Methodenartikel

Het bestuderen van erfelijke immuniteit in een Caenorhabditis elegans Model van Microsporidia-infectie

2.2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63636

⸱

6 april 2022

 ,  , 
1Department of Molecular Genetics, University of Toronto

In dit artikel

Samenvatting

De infectie van Caenorhabditis elegans door de microsporidische parasiet Nematocida parisii stelt de wormen in staat om nakomelingen te produceren die zeer resistent zijn tegen dezelfde ziekteverwekker. Dit is een voorbeeld van erfelijke immuniteit, een slecht begrepen epigenetisch fenomeen. Het huidige protocol beschrijft de studie van erfelijke immuniteit in een genetisch handelbaar wormmodel.

Samenvatting

Erfelijke immuniteit beschrijft hoe sommige dieren de "herinnering" aan een eerdere infectie kunnen doorgeven aan hun nakomelingen. Dit kan de resistentie tegen ziekteverwekkers in hun nageslacht verhogen en de overleving bevorderen. Hoewel erfelijke immuniteit is gemeld bij veel ongewervelde dieren, zijn de mechanismen die ten grondslag liggen aan dit epigenetische fenomeen grotendeels onbekend. De infectie van Caenorhabditis elegans door de natuurlijke microsporidische ziekteverwekker Nematocida parisii resulteert in de wormen die nakomelingen produceren die robuust resistent zijn tegen microsporidia. Het huidige protocol beschrijft de studie van intergenerationele immuniteit in het eenvoudige en genetisch verhandelbare N. parisii -C. elegans infectiemodel. Het huidige artikel beschrijft methoden voor het infecteren van C. elegans en het genereren van immuungeprimeerde nakomelingen. Er worden ook methoden gegeven voor het testen van de weerstand tegen microsporidia-infectie door kleuring voor microsporidia en het visualiseren van infectie door microscopie. In het bijzonder voorkomt erfelijke immuniteit gastheercelinvasie door microsporidia en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) kan worden gebruikt om invasiegebeurtenissen te kwantificeren. De relatieve hoeveelheid microsporidia-sporen die in de immuungeprimeerde nakomelingen worden geproduceerd, kan worden gekwantificeerd door de sporen te kleuren met een chitinebindende kleurstof. Tot op heden hebben deze methoden licht geworpen op de kinetische en pathogene specificiteit van erfelijke immuniteit, evenals de moleculaire mechanismen die eraan ten grondslag liggen. Deze technieken, samen met de uitgebreide hulpmiddelen die beschikbaar zijn voor C. elegans-onderzoek , zullen belangrijke ontdekkingen op het gebied van erfelijke immuniteit mogelijk maken.

Inleiding

Erfelijke immuniteit is een epigenetisch fenomeen waarbij ouderlijke blootstelling aan pathogenen de productie van infectieresistente nakomelingen mogelijk kan maken. Dit type immuungeheugen is aangetoond bij veel ongewervelde dieren die geen adaptief immuunsysteem hebben en kunnen beschermen tegen virale, bacteriële en schimmelziekten1. Hoewel erfelijke immuniteit belangrijke implicaties heeft voor het begrijpen van zowel gezondheid als evolutie, zijn de moleculaire mechanismen die aan deze bescherming ten grondslag liggen grotendeels onbekend. Dit komt deels omdat veel van de dieren waarbij erfelijke immuniteit is beschreven, geen gevestigde modelorganismen zijn voor onderzoek. Daarentegen profiteren studies in de transparante nematode Caenorhabditis elegans van een uitgebreide genetische en biochemische toolkit 2,3, een sterk geannoteerd genoom 4,5 en een korte generatietijd. Inderdaad, onderzoek in C. elegans heeft fundamentele vooruitgang mogelijk gemaakt op het gebied van epigenetica en aangeboren immuniteit 6,7, en het is nu een gevestigd model voor het bestuderen van immuungeheugen 8,9.

Microsporidia zijn schimmelpathogenen die bijna alle dieren infecteren en dodelijke infecties veroorzaken bij immuungecompromitteerde mensen10. Infectie begint wanneer een microsporidia-spore zijn cellulaire inhoud (sporoplasma) injecteert of "afvuurt" in een gastheercel met behulp van een structuur die een polaire buis wordt genoemd. Intracellulaire replicatie van de parasiet resulteert in de vorming van meronten, die uiteindelijk differentiëren in volwassen sporen die de cel kunnen verlaten11,12. Hoewel deze parasieten schadelijk zijn voor zowel de menselijke gezondheid als de voedselzekerheid, is er nog veel te leren over hun infectiebiologie12. Nematocida parisii is een natuurlijke microsporidische parasiet die zich uitsluitend in de darmcellen van wormen vermenigvuldigt, wat resulteert in verminderde vruchtbaarheid en uiteindelijk de dood. Het N. parisii -C. elegans infectiemodel is gebruikt om aan te tonen: (1) de rol van autofagie bij de klaring van pathogenen13, (2) hoe microsporidia geïnfecteerde cellen niet-lytisch kunnen verlaten14, (3) hoe pathogenen zich van cel tot cel kunnen verspreiden door syncytia15 te vormen, (4) de eiwitten die N. parisii gebruikt om te communiceren met zijn gastheer16, en (5) de regulatie van de transcriptionele intracellulaire pathogene respons (IPR)17, 18.

Protocollen voor de infectie van C. elegans worden beschreven in het huidige werk en kunnen worden gebruikt om de unieke microsporidia-biologie te onthullen en de reactie van de gastheer op infectie te ontleden. De microscopie van vaste wormen gekleurd met de chitinebindende kleurstof Direct Yellow 96 (DY96) toont de infectieverspreiding van chitinebevattende microsporidia-sporen door de darm. DY96-kleuring maakt ook de visualisatie van chitinebevattende wormembryo's mogelijk voor de gelijktijdige beoordeling van worm graviditeit (vermogen om embryo's te produceren) als een uitlezing van de geschiktheid van de gastheer.

Recent werk heeft aangetoond dat C. elegans geïnfecteerd met N. parisii nakomelingen produceren die robuust resistent zijn tegen dezelfde infectie19. Deze erfelijke immuniteit duurt een enkele generatie en is dosisafhankelijk, omdat nakomelingen van zwaarder geïnfecteerde ouders resistenter zijn tegen microsporidia. Interessant is dat N. parisii-geprimeerde nakomelingen ook resistenter zijn tegen de bacteriële darmpathogeen Pseudomonas aeruginosa, hoewel ze niet beschermd zijn tegen de natuurlijke ziekteverwekker Orsay-virus19. Het huidige werk toont ook aan dat immuungeprimeerde nakomelingen de invasie van gastheercellen door microsporidia beperken. De methode beschrijft ook de verzameling immuungeprimeerde nakomelingen en hoe FISH kan worden gebruikt om N. parisii-RNA in darmcellen te detecteren om gastheercelinvasie en sporenvurente testen 20.

Samen bieden deze protocollen een solide basis voor het bestuderen van microsporidia en erfelijke immuniteit in C. elegans. Het is te hopen dat toekomstig werk in dit modelsysteem belangrijke ontdekkingen op het ontluikende gebied van erfelijke immuniteit mogelijk zal maken. Deze technieken zijn waarschijnlijk ook startpunten voor het onderzoeken van microsporidia-geïnduceerde erfelijke immuniteit in andere gastheerorganismen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De huidige studie maakt gebruik van wild-type C. elegans Bristol stam N2 gekweekt bij 21 °C.

1. Voorbereiding van media

  1. Bereid M9-media voor volgens het vorige rapport21,22.
  2. Bereid nematodengroeimedium (NGM) voor volgens vorig rapport21,22. Giet 12 ml NGM per plaat van 6 cm of 30 ml per plaat van 10 cm.
  3. Bereid Escherichia coli stam OP50-1 voor volgens een eerder rapport23.
  4. Bereid OP50-1-gezaaide NGM-platen voor volgens de onderstaande stappen.
    1. Resuspend 10x geconcentreerd OP50-1 door vortexing.
    2. Gebruik een repeaterpipet om de platen in het midden te zaaien. Voor platen van 6 cm en 10 cm, zaad met een volume van respectievelijk 200 μL of 500 μL.
    3. Gebruik voor platen van 10 cm een glazen strooier om de OP50-1 te verspreiden en een gazon van bacteriën te creëren. Verspreid de bacteriën niet naar de uiterste rand van de plaat.
      OPMERKING: Ethanol dompel en vlam de strooier om de vijf platen om steriliteit te garanderen. Laat de spreader een paar seconden afkoelen voordat je hem verspreidt om te voorkomen dat bacteriën worden gedood.
    4. Laat platen 2 dagen op kamertemperatuur drogen en zorg voor de groei van het bacteriële gazon.
      OPMERKING: Gezaaide platen kunnen 2-3 weken bij kamertemperatuur of tot 1 maand bij 4 °C worden bewaard.

2. Onderhoud van C. elegans

  1. Onderhoud wormen op een constante bacteriële voedselbron op OP50-1-gezaaide NGM-platen.
    OPMERKING: Uithongering kan leiden tot intergenerationele fenotypen, wat de resultaten kan beïnvloeden. Een 10 cm OP50-1-gezaaide plaat ondersteunt 2.500 L1's (het vroegste larvale stadium van C. elegans) gedurende maximaal 72 h.
  2. Als de wormen verhongeren, groei dan drie generaties op OP50-1 voordat je de wormen voor experimenten gebruikt.

3. Synchronisatie van C. elegans populaties met behulp van natriumhypochloriet (bleken)

OPMERKING: Deze stap is zeer tijdgevoelig, dus zorg ervoor dat de centrifuge beschikbaar is voordat u begint. Alternatieve, minder snelle bleekprotocollen zijn beschikbaar in de literatuur en kunnen indien gewenst worden gebruikt. Om te voorkomen dat 6% natriumhypochloriet na verloop van tijd activiteit verliest, bewaart u het reagens in het donker bij 4 °C en bewaart u het maximaal 1 jaar.

  1. Bereid 2 ml bleekoplossing voor elk monster door 400 μl 1 M NaOH, 250 μL 6% natriumhypochloriet (zie materiaaltabel) en 1350 μL gedestilleerd water te mengen.
  2. Was volwassen wormen (~ 72 uur na het uitkomen) van de platen in een microcentrifugebuis met behulp van 1 ml M9-media.
    OPMERKING: Als er veel wormen op de platen achterblijven, pelleteert u de wormen door centrifugering bij 1.400 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur, verwijdert u het supernatant met een pipetpunt van 1 ml en voert u extra plaatwassingen uit.
  3. Centrifugeer bij 1.400 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur om de wormen te pelleteren en was vervolgens 2x met 1 ml M9-media om bacteriën te verwijderen.
  4. Verwijder het supernatant, voeg 1 ml van de bereide bleekoplossing (stap 3.1.) toe en stel een timer in voor 1 min. Keer de buizen 3-4x om.
    OPMERKING: Onder een lichtmicroscoop kunnen de wormen worden gezien om te stoppen met thrashing.
  5. Centrifugeer na 1 minuut bij 3.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur om de wormen te pelleteren, verwijder vervolgens het supernatant en voeg 1 ml verse bleekoplossing toe.
  6. Volg de buis (en) nauwlettend onder een lichtmicroscoop om te visualiseren dat de wormkarkassen openbreken en embryo's vrijgeven. Ga onmiddellijk door naar de volgende stap wanneer ~ 50% -80% van de karkassen is opengebroken en veel embryo's zijn vrijgegeven.
    OPMERKING: Afhankelijk van het aantal dieren en de wormstam kan deze stap 15 s tot 4 minuten duren. Om onbekende redenen doen N. parisii-geïnfecteerde wormen er vaak langer over om te bleken dan niet-geïnfecteerde dieren.
  7. Centrifugeer bij 3.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur om de embryo's te pelleteren en was vervolgens 3x in 1 ml M9-media.
    OPMERKING: Wasbeurten verdunnen de resterende hypochlorietoplossing uit de buizen en moeten snel worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de bleekoplossing de embryo's niet beschadigt.
  8. Voeg 1 ml M9-media toe aan de uiteindelijke pellet en breng over in een conische buis van 15 ml met 4 ml M9-media. Suspensie van de embryo's in een eindvolume van 5 ml.
  9. Draai de buizen op een mechanische rotor (zie materiaaltabel) bij 21 °C gedurende 18-24 uur om de embryo's uit te broeden tot L1's.
    OPMERKING: Omdat N. parisii de darm van de worm infecteert en de kiembaan niet binnendringt, geven geïnfecteerde ouders de infectie niet door aan hun nakomelingen door verticale transmissie19. Het bleken van geïnfecteerde volwassenen synchroniseert F1-dieren en vernietigt N. parisii-sporen , zodat F1-nakomelingen niet worden geïnfecteerd door sporen die van de ouders worden overgedragen.
  10. Centrifugeer de buizen gedurende 1 minuut bij 1.800 x g bij kamertemperatuur om de L1's te pelleteren en gooi alle supernatant weg, behalve 1 ml.
  11. Pipetteer 1-5 μL L1-mengsel op een niet-gezaaide NGM-plaat en tel onmiddellijk het aantal L1's in de druppel door te visualiseren onder een lichtmicroscoop. Herhaal 3x en gemiddelde de tellingen om de concentratie en het totale aantal L1's te bepalen.
    OPMERKING: De meerderheid van de embryo's moet worden uitgebroed en de L1's moeten snel in de vloeistofdruppel bewegen. Als een groot deel van de niet-gehate embryo's en lethargische (langzaam bewegende) L1's achterblijft, duidt dit op te lang bleken.

4. Bereiding van sporen van N. parisii

  1. Bereid N. parisii sporen voor volgens eerder gepubliceerde referenties19,24.

5. Infectie van C. elegans met N. parisii om immuungeprimeerde nakomelingen te produceren

  1. Verplaats een dag voor geplande infecties het vereiste aantal ongeplaatste NGM-platen van 10 cm van 4 °C naar kamertemperatuur.
  2. Centrifugeer onmiddellijk vóór infectie ~ 2.500 gesynchroniseerde L1-wormen bij 1.400 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur in een microcentrifugebuis om de wormen te pelleteren. Verwijder het supernatant met een pipetpunt om wormen achter te laten in ~50 μL M9-media.
  3. Voeg 1 ml 10x OP50-1 toe aan de sporen van L1s en N. parisii tot de gewenste concentratie (meestal ~ 2,5 miljoen sporen). Bereid als een niet-geïnfecteerde controle een equivalente buis van L1s en OP50-1 voor met een volume van M9-media dat overeenkomt met het gebruikte volume van het sporenpreparaat.
    OPMERKING: Om immuungeprimeerde nakomelingen te verkrijgen, gebruikt u een sporendosis die hoog genoeg is, zodat >90% van de dieren binnen 72 uur is geïnfecteerd (zoals gemeten door DY96-kleuring, stap 7), maar laag genoeg zodat >80% van de dieren nog steeds gravid is. Dit zorgt ervoor dat de meeste nakomelingen afkomstig zijn van besmette ouders en dat het bleken van de ouders voldoende embryo's oplevert voor F1-testen. Hoewel sporenpreparaten variëren in concentratie en infectiviteit, ligt een geschikte ouderlijke dosis meestal tussen 5-15 μL sporenpreparaat (~ 2,5 miljoen sporen) per 10 cm plaat.
  4. Vortex kort om de bovenstaande 1 ml wormen te mengen en op een 10 cm ongeplaatste NGM-plaat te plaatsen. Draai om ervoor te zorgen dat de vloeistof zich over de hele plaat verspreidt.
  5. Droog de platen in een schone kast met de deksels eraf gedurende 10-20 min of tot ze volledig droog zijn, voordat ze gedurende 72 uur bij 21 °C worden geëbroed.
  6. Spoel de wormen na 72 uur na infectie (hpi) van de platen in een microcentrifugebuis met behulp van 1 ml M9-media. Als er veel wormen op de platen achterblijven, pelleteert u de wormen door centrifugering op 1.400 x g gedurende 30 s, verwijdert u het supernatant en voert u extra plaatwassingen uit.
  7. Centrifugeer bij 1.400 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur tot pelletwormen, was 2x met 1 ml M9-media of totdat het supernatant helder is. Resuspend in een eindvolume van 1 ml M9-media.
  8. Pipetteer op en neer om te mengen en breng vervolgens 100 μL van de gesuspendeerde wormen over in een verse buis.
    OPMERKING: Dit monster van ~250 volwassenen kan later worden gefixeerd en gekleurd om de geschiktheid en infectiestatus van de ouderlijke worm te bepalen, zoals beschreven in stap 7 en het begin van stap 3.
  9. Om de volwassen wormen open te breken en F1-embryo's vrij te geven voor onderzoek, bleekt u de resterende 900 μL gesuspendeerde wormen, zoals beschreven in stap 3.
    OPMERKING: Deze stap vernietigt ook alle N. parisii-sporen voordat volgende infectietests worden uitgevoerd.

6. Toetsing van de erfelijke immuniteit tegen N. parisii in C. elegans

  1. Voer infecties uit zoals beschreven in stappen 5.1.-5.6., met wijzigingen zoals hieronder vermeld.
    OPMERKING: Infectietests op F1's kunnen worden verkleind en uitgevoerd op NGM-platen van 6 cm met behulp van ~ 1.000 L1-wormen en 400 μL van 10x OP50-1. Een "hoge" dosis sporen moet ook worden gebruikt, zodat ~ 100% van de naïeve F1's (d.w.z. wormen van niet-geïnfecteerde ouders) zijn geïnfecteerd en slechts ~ 10% van de naïeve F1's gravid zijn. Hoewel sporenpreparaten variëren in concentratie en infectiviteit, ligt een geschikte dosis meestal tussen 5-15 μL (~ 2,5 miljoen sporen) per plaat van 6 cm.
  2. Bij 72 hpi, fixeren en vlekken om de wormconditie en infectiestatus te bepalen, zoals beschreven in stap 7.

7. DY96-kleuring van C. elegans om embryo's en microsporidia-sporen te visualiseren

OPMERKING: DY96 is een groene fluorescerende chitine-bindende kleurstof die wormembryo's en microsporidia sporenwanden kleurt 19,15,25. Dit maakt gelijktijdige monitoring van de fitheid en infectiestatus van de wormen mogelijk.

  1. Was de wormen van de platen in een microcentrifugebuis met behulp van 1 ml M9-media met 0,1% Tween-20. Als er veel wormen op de platen achterblijven, pelleteert u de wormen door centrifugering bij 1.400 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur, verwijdert u het supernatant met een pipetpunt en voert u extra plaatwassingen uit.
  2. Centrifugeer bij 1.400 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur om de wormen te pelleteren en was 2x met 1 ml M9-media met 0,1% Tween-20 of totdat het supernatant helder is.
  3. Verwijder het supernatant, voeg 700 μL aceton toe en laat de wormen gedurende 10 minuten op kamertemperatuur fixeren.
    OPMERKING: Op dit punt kunnen de wormen worden bewaard bij -20 °C voor verwerking tot enkele maanden later, indien gewenst.
  4. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur om de vaste wormen te pelleteren en was 2x met 1 ml PBS met 0,1% Tween-20 (PBST).
  5. Bereid 50 ml DY96-werkoplossing: PBST, 0,1% (v/v) natriumdodecylodeylsulfaat (SDS) en 20 μg/ml DY96 (uit een voorraadoplossing van 5 mg/ml in gedestilleerd water) (zie Materiaaltabel). Wikkel de tube in folie en bewaar deze in een lade om blootstelling aan licht te voorkomen.
    OPMERKING: DY96 voorraad- en werkoplossingen kunnen >1 jaar bij kamertemperatuur worden bewaard als ze in het donker worden bewaard.
  6. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur om de wormen te pelleteren en supernatant te verwijderen. Voeg 500 μL DY96-werkoplossing toe aan de pellet en draai gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
  7. Centrifugeer bij 10.000 x g gedurende 30 s bij kamertemperatuur om de wormen te pelleteren. Verwijder het supernatant en voeg 15 μL van het montagemedium met/zonder DAPI toe (zie Materiaaltabel).
  8. Pipetteer 10 μL van de oplossing met gekleurde wormen op een microscoopglaasje en plaats een deklapje over de bovenkant.
    OPMERKING: Dia's en extra monsters kunnen bij 4 °C in het donker worden bewaard voor langdurige opslag.

8. Beeldvorming en analyse van DY96-gekleurde wormen om de wormconditie en infectiestatus te beoordelen

  1. Om de DY96-gekleurde wormen (gemonteerd op dia's, zoals in stap 7.8.) te analyseren, voert u beeldvorming uit met behulp van het GFP-kanaal van een fluorescentiemicroscoop.
  2. Om de fitheid van de wormpopulaties te bepalen, gebruikt u een 5x of 10x-doelstelling om de graviditeit van >100 wormen per aandoening te testen.
    OPMERKING: Wormen die ≥1 embryo dragen, worden als gravid beschouwd. Mechanische celtellers kunnen helpen om menselijke fouten bij het tellen te minimaliseren. Wormembryo's zijn minder gekleurd (minder fluorescerend) dan microsporidia-sporen19. Embryo's zijn eivormig, ~ 50 μm x ~ 30 μm, en worden gevonden in het middenlichaam van gezonde C. elegans-volwassenen . Gezonde, niet-geïnfecteerde volwassenen dragen 10-20 embryo's georganiseerd in rijen langs hun lichaamslengte26.
  3. Om meer subtiele verschillen in fitheid te onthullen, voert u embryotellingen uit. Tel hiervoor handmatig het aantal embryo's in 20-30 individuele wormen per aandoening.
  4. Om te bepalen hoe geïnfecteerd de wormpopulaties zijn, gebruikt u een 5x-40x-objectief om de infectiestatus van > 100 wormen per aandoening te beoordelen. Wormen die een willekeurig aantal intracellulaire darmsporen bevatten, worden als geïnfecteerd beschouwd.
    OPMERKING: Microsporidia sporen zijn helderder dan worm embryo's. De boonvormige sporen van N. parisii zijn ~2,2 μm x ~0,8 μm en worden geproduceerd in de darmcellen van de worm vanaf ~48 hpi15. Wormen waarin sporen uitsluitend in het darmlumen worden gezien en niet langs de darmwanden worden niet als geïnfecteerd beschouwd19. Dit komt omdat deze sporen waarschijnlijk nieuw ingenomen sporen vertegenwoordigen die niet het gevolg zijn van infectie van het individu.
  5. Gebruik beeldanalysesoftware (zie Tabel met materialen) om de parasietbelasting en wormgrootte te kwantificeren volgens de onderstaande stappen.
    1. Afbeelding 20-30 wormen gemonteerd op microscoopglaasjes met behulp van een fluorescerende rechtopstaande stereoscoop voor elk monster. Leg beelden vast in Brightfield-, DAPI- en GFP-kanalen. Kies een geschikte blootstelling in het GFP-kanaal zodat de fluorescentie in de meest geïnfecteerde monsters niet verzadigd is.
      OPMERKING: De infectie kan nog steeds worden gevisualiseerd in de minst geïnfecteerde monsters. Foto's worden meestal gemaakt met een 5x-objectief.
    2. Open bestanden in FIJI/ImageJ. Afhankelijk van het bestandstype kan de plug-in Bio-Formats Importer nodig zijn om afbeeldingen in ImageJ te openen.
    3. Schets 20-30 afzonderlijke wormen in afbeeldingen met behulp van brightfield- of DAPI-afbeeldingen en het gereedschap Polygoonselecties op de werkbalk. Sla elk overzicht op met Analyse > Tools > Regions of Interest (ROI) Manager in het vervolgkeuzemenu door op Toevoegen [t] te klikken. Schets dieren die volledig zichtbaar zijn in het frame.
      OPMERKING: Wormcontouren kunnen later opnieuw worden bekeken door het bestand met contouren op te slaan als een Tiff.
    4. Klik op Deselecteren in de ROI-manager om alle contouren uit de afbeelding te verwijderen en klik op Afbeelding > Dupliceren in het vervolgkeuzemenu. Typ het nummer dat overeenkomt met het gewenste kanaal in het vak "Kanalen" om het GFP-kanaal te dupliceren voor parasietbelasting (bijv. 2).
    5. Drempel dit kanaal met behulp van Afbeelding > Pas > drempel aan tot een niveau waarop de heldere parasietbelasting wordt opgevangen, maar de dimmer fluorescentie van wormembryo's niet, en klik vervolgens op Toepassen. Noteer de toegepaste drempelwaarden en gebruik deze consistent voor alle afbeeldingen van hetzelfde experiment.
      OPMERKING: Controleer of de drempelwaarde een geschikte waarde is voor zowel de minste als de meeste geïnfecteerde monsters voordat u alle afbeeldingen analyseert.
    6. Selecteer Analyseren > Metingen instellen en schakel het selectievakje Gebiedsfractie in. Selecteer op zijn beurt enkele wormcontouren in de ROI-manager en klik op de functie Analyseren > meten . Een resultatenvenster bevat de meting voor %Oppervlakte (d.w.z. % parasietbelasting).
      OPMERKING: Als de fluorescentie van de embryo's zo helder is dat deze de drempel overschrijdt, kan het gereedschap Penseel in zwart in de werkbalk worden gebruikt om deze gebieden handmatig te wissen voordat het %Gebied wordt gemeten.
    7. Om de wormgrootte te bepalen als een uitlezing van de geschiktheid, schetst u wormen zoals beschreven in stap 8.3. Selecteer Analyseren > Metingen instellen en schakel het selectievakje Gebied in. Selecteer op zijn beurt afzonderlijke wormcontouren in de ROI-manager en klik op de functie Analyseren > meten . Een resultatenvenster bevat de meting voor %Area.

9. FISH-test om de invasie van C. elegans door microsporidia en sporenvuren te beoordelen

OPMERKING: De MicroB FISH-sonde herkent een geconserveerd gebied van microsporidisch 18s-rRNA en kan worden gebruikt om intracellulaire sporoplasmata (d.w.z. binnengevallen gastheercellen) en het genetisch materiaal in sporen te labelen.

  1. Infecteer 6.000 bleek gesynchroniseerde L1-wormen met 4 miljoen sporen van N. parisii en 10 μL van 10x OP50-1 in een eindvolume van 400 μL dat is samengesteld uit M9-media.
  2. Zet het mengsel op een 6 cm ongeplaatste NGM-plaat, droog het gedurende 10-20 minuten in een schone kast en plaats het op 21 °C.
  3. Was de dieren na 30 minuten van de platen met 1 ml M9-media met 0,1% Tween-20.
  4. Pellet de wormen door 1 min bij kamertemperatuur te centrifugeren bij 1.400 x g .
  5. Verwijder het supernatant met een pipetpunt, voeg 700 μL aceton toe en laat het 10 minuten op kamertemperatuur staan.
    OPMERKING: Op dit punt kunnen de wormen worden opgeslagen bij -20 °C voor verwerking op een later tijdstip.
  6. Voer 's nachts een FISH-test uit met behulp van de MicroB-sonde na eerder gepubliceerde rapporten27,19.
    OPMERKING: Om het sporenvuren te beoordelen, vult u de laatste 500 μL wasbuffer aan met 20 μg/ml DY96 aan de monsters en roteert u gedurende 30 minuten bij 21 °C voordat u doorgaat met het protocol zoals normaal.
  7. Bewaar de dia's in een diabox bij 4 °C. Voor langdurige opslag (d.w.z. enkele maanden) bewaart u extra monsters in microcentrifugebuizen bij 4 °C in het donker.
  8. Om de invasie in FISH-gekleurde wormen te beoordelen, kijkt u naar de wormen met behulp van het rode kanaal van een fluorescentiemicroscoop. Visualiseer infectiegebeurtenissen bij hoge vergroting (63x objectief) omdat L1-dieren klein zijn en sporoplasmata zich in de vroege stadia van replicatie bevinden. Om sporenvuren te beoordelen, gebruikt u een 63x objectief en zowel rode als groene fluorescentiekanalen.
    OPMERKING: Sporen waarin GFP en mCherry colocaliseren worden als niet-gefired beschouwd; lege GFP-sporenkoffers worden als afgevuurd beschouwd.
  9. Om invasie of sporenvuren te testen, telt u handmatig het aantal sporoplasmata (mCherry foci in de darmcellen) of het percentage sporen dat in 20-30 wormen per aandoening wordt afgevuurd. Pas de focus in het z-vlak aan om alle infectiegebeurtenissen en sporen vast te leggen, die vaak in verschillende vlakken worden aangetroffen.
    OPMERKING: Sporoplasmata worden uitsluitend aangetroffen in de darmcellen. De hoogste concentratie sporoplasmata wordt meestal onmiddellijk na de keelholte gevonden. Als monsters ook worden gekleurd met DY96, zoek dan naar de aanwezigheid van sporoplasmata die niet colocaliseren met de spore.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

In de huidige studie werden ouderpopulaties van C. elegans (P0) in het L1-stadium geïnfecteerd met een lage dosis N. parisii-sporen . Deze infectieomstandigheden worden meestal gebruikt om hoge aantallen microsporidia-resistente F1-nakomelingen te verkrijgen door het bleken van de ouders. Geïnfecteerde ouderlijke populaties en niet-geïnfecteerde controles werden vastgesteld op 72 hpi en gekleurd met DY96 om de wormembryo's en microsporidia-sporen te visualiseren (figuur 1A)...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het huidige protocol beschrijft de studie van microsporidia en erfelijke immuniteit in een eenvoudig en genetisch handelbaar N. parisii -C. elegans infectiemodel.

Sporenpreparaat is een intensief protocol dat doorgaans voldoende sporen oplevert voor 6 maanden experimenten, afhankelijk van de productiviteit24. Belangrijk is dat de infectiviteit moet worden bepaald voor elke nieuwe sporen "partij" voordat het voor de experimenten wordt gebruikt. Vanwege ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We zijn Winnie Zhao en Yin Chen Wan dankbaar voor het geven van nuttig commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant #522691522691).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
2.0 mm zirconia beadsBiospec Products Inc.11079124ZX
10 mL spuitFisher Scientific1482613
5 μm filterMillipore SigmaSLSV025LS
Axio Imager 2Zeiss-Fluorescente microscoop voor het beeldvormen van DY96- en FISH-gekleurde wormen op microscoopglazen
Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom MicroscoopZeiss-Voor live beeldvorming van fluorescente transgene dieren om de IPR te visualiseren
Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean BenchBaker-
Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 VGlobal IndustrialT9FB893150
Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count CytometersFisher ScientificDRM600
Direct Yellow 96Sigma-AldrichS472409-1G
EverBrite Mounting Medium met DAPIBiotium23001
EverBrite Mounting Medium zonder DAPIBiotium23002
Fiji/ImageJ softwareImageJhttps://imagej.net/software/fiji/downloads
Mechanische rotorThermo Sceintific415110 / 1834090806873Gebaten om buizen met gebleekte embryo's te laten draaien voor nachtelijk uitkomen
MicroB FISH probeBiosearch Technologies Inc.-Gesynthetiseerd met een Quasar 570 (Cy3) 5' modificatie en HPLC gezuiverd, CTCTCGGCACTCCTTCCTG
N2Wild-type, Bristol stamStandaard stamCaenorhabditis Genetics Center (CGC)
Natriumdodecylsulfaat (SDS)Sigma-AldrichL3771-100G
Natriumhydroxide oplossing (5 N)Fisher ChemicalFLSS256500
Natriumhypochlorietoplossing (6%)Fisher ChemicalSS290-1
Stemi 508 Stereo MicroscoopZeiss-Voor dagelijks onderhoud van wormen en het tellen van L1 wormen voor assay setups
Tween-20Sigma-AldrichP1379-100ML
Vectashield + A16BiolynxVECTH1500

Referenties

  1. Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938(2019).
  2. Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
  3. Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
  4. The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
  5. Yoshimura, J., et al. Recompleting the Caenorhabditis elegans genome. Genome Research. 29, 1009-1022 (2019).
  6. Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
  7. Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
  8. Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
  9. Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741(2020).
  10. Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276(2020).
  11. Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172(2020).
  12. Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247(2020).
  13. Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011(2019).
  14. Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
  15. Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
  16. Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023(2017).
  17. Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200(2014).
  18. Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
  19. Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
  20. Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458(2022).
  21. Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496(2011).
  22. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , (2006).
  23. Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152(2009).
  24. Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227(2011).
  25. Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
  26. Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  27. Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
  28. Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093(2016).
  29. Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724(2016).
  30. Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309(2008).
  31. Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425(2021).
  32. Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738(2020).
  33. Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Intergenerationele immuniteitNematocida parisiifluorescentiemicroscopieDY96 kleuringfluorescentie in situ hybridisatieparasietenlastfitness van wormen

Gerelateerde artikelen