel de LG-organoïden/-bollen gedurende 2 minuten af met 1 ml steriele PBS-oplossing van 10 mM.
  2. Centrifugeer op 100 × g gedurende 1 min en verwijder het supernatant.
  3. Bereid de 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing als volgt: voeg 20 g PFA toe aan een mengsel van 400 ml 10 mM PBS en 40 μL 1 M NaOH, schud de oplossing goed en verwarm deze gedurende 2 uur in een waterbad van 65 °C totdat de PFA volledig is opgelost. Gebruik na afkoeling tot kamertemperatuur 10 mM PBS om het volume op te maken tot 500 ml en bewaar het bij 4 °C.
  4. Voeg 1 ml 4% PFA toe aan de microcentrifugebuis met de organoïde/bolpellet en plaats de buis gedurende ten minste 24 uur in een koelkast van 4 °C voor fixatie.
  5. Na fixatie centrifugeer u gedurende 1 minuut op 100 × g en verwijdert u het supernatant. Voeg 1 ml 10 mM PBS toe aan de microcentrifugebuis met de organoïde/bolpellet en meng voorzichtig door gedurende 2 minuten te pipetteren om de PFA af te spoelen. Herhaal deze stap twee keer.
  6. Centrifugeer op 100 × g gedurende 1 min en verwijder het supernatant.
  7. Warmte-inbedding hydrogel om op te lossen en voeg 50-60 μL insluitende hydrogel toe aan de organoïde / bolpellet en meng. Pipetteer het mengsel op de parafilm in de vorm van een druppel en wacht 5 minuten tot het bij kamertemperatuur stolt.
  8. Droog de gel met de organoïden/bolletjes in een nieuwe microcentrifugebuis van 1,5 ml als volgt uit.
    1. Voeg 1 ml 50% ethanol toe aan de buis, wacht 30 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de vloeistof uit de buis door te pipetteren. Herhaal deze stap door achtereenvolgens de ethanolconcentratie te wijzigen in 70%, 80%, 90%, 95%.
    2. Voeg 1 ml absolute ethanol toe aan de buis, wacht 30 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de vloeistof uit de buis door te pipetteren. Herhaal deze stap.
    3. Voeg 1 ml van een mengsel van 0,5 ml absolute ethanol en 0,5 ml 100% xyleen toe aan de buis, wacht 30 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de vloeistof uit de buis door te pipetteren.
    4. Voeg 1 ml 100% xyleen toe aan de buis, wacht 30 minuten bij kamertemperatuur en verwijder de vloeistof uit de buis door te pipetteren. Herhaal deze stap.
      OPMERKING: Stap 5.8.5-5.8.6 moet worden uitgevoerd in een metalen bad bij 65 °C.
    5. Voeg 1 ml van een mengsel van 0,5 ml paraffine en 0,5 ml 100% xyleen toe aan de buis, wacht 30 minuten bij 65 °C en verwijder de vloeistof uit de buis door te pipetteren.
    6. Voeg 1 ml paraffine toe aan de buis, wacht 30 minuten bij 65 °C en verwijder de vloeistof uit de buis door te pipetteren. Herhaal deze stap en verleng de verwerkingstijd tot 1 uur.

6. Paraffine inbedding en sectie

  1. Paraffine inbedding
    1. Voordat u insluit, schakelt u de insluitmachine in en verwarmt u deze voor om de paraffinewas in de paraffinetank te smelten.
    2. Plaats het gedehydrateerde weefsel of de organoïde/bolgel in de groef van de insluitijzeren doos en plaats de ijzeren doos in de paraffine van de insluitmachine.
    3. Verwijder het plastic deksel en plaats de plastic insluitdoos op de ijzeren doos om deze te bedekken. Verplaats de insluitijzeren doos naar een koeltafel.
    4. Nadat de paraffine in blokken in de inbouwdoos is gecondenseerd, haalt u deze uit de ijzeren doos en snijdt u deze direct in plakjes of bewaart u deze tijdelijk in een koelkast van 4 °C.
  2. Paraffine sectie
    1. Voordat u paraffine snijdt, monteer de paraffinesnijmachine voor en voeg gedestilleerd water toe aan de gootsteen van de snijmachine voor het voorverwarmen. Begin met snijden wanneer de watertemperatuur stijgt tot 42 °C.
    2. Bevestig het monster op de monstersleuf van de paraffinesnijder. Stel de sectiedikte tijdens het snijden in op 5 μm.
    3. Sectie het monster continu. Bevestig het volledig betegelde gedeelte op de antislipschuif in de snijtank.
    4. Plaats na het snijden de met monsterweefsel aangebrachte dia's in een biochemische incubator bij 37 °C om gedurende 24 uur te drogen. Bewaar de dia's tijdelijk in de koelkast bij 4 °C.

7. Hematoxyline en eosine kleuring

  1. Smelt de paraffinesecties bij 60 °C gedurende 30 minuten, week de secties gedurende 15 minuten in 100% xyleen en herhaal.
  2. Behandel de secties met absolute ethanol op een shaker gedurende 5 minuten.
  3. Behandel de secties met 90% ethanol, 80% ethanol en 70% ethanol op een shaker, elk gedurende 3 minuten.
  4. Behandel de secties met gedeïoniseerd water op een shaker gedurende 5 minuten en 2 minuten achter elkaar.
  5. Bevlek de secties op een natte doos gedurende 5 minuten met 4 mg / ml hematoxyline-oplossing. Spoel de secties gedurende 10 minuten af in stromend water.
  6. Roer de secties eerst op een shaker met gedeïoniseerd water gedurende 2 minuten en vervolgens met 0,5% -1% eosine gedurende 1 min.
  7. Roer de secties met 70% ethanol, 80% ethanol en 90% ethanol op een shaker gedurende 3 minuten (elk) achter elkaar. Roer de secties met absolute ethanol op een shaker gedurende 5 minuten.
  8. Week de secties in 100% xyleen gedurende 15 minuten en herhaal het weken.
  9. Gebruik een pipet of druppelaar om 3-4 druppels neutrale balsem aan de dia toe te voegen en bedek deze langzaam met een afdekplaat. Droog de dia's aan de lucht bij kamertemperatuur.

8. Immunohistochemische (IHC) kleuring

  1. Smelt de paraffinesecties op 60 °C gedurende 30 minuten, week de secties gedurende 100 minuten in 100% xyleen en herhaal deze stap tweemaal.
  2. Roer de secties eerst op een shaker met absolute ethanol, 90% ethanol en 80% ethanol gedurende 2 minuten (elk), achtereenvolgens, en vervolgens met gedeïoniseerd water gedurende 3 minuten. Herhaal de agitatie met gedeïoniseerd water tweemaal.
  3. Roer de secties eerst op een shaker met een mengsel van 20 ml 30% H2O2 en 180 ml methanol gedurende 10 minuten en vervolgens gedeïoniseerd water gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap drie keer.
  4. Breng de secties over in voorgekookte citroenzuurbuffer (1 L gedeïoniseerd water met 3 g Na3C6H5O7,2H 2O en 0,4 g C6H8O7, pH 6,0), magnetron gedurende 10 minuten om ze op subkritisch kookpunt te houden en koel gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Roer de secties met gedeïoniseerd water op een shaker gedurende 5 minuten. Herhaal deze stap drie keer.
  5. Roer de secties met 10 mM PBS op een shaker gedurende 5 minuten en herhaal deze stap drie keer. Omsluit het weefselgebied op de natte doos met een waterafstotende marker, voeg een druppel kant-en-klaar niet-immuun geitenserum toe om de monsters te bedekken en plaats ze gedurende 1 uur op kamertemperatuur.
  6. Verwijder het serum, voeg primair antilichaam toe aan de monsters (zie de tabel met materialen) en incubeer ze een nacht bij 4 °C. Verwijder het primaire antilichaam, roer de secties met 10 mM PBS op een shaker gedurende 5 minuten en herhaal deze agitatiestap met 10 mM PBS drie keer.
  7. Voeg secundair antilichaam toe (zie de tabel met materialen) om de monsters te bedekken en incubeer ze op een natte doos gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Roer de secties met 10 mM PBS op een shaker gedurende 5 minuten en herhaal de agitatiestap drie keer.
  8. Voeg vers bereide 0,03-0,05% 3,3'-diaminobenzidine (DAB) oplossing toe om de monsters op de natte doos en vlek gedurende 30-90 s te bedekken. Spoel de secties af met stromend water gedurende 10 min.
    OPMERKING: Controleer de kleuringstijd door te observeren onder een lichtmicroscoop totdat de gele kleur verschijnt.
  9. Voeg 4 mg / ml hematoxyline-oplossing toe om de monsters te bedekken, bevlek gedurende 5 minuten op een natte doos en spoel de secties gedurende 10 minuten af met stromend water.
  10. Roer de secties op een shaker met 80% ethanol, 90% ethanol en absolute ethanol gedurende 2 minuten elk, achtereenvolgens, en week de secties in 100% xyleen gedurende 30 minuten.
  11. Gebruik een pipet of druppelaar om 3-4 druppels neutrale balsem aan de dia toe te voegen en bedek deze langzaam met een afdekplaat. Droog de dia's aan de lucht bij kamertemperatuur.

9. Globale immunofluorescentiekleuring van organoïden/bolletjes

OPMERKING: Verzamel de organoïden/bollen die zijn bevestigd met 4% PFA-oplossing in een microcentrifugebuis van 1,5 ml (zie stappen 5.1 tot 5.4). Voer de fluorescentielabeling als volgt uit.

  1. Droog de organoïden/bolletjes uit door 1 ml sucrose-oplossing aan de buis toe te voegen en deze een nacht in een koelkast bij 4 °C te incuberen.
  2. Voeg 100 μL PBST-oplossing (10 mM PBS-oplossing met 0,1% Triton X-100) toe aan de buis om de organoïden/bolletjes gedurende 5 minuten te spoelen, centrifugeer de buis op 100 × g gedurende 1 minuut en verzamel de pellet. Herhaal deze stap drie keer.
  3. Voeg 0,5-1 ml kant-en-klaar niet-immuun geitenserum toe aan de buis en sluit het gedurende 1 uur af bij kamertemperatuur. Centrifugeer de buis op 100 × g gedurende 1 min en vang de pellet op.
  4. Voeg enkele druppels verdund primair antilichaam toe om de pellet te bedekken en incubeer in een koelkast bij 4 °C gedurende 48 uur. Centrifugeer de buis op 100 × g gedurende 1 min en vang de pellet op.
  5. Herhaal stap 9.2.
  6. Voeg enkele druppels fluorescerend secundair antilichaam en 4',6-diamidino-2-fenyladool (DAPI) oplossing toe aan de buis om de pellet te bedekken en incubeer in een koelkast bij 4 °C gedurende 24 uur, waarbij licht wordt vermeden.
  7. Herhaal stap 9.2 en vermijd licht.
  8. Voeg 100 μL PBST-oplossing toe aan de buis en bewaar deze tijdelijk in een koelkast van 4 °C, uit de buurt van licht. Observeer en fotografeer de organoïden/bollen met behulp van de light-sheet scanning microscoop.

10. LGSC pLX-mCherry transfectie

OPMERKING: De productie van lentivirale deeltjes moet worden uitgevoerd in een bioveiligheidskast en een schone bank op BSL2-bioveiligheidsniveau.

  1. Kweek de lentivirus verpakkingscel 293T in een 6-well plaat met DMEM + 10% FBS bij 37 °C, 5% CO2 gedurende 3-5 dagen om 80% celconfluentie te bereiken.
  2. Transfecteer de lentivirusvector pLX-mCherry in LGSC's.
    OPMERKING: Reagensbereiding is geïndiceerd voor één put van een 6-wellsplaat.
    1. Bereid twee steriele centrifugebuizen van 1,5 ml en voeg 250 μL DMEM/F12 toe aan elke buis.
    2. Voeg 7,5 μL transfectiereagens toe aan één buis en meng het reagens grondig door te pipetteren.
    3. Voeg 2 μg pLX-mCherry plasmide zonder endotoxine en overeenkomend lentivirusverpakkingsplasmide toe aan een andere buis en voeg het transfectiereagens (2 μL/μg plasmide) toe.
    4. Meng de vloeistof in beide centrifugebuizen en laat de mengsels 5 minuten staan bij kamertemperatuur.
    5. Verwijder het kweekmedium van de 293T-cellen en voeg het mengsel uit stap 10.2.4 toe aan de 293T-cellen. Verander het kweekmedium naar verse DMEM + 10% FBS na 8 uur.
    6. Verzamel na 48 uur het virussupernatant voor de eerste keer en filter het door een filter van 0,45 μm. Verzamel na 72 uur het virussupernatant voor de tweede keer en filter het opnieuw door een filter van 0,45 μm.
      OPMERKING: Bewaar beide gefilterde supernatanten op ijs tot lentivirustransductie.
  3. Verkrijg de LGSC's van DED-muizen (NOD/ShiLtJ) (zie stap 1).
  4. Voeg 1 ml van het vooraf verzamelde pLX-mCherry lentivirus supernatant toe om de cellen te resuspenderen.
  5. Zet de centrifugebuis op een shaker in de CO2-incubator op 37 °C. Schud het op 100 tpm om het contact tussen het lentivirus en de cellen te maximaliseren. Na 8 uur centrifugeert u het mengsel gedurende 4 minuten op 250 × g en verwijdert u het supernatant.
  6. Voeg 1 ml DMEM/F12 toe om de celpellet te resuspenderen. Gebruik een celteller om het celnummer te bepalen en zaai in totaal 1 × 104 cellen in 100 μL matrixgel-LGSCM matrix (matrixgel: LGSCM = 1:1) in elke put van een 24-well plaat vooraf gecoat met 20 μL matrix gel-LGSCM matrix (zie stap 1.3.2).
  7. Na 7 dagen cultuur (zie stap 1) selecteert u bollen met rode fluorescentie onder een fluorescentiemicroscoop om de cultuur uit te breiden.

11. LGSC orthotopische transplantatie

OPMERKING: Alle chirurgische operaties worden uitgevoerd in een SPF-operatiekamer en alle chirurgische instrumenten worden gesteriliseerd.

  1. Verkrijg de LGSC-bollen van ROSA26mT/mG-muizen met rode fluorescentie (td-Tomato) of mCherry-transfectie gekweekt gedurende 7 dagen (zie stap 1).
  2. Koel een microcentrifugebuis van 1,5 ml met een 1:1 mengsel van matrixgel en DMEM/F12 voor gebruik af op ijs. Verwerk de LGSC-bollen in enkele cellen en resuspensieer de cellen met een dichtheid van 2 × 106 cellen / ml in de buis.
  3. Verdoof de NOD/ShiLtJ muizen door intraperitoneale injectie van pentobarbital natrium (50 mg/kg).
    OPMERKING: NOD / ShiLtJ-muis is een ideaal model met idiopathische TOEGEVOEGDE symptomen, waaronder verminderde scheursecretie, inflammatoire infiltratie en orbitale ulceratie.
  4. Gebruik na anesthesie zoutoplossing of vetzalf op de ogen om uitdroging te voorkomen en gebruik vervolgens een oogheelkundige schaar om een snede van 5-8 mm in de huid achter het oor (bij het oog) van de anesthetische muizen te maken om de PG's bloot te stellen.
    OPMERKING: Jodophor moet strikt worden gebruikt voor desinfectie rond de incisie.
  5. Injecteer 2 × 104 cellen in de LG aan de linkerkant en injecteer het mengsel zonder cellen (zie stap 11.2) in de LG aan de rechterkant als bedieningsorgaan.
  6. Herstel na injectie de PG's in hun oorspronkelijke positie met een oogheelkundige tang en hecht de wond. Voer de muizen gedurende 2 maanden en observeer het effect van de behandeling.
    OPMERKING: Het kooikussenmateriaal moet ook strikt worden gesteriliseerd na de operatie en het kussenmateriaal moet eenmaal per dag worden vervangen. Na het hechten van de wond kan tramadol selectief in de staartader van muizen worden geïnjecteerd met de standaarddosis van 2,5 mg / kg om analgesie te bereiken.
  7. Verdoof deze muizen 2 maanden na het experiment (zie stap 11.3). Film de symptomen van het oculaire gebied.
    1. Zoek tijdens anesthesie naar de volgende symptomen: nek- en ledemaatspierontspanning; diepe, langzame en gestage ademhaling; pupilvernauwing; corneareflex verdwijning.
    2. Houd tijdens anesthesie en operatie de lichaamstemperatuur van muizen op 37 °C. Voeg na de operatie geschikte antibiotica toe aan het drinkwater voor muizen om het risico op wondinfectie te verminderen. Laat de muizen niet onbeheerd achter totdat ze weer voldoende bij bewustzijn zijn gekomen om de sternale lighouding te behouden. Breng de muizen die een operatie hebben ondergaan niet terug naar het gezelschap van andere muizen totdat ze volledig zijn hersteld.
    3. Na het filmen van de symptomen van het oculaire gebied, opent u de ImageJ-software, klikt u op Bestand | Open | Selecties uit de vrije hand, houd de linkermuisknop ingedrukt en selecteer het gebied van orbitale ulceratie in de afbeelding. Klik op | analyseren Meet om het relatieve gebied van ulceratie te verkrijgen.
  8. Leg de fenolrode katoendraad gedurende 10 s op de laterale canthus van anesthetische muizen; meet en noteer de lengte van het verkleurde deel van de katoendraad. Euthanaseer de muizen door cervicale werveldislocatie na scheurmeting.
  9. Ontleed de muizen en verkrijg de PG's voor IHC-analyse.

12. RNA-isolatie

OPMERKING: Koel de centrifuge vóór het experiment voor op 4 °C en garandeer dat alle reagentia en verbruiksartikelen vrij zijn van RNAse-verontreiniging.

  1. Verzamel LGSC's of LG-fragmenten in een microcentrifugebuis. Voeg 1 ml cellysebuffer toe en laat de cellen of weefsels volledig lyseren door vortexoscillatie.
  2. Voeg 0,2 ml chloroform toe en laat het 10 minuten op kamertemperatuur staan na vortexoscillatie gedurende 1 minuut. Centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4 °C, 12.000 × g.
    OPMERKING: Na centrifugatie wordt de vloeistof verdeeld in drie lagen en bevindt het RNA zich in de bovenste transparante waterige fase.
  3. Pipetteer voorzichtig de bovenste transparante waterige fase en breng deze over naar een nieuwe RNAse-vrije centrifugebuis van 1,5 ml.
  4. Voeg een gelijk volume isopropylalcohol toe en meng voorzichtig. Laat het mengsel 10 min op kamertemperatuur staan en centrifugeer vervolgens gedurende 15 minuten bij 4 °C, 12.000 × g.
  5. Verwijder het supernatant en voeg 1 ml 75% ethanol toe. Keer de buis om om de pellet te wassen en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 4 °C, 7.500 × g. Herhaal deze stap.
  6. Verwijder het supernatant voorzichtig en plaats de centrifugebuis in de ultraschone werkbank om deze ongeveer 20 minuten te drogen.
    OPMERKING: Ga verder met de volgende stap wanneer de witte pellet doorschijnend wordt. Voer alle bewerkingen op ijs uit.
  7. Voeg 20 μL RNAse-vrij water toe om de pellet volledig op te lossen. Meet de RNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer (zie de tabel met materialen) en bewaar de RNA-oplossing bij -80 °C.

13. PCR

  1. Reverse transcriptie reactie
    1. Voeg 1 μg totaal RNA toe (bereken het volume toegevoegde RNA-oplossing op basis van de concentratie van de RNA-oplossing) aan de PCR-reactiebuis en incubeer bij 65 °C gedurende 5 minuten voor denaturatie.
    2. Zet het 1 min in de ijskast en voeg vervolgens enzymvrij water toe tot het totale volume 12 μL bereikt. Voeg 4 μL 4x DNA Master Mix toe en incubeer het bij 37 °C gedurende 5 min.
    3. Zet de tube op ijs, voeg 4 μL 5x RT Master Mix toe en meng het voorzichtig. Stel de volgende PCR-instellingen in: 37 °C gedurende 15 min, 50 °C gedurende 5 min, 98 °C gedurende 5 min, 4 °C gedurende 1 min.
    4. Bewaar het bij -20 °C of ga verder met de volgende stap nadat de reverse transcriptiereactie is voltooid.
  2. PCR-reactie
    1. Bereid de PCR-reactie in de PCR-buis als volgt voor: 14,1 μL enzymvrij water, 2 μL dNTP, 2 μL 10x Buffer, 0,8 μL Primer (10 μM, 0,4 μL Forward Primer en 0,4 μL Reverse Primer, zie de Materiaaltabel), 1 μL reverse transcription cDNA (zie stap 13.1) en 0,1 μL Taq-enzym.
    2. Plaats de voorbereide PCR-reactie in het PCR-apparaat voor PCR. Raadpleeg de instructies van de Taq-enzymkit voor de PCR-procedure (zie de materiaaltabel).
  3. Agarose gel elektroforese
    1. Gebruik een analytische balans om 242 g Tris en 37,2 g Na 2 EDTA·2H2O te wegen en voeg deze toe aan een bekerglas van 1 L. Voeg ~ 800 ml gedeïoniseerd water en 57,1 ml ijsazijn toe aan het bekerglas, meng goed, voeg gedeïoniseerd water toe aan 1 l om 50x TAE-buffer te verkrijgen en bewaar het bij kamertemperatuur.
      OPMERKING: Verdun 50x TAE buffer met gedeïoniseerd water voor gebruik.
    2. Gebruik een analytische balans om 1,2 g agarose te wegen en voeg deze toe aan een erlenmeyer met 80 ml 1x TAE-buffer. Verwarm het herhaaldelijk in de magnetron tot het volledig is opgelost.
    3. Koel de kolf onder stromend leidingwater tot de temperatuur van de oplossing daalt tot 60 °C. Voeg 8 μL nucleïnezuurvlek toe, giet de oplossing in de gelatinisatietank na goed mengen, plaats de kam en laat deze 30 minuten op kamertemperatuur staan.
    4. Trek de kam eruit en laad de PCR-producten in de bereide agarose-gel. Voer elektroforese uit bij 120 V gedurende 30 minuten.
    5. Plaats de gel in het ECL Gel beeldvormingssysteem en fotografeer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

3D, serumvrij kweeksysteem opzetten
In deze studie werd LGSCM met EGF, Wnt3A, FGF10 en Y-27632 voor muis LGSC's ontwikkeld en werden LGSC's met succes geïsoleerd en gekweekt door een 3D-kweekmethode (figuur 1A). Een succesvol 3D, serumvrij kweeksysteem van LGSC's van C57BL/6 muizen, NOD/ShiLtJ muizen, BALB/c muizen en ROSA26mT/mG muizen is vastgesteld met behulp van deze methode16. Voor een mannelijke muis werden 1,5-2 × 106 c...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Er zijn gevestigde methoden voor de isolatie en in vitro kweek van traanstamcellen voor traanstamcelkweek en LG-letselherstel. Shatos et al.17 en Ackermannet al. 6 succesvol gekweekte en subculturele traanstamcellen van ratten en muizen door respectievelijk 2D-kweekmethoden, waardoor het mogelijk is om traanstamcellen te transplanteren voor de behandeling van ADDED. Studies op stamcellen18 en mesenchymale stamcellen

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door een subsidie van de National Natural Science Foundation of China (nr. 31871413) en twee programma's van Guangdong Science and Technology (2017B020230002 en 2016B030231001). We zijn de onderzoekers die ons hebben geholpen tijdens het onderzoek en de medewerkers die in het dierencentrum werken echt dankbaar voor hun steun in de dierverzorging.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dier(Muis)
Bal B/CModel Animal Research Center of Nanjing University
C57 BL/6JLaboratory Animal Center of Sun Yat-sen University
NOD/ShiLtJModel Animal Research Center of Nanjing University
ROSA26mT/mGModel Animal Research Center of Nanjing University
Apparatuur
Analytische weegschaalSartorius
Automatische ontwateraarThermo
Tellkamer voor bloedtellingBLAU
Cell CounterCountStar
CO2 incubator met constante temperatuurThermo
ECL Gel imaging systeemGE healthcare
Elektrisch bad voor waterbadYiheng Technology
Elektroforese apparaatBioRad
Fluorescentie kwantitatieve PCR-instrumentRoche
Ingevroren weefselsnijderLecia
Horizontale centrifugeCENCE
Omgekeerde fluorescentiemicroscoopNikon
Omgekeerde microscoopOlympus
Laser lamellaire scannen micrograafCarl Zeiss
Vloeibare stikstof containerThermo
Lage temperatuur hoge snelheid centrifugeEppendorf
MicropipettorGilson
MicrogolfovenPanasonic
Nanodrop ultraviolet spectrofotometerThermomeet RNA concentratie
Paraffine snijmachineThermo
PCR VersterkerEppendorf
pH waarde testerSartorius
4 °C KoelkastHaier
Thermostaat cultuur oscillatorZHICHENG
Weefsel paraffine inbedding instrumentThermo
 -80°C Ultra-lage temperatuur koelkastThermo
 -20°C Ultra-lage temperatuur koelkastThermo
Ultra zuiver water zuiveringssysteemELGA
Reagens
Dierexperiment
HCGSigma9002-61-3
PMSGSigma14158-65-7
Pentobarbital NatriumSigma57-33-0
Celcultuur
B27Gibco17504044
Collageenase IGibco17018029
DispaseBD354235
DMEMSigmaD6429
DMEM/F12SigmaD0697
DMSOSigma67-68-5
EDTASangon BiotechA500895
Foetale RundeserumGibco04-001-1ACS
GlutaMaxGibco35050087
Human FGF10PeproTech100-26
Matrigel (Matrix gel)BD356231
Murine NogginPeproTech250-38
Murine Wnt3APeproTech315-20
Murine EGFPeproTech315-09
NEAAGibco11140050
N2Gibco17502048
R-spondin 1PeproTech120-38
Trypsine Inhibitor (TI)SigmaT6522Afkomstig van Glycine max; kan trypsine, chymotrypsine en plasminase in mindere mate remmen. Een mg zal 1,0-3,0 mg trypsine remmen.
TrypsineSigma T4799
Y-27632SelleckS1049
HE kleuring & Immunokleuring
Alexa Fluor 488 donkey anti-Muis IgGThermoA-21202Gebruikte verdunning: IHC) 2 μg/mL, (IF) 0,2 μg/mL
Alexa Fluor 488 donkey anti-Konijn IgGThermoA-21206Gebruikte verdunning: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Muis IgGThermoA-10037Gebruikte verdunning: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Alexa Fluor 568 donkey anti-Konijn IgGThermoA-10042Gebruikte verdunning: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 4 μg/mL
Anti-AQP5 konijn antilichaamAbcamab104751Gebruikte verdunning: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 0,1 μg/mL
Anti-E-cadherine Rat antilichaamAbcamab11512Gebruikte verdunning: (IF)  5 μg/mL
Anti-Keratin14 konijn antilichaamAbcamab181595Gebruikte verdunning: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 2 μg/mL
Anti-Ki67 konijn antilichaamAbcamab15580Gebruikte verdunning: (IHC) 1 μg/mL, (IF) 1 μg/mL
Anti-mCherry muis antilichaamAbcamab125096Gebruikte verdunning: (IHC) 2 μg/mL, (IF) 2 μg/mL

Referenties

  1. Zoukhri, D., Macari, E., Kublin, C. L. A single injection of interleukin-1 induces reversible aqueous tear deficiency, lacrimal gland inflammation, and acinar and ductal cell proliferation. Experimental Eye Research. 84 (5), 894-904 (2007).
  2. Gromova, A., et al. Lacrimal gland repair using progenitor cells. Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 88-98 (2016).
  3. Buzhor, E., et al. Cell-based therapy approaches: the hope for incurable diseases. Regenerative Medicine. 9 (5), 649-672 (2014).
  4. Tiwari, S., et al. Establishing human lacrimal gland cultures with secretory function. PLoS One. 7 (1), 29458(2012).
  5. You, S., Kublin, C. L., Avidan, O., Miyasaki, D., Zoukhri, D. Isolation and propagation of mesenchymal stem cells from the lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (5), 2087-2094 (2011).
  6. Ackermann, P., et al. Isolation and investigation of presumptive murine lacrimal gland stem cells. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (8), 4350-4363 (2015).
  7. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
  8. Lugli, N., et al. R-spondin 1 and noggin facilitate expansion of resident stem cells from non-damaged gallbladders. EMBO Reports. 17 (5), 769-779 (2016).
  9. Huch, M., et al. Long-term culture of genome-stable bipotent stem cells from adult human liver. Cell. 160 (1), 299-312 (2015).
  10. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1), 324-338 (2015).
  11. Barker, N., et al. Lgr5+(ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6 (1), 25-36 (2010).
  12. Linnemann, J. R., et al. Quantification of regenerative potential in primary human mammary epithelial cells. Development. 142 (18), 3239-3251 (2015).
  13. Rock, J. R., et al. Basal cells as stem cells of the mouse trachea and human airway epithelium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (31), 12771-12775 (2009).
  14. Chua, C. W., et al. Single luminal epithelial progenitors can generate prostate organoids in culture. Nature Cell Biology. 16 (1), 951-961 (2014).
  15. Maimets, M., et al. Long-term in vitro expansion of salivary gland stem cells driven by Wnt signals. Stem Cell Reports. 6 (1), 150-162 (2016).
  16. Xiao, S., Zhang, Y. Establishment of long-term serum-free culture for lacrimal gland stem cells aiming at lacrimal gland repair. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 20(2020).
  17. Shatos, M. A., Haugaard-Kedstrom, L., Hodges, R. R., Dartt, D. A. Isolation and characterization of progenitor cells in uninjured, adult rat lacrimal gland. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 53 (6), 2749-2759 (2012).
  18. Mishima, K., et al. Transplantation of side population cells restores the function of damaged exocrine glands through clusterin. Stem Cells. 30 (9), 1925-1937 (2012).
  19. Aluri, H. S., et al. Delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells improves tear production in a mouse model of sjögren's syndrome. Stem Cells International. 2017, 1-10 (2017).
  20. Dietrich, J., Schrader, S. Towards lacrimal gland regeneration: current concepts and experimental approaches. Current Eye Research. 45 (3), 230-240 (2020).
  21. Sato, T., Clevers, H. SnapShot: growing organoids from stem cells. Cell. 161 (7), 1700(2015).
  22. Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15 (5), 378-386 (2005).
  23. Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. Basement membrane matrix (BME) has multiple uses with stem cells. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (1), 163-169 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Driedimensionale kweekstamceldifferentiatieacinaire celinductieductale celdifferentiatiematrixgelkweekstamcelmarkersisolatie van primaire cellenexpansie van stamcellen
Driedimensionaal, serumvrij kweeksysteem voor traanklierstamcellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.