Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Primaire celculturen om het regeneratiepotentieel van Murine Müller Glia na microRNA-behandeling te bestuderen

2.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63651

⸱

28 maart 2022

 , 
1Department of Biological and Vision Sciences, College of Optometry, The State University of New York

In dit artikel

Samenvatting

Müller glia primaire culturen verkregen uit het netvlies van muizen vormen een zeer robuust en betrouwbaar hulpmiddel om de gliale omzetting in retinale voorlopercellen na microRNA-behandeling te bestuderen. Afzonderlijke moleculen of combinaties kunnen worden getest voordat ze vervolgens in vivo worden toegepast.

Samenvatting

Müller glia (MG) zijn de overheersende glia in het neurale netvlies en kunnen functioneren als een regeneratieve bron voor retinale neuronen. Bij lagere gewervelde dieren zoals vissen vindt MG-gedreven regeneratie van nature plaats; bij zoogdieren is echter stimulatie met bepaalde factoren of genetische/epigenetische manipulatie vereist. Aangezien MG slechts 5% van de retinale celpopulatie uitmaakt, is er behoefte aan modelsystemen die de studie van deze celpopulatie uitsluitend mogelijk maken. Een van deze modelsystemen zijn primaire MG-culturen die reproduceerbaar zijn en kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder moleculen / factorscreening en -identificatie, testen van verbindingen of factoren, celmonitoring en / of functionele tests. Dit model wordt gebruikt om het potentieel van muizen-MG te bestuderen om te converteren in retinale neuronen na suppletie of remming van microRNA's (miRNA's) via transfectie van kunstmatige miRNA's of hun remmers. Het gebruik van MG-specifieke reportermuizen in combinatie met immunofluorescente etikettering en single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) bevestigde dat 80% -90% van de cellen in deze culturen MG zijn. Met behulp van dit model werd ontdekt dat miRNA's MG kunnen herprogrammeren in retinale voorlopercellen (RPC's), die vervolgens differentiëren in neuronaal-achtige cellen. De voordelen van deze techniek zijn dat miRNA-kandidaten kunnen worden getest op hun efficiëntie en uitkomst voordat ze in in vivo toepassingen worden gebruikt.

Inleiding

De Müller glia (MG) zijn de overheersende glia in het neurale netvlies. Ze hebben vergelijkbare functies in vergelijking met andere glia in andere delen van het centrale zenuwstelsel, zoals het handhaven van de water- en ionhomeostase, het voeden van neuronen en het beschermen van het weefsel. MG hebben nog een fascinerend kenmerk: hoewel ze volwassen glia zijn, brengen ze nog steeds veel genen tot expressie die tot expressie komen in retinale voorlopercellen (RPC's) tijdens de late ontwikkeling 1,2. Deze gelijkenis wordt verondersteld de reden te zijn voor de natuurlijk voorkomende op MG gebaseerde neuronale regeneratie in het netvlies van vissen na retinale schade 3,4. Tijdens dit proces komt MG opnieuw in de celcyclus en de-differentieert in RPC's die vervolgens differentiëren in alle zes soorten retinale neuronen. Hoewel dit fenomeen van nature voorkomt bij vissen, zet mg van zoogdieren niet om in neuronen 5,6. Ze kunnen echter worden geherprogrammeerd. Van een verscheidenheid aan factoren is aangetoond dat ze MG herprogrammeren in RPC's / neuronen; een van deze factoren is de basis helix-loop-helix (bHLH) transcriptiefactor achaete-scute homoloog 1 (Ascl1) die betrokken is bij visregeneratie 7,8. Bij muizen komt Ascl1 alleen tot expressie in RPC's tijdens retinogenese, maar is afwezig in volwassen MG- of retinale neuronen9.

Het direct in vivo herprogrammeren van cellen is niet alleen methodologisch uitdagend, maar vereist ook goedkeuring van een instellingscommissie voor dierverzorging en -gebruik. Om goedkeuring te krijgen, zijn voorlopige gegevens nodig over de gebruikte of gewijzigde factor(en), concentraties, off-target effecten, onderliggende mechanismen, toxiciteit en efficiëntie. Celkweeksystemen maken het mogelijk om deze criteria te testen voordat ze in in vivo modellen worden gebruikt. Bovendien, aangezien MG slechts ongeveer 5% van de gehele retinale celpopulatie10 omvat, maken MG-culturen de studie van hun functie11 en hun gedrag mogelijk, inclusief migratie12,13, proliferatie14, stressreactie op letsel / schade15,16, hun interactie met andere celtypen zoals microglia17 of retinale ganglioncellen (RGC's)18, of hun neurogene potentieel 19,20,21. Veel onderzoekers gebruiken onsterfelijke cellijnen voor hun studies, omdat ze een onbeperkt proliferatief potentieel hebben en gemakkelijk kunnen worden onderhouden en getransfecteerd. Primaire cellen hebben echter de voorkeur voor biologisch relevante testen dan vereeuwigde cellen, omdat ze echte celkenmerken hebben (gen- en eiwitexpressie) en, nog belangrijker, ze vertegenwoordigen een bepaald stadium in ontwikkeling en hebben daarom een "leeftijd". De leeftijd van een dier (en bijgevolg van de cellen verkregen van een dier) is een bijzonder cruciale factor bij cellulaire herprogrammering, omdat de plasticiteit van cellen afneemt met het gevorderde stadium van ontwikkeling22.

Dit protocol beschrijft in detail hoe primaire MG met miRNA's kan worden geherprogrammeerd als een huidige in vitro methode voor het bestuderen van regeneratie. Dit MG primaire kweekmodel werd in 2012 opgericht om celproliferatiekenmerken van MG te evalueren bij P53 knock-out muizen (trp53-/- muizen)23. Er werd aangetoond dat gekweekte MG hun gliale kenmerken behouden (d.w.z. expressie van S100β-, Pax6- en Sox2-eiwitten geëvalueerd via immunofluorescente etikettering), en dat ze lijken op in vivo MG (microarray van FACS-gezuiverde MG)23. Kort daarna werden gliale mRNA en eiwitexpressie gevalideerd en bevestigd in een andere benadering met behulp van virale vectoren20. Een paar jaar later werd bevestigd dat de overgrote meerderheid van de cellen in deze culturen MG zijn met behulp van de MG-specifieke Rlbp1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl reporter mouse24. Bovendien toonde kwantificering van de set miRNA's in zowel FACS-gezuiverde MG als gekweekte primaire MG aan dat de niveaus van MG miRNA's (mGLiomiRs) niet veel variëren in gekweekte MG tijdens de groeifase. Langgerekte kweekperioden veroorzaken echter veranderingen in miRNA-niveaus en bijgevolg in mRNA-niveaus en eiwitexpressie, aangezien miRNA's translationele regulatoren zijn25.

In 2013 werd dit MG-cultuurmodel gebruikt om een verscheidenheid aan transcriptiefactoren te testen met betrekking tot hun vermogen om MG te herprogrammeren in retinale neuronen20. Ascl1 bleek een zeer robuuste en betrouwbare herprogrammeringsfactor te zijn. Overexpressie van Ascl1 via virale vectoren veroorzaakte morfologische veranderingen, expressie van neuronale markers en de verwerving van neuronale elektrofysiologische eigenschappen. Wat nog belangrijker is, de inzichten en resultaten verkregen uit deze eerste in vitro experimenten werden met succes overgebracht naar in vivo toepassingen22,26 wat aantoont dat primaire MG-culturen een solide en betrouwbaar hulpmiddel vormen voor initiële factorscreenings en evaluatie van gliale kenmerken voorafgaand aan in vivo implementatie.

Een paar jaar geleden werd aangetoond dat het met de hersenen verrijkte miRNA miR-124, dat ook sterk tot expressie komt in retinale neuronen, Ascl1-expressie kan induceren in gekweekte MG21. Ascl1-expressie in levende cellen werd gevisualiseerd via een Ascl1 reportermuis (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Een reportermuis is een genetisch gemanipuleerde muis waarvan een reporter-gen in zijn DNA is ingebracht. Dit reporter-gen codeert voor een reporter-eiwit, dat in deze studie tdTomato is, een rood fluorescerend eiwit. Dit reporter-eiwit rapporteert de expressie van een gen van belang, in dit geval Ascl1. Met andere woorden, cellen die Ascl1 tot expressie brengen, worden rood. Aangezien Ascl1 alleen tot expressie komt in RPC's9, maakt deze Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl muis het mogelijk om mg-conversie te volgen in Ascl1-expresserende RPC's, wat betekent dat converterende cellen rode fluorescerende tdTomato-reportereiwitten tot expressie zullen brengen. Dit is onomkeerbare etikettering omdat het DNA van deze cellen is veranderd. Bijgevolg zal elke daaropvolgende neuronale differentiatie worden gevisualiseerd omdat het tdTomato-label in differentiërende cellen blijft. Als Ascl1-expressie mg-afgeleide RPC's (met tdTomato-label) differentiëren in neuronen, zullen deze neuronen nog steeds hun rode label hebben. Deze muis maakt daarom niet alleen de etikettering van MG-afgeleide RPC's mogelijk voor live-cell imaging, maar maakt ook fate mapping en lineage tracing van deze MG-afgeleide (rode) RPC's mogelijk. Meer recent werd de set miRNA's in RPC's geïdentificeerd en werden MG-culturen van Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reporter-muizen gebruikt om het effect van deze miRNA's op herprogrammeringscapaciteit en efficiëntie te screenen en te testen27. Eén kandidaat, de RPC-miRNA miR-25, bleek in staat om gekweekte MG te herprogrammeren in Ascl1-expressie (Ascl1-Tomato+) cellen. Deze geherprogrammeerde cellen nemen in de loop van de tijd neuronale kenmerken aan, waaronder neuronale morfologie (kleine somata en korte of lange fijne processen), expressie van neuronale transcripten gemeten via scRNA-Seq, evenals expressie van neuronale eiwitten gevalideerd via immunofluorescente etikettering27.

Hier beschrijft het protocol hoe MG te kweken en te transfecteren van P12-muizen aangepast van het vorige werk 21,24,27. Gekozen voor dit protocol is het eerder genoemde miRNA miR-25, een miRNA dat sterk tot expressie komt in RPC's, met lage expressieniveaus in MG of retinale neuronen. Om miR-25 te overexpressie te geven, worden murine miR-25-mimiek, d.w.z. kunstmatige miRNA-moleculen gebruikt. Als controle worden mimics van een miRNA van Caenorhabditis elegans gekozen, die geen functie hebben in zoogdiercellen. Visualisatie van de omzetting van MG in RPC's werd bereikt via de RPC reporter muis (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), een muis met gemengde achtergrond (C57BL/6, S129 en ICR stammen). Deze kweek kan echter worden uitgevoerd met alle muizenstammen, inclusief wildtype stammen. In de afgelopen jaren is het oorspronkelijke protocol aangepast om de duur van de groeifase en de algehele kweekperiode te verminderen en een robuustere gliacelstatus te garanderen en de mate van cellulaire degeneratie, die optreedt in langdurige kweekperioden, te minimaliseren. Het reguliere transfectietijdvenster werd ook verlengd van 3 uur naar 2 dagen. Zoals eerder vermeld, hoewel het huidige protocol MG-culturen beschrijft als een hulpmiddel voor regeneratiestudies, is de methode niet alleen nuttig voor het testen van herprogrammeringsfactoren, maar kan deze ook worden aangepast voor andere toepassingen, waaronder studies over MG-migratie of proliferatief gedrag, letsel / celschade gerelateerde paradigma's en / of de identificatie van onderliggende mechanismen en paden.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Procedures met betrekking tot dierlijke proefpersonen zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) aan het SUNY College of Optometry.

OPMERKING: Dit kweekprotocol bestaat uit drie fasen: groei, transfectie en conversiefase. Een samenvatting van het algemene protocol met de tijdlijn wordt gegeven in figuur 1.

1. Bereiding van media en alle benodigde reagentia

OPMERKING: Alle stappen moeten worden uitgevoerd in een A2- of B2-bioveiligheidskast (BSC). Tijdens de groeifase wordt een hoog serum groeimedium gebruikt dat bestaat uit een basaal neuronaal medium aangevuld met epidermale groeifactor (EGF). Voor de conversiefase wordt een neurofysiologisch basaal medium met een laag serum, aangevuld met neuronale supplementen, gebruikt om neuronale differentiatie en overleving te garanderen.

  1. Bereid groeimedium voor (gebruikt tijdens de groeifase) door 200 ml basaal neuronaal medium aan te vullen met 20 ml foetaal runderserum (FBS, 10%), 1 ml L-glutamine (0,5%), 2 ml penicilline / streptomycine (1%) en 2 ml N2-supplement (1%). Voer steriele filtratie uit (filtereenheden met een poriegrootte van 0,22 μm). Verwarm het medium voor gebruik voor in een metalen kraalbad van 37 °C.
  2. Bereid neuronaal medium (gebruikt tijdens de conversiefase) volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel) door 100 ml serumvrij neurofysiologisch basaal medium aan te vullen met 2 ml B27 neuronaal supplement (2%), 1 ml N2-supplement (1%), 20 μL 100 ng / ml hersengeoduceerde neurotrofe factor (BDNF, reconstitute in 0,1% runderserumalbumine (BSA) in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, eindconcentratie 20 ng/ml), 20 μl van 100 ng/ml van gliacellen afgeleide neurotrofe factor (GDNF, reconstituet in steriele Hanks' Balanced Salt Solution [HBSS], eindconcentratie 20 ng/ml), 500 μl van 100 mg/ml dibutyryl-cAMP (reconstituet in DMSO), 70 μl ascorbinezuur (reconstituet in steriel PBS) en 1,5 ml penicilline/streptomycine. Voer steriele filtratie uit (filtereenheden met een poriegrootte van 0,22 μm). Voorverwarm medium voor gebruik in een metalen kraalbad van 37 °C.
    OPMERKING: Deze media kunnen gedurende 1 maand bij 4 °C worden bewaard.
  3. Reconstitueer Papaïne, DNase I en Ovomucoïde reagentia die nodig zijn voor retinale dissociatie volgens het protocol van de fabrikant. Aliquot 750 μL Papaïne in steriele buizen van 1,5 ml, 75 μL DNase I in steriele buisjes van 0,6 ml en 750 μL ovomucoïde proteaseremmer in buisjes van 2 ml. Vries Papaïne en DNase I aliquots in bij -20 °C en bewaar ovomucoïde aliquots bij 4 °C om afbraak van de reagentia te voorkomen. Ontdooi bij kamertemperatuur vlak voor gebruik.
    OPMERKING: Papaïne, DNase I en Ovomucoid zijn te vinden in een kit genaamd Papain Dissociation System (zie Tabel van materialen).
  4. Poly-L-ornithine (Poly-O) en Laminine reconstitueren voor coverslipcoating als immunofluorescente etikettering wordt uitgevoerd volgens de instructies van het gegevensblad (Poly-O: 0,1 mg/ml in steriel water; Laminine: verdun 1,2 mg / ml na 1:50 in DMEM). Aliquot Poly-O en Laminin (2,5 ml) en vries aliquots in bij -20 °C. Ontdooi bij kamertemperatuur vlak voor gebruik.
    OPMERKING: Stap 1.4. is alleen vereist als immunofluorescente etikettering en laserscanmicroscopie wordt uitgevoerd.

2. Muizen en weefselextractie

OPMERKING: Voor deze herprogrammeringsstudies is de Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl muis gemaakt door een Ascl1CreERT muis (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) te kruisen met een tdTomatoSTOPfl/fl muis (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914). Deze muis heeft een gemengde achtergrond (C57BL/6, S129 en ICR stam). Het genotype van deze muis is weergegeven in figuur 1A. Alle stammen kunnen voor dit protocol worden gebruikt.

  1. Draag handschoenen en ontsmet de werkruimte, inclusief dissectiemicroscoop en alle fijne gereedschappen (Dumont # 5 fijne en Dumont # 7 gebogen tang, fijne schaar en Vannas-schaar) met 70% ethanol. Ontsmet een 10 cm siliconen gecoate zwarte dissectieschaal door deze gedurende 20 minuten bloot te stellen aan UV-licht.
  2. Bereiding van gerechten en borden voor weefselextractie
    1. Bereid een plaat met 24 putten voor oogverzameling en monsterscheiding (twee ogen per muis in één putje, gelabeld met muis-ID's) met ~ 1 ml koude HBSS (4 °C) per putje. Leg de 24-well plaat op ijs.
    2. Vul een steriele petrischaal van 10 cm (om te wassen) en de ontsmette, met siliconen gecoate dissectieschaal met enkele ml koude HBSS (4 °C) om ervoor te zorgen dat het weefsel volledig bedekt is met HBSS.
    3. Bereid een steriele buis van 1,5 ml met 1 ml 70% ethanol.
    4. Bereid een kweekplaat met 12 putten voor door de plaat te labelen met kweeknummer, datum, stam en alle vereiste informatie.
  3. Euthanaseer P12-muizen met behulp van een goedgekeurde methode.
  4. Oogverwijdering
    1. Houd de muiskop voorzichtig met de duim en wijsvinger rond het oog.
    2. Gebruik Dumont #7 gebogen tang, ga voorzichtig achter de oogbol en klem de oogzenuw. Haal voorzichtig het oog eruit.
      OPMERKING: Als volwassen muizen worden gebruikt, gebruik dan geen gebogen tang en trek niet aan het oog. Knip in plaats daarvan voorzichtig rond de oogbol met een fijne schaar; snijd de oogzenuw door, maar snijd het oog zelf niet door. Gebruik een tang om de oogbol voorzichtig te verwijderen.
  5. Oogbolreiniging
    1. Dompel de oogbol kort in een ethanolhoudende buis om overdracht van bacteriën van het dier te voorkomen.
    2. Was de oogbol kort in de petrischaal van 10 cm voordat u deze in de 24 putplaat op ijs plaatst.
  6. Herhaal stap 2.4 en 2.5 voor de andere ogen. Houd de putplaat tijdens het proces op het ijs. Plaats twee ogen van één dier in de dissectieschaal die onder een dissectiemicroscoop met een lichtbron wordt geplaatst.
  7. Retina-extractie
    1. Fixeer één oogbol door de oogzenuw en het omliggende bindweefsel rond de sclera te grijpen met Dumont #5 fijne tang en druk deze voorzichtig tegen de dissectieschaal (hoornvlies naar boven).
    2. Maak een gat in het midden van het hoornvlies met behulp van een naald van 30 G om de Vannas-schaar gemakkelijker toegankelijk te maken.
    3. Ontleed het hoornvlies rond het ciliaire lichaam met een Vannas-schaar en verwijder hoornvlies, lens, iris en glasachtig lichaam voorzichtig met Dumont # 5 fijne tang. Figuur 2A illustreert een oogschelp met het netvlies erin.
    4. Ontleed de sclera met een Vannas-schaar totdat de oogzenuw is bereikt. Klem de oogzenuw vast en haal het netvlies voorzichtig tevoorschijn met een dumont #5 fijne tang.
    5. Gebruik een tweede paar Dumont #5 fijne tangen om tegen het netvlies te duwen en het glasvochtlichaam volledig te verwijderen. Figuur 2B illustreert twee geëxtraheerde netvliezen.
  8. Overbrengen en wassen
    1. Snijd ongeveer 2,5 cm van de punt van een steriele transferpipet om de diameter te vergroten. Gebruik deze tip om hele netvliezen op te pakken (op te zuigen) zonder het weefsel te beschadigen.
    2. Breng de netvliezen over in een nieuwe steriele petrischaal met koude HBSS (4 °C) en schommel de schaal (heen en weer, links en rechts).
    3. Gebruik de transferpipetpunt en duw de netvliezen voorzichtig rond om retinale pigmentepitheelcellen (RPE) af te spoelen.
      OPMERKING: Als alternatief kan het hele netvlies met lens en glasachtig lichaam uit de oogschelp worden verwijderd. Vervolgens kunnen de lens en het glasachtig lichaam van het geëxtraheerde netvlies worden verwijderd. Als het netvlies is gescheurd, zorg er dan voor dat u alle stukken verzamelt voor dissociatie; anders zullen er onvoldoende hoeveelheden weefsel zijn om confluente cellagen te laten groeien.
  9. Plaats het geïsoleerde netvlies onmiddellijk in een nieuwe, schone put van de 24-well plaat gevuld met 1 ml HBSS. Houd de 24-well plaat op het ijs tijdens het dissectieproces.
  10. Herhaal stap 2.7-2.9 om het tweede netvlies te isoleren.

3. Retina dissociatie

OPMERKING: Alle volgende stappen (tot de celoogst) moeten worden uitgevoerd in een A2- of B2-bioveiligheidskast (BSC).

  1. Bereid het papaïne/DNase I dissociatiemengsel als volgt.
    1. Voeg voor zes netvliezen 75 μL DNase I toe aan de buis met 750 μL Papaïne (vanaf stap 1.3) en meng voorzichtig (dissociatiemengsel).
    2. Voor individuele monstervoorbereiding die nodig is voor dit protocol, splitst u het totale volume van 825 μL in drie aliquots: 275 μL van het mengsel in één buis van 1,5 ml per muis (twee netvliezen). Bereken de benodigde hoeveelheden DNase I en Papain dienovereenkomstig.
      OPMERKING: Maximaal zes netvliezen kunnen worden gedissocieerd in één tube Papaïne / DNase I-mengsel. Individuele monstervoorbereiding resulteert echter in minder klonten en een betere celgroei dan in gecombineerde monsters.
  2. Breng twee netvliezen over naar het papaïne/DNase I-dissociatiemengsel. Gebruik een transferpipet met een vergrote tipdiameter (stap 2.8.1), pak de netvliezen op, wacht tot de netvliezen zich aan de onderkant van de punt nestelen en laat vervolgens de netvliezen zonder overmatig HBSS los in de buis met papaïne/DNase I-mengsel.
  3. Plaats op een nutator en incubeer deze gedurende 10 minuten in een celkweekincubator (37 °C, 5% CO2).
  4. Dissociëer de cellen door voorzichtig op en neer te pipetteren (ongeveer 20-30 keer) met een pipet van 1 ml. Nadat cellen zijn gedissocieerd (d.w.z. resulterend in een homogene oplossing zonder brokken), voegt u 275 μL ovomucoïde proteaseremmer uit de Papain Dissociation Kit toe om de Papain te neutraliseren. Meng voorzichtig door op en neer te pipetteren.
    OPMERKING: Als zes netvliezen werden gedissocieerd in 825 μL Papaïne/DNase I-mengsel, is 825 μL ovomucoïde vereist.
  5. Centrifugeer het mengsel bij 300 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C.
  6. Voeg epidermale groeifactor (EGF, 1 μL per 1 ml van het groeimedium, gereconstitueerd bij 200 μg/ml in PBS) toe aan het berekende volume groeimedium (1 ml per muis) voorverwarmd bij 37 °C.
    OPMERKING: Afhankelijk van het experimentele ontwerp kunnen de proliferatiemarker 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), evenals 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) of andere vereiste factoren aan het begin van de kweekperiode worden toegevoegd.
  7. Verwijder de buisjes voorzichtig uit de centrifuge. Raak de pellet aan de onderkant van de buis niet aan.
  8. Verwijder het supernatant voorzichtig en volledig. Resuspendeer de celpellet met 500 μL EGF-aangevuld groeimedium.
  9. Breng de celsuspensie over in een put van de gelabelde 12-well plaat (figuur 2C). Spoel de buis af met nog eens 500 μL van het met EGF aangevulde groeimedium en voeg deze toe aan de put (totaal volume van 1 ml per putje).
  10. Herhaal stap 3.8 en 3.9 met alle andere voorbeelden.
  11. Schommel de putplaat drie keer voorzichtig (heen en weer; links en rechts). Plaats de plaat in de incubator (37 °C, CO2).
    OPMERKING: Als transgene muizen worden gebruikt, voer dan genotypering uit voor elk dier (figuur 2D). Identificeer Cre-recombinase positieve en negatieve muizen en label de plaat dienovereenkomstig. Voor dit protocol werden alleen cellen van Cre-recombinasepositieve reportermuizen gebruikt voor de volgende stappen. Cellen van Cre-negatieve monsters worden ingevroren en gebruikt voor andere toepassingen.

4. Groeifase

OPMERKING: De groeifase duurt ongeveer 4-5 dagen (figuur 1B). Voor het toevoegen van vloeistoffen aan putten die cellen bevatten, moet de pipet naar de wand van de put wijzen en moet de vloeistof langzaam worden vrijgegeven om celloslating te voorkomen. Pipetteer niet direct op de cellen.

  1. Verwijder een dag na dissociatie het medium en voeg 1 ml vers met EFG aangevuld groeimedium toe.
  2. Verwijder op dag 3 het medium en voeg 1 ml HBSS (kamertemperatuur) toe om celresten te verwijderen. Schommel zachtjes heen en weer van links naar rechts. Verwijder HBSS, herhaal de wasstap en voeg 1 ml voorverwarmd EGF-aangevuld groeimedium toe.
  3. Controleer de cellen elke dag en evalueer hun groeistatus totdat de cellen 90% -100% samenvloeiing bereiken. Figuur 3 toont een voorbeeld van goede MG-groei in de loop van de tijd. Controleer op mogelijke besmetting of celdood (aanvullende figuur 1). Gooi besmette culturen weg.
    OPMERKING: Als u de celstatus wilt controleren en opnemen, maakt u afbeeldingen met verschillende vergrotingen met behulp van een lichtmicroscoop met een aangesloten camera en 4x, 10x of 20x objectieven. In deze studie wordt een fluorescentiemicroscoop gebruikt.

5. Bereiding van coverslips met poly-L-ornithine (Poly-O) en Laminin-vacht

OPMERKING: Deze stap is alleen nodig als immunofluorescente etikettering en confocale laserscanmicroscopie worden uitgevoerd. Ronde glazen afdekplaten (12 mm diameter) zijn vereist voor een goede beeldvorming. Het coatingprotocol is ook te vinden in de neuronale medium datasheet (zie Tabel van materialen).

  1. Plaats steriele coverslips voorzichtig in het midden van elke put van een 24-well plaat met behulp van steriele Dumont #2AP tang.
    LET OP: Plaats coverslips in het midden van de put. Het plaatsen van coverslips dicht bij de wand van een put zal oppervlaktespanningsproblemen veroorzaken voor de volgende stappen.
  2. Ontdooi een 2,5 ml Poly-O aliquot bij kamertemperatuur en plaats er 100 μL van in het midden van elke coverslip.
  3. Incubeer de putplaat gedurende 30 minuten in een incubator van 37 °C.
  4. Verwijder Poly-O en was de put met de coverslip drie keer met ~1 ml steriel water.
  5. Laat de putplaat een nacht drogen in de BSC. Ontdooi 2,5 ml Laminin bij 4 °C 's nachts.
  6. Voeg de volgende ochtend 100 μL Laminin toe in het midden van elke coverslip en incubeer gedurende 4 uur in een incubator van 37 °C.
  7. Verwijder de Laminin voorzichtig en volledig.
  8. Houd de plaat op 4 °C als het passeren niet onmiddellijk kan worden uitgevoerd.
    LET OP: De gecoate coverslips in geprepareerde platen kunnen enkele dagen bij 4 °C worden bewaard.

6. Celpassage om neuronale overlevenden te verwijderen

OPMERKING: Celpassage is nodig om neuronale cellen te verwijderen, niet om de celpopulatie te vergroten. Glia delen slechts een paar keer en zullen na passage niet verder groeien. Verdun de celsuspensies niet. De cellen van een confluente put van een 12-well plaat kunnen worden verdeeld over een put van een 12-well plaat of twee putten van een 24-well plaat. Wanneer gecoate coverslips worden gebruikt, is slechts ongeveer een derde van de coverslip gecoat. Daarom kunnen zes coverslips in een 24-well plaat, met confluente cellen (~ 80% -90%) worden verkregen uit één put van confluente cellen van een 12-well plaat. Andere verhoudingen kunnen ook worden gekozen om de celdichtheid te verhogen of te verlagen. Voor dit protocol wordt één Cre+ reportermuis gebruikt [één experiment, twee behandelingen: miR-25 of control-miR; technische replicaties n = 3 (drie coverslips per behandeling), biologische replicaat n = 1]. Het aantal technische en biologische replicaties kan verschillend worden gedefinieerd, afhankelijk van het experimentele ontwerp.

  1. Controleer of de cellen 90%-100% confluent zijn (ook aan de rand van de put; Figuur 3E,F).
  2. Verwijder het medium en voeg 1 ml HBSS (kamertemperatuur) toe om te wassen. Schommel de plaat voorzichtig (heen en weer, links en rechts). Verwijder HBSS volledig.
  3. Voeg 500 μL van een voorverwarmde trypsinehoudende oplossing (voorverwarmd bij 37 °C in een metalen kralenbad) toe om de cellen van de put los te maken. Schommel zachtjes (heen en weer, van links naar rechts) en incubeer gedurende 2 minuten in een incubator van 37 °C.
  4. Verplaats de plaat van de incubator naar BSC. Tijdens het kantelen, aspirateer de trypsine-bevattende oplossing en verspreid deze voorzichtig en langzaam over de put meerdere keren totdat de cellen volledig loskomen. Houd de plaat tegen het licht en zorg ervoor dat er aan de onderkant geen cellen achterblijven.
  5. Breng deze celsuspensie over in een steriele buis van 1,5 ml. Centrifugeer bij 300 x g gedurende 8 minuten bij 4 °C.
  6. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet voorzichtig door toevoeging van 600 μL (100 μL per putje voor 6 putjes/coverslips) voorverwarmd groeimedium (aangevuld met EFG; 1:1000). en pipetteren op en neer ~ 30-40 keer.
    OPMERKING: De cellen kunnen op dit moment worden ingevroren bij -80 °C of in vloeibare stikstof en ontdooid volgens standaardprotocollen voor het ontdooien van cellijnen. Als cellen worden ingevroren, worden ze niet geresuspendeerd in EFG-aangevuld medium (groeimedium). Ze worden geresuspendeerd in basismedium (zonder EFG) en vriesoplossing (1/1-verhouding). In de stappen 6.1.1 tot en met 6.6.2 worden de stappen beschreven voor het bevriezen van de cellen. Als er geen cellen zijn bevroren, gaat u verder met stap 6.7.
    1. Bereid de vriesoplossing door 100 μL DMSO en 400 μL FBS (totaal volume van 500 μL per put/monster) te mengen.
    2. Resuspendeer de celpellet in 500 μL voorverwarmd groeimedium. Voeg de celsuspensie toe aan 500 μL DMSO/FBS-vriesoplossing (totaal volume van 1 ml). Bewaar buisjes op ijs totdat alle monsters zijn verwerkt. Vries cellen in bij -20 °C gedurende 1 uur en bewaar ze vervolgens bij -80 °C.
  7. Zaadcellen door 100 μL van de 600 μL cel/media suspensie (stap 6.6) in het midden van zes gecoate coverslips (zie stap 5) van de 24-well plaat te plaatsen. Plaats het bord voorzichtig in de couveuse en laat de cellen bezinken.
    OPMERKING: 100 μL van de 600 μL celsuspensie (geoogst uit één put van een 12-well plaat) zal resulteren in 90% -100% celconfluentie, die nodig is voor transfectie.
  8. Controleer de cellen na 3 uur om te zien of ze zich op de coverslip hebben gevestigd. Voeg 400 μL groeimedium aangevuld met EFG toe.
    OPMERKING: Cellen zijn meestal klaar voor transfectie de volgende dag (figuur 3G). Als ze niet samenvloeien (90%-100%), laat ze dan nog een dag staan. Als ze nog steeds niet samenvloeien, gebruik ze dan niet voor transfectie. Als andere downstream-toepassingen worden uitgevoerd, zoals miRNA-profilering, RNA-Seq, RT-qPCR of western blot, moeten cellen worden doorgegeven aan 12-wellplaten (1: 1-verhouding; geen plaatbehandeling vereist) en geoogst voor RNA / eiwitextractie.

7. Transfectie

OPMERKING: De transfectiefase bestaat uit een 3 h-fase in transfectiemedium alleen (transfectieprocedures worden beschreven in het transfectiehandboek dat bij het transfectieregens wordt geleverd) en een langwerpige fase waarin transfectiereagens en miRNA's nog steeds aanwezig zijn, maar neuronaal medium met vereiste supplementen wordt toegevoegd (totale duur is 2 dagen; Figuur 1B). In dit protocol worden zes putten getransfecteerd: drie putten ontvangen het herprogrammerende miRNA miR-25 en drie putten ontvangen het controle-miRNA.

  1. Controleer of de cellen 90% samenvloeiing hebben bereikt en registreer/ beeld de cellen vóór de transfectie.
  2. Verwijder het groeimedium en voeg 500 μL HBSS (kamertemperatuur) toe om de cellen te wassen.
  3. Verwijder HBSS en voeg 400 μL gereduceerd serummedium toe dat wordt gebruikt voor transfecties. Plaats de plaat terug in een incubator van 37 °C.
  4. Bereid het transfectiemengsel volgens de instructies van het transfectiereagensprotocol van de fabrikant. Maak twee mengsels: transfectiereagensmengsel en miRNA-mengsel (zie figuur 1B ter illustratie).
    1. Bereid het transfectiereagensmengsel: Voor een 24-wellsplaat zijn 49 μL gereduceerd serummedium en 1 μL transfectiereagens nodig voor één put (50 μL in totaal). Voor zes putten worden 294 μL gereduceerd serummedium en 6 μL transfectiereagens gecombineerd en goed gemengd door voorzichtig op en neer te pipetteren.
    2. Bereid miRNA-nabootsingsmengsel: Voor een 24-wellsplaat is een totaal volume van 50 μL van het mimische mengsel vereist voor één put. Drie putten krijgen het controle-miRNA en de andere drie putten worden behandeld met miR-25. Voor dit protocol wordt een eindconcentratie van 200 nM gebruikt.
      1. Voor de miR-25-behandeling (drie putjes) worden 150 μL gereduceerd serummedium en 3 μL miR-25-mimics (100 μM stockoplossing) gecombineerd en goed gemengd door voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende 5 min.
        Voor de controle-mimicsbehandeling (drie putjes) worden 150 μL gereduceerd serummedium en 3 μL control-miRNA-mimics (100 μM stockoplossing) gecombineerd en goed gemengd door voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende 5 min.
        OPMERKING: Het volume van miRNA-nabootsingen is afhankelijk van de verdunningsfactor en de benodigde concentratie (20-500 nM). miRNA-remmers (antagomiRs), of andere moleculen waaronder plasmiden, kunnen ook worden gebruikt. Ook zijn combinaties van moleculen mogelijk om getransfecteerd te worden.
  5. Combineer miRNA-nabootsingsmengsel en transfectiereagensmengsel. Meng voorzichtig door langzaam en grondig te pipetteren door voorzichtig op en neer te pipetteren. Incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur (volgens de instructies van de fabrikant).
  6. Voeg het bovenstaande transfectiemengsel druppelsgewijs en langzaam bovenop de cellen toe, dicht bij het mediaoppervlak in de put met behulp van een pipet van 20 μL. Schommel de plaat zachtjes (heen en weer, van links naar rechts).
  7. Incubeer gedurende 3 uur in een incubator van 37 °C.
  8. Voeg na 3 uur neuronaal medium toe aan de putten (500 μL per put) aangevuld met 4-Hydroxytamoxifen (5 mM stam gereconstitueerd met 2,58 ml ethanol, 250 nM eindconcentratie) om het Cre-recombinase en 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU, 10 mM stamoplossing gereconstitueerd met 2 ml DMSO, 1 μM eindconcentratie) te activeren om de celproliferatie te volgen.
    LET OP: 4-Hydroxytamoxifen en EdU staan bekend als kankerverwekkende stoffen, teratogenen en mutagene stoffen voor de mens. Lees het veiligheidsinformatieblad voor gebruik en draag handschoenen, een bril en een laboratoriumjas. Reconstitueer beide reagentia volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Inhaleer de stof/het mengsel niet. Sluit na gebruik goed. Afvalmateriaal moet worden verwijderd volgens nationale en lokale voorschriften. Was handen en gezicht na het werken met de stof.
  9. Incubeer gedurende 2 dagen in een incubator van 37 °C (figuur 1B).

8. Celconversie

OPMERKING: De celconversiefase heeft een duur van ongeveer 5-6 dagen (figuur 1B), maar langere perioden zijn mogelijk.

  1. Controleer cellen dagelijks op succesvolle inductie van tdTomato-expressie, mogelijke celdood en/of besmetting. De celdichtheid verandert niet (figuur 4). Eerste vage rode fluorescerende cellen kunnen 1 dag na de behandeling met 4-Hydroxytamoxifen worden waargenomen. Een fluorescerende microscoop is nodig om de cellen te bewaken en in beeld te brengen.
    OPMERKING: In deze studie wordt een fluorescentiemicroscoop gebruikt voor live beeldvorming. Foto's worden gemaakt met 4x, 10x of 20x objectieven.
  2. Verwijder twee dagen na transfectie het medium en voeg 500 μL voorverwarmd neuronaal medium toe, aangevuld met 4-Hydroxytamoxifen en EdU in elk putje.
  3. Vervang het medium om de dag door een vers medium totdat de cellen geoogst zijn.
  4. Maak live beelden voor evaluatie en beoordeling van het aantal rode fluorescerende (Ascl1-expressie) cellen en hun morfologische veranderingen (figuur 4 en figuur 5A-C).

9. Celoogst: fixatie voor immunofluorescente etikettering

OPMERKING: Cellen kunnen worden geoogst voor andere downstream-toepassingen, waaronder bulk of scRNA-Seq, RT-qPCR of western blot.

  1. Verwijder het medium en voeg 500 μL koud HBSS (4 °C) per putje toe en schommel de plaat voorzichtig (heen en weer, van links naar rechts). Verwijder HBSS.
  2. Fixeer de cellen door 500 μL 2% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
  3. Voer immunofluorescente etikettering uit volgens vastgestelde protocollen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol beschrijft hoe MG uit de retinas van P12-muizen kan groeien en hoe deze cellen met miR-25 kunnen worden geherprogrammeerd tot retinale neuronen met behulp van de Ascl1CreERT: tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reportermuis. Deze methode werd gebruikt in eerder werk dat in detail andere geschikte miRNA's (mimics of remmers, als enkele moleculen of in combinatie) rapporteerde om MG te herprogrammeren in RPC die vervolgens neuronale celkenmerken aannemen27. Deze metho...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft hoe MG kan worden gekweekt uit gedissocieerde netvliezen van muizen voor herprogrammeringsstudies met behulp van miRNA's. Zoals aangetoond en bevestigd in een verscheidenheid aan eerdere studies, is de overgrote meerderheid (80% -90%) van de cellen in deze culturen MG 20,23,24. Deze methode is een zeer robuuste en betrouwbare techniek en de resultaten kunnen gemakkelijk worden gereproduceerd als het proto...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

Een patent met enkele van de bevindingen in dit rapport is aangevraagd door de Universiteit van Washington met uitvinders Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl en Thomas A. Reh. Het patent is getiteld ''Methoden en samenstellingen om retinale regeneratie te stimuleren.

Dankbetuigingen

De auteurs bedanken Dr. Ann Beaton en alle lableden voor hun input over het manuscript. Speciale dank gaat uit naar Drs. Tom Reh, Julia Pollak en Russ Taylor voor het introduceren van MG primaire culturen als een screeningsinstrument voor S.G.W. tijdens postdoctorale training aan de Universiteit van Washington in Seattle. De studie werd gefinancierd door de Empire Innovation Program (EIP) Grant aan S.G.W. en start-upfondsen van SUNY Optometry tot S.G.W., evenals de R01EY032532 award van het National Eye Institute (NEI) aan S.G.W.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Dieren
Ascl1-CreERT muis Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JJax laboratoria#012882Ascl1-CreERT muizen werden gekruist met tdTomato muizen
tdTomato-STOPfl/fl muis  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JJax laboratoria#007914Genotypering is vereist om Ascl1CreER positieve muizen te identificeren
Reagentia
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z-isomeerSigma-AldrichH7904-5MGgereconstitueerd in ethanol, ingevroren aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) waterige oplossingVWR100504-7822% PFA gemaakt met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), ingevroren aliquots
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Konijn IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152verdunning 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Geit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories705-606-147verdunning 1:500
Anti-menselijk Otx2 Antilichaam, R&D SystemsFisher ScientificAF1979verdunning 1:500
Anti-konijn MAP2 antilichaamSigma-AldrichM9942-200ULverdunning 1:250
Anti-Rode Fluorescentie Eiwit (RFP) antilichaamAntibodies-OnlineABIN334653verdunning 1:500
AscorbinezuurSTEMCELL Technologies72132gereconstitueerd in PBS, ingevroren aliquots
B-27 SupplementFisher Scientific17-504-044ingevroren aliquots
Brain Phys Neuronal MediumSTEMCELL Technologies05790gebruikt als neuronaal medium in sectie 1.2, bewaar bij 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitFisher ScientificC10340reconstitueer volgens handleiding, 4°C
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73886gereconstitueerd in Dimethyl sulfoxide (DMSO), ingevroren aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificMT-25950CQC
Fetaal Rundserum (FBS)Fisher ScientificMT35010CVingevroren aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX SupplementFisher Scientific51-985-034bewaar bij 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), fenol roodFisher Scientific12-605-028gebruikt als oplossing met trypsine, bewaar bij 4 °C
HBSSFisher Scientific14-025-134bewaar bij 4 °C
Laminine muis eiwit, natuurlijkFisher Scientific23-017-015

ingevroren aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-GlutamineFisher Scientific25-030-081ingevroren aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negatieve ControleHorizonCN-001000-01-50gereconstitueerd in RNase-vrij water (200 µM), ingevroren aliquots
miRIDIAN microRNA Muis mmu-miR-25-3p mimicHorizonC-310564-05-0050gereconstitueerd in RNase-vrij water (200 µM), ingevroren aliquots
N-2 SupplementFisher Scientific17-502-048ingevroren aliquots
Neurobasal MediumFisher Scientific21-103-049gebruikt voor groeimedium in sectie 1.1, bewaar bij 4 °C
Papaine Dissociatie SysteemWorthington BiochemicalLK003153gereconstitueerd in Earle's Balanced Salt Solution, ingevroren aliquots
Penicilline StreptomycineFisher Scientific15-140-122ingevroren aliquots
Fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS)Fisher Scientific20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma-AldrichP4538-50MGgereconstitueerd in steriele water, ingevroren aliquots
Recombinant Humaan BDNF EiwitR&D Systems248-BDB-050/CFgereconstitueerd in steriele PBS en FBS, ingevroren aliquots
Recombin

Referenties

  1. Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
  2. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
  3. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  4. Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632(2020).
  5. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
  6. Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
  7. Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
  8. Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
  9. Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
  10. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  11. Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
  12. Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
  13. Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330(2020).
  14. Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
  15. Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
  16. Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
  17. Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173(2011).
  18. Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759(2020).
  19. Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
  20. Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
  21. Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
  22. Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
  23. Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
  24. Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423(2016).
  25. Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377(2019).
  26. Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
  27. Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556(2019).
  28. Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
  29. Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
  30. Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204(2020).
  31. Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
  32. Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603(2017).
  33. Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
  34. Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
  35. Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
  36. Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279(2020).
  37. Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
  38. Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
  39. Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
  40. Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
  41. Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817(2011).
  42. VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615(2020).
  43. Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
  44. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
  45. Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
  46. Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
  47. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408(2011).
  48. Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
  49. Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
  50. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
  51. Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
  52. Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
  53. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
  54. Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
  55. Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
  56. Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

Müllergiaprimaire celkweekretina-progenitorcellenretina-regeneratieimmunofluorescentie-labelingsingle-cell RNA-sequencingneuronale differentiatieceltransfectieregeneratieve geneeskunde
Primaire celculturen om het regeneratiepotentieel van Murine Müller Glia na microRNA-behandeling te bestuderen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.