Methodenartikel

Voorbereiding en karakterisering van op grafeen gebaseerde 3D biohybride hydrogel bioink voor perifere neuro-engineering

DOI:

10.3791/63622

⸱

16 mei 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Vocational School of Health Services, Istinye University, 2Chemical Metallurgy Faculty, Yildiz Technical University, 3Faculty of Medicine, Department of Histology & Embryology, Istinye University, 43D Bioprinting Design & Prototyping R&D Center, Istinye University, 5Stem Cell, and Tissue Engineering R&D Center, Istinye University, 6Vocational School of Health Services, Altinbas University, 7The V. Akhundov National Scientific Research Medical Prophylactic Institute, 8Center for Stem Cells and Regenerative Medicine (LivMedCell), Liv Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit manuscript demonstreren we de bereiding van een biohybride hydrogel bioink met grafeen voor gebruik in perifere tissue engineering. Met behulp van dit 3D-biohybride materiaal wordt het neurale differentiatieprotocol van stamcellen uitgevoerd. Dit kan een belangrijke stap zijn om vergelijkbare biomaterialen naar de kliniek te brengen.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Perifere neuropathieën kunnen optreden als gevolg van axonale schade en soms als gevolg van demyeliniserende ziekten. Perifere zenuwbeschadiging is een wereldwijd probleem dat voorkomt bij 1,5% -5% van de spoedeisende hulppatiënten en kan leiden tot aanzienlijk banenverlies. Tegenwoordig zijn op tissue engineering gebaseerde benaderingen, bestaande uit steigers, geschikte cellijnen en biosignalen, meer toepasbaar geworden met de ontwikkeling van driedimensionale (3D) bioprinttechnologieën. De combinatie van verschillende hydrogel-biomaterialen met stamcellen, exosomen of bio-signalerende moleculen wordt vaak bestudeerd om de bestaande problemen bij perifere zenuwregeneratie te overwinnen. Dienovereenkomstig heeft de productie van injecteerbare systemen, zoals hydrogels, of implanteerbare buisstructuren gevormd door verschillende bioprintmethoden aan belang gewonnen in perifere neuro-engineering. Onder normale omstandigheden zijn stamcellen de regeneratieve cellen van het lichaam en hun aantal en functies nemen niet af met de tijd om hun populaties te beschermen; Dit zijn geen gespecialiseerde cellen, maar kunnen differentiëren bij passende stimulatie als reactie op letsel. Het stamcelsysteem staat onder invloed van zijn micro-omgeving, de stamcelniche genaamd. Bij perifere zenuwletsels, vooral bij neurotmese, kan deze micro-omgeving niet volledig worden gered, zelfs niet na het chirurgisch samenbinden van doorgesneden zenuwuiteinden. De benadering van samengestelde biomaterialen en gecombineerde cellulaire therapieën verhoogt de functionaliteit en toepasbaarheid van materialen in termen van verschillende eigenschappen zoals biologische afbreekbaarheid, biocompatibiliteit en verwerkbaarheid. Dienovereenkomstig heeft deze studie tot doel de bereiding en het gebruik van op grafeen gebaseerde biohybride hydrogelpatronen aan te tonen en de differentiatie-efficiëntie van stamcellen in zenuwcellen te onderzoeken, wat een effectieve oplossing kan zijn bij zenuwregeneratie.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het zenuwstelsel, het mechanisme dat de interne structuur van het organisme en de omgeving overbrugt, is verdeeld in twee delen: het centrale en perifere zenuwstelsel. Perifere zenuwbeschadiging is een wereldwijd probleem dat 1,5% -5% van de patiënten vormt die zich op de afdeling spoedeisende hulp presenteren en zich ontwikkelt als gevolg van verschillende trauma's, wat leidt tot aanzienlijk baanverlies 1,2,3.

Tegenwoordig zijn cellulaire benaderingen van perifere neuro-engineering van groot belang. Stamcellen komen op de eerste plaats onder de cellen die in deze benaderingen worden gebruikt. Onder normale omstandigheden zijn stamcellen de regeneratieve cellen van het lichaam en hun aantal en functies nemen niet af met de tijd om hun populaties te beschermen; Deze cellen zijn gespecialiseerd, maar kunnen differentiëren bij passende stimulatie als reactie op letsel 4,5. Volgens de stamcelhypothese staat het stamcelsysteem onder invloed van zijn micro-omgeving, de stamcelniche genaamd. Het behoud en de differentiatie van stamcellen zijn onmogelijk zonder de aanwezigheid van hun micro-omgeving6, die kan worden gereconstitueerd via tissue engineering met behulp van cellen en steigers7. Tissue engineering is een multidisciplinair veld dat zowel technische als biologische principes omvat. Tissue engineering biedt hulpmiddelen voor het creëren van kunstmatige weefsels die levende weefsels kunnen vervangen en kan worden gebruikt bij de regeneratie van deze weefsels door de beschadigde weefsels te verwijderen en functionele weefsels te leveren8. Weefselsteigers, een van de drie hoekstenen van tissue engineering, worden geproduceerd met behulp van verschillende methoden van natuurlijke en synthetische materialen9. Driedimensionaal (3D) printen is een opkomende additieve productietechnologie die veel wordt gebruikt om defecte weefsels te vervangen of te herstellen via de eenvoudige maar veelzijdige productie van complexe vormen met behulp van verschillende methoden. Bioprinting is een additieve productiemethode die het naast elkaar bestaan van cellen en biomaterialen mogelijk maakt, genaamd bioinks10. Gezien de interactie van zenuwcellen met elkaar, zijn studies verschoven naar geleidende biomateriaalkandidaten zoals grafeen. Grafeen nanoplaten, die eigenschappen hebben zoals flexibele elektronica, supercondensatoren, batterijen, optica, elektrochemische sensoren en energieopslag, zijn een geprefereerd biomateriaal op het gebied van tissue engineering11. Grafeen is gebruikt in studies waar de proliferatie en regeneratie van beschadigde weefsels en organen werden uitgevoerd12,13.

Tissue engineering bestaat uit drie basisbouwstenen: steigers, cellen en biosignaalmoleculen. Er zijn tekortkomingen in de studies naar perifere zenuwbeschadiging in termen van het volledig verstrekken van deze drie structuren. Er zijn verschillende problemen ondervonden bij de biomaterialen die in de studies worden geproduceerd en gebruikt, zoals het feit dat ze alleen stamcellen of biosignaalmoleculen bevatten, het ontbreken van een bioactief molecuul dat stamceldifferentiatie mogelijk maakt, het gebrek aan biocompatibiliteit van het gebruikte biomateriaal en het lage effect op de proliferatie van cellen in de weefselniche, en dus wordt zenuwgeleiding niet volledig gerealiseerd 2,13,14,15,16. Dit vereist de optimalisatie van zenuwregeneratie, het verminderen van spieratrofie 17,18 en het creëren van noodzakelijke homing19 met groeifactoren tegen dergelijke problemen. Op dit punt zijn de karakterisering en analyse van de neuro-activiteit van een chirurgisch biomateriaalprototype, dat naar de kliniek moet worden overgebracht, erg belangrijk.

Dienovereenkomstig onderzoekt deze methodestudie de bioink hydrogel-patronen met grafeennanoplaten gevormd door een 3D-bioprinter en de effectiviteit ervan op de neurogene differentiatie van de stamcellen die het bevat. Ook worden de effecten van grafeen op neurosfeervorming en differentiatie onderzocht.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Kweken van Wharton's gelei mesenchymale stamcellen

  1. Neem de gelei mesenchymale stamcellen van de Wharton (WJ-MSCs, van ATCC) uit een vriezer van −80 °C. Kweek WJ-MSC's in DMEM-F12 medium met 10% foetaal kalfsserum (FBS), 1% Pen-Strep en 1% L-glutamine in een steriele laminaire stroom bij kamertemperatuur, zoals beschreven in Yurie et al.20.
  2. Cryopreserveer sommige cellen bij 1 x 106 cellen / ml met vriesmedium dat 35% FBS, 55% DMEMF-12 en 10% dimethylsulfoxide (DMSO) bevat. Tel hiervoor 1 x 106 cellen op een Thoma-celtelglaasje en voeg druppelsgewijs de vriesoplossing toe. Breng de dia snel over in een container met vloeibare stikstof.
  3. Wanneer gekweekte cellen voor 80% samenvloeien in de kolf, giet dan het medium uit en was met 5 ml PBS. Voeg 5 ml 0,25% trypsine en 2,21 mM EDTA-4Na toe. Incubeer in een incubator bij 37 °C gedurende 5 min.
  4. Voeg 10 ml DMEM-F12-medium met 10% FBS toe aan de cellen die uit de incubator zijn verwijderd. Suspenseer het goed, verzamel het medium en breng het medium over naar een centrifugebuis.
  5. Centrifugeer met een rotatiesnelheid van 101 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg en zaai de cellen opnieuw in nieuwe kolven met een vers voedingsmedium dat 10% FBS bevat.
    OPMERKING: Commerciële WJ-MSC's die door de transductiemethode met het GFP-gen zijn gelabeld, kunnen worden gebruikt om de te produceren biomateriaal-celinteracties beter te visualiseren21. De groepen die in deze methode moeten worden gebruikt, kunnen worden gemaakt zoals weergegeven in tabel 1.

Groepen gemaaktRedenen om te creërenAantal herhalingen
2D WJ-MSC's (2D-C)2D-besturingx 5
2D WJ-MSCs & Grafeen (2D-G)Bepaling van de toxische dosis van grafeen in 2Dx 5 herhalingen voor elk van verschillende concentraties
WJ-MSC's zijn opgenomen in bioinks (3D-B)3D-besturingx 3
WJ-MSCs &; 0,1% grafeen zijn opgenomen in bioinks (3D-G)3D Grafeen-Bioink Biohybride Groepx 3
WJ-MSC's zijn in sferoïde vorm op de bioinks (3D-BS)3D-besturing van sferoïde vormx 3
WJ-MSCs & 0,1% Grafeen zijn in sferoïde vorm op de bioinks (3D-GS groep)3D Grafeen-Bioink Biohybride Groep van Sferoïde Vormx3
3D Bioink druppelHet wordt geproduceerd voor SEM- en FTIR-karakteriseringsanalyse.x5
3D Grafeen druppelHet wordt geproduceerd voor SEM- en FTIR-karakteriseringsanalyse.x5
3D Bioink met GFP gelabeld WJ-MSCs & 0,1%Observatie van de bewegingen van WJ-MsC's in de bioink die de juiste dosis grafeen bevat.x3

Tabel 1. Groepen in de methode. Alle 2D- en 3D-groepen in de methode zijn opgenomen.

2. Grafeentoxiciteit en 2D-beeldvorming

  1. Bereiding van grafeenconcentraties en toepassing op cellen
    OPMERKING: Ruwe grafeen nanodeeltjes werden commercieel gekocht (industriële grafeen nanoplaten type) en werden ook gedoneerd. De afmetingen van de deeltjes waren 5-8 nm dik, 5 μm in diameter en 120-150 m2/g in oppervlakte.
    1. Weeg het grafeen af om een 1% oplossing (mg/ml) te creëren. Maak een stockoplossing door 10 ml DMEMF-12-medium met 10% FBS toe te voegen aan de gewogen 100 μg grafeennanodeeltjes en label deze oplossing als stockoplossing. Steriliseren in een autoclaaf bij 121 °C onder 1,5 atm druk gedurende 20 min.
      OPMERKING: Het steriele grafeenmengsel wordt tot gebruik bij 4 °C in de koelkast bewaard. Het is mogelijk niet geschikt voor langdurig gebruik (maximaal 1 maand). In deze gevallen moet het mengsel worden gereconstitueerd en gesteriliseerd.
    2. Bereid een mengsel van medium grafeen in verschillende concentraties om niet-toxische doses te bepalen. Stel de initiële verdunningen in op 1%, 0,1%, 0,01%, 0,001% en 0,0001% grafeen/media.
    3. Begin met de 1% stamoplossing, neem 1 ml achtereenvolgens van elke concentratie en breng deze over in een nieuwe buis. Voeg 9 ml DMEMF-12-medium met 10% FBS toe aan elke buis, maak vijf geleidelijk verdunde monsters en schud en vortex de oplossingen om een gelijke verdeling te krijgen. Gebruik slechts 10 ml DMEMF-12 medium met 10% FBS als controle.
      OPMERKING: De zware vlokken grafeen slaan neer en moeten daarom worden herverdeeld.
    4. Zaai de WJ-MSC's in 6-well platen met 2 ml vers medium met 10% FBS bij 5 x 105 cellen per put. Incubeer gedurende 1 dag bij 37 °C. Verdeel vervolgens de platen in groepen van gelijke en herhaalde putten. Doe vijf herhalingen voor elke concentratie.
    5. Gooi het medium weg en vervang het medium vervolgens door grafeenmediumconcentraties van 2 ml per put. Gebruik alleen het medium voor de controlegroep. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende 24 uur.
  2. Bepaling van niet-toxische concentraties van grafeen met MTT
    1. Gooi media met grafeen na 24 uur weg. Was elk goed met PBS. Voeg vers DMEMF-12 medium toe met 10% FBS bij 2 ml per put.
      OPMERKING: Het is belangrijk om te wassen met PBS na het aanbrengen van grafeenconcentraties op de cel omdat grafeennanodeeltjes, die niet door endocytose in de cel worden opgenomen, uit de omgeving worden verwijderd. Dit maakt de MTT-test efficiënter.
    2. Gebruik het MTT-protocol (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl-tetrazoliumbromide) om de IC50-waarde te bepalen die 50% levensvatbaarheid van cellen aangeeft, zoals beschreven in Kose et al.22 en in stappen 2.2.3.-2.2.6.
    3. Weeg eerst 5 mg / ml MTT-zout af en los op in PBS. Steriliseer met een filter van 0,45 μm. Wikkel de MTT-oplossing, gemaakt in een centrifugebuis van 15 ml, met aluminiumfolie en bewaar bij 4 °C.
    4. Voeg 10 μL MTT toe aan alle putjes en incubeer de plaat gedurende 4 uur bij 37 °C. Observeer de vorming van formazankristallen bij 10x vergroting onder de microscoop na incubatie.
    5. Om de kristallen die in de cellen zijn gevormd op te lossen, voegt u 100 μL DMSO toe aan elke put en mengt u door pipetteren. Houd de plaat in het donker op kamertemperatuur gedurende 30 min. Plaats de plaat in de ELISA-plaatlezer. Stel een golflengte van 570 nm in vanuit het programma voor absorptiemeting en laat deze de plaat22 lezen.
      OPMERKING: Bovendien, terwijl grafeendeeltjes alleen worden gelezen bij 270 nm23, is het leesbereik van 570 nm24 hier alleen voor het lezen van de levensvatbaarheid van cellen.
    6. Voer statistische analyse uit op de verkregen resultaten met behulp van eenrichtings-ANOVA met de test van Tukey in een statistisch analyseprogramma.
  3. Beeldvorming van steekstoffen
    1. Om de interactie van verschillende grafeenconcentraties met cellen te onderzoeken, voert u een time-lapse van de cellen uit met de methode die steekbeeldvorming wordt genoemd. Deze methode creëert een time-lapse-beeld met behulp van beeldmonsters die met regelmatige tussenpozen onder de microscoop zijn genomen.
    2. Schakel hiervoor eerst de computer in. Schakel de time-lapse imaging incubator in en stel deze in op 37 °C. Plaats de MTT-plaat in de time-lapse-incubatorsleuf.
    3. Open het programma Stitch op de computer. Geef de putten op die in het systeem moeten worden gelezen. Breng de lezer naar de eerste put en lokaliseer en focus het gebied met een vergroting van 10x in wit licht. Start het programma.
      OPMERKING: Het is een programma voor het maken van hoogwaardige 4 rijen x 5 kolommen meerdere fotocollages. Het programma combineert foto's die achter elkaar zijn gemaakt in HD-kwaliteit. Wanneer u op de startknop van het systeem drukt, worden de putjes automatisch gelezen en worden 4 rijen x 5 kolommen meerdere foto's gemaakt en samengevoegd.

3. Grafeen - Bioink biohybride hydrogel productie en WJ-MSCs differentiatie

  1. Productie van bioinks
    OPMERKING: De gelyofiliseerde commercieel verkrijgbare alginaat-gelatine (3:5) poeders worden gebruikt als basis voor bioinks. De grafeenbioinkgroep (3D-G; 3D-GS) en de grafeenvrije controlebioinkgroep (3D-B; 3D-BS) worden met dezelfde methode bereid (tabel 1).
    1. Gebruik 50 ml conische buizen voor de bereiding. Weeg eerst 4,5 mg alginaat en 1,5 mg gelatine af en breng het over in een centrifugebuis. Voeg DMEMF-12 medium met 10% FBS toe aan het mengsel tot een totaal volume van 50 ml. Dit is de controle (C) groep zonder grafeen.
    2. Herhaal een weging van 4,5 mg alginaat en 1,5 mg gelatine en breng over in een centrifugebuis. Neem vervolgens 50 μL van het bereide 0,1% grafeen uit stap 2.1.3. en voeg het toe aan de buis. Voeg DMEMF-12 met 10% FBS toe aan een totaal volume van 50 ml.
    3. Meng de bioinks eerst door pipetteren en daarna door vortex. Steriliseren in een autoclaaf bij 121 °C onder 1,5 atm druk gedurende 20 min. U kunt ook sterilisatie uitvoeren door in de magnetron te gaan tot het kookpunt.
    4. Nadat de mengsels zijn geautoclaveerd, centrifugeer u gedurende 2 minuten bij 280 x g bij kamertemperatuur om gevormde bellen te verwijderen. Houd de bioinks op 37 °C totdat de cellen zijn voorbereid.
  2. Toevoeging van WJ-MSCs en 3D bioprinting
    1. Voor het tellen, was de cellen wanneer er 80% samenvloeiing is met ongeveer 5 ml PBS en voeg 5 ml 0,25% trypsine en 2,21 mM EDTA 4Na toe. Laat 5 min staan bij 37 °C.
    2. Voeg 10 ml DMEM-F12-medium met 10% FBS toe aan de cellen na verwijdering uit de incubator. Suspenseer goed, verzamel het medium en breng het over naar een centrifugebuis. Centrifugeer op 101 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en gooi het supernatant vervolgens weg.
    3. Laat ongeveer 250 μL medium bij de pellet. Los de pellet opnieuw op in 1 ml vers medium. Voeg aan 48 μL medium 2 μL celsuspensie en 50 μL trypan blue (0,4 g trypanblauw/100 ml) toe in een conische buis (1,5 ml) voor het tellenvan 4. Pipetteer het goed.
    4. Voeg ongeveer 10 ml van de bereide gekleurde celsuspensie toe aan een Thoma-celtelkamer. Bereken het gemiddelde aantal cellen dat in de vierkanten aan beide zijden van de lichtmicroscoop valt.
      Bereken het vitaliteitspercentage (%) = (getelde levensvatbare cellen/totaal aantal getelde cellen) x 100
      OPMERKING: De cel-bioink interactie wordt op twee manieren bestudeerd: (1) Het kan worden geprint door het toe te voegen aan de bioinks (3D-B; 3D-G); (2) De cellen worden na het persen op de bioinks gezaaid en de cellen vormen een sferoïde (3D-BS; 3D-GS).
    5. Maak voor de cel-bioink-interactie eerst de bioinkgroepen (tabel 1). Groep 1 omvat 3D-B en 3D-G geprint met bioink voor bioprinting. Groep 2 omvat 3D-BS en 3D-GS bioinks waarop na bioprinting sferoïden zijn gevormd.
    6. Tel de cellen voor groep 1 zodat er ongeveer 1 x 107 cellen in 0,5 ml medium zitten. Voeg 4,5 ml bioink toe om het totale volume op 5 ml te brengen. Breng dit met behulp van spuiten over naar de patronen in de steriele kast. Installeer de cartridges in het overeenkomstige extrudergedeelte van de bioprinter.
    7. Neem voor de tweede groep 5 ml van elk van de bioinkgroepen en breng ze over naar steriele patronen met behulp van een injector.
    8. Gebruik de bioprinter met twee coaxiale printkoppen en de pneumatisch aangedreven extrusietechnologie. Stel de X/Y/Z-resolutie per microstap in op 1,25 μm, de extrusiebreedte op 400 μm en de extrusiehoogte op 200 μm. Een raster van 20 mm x 20 mm x 5 mm is een van de meest gebruikte 3D-modellen voor 3D-bioprintwerk.
    9. Maak de 3D-modellen met behulp van open-source, webgebaseerde CAD-programma's. Maak vóór bioprinting eenvoudige 3D-modellen met een van de open-sourceplatforms (bijvoorbeeld infill). Het model kan lineair zijn (zoals het model dat hier wordt gebruikt), honingraat of rastervormig. Exporteer en download in .stl-formaat na het maken van een vierkant van 5 mm x 20 mm x 20 mm.
    10. De bioprintersoftware maakt gebruik van .stl-bestanden en converteert deze naar afdrukbare .gcode-indeling met behulp van slicermodules. Als u een afdrukbare rastervorm wilt krijgen, schakelt u de buitenste schil in de slicermodule uit. Veeg het apparaat voor gebruik af met 70% ethanol en steriliseer het vervolgens door UV-sterilisatie.
    11. Voor het bioprintproces brengt u de bioinkgroepen over naar de cartridges met behulp van een injector. Installeer de cartridges in het overeenkomstige extrudergedeelte van de bioprinter.
    12. Stel de gemiddelde druk van de 3D-printer in op 7,5 psi en de cartridge- en bedtemperatuur op 37 °C. Stel de snelheid in op 60% en voer een standaard 3D-printproces uit.
      OPMERKING: Door de voorbereide modellen te plannen met spaties (zoals een lineair model) kan celkweek worden uitgevoerd in de ruimtes na bioprinting.
    13. Zet het systeem in de thuispositie tijdens de schrijffase. Plaats de assen (X, Y, Z) automatisch, selecteer de extruder en stel in. Start het afdrukproces. Neem na het bioprintproces het monster en plaats het onder een laminaire stroomkast.
    14. Spuit de bioinks na het afdrukken met 0,1 N CaCl2-oplossing of voeg 1 ml van de oplossing toe met een pipet bij kamertemperatuur. Wacht ongeveer 10-20 s en was de bedrukte patronen 2x met PBS met Ca 2+ en Mg2+.
    15. Voeg 2 ml DMEMF-12 met 10% FBS-medium toe aan elk van de celbevattende bioinkgroepen. Incubeer de platen bij 37 °C met 5% CO2. Voeg daarna 2 ml suspensiemedium met 1 x 106 cellen toe aan elke groep voor sferoïdevorming.
    16. Incubeer de platen bij 37 °C met 5% CO2. Observeer na 24 uur incubatie de sferoïdevorming onder een omgekeerde microscoop.
  3. WJ-MSCs differentiatie naar neuron-achtige cellen
    1. Observeer en fotografeer alle partijen bioink na 24 uur incubatie. Voeg 2 ml neurogeen differentiatiemedium per put toe (behalve voor de controlegroep) en ververs elke 2 dagen. Volg gedurende 7 dagen om neurale differentiatie te observeren.

4. Grafeen-Bioink biohybride hydrogel karakterisering

OPMERKING: Time-lapse beeldvorming, Fouriertransformatie infraroodspectroscopie (FT/IR) en scanning elektronenmicroscopie (SEM) analyses worden uitgevoerd voor de karakterisering van grafeen-bioink biohybride hydrogel. De monsters worden gemaakt van 3D-B- en 3D-G-bioinkgroepen met behulp van de druppelmethode voor FT / IR- en SEM-analyse.

  1. FT/IR analyse
    OPMERKING: FT/IR is een chemische analysemethode gebaseerd op de wiskundige Fouriertransformatie, onmisbaar voor materiaalkarakterisering. Gebruik een FT/IR-apparaat op basis van 28 °C Michelson-interferometerprincipes, met een halogeenlamp, watergekoelde kwiklichtbron, signaalverhouding van 4 cm−1, gemeten gedurende 1 min, bij 2.200 cm−1.
    1. Bereid de FT/IR-microscoop voor en zorg ervoor dat de optiek van het instrument is uitgelijnd. Kalibreer het apparaat.
    2. Omdat het monster zich in een druppel bevindt, neemt u een stuk hydrogel van 1-2 mm dik en plaatst u het met een tang op het monstergedeelte. Focus op het monster en til het op totdat er nauw contact is gemaakt. Verzamel het monsterspectrum door het proces vanuit het systeem te starten.
  2. Scanning elektronenmicroscopie (SEM) analyse
    OPMERKING: De oppervlaktemorfologie, interne structuur, celverdeling en bioink-celinteracties kunnen worden onderzocht door SEM-analyse in verschillende dimensies.
    1. Laat de hydrogel in 6-putplaten met 1 ml CaCl 2-crosslinker vallen met behulp van de pipetpuntdruppelmethode (zie figuur 1).
    2. Was de borden 2x met ongeveer 1 ml PBS om de oplossing van zouten te bevrijden. Doe deze druppels vervolgens in een valkenbuis met 5 ml 5% paraformaldehyde met behulp van een tang.
    3. Maak dunne secties van de druppelbioinks met behulp van een scalpel. Plak de monsters aan de kleverige kant op de metalen plaat. Plaats in het coatingapparaat waar het gouden palladium, dat in de plasmafase overgaat door de lucht te vervangen door argongas, het monster bedekt.
    4. Leg het in de elektronenmicroscoop (SEM). Open het microscoopprogramma waarmee de SEM is verbonden. Voer de schaling uit en maak afbeeldingen van verschillende delen van het monster. Voor dit protocol werden schalen van 5 μm, 10 μm en 200 μm gebruikt. In totaal zijn er 40 opnames gemaakt voor de 3D-B en 3D-G groepen.
  3. Time-lapse beeldvorming
    OPMERKING: Tijdens time-lapse beeldvorming werden niet alleen bioinkmonsters met GFP-gengetransformeerde cellen gebruikt, maar ook bioinks met sferoïden worden gedurende 16 uur afgebeeld. Time-lapse beeldvorming wordt uitgevoerd om de effecten van grafeen op stamcellen te onderzoeken en om celinteracties binnen de bioink te volgen.
    1. Voeg in de handel verkrijgbare 1 x 107 GFP-gelabelde MSC's toe aan 5 ml bioink en bioprint zoals in stap 3.2.11. Voeg 1 ml crosslinker toe, houd 20-30 s vast en was 2x met PBS.
    2. Schakel de time-lapsemonitor in en open het programma op de computer. Stel ongeveer 16 uur in time-lapse-modus in en stel de temperatuur in op 37 °C. Druk op de knop Start . Video's in de vorm van 40 s time-lapse videosamples worden door het systeem opgenomen.
    3. Focus de microscoop op 10x vergroting om de 2 uur. Visualiseer ook de sferoïden die zijn gemaakt door dezelfde stappen te volgen.

figure-protocol-1
Figuur 1: 3D-B en 3D-G bioink groepen geproduceerd als druppels voor gebruik bij karakterisering . (A) Bioink-monsters (pre-karakteriseringsbeeld) op een plaat met een crosslinker. (B) 3D-B drop afbeelding van bioink. (C) 3D-G bioink drop afbeelding. Het te karakteriseren biomateriaal en de cellen die het bevat, kunnen gemakkelijker processen doorlopen zoals vergulding, bemonstering, enz. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5. Bepaling van neurogene differentiatie door immunostaining methode

  1. Verzamel de sferoïden, zonder de bolvormen te onderbreken, en zaai opnieuw in nieuwe platen om opnieuw te kleuren met een eenvoudigere methode, in plaats van in te bedden in paraffine voor weefselsectie.
  2. Bedek de 48-putplaten met ongeveer 20 ml voorgeautoclaveerde 0,1% gelatine-oplossing en bewaar ze minstens 1 uur in een incubator. Pipetteer ongeveer 500 μL bereide 0,1% gelatine in 48-putplaten. Laat de gelatineuze platen 10 minuten in de incubator staan.
    OPMERKING: Hierdoor kan de gelatine enigszins opzwellen, het oppervlak bedekken en een betere omgeving creëren voor de verzamelde sferoïden om zich te hechten.
  3. Verzamel de sferoïden door pipetteren, verdeel de verzamelde sferoïden uit de incubator in de putten van de 48-putplaat en voeg vers medium toe. Incubeer vervolgens gedurende 12-24 uur.
    OPMERKING: Het is vrij moeilijk om de sferoïden te verdelen door te tellen. Verzamel de sferoïden in een enkele buis en verdeel het totale volume gelijkmatig over de putten. Voor deze studie bevatte elke put ongeveer 4-6 sferoïden.
    OPMERKING: Voor 2D-monsters is het voldoende om vlekken voor te wassen en is er geen mediavervanging vereist.
  4. Verwijder het medium en was de cellen langzaam met PBS omdat de sferoïden zich aan de bovenkant bevinden. Fixeer in 4% paraformaldehyde gedurende 2 uur.
  5. Was de monsters opnieuw met PBS en blokkeer met ongeveer 10 ml 2% BSA en 0,1% TritonX gedurende 30 minuten. Daarna 3x wassen met PBS.
  6. Verdun geselecteerde primerantistoffen (N-cadherine-konijn en β-III tubuline-muis) in een verhouding van 1:100 met antilichaamverdunningsreagensoplossing. Voeg 100 μL antilichaamoplossing toe aan elk van de monsters en incubeer een nacht bij 4 °C.
  7. Was de monsters 3x met PBS. Incubeer met antimuis IgG-FTIC-konijn voor β-III tubuline en antimuis IgG-SC2781-geit secundair antilichaam voor N-Cad verdund tot 1:200 bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten. Voer alle bewerkingen uit in het donker.
    OPMERKING: Welke stam ook wordt gebruikt als het primaire antilichaam (bijv. Muis) bij dubbele kleuring, een andere stam (bijv. Geit of konijn) moet worden gebruikt voor het secundaire antilichaam.
  8. Was het secundaire antilichaam met PBS 3x en druppel vervolgens de DAPI-oplossing (1:1) in elk van de monsters. Wacht 15-20 min. Voer immunofluorescentiebeeldvorming uit.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grafeentoxiciteit en 2D-beeldvorming
Statistische analyse van de verkregen MTT-resultaten werd uitgevoerd met een eenrichtings-ANOVA met Tukey's test in statistische analysesoftware, en de verkregen grafiek is weergegeven in figuur 2. Het grafeenpercentage in vergelijking met de controle vertoonde alleen een significante daling voor de grafeenconcentratie van 0,001% (**p < 0,01).. Er waren geen significante verschillen tussen de andere groepen en de controle (p > 0,05). D...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De voordelen van behandelingen toegepast met technische 3D-steigers ten opzichte van conventionele 2D-methoden worden elke dag meer en meer merkbaar. Stamcellen die alleen in deze therapieën worden gebruikt of samen met steigers geproduceerd uit verschillende biomaterialen met een lage biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid zijn meestal ontoereikend bij perifere zenuwregeneratie. Wharton's jelly mesenchymale stamcellen (WJ-MSCs) lijken een geschikte kandidaat-cellijn te zijn, vooral gezien de optimalisatie van...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling. Het project werd uitgevoerd in samenwerking met HD Bioink, ontwikkelaar van de 3D-bioprinttechnologie.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het grafeen dat in deze studie werd gebruikt, werd ontwikkeld aan de Kirklareli University, Department of Mechanical Engineering. Het werd geschonken door Dr. Karabeyoğlu. De grafeentoxiciteitstest werd gefinancierd door het project getiteld "Printing and Differentiation of Mesenchymal Stem Cells on 3D Bioprinters with Graphene Doped Bioinks" (Application No: 1139B411802273) voltooid in het kader van TÜBİTAK 2209-B-Industry-Oriented Undergraduate Thesis Support Program. Het andere deel van de studie werd ondersteund door het onderzoeksfonds van Yildiz Technical University Scientific Research Projects (TSA-2021-4713). Mesenchymale stamcellen met GFP gebruikt in de time-lapse beeldvormingsfase werden gedoneerd door Virostem Biotechnology. De auteurs bedanken Darıcı LAB en YTU The Cell Culture and Tissue Engineering LAB-team voor productieve discussies.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen

Centrifugal		HitachiGebruikt in celcultuur en biomateriaal stap
0.1N CaCl2HD BioinkGebruikt voor crosslinker
0.22 µm membraanfilterAιsιmoGebruikt voor sterilisatie
0.45 µm spuitfilterAιsιmoGebruikt voor sterilisatie
1.5mL conische buisEppendorfaGebruikt voor bioink druppel
15mL Falcon buisNestGebruikt in celcultuur stap
25 cm2 celcultuur kolven (Falcon, TPP weefselcultuurkolven)NestGebruikt voor celcultuur
3D BioprintingAxolotl Biosystems Bio A2 (Turkije)Bioprinting stap
50 mL Falcon buisNestGebruikt in celcultuur stap
6/24/48/96 well platen (Falcon, TPP microplaten)Merck MilliporeGebruikt in celcultuur stap
75 cm2 celcultuur kolven (Falcon, TPP weefselcultuurkolven)NestGebruikt voor celcultuur
Anti muis IgG-FTIC-konijnSanta Cruz BiotechnologyJ1514Secundaire antilichaam, gebruikt voor kleurstof
Anti muis IgG-SC2781-geitSanta Cruz BiotechnologyC3109Secundaire antilichaam, gebruikt voor kleurstof
Au coating apparaat EM ACE600Leicavoor goud plateren van biomateriaal sectie voor SEM beeldvorming
AutoclaafNUVE-OT 90LGebruikt voor het sterilisatieproces.
AutoclaafNUVE-OT 90LGebruikt voor het sterilisatieproces.
Cel Cultre CabineHera Safe KSGebruikt voor het celcultuur proces
Dulbecco's Gemodificeerd Eagle's Medium/Nutrient Mixtuur-F12SigmaRNBJ7249Gebruikt als celcultuur medium
FEI QUANTA 450 FEG ESEM SEMQuantaFEG 450voor SEM
Fetaal bovien serum-FBSCapricornFBS-16AHet werd gebruikt door toevoeging aan het celcultuur medium.
Vrieskast -80°CPanasonicMDF-U5386S-PEWe werden gebruikt om cellen en de resulterende exosomen op te slaan
Gelatine-Alginaat bioink poederHD BioinkGebruikt voor geproduceerde bioink stap
GFP gelabelde-WJ-MSCsVirostemGebruikt voor beeldvorming naar cel-bioink interactie
Grafeen nanoplateletjes (Grafeen-IGP2)Grafen Chemical Industries Co.Gebruikt voor productie 3D-G bioink
Immunofluorescentie antilichamen (N-CAD; β-III Tubuline)Cell Signalling en Santa CruzGebruikt voor kleurstof
JASCO 6600Tetravoor FTIR
MTT AssaySigmaLevendheidstest
Penicilline/Streptomycine OplossingCapricornPB-SHet werd toegevoegd aan het medium om besmetting in celcultuur te voorkomen.
Thoma glijbaanIsolabGebruikt voor het tellen van de cel
Time-Lapse Imaging SysteemZeiss Axio.Observer.Z1Beeldvorming
Tripsine-EDTAMulticellDe kolf werd gebruikt om de cellen die het oppervlak bedekken te verwijderen.
VortexBiobaseVoor geproduceerde bioink stap
WJ-MSCsATCCGebruikt voor het celcultuur proces

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kamasak, B., et al. Peripheral Nerve Injuries and Physiotherapy. Clinical Physiotherapy. 19, Vize Publishing, Istanbul. (2019).
  2. Yegiyants, S., Dayicioglu, D., Kardashian, G., Panthaki, Z. J. Traumatic peripheral nerve injury: A wartime review. Journal of Craniofacial Surgery. 21 (4), 998-1001 (2010).
  3. Mushtaq, S., et al. Frequency of peripheral nerve injury in trauma in emergency settings. Cureus. 13 (3), 14195(2021).
  4. Allahverdiyev, A. Basic Principles of Somatic and Stem Cell Culture Systems, 1st Edition. , Nobel Medicine Bookstore. Istanbul. (2018).
  5. Allahverdiyev, A. M., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells as a new host cell in latent leishmaniasis. The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 85 (3), 535-539 (2011).
  6. Schofield, R. The relationship between the spleen colony-forming cell and the hemopoietic stem cell. Blood Cells. 4 (1-2), 7-25 (1978).
  7. Goodman, S. R. Stem Cells and Regenerative Medicine (Chapter 13). Goodman's Medical Cell Biology, Fourth Edition. , Academic Press. 361-380 (2021).
  8. Kaya, T. I. Tissue engineering. International Journal of Medical Sciences. 1 (48), 165-169 (2018).
  9. Sensharma, P., Madhumathi, R. G., Jayant, R. D., Jaiswal, A. K. Biomaterials and cells for neural tissue engineering: Current choices. Materials Science and Engineering: C. 7, 1302-1315 (2017).
  10. Hölzl, K., et al. Bioink properties before, during, and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002(2016).
  11. Zheng, Y., et al. 2D nanomaterials for tissue engineering and regenerative nanomedicines: Recent advances and future challenges. Advanced Healthcare Materials. 10 (7), 2001743(2021).
  12. Shin, S. R. Graphene-based materials for tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 105, 255-274 (2016).
  13. Chen, M., Qin, X., Zeng, G. Biodegradation of carbon nanotubes, graphene, and their derivatives. Trends in Biotechnology. 35 (9), 836-846 (2017).
  14. Chen, S., et al. PAM/GO/Gel/SA composite hydrogel conduit with bioactivity for repairing peripheral nerve injury. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 107, 1273-1283 (2019).
  15. Chiriac, S., Facca, S., Diaconu, M., Gouzou, S., Liverneaux, P. Experience of using the bioresorbable copolyester poly(DL-lactide-ε-caprolactone) nerve conduit guide Neurolac™ for nerve repair in peripheral nerve defects: Report on a series of 28 lesions. Journal of Hand Surgery (European Volume). 37 (4), 342-349 (2011).
  16. Karaaltin, A. B., et al. Human olfactory stem cells for injured facial nerve reconstruction in a rat model). Head & Neck. 38, 2011-2020 (2016).
  17. Bingham, J. R., et al. Stem cell therapy to promote limb function recovery in peripheral nerve damage in a rat model. Annals of Medicine and Surgery. 41, 20-28 (2019).
  18. Zhuang, H., et al. Gelatin-methacrylamide gel loaded with microspheres to deliver GDNF in bilayer collagen conduit promoting sciatic nerve growth. International Journal of Nanomedicine. 11, 1383-1394 (2016).
  19. Scheib, J., Hoke, A. Advances in peripheral nerve regeneration. Nature Reviews: Neurology. 9 (12), 668-676 (2013).
  20. Yurie, H., et al. The efficacy of a scaffold-free bio 3D conduit developed from human fibroblasts on peripheral nerve regeneration in a rat sciatic nerve model. PLOS ONE. 12 (2), 0171448(2017).
  21. Guo, Y., et al. Assessment of the green florescence protein labeling method for tracking implanted mesenchymal stem cells. Cytotechnology. 64 (4), 391-401 (2012).
  22. Kose, C., Kacar, R., Zorba, A. P., Bagirova, M., Allahverdiyev, A. The effect of CO2 laser beam welded AISI 316L austenitic stainless steel on the viability of fibroblast cells, in vitro. Materials Science and Engineering: C. 60, 211-218 (2016).
  23. Liu, Y., et al. Bio-adenine-bridged molecular design approach toward non-covalent functionalized graphene by liquid-phase exfoliation. Journal of Materials Science. 55, 140-150 (2020).
  24. Rehman, S. Reduced graphene oxide incorporated GelMA hydrogel promotes angiogenesis for wound healing applications. International Journal of Nanomedicine. 14, 9603-9617 (2019).
  25. Bei, H. P., et al. Graphene-based nanocomposites for neural tissue engineering. Molecules. 24 (4), 658(2019).
  26. Othman, S. A., et al. Alginate-gelatin bioink for bioprinting of HeLa spheroids in alginate-gelatin hexagon-shaped scaffolds. Polymer Bulletin. 78, 6115-6135 (2021).
  27. Peng, X. L., Li, Y., Zhang, G., Zhang, F., Fan, X. Functionalization of graphene with nitrile groups by cycloaddition of tetracyanoethylene oxide. Journal of Nanomaterials. 2013, 841789(2013).
  28. Zorba Yildiz, A. P., et al. 3D therapeutic approaches for peripheral nerve damage. 9th International Molecular Biology and Biotechnology Congress Abstract Book. , E- ISBN: 978-605-70057-4-8 (2020).
  29. Liau, L. L., Ruszymah, B. H. I., Ng, M. H., Law, J. X. Characteristics and clinical applications of Wharton's jelly-derived mesenchymal stromal cells. Current Research in Translational Medicine. 68 (1), 5-16 (2020).
  30. Yoo, J., et al. Augmented peripheral nerve regeneration through elastic nerve guidance conduits prepared using a porous PLCL membrane with a 3D printed collagen hydrogel. Biomaterials Science. 22, 1-12 (2020).
  31. Jansen, K., Meek, M. F., vander Werff, J. F. A., van Wachem, P. B., van Luyn, M. J. A. Long-term regeneration of the rat sciatic nerve through a biodegradable poly (DL-lactide-Ɛ-caprolactone) nerve guide: Tissue reactions with a focus on collagen III/IV reformation. Journal of Biomedical Materials Research. 69 (2), 334-341 (2016).
  32. Pathre, P., et al. PTP1B regulates neurite extension mediated by cell-cell and cell-matrix adhesion molecules. Journal of Neuroscience Research. 15, 143-150 (2001).
  33. Qing, L., Chen, H., Tang, J., Jia, X. Exosomes and their microRNA cargo: New players in peripheral nerve regeneration. Neurorehabilitation and Neural Repair. 32 (9), 765-776 (2018).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Grafeenhydrogel bio inkt3D bioprintenstamceldifferentiatieneurale regeneratiesfero dvormingmesenchymale stamcellenimmunokleuringcel scaffold interactie

Gerelateerde artikelen