Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Nitroreductase/metronidazol-gemedieerde ablatie en een MATLAB-platform (RpEGEN) voor het bestuderen van regeneratie van het retinale pigmentepitheel van de zebravis

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/63658

⸱

2 maart 2022

 ,  , 
1Department of Ophthalmology, Louis J. Fox Center for Vision Restoration, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Earth Research Institute, University of California, Santa Barbara, 3Department of Developmental Biology, University of Pittsburgh School of Medicine

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol beschrijft de methodologie om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van een transgeen zebravismodel. Het aanpassen van het protocol om signaleringsroutemodulatie met behulp van farmacologische verbindingen op te nemen, is uitgebreid gedetailleerd. Een MATLAB-platform voor het kwantificeren van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie werd ontwikkeld en wordt gepresenteerd en besproken.

Samenvatting

Het retinale pigmentepitheel (RPE) bevindt zich aan de achterkant van het oog en vervult functies die essentieel zijn voor het behoud van de gezondheid en integriteit van aangrenzende retinale en vasculaire weefsels. Op dit moment heeft de beperkte herstelcapaciteit van RPE bij zoogdieren, die beperkt is tot kleine verwondingen, de vooruitgang in het begrijpen van in vivo RPE regeneratieve processen belemmerd. Hier wordt een gedetailleerde methodologie gegeven om de studie van in vivo RPE-reparatie met behulp van de zebravis te vergemakkelijken, een gewerveld model dat in staat is tot robuuste weefselregeneratie. Dit protocol beschrijft een transgeen nitroreductase/metronidazol (NTR/MTZ)-gemedieerd letselparadigma (rpe65a:nfsB-eGFP), dat resulteert in ablatie van de centrale tweederde van de RPE na 24 uur behandeling met MTZ, met daaropvolgend weefselherstel. De nadruk wordt gelegd op RPE-ablaties in larvale zebravissen en methoden voor het testen van de effecten van farmacologische verbindingen op RPE-regeneratie worden ook geschetst. Generatie en validatie van RpEGEN, een MATLAB-script dat is gemaakt om de kwantificering van RPE-regeneratie op basis van pigmentatie te automatiseren, wordt ook besproken. Naast actieve RPE-reparatiemechanismen kan dit protocol worden uitgebreid naar studies van RPE-degeneratie en letselresponsen, evenals de effecten van RPE-schade op aangrenzende retinale en vasculaire weefsels, naast andere cellulaire en moleculaire processen. Dit zebravissysteem is veelbelovend bij het identificeren van genen, netwerken en processen die RPE-regeneratie en RPE-ziektegerelateerde mechanismen aansturen, met het langetermijndoel om deze kennis toe te passen op zoogdiersystemen en, uiteindelijk, in de richting van therapeutische ontwikkeling.

Inleiding

De hierin beschreven methodologie beschrijft een protocol om het retinale pigmentepitheel (RPE) genetisch te aborteren met behulp van larvale zebravissen. De RPE strekt zich uit over de achterkant van het oog en bevindt zich tussen de gelaagde lagen van het neurale netvlies en de laag vasculatuur die het vaatvlies vormt. Trofische ondersteuning, absorptie van fototoxisch licht en onderhoud van visuele cycluseiwitten zijn slechts enkele van de kritieke functies die de RPE uitvoert en die essentieel zijn voor het behoud van de gezondheid en integriteit van deze aangrenzende weefsels1. Schade aan RPE bij zoogdieren is te herstellen wanneer laesies klein zijn2; schade geleden door grotere verwondingen of progressieve degeneratieve ziekte is echter onomkeerbaar. Bij mensen leiden RPE-degeneratieve ziekten (bijv. leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD) en de ziekte van Stargardt) tot permanent verlies van het gezichtsvermogen en, met weinig beschikbare behandelingsopties, verminderde kwaliteit van leven van de patiënt. Het beperkte vermogen van RPE bij zoogdieren om zichzelf te herstellen heeft een kenniskloof gecreëerd op het gebied van RPE-regeneratieve processen. Gezien het robuuste regeneratieve vermogen van de zebravis in veel verschillende weefseltypen, is dit protocol ontwikkeld om een in vivo gewerveld systeem op te zetten om studies naar intrinsiek regenererende RPE te vergemakkelijken en mechanismen bloot te leggen die die respons stimuleren. Met behulp van het hier geschetste ablatieparadigma zijn de canonieke Wnt-signaleringsroute3, de mTOR-route4 en immuungerelateerde responsen5 geïdentificeerd als kritieke mediatoren van RPE-regeneratie, waarschijnlijk met overlappende functies.

In dit genetische ablatieparadigma brengen Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)3 zebravissen het bacteriële nitroreductase (NTR/nfsB) gen6 tot expressie, gefuseerd met eGFP onder controle van het RPE-versterkerelement, rpe65a7. Ablatie wordt bereikt door de prodrug, metronidazol (MTZ), toe te voegen aan het systeemwater dat zebravissen huisvest. Intracellulaire activering van MTZ door nitroreductase resulteert in DNA-crosslinking en apoptose in NTR/nfsB-tot expressie brengende cellen 8,9. Deze technologie is veel gebruikt in zebravissen om cellen van het netvlies10,11,12,13 en andere weefsels te aborteren8. Samen maken deze elementen gerichte expressie (rpe65a) van een induceerbare celablatiemethodologie (NTR/MTZ)8,9 en een fluorescerende marker (eGFP) voor visualisatie mogelijk.

Er bestaan ook andere interessante in vivo modellen die kunnen worden gebruikt om het regeneratieve potentieel van de RPE14 te bestuderen. Deze zijn breed en omvatten RPE-naar-retina transdifferentiatie post-retinectomie bij amfibieën, waarbij RPE-cellen die verloren gaan aan retinale hergroei worden vervangen15,16; RPE restauratie na letsel in de "super healing" MRL/MpJ muis17; en exogene stimulatie van RPE-proliferatie in een rattenmodel van spontane RPE en retinale degeneratie18, onder anderen. Er zijn ook in vitro modellen ontwikkeld, zoals volwassen menselijke RPE-stamcellen (RPESCs)19. Deze modellen zijn allemaal waardevolle hulpmiddelen die werken aan het blootleggen van de cellulaire processen die verband houden met RPE-regeneratie (bijv. Proliferatie, differentiatie, enz.); de zebravis is echter uniek in zijn vermogen tot intrinsiek RPE-herstel na ablatie.

Hoewel de methodologie hier is geschreven om zich te concentreren op het begrijpen van de mechanismen die RPE-regeneratie aansturen, kunnen de Tg (rpe65a: nfsB-eGFP) - lijn en dit genetische ablatieprotocol worden gebruikt om andere cellulaire processen te bestuderen, zoals RPE-apoptose, RPE-degeneratie en het effect van RPE-letsel op aangrenzende retinale en vasculaire weefsels. Het ablatieprotocol kan ook worden gewijzigd om farmacologische manipulatie op te nemen, wat een handige voorlopige strategie is om signaalroutes van belang te screenen. Het blokkeren van de canonieke Wnt-route met behulp van Inhibitor of Wnt Response-1 (IWR-1)20, is bijvoorbeeld aangetoond dat het de RPE-regeneratie3 schaadt. Dit werd hier herhaald om gebruikers door een farmacologisch manipulatie-experiment te leiden en als proof-of-concept te dienen om een MATLAB-script (RpEGEN) te valideren dat is gemaakt om RPE-regeneratie te kwantificeren op basis van herstel van pigmentatie. Net als de transgene lijn en het ablatieprotocol zijn de RpEGEN-scripts aanpasbaar en kunnen ze worden gebruikt om andere markers / cellulaire processen binnen de RPE te kwantificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle hierin beschreven methodologieën voldoen aan het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Pittsburgh.

1. Voorbereiding voorafgaand aan het verzamelen van zebravisembryo's

  1. Stel de embryo-incubator in op 28,5°C.
  2. Bereid een 25x stockoplossing van de melanogeneseremmer, N-fenylethiourea (PTU)21,22. Deze stamoplossing wordt geschaald op basis van een gangbaar recept22 en 1x is gelijk aan 0,003% gewicht per volume (% w/v) (bijv. 0,003 g PTU-poeder in 100 ml vloeibaar oplosmiddel).
    1. Om een grote 25x PTU-stamoplossing te maken, voegt u 0,75 g PTU-poeder toe aan 1 l gezuiverd gedeïoniseerd water (hierna dH2O genoemd) en mengt u grondig bij kamertemperatuur (~ 25 °C) met behulp van een roerstaaf en roerplaat. Bewaren bij 4°C gedurende maximaal 3 maanden beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Het is moeilijk om PTU in waterige oplossing te krijgen en langdurig roeren 's nachts kan nodig zijn.
      LET OP: PTU is gevaarlijk en er moet voor worden gezorgd dat inname, inademing en / of contact met de huid of ogen worden voorkomen. PTU-poeder en alle PTU-vloeibare derivaten die hierin worden beschreven, moeten mogelijk worden verwijderd als chemisch afval, afhankelijk van de staats- en institutionele voorschriften. Bevestiging van de juiste PTU-afvalverwijderingsmethoden, indien aanwezig, wordt aanbevolen voorafgaand aan gebruik.
    2. Om een 1,5x PTU-werkoplossing (hierna 1,5x PTU genoemd) te maken, voegt u 60 ml 25x PTU-stamoplossing toe aan 940 ml water van de zebravishuisvesting (hierna systeemwater genoemd). Optimale waterkwaliteitsparameters voor zebravissen zijn beschreven23 en aquatische faciliteiten moeten standaard watermonitoringprocedures hebben. Bewaar 1,5x PTU bij 28,5°C gedurende 1-2 weken beschermd tegen licht.
      OPMERKING: Dit protocol wordt routinematig uitgevoerd met behulp van de PTU-concentraties, oplosmiddelen en opslagparameters die worden beschreven in stap 1.2. Uit voorzorg moeten embryo's/larven om de 1-2 dagen worden geobserveerd terwijl ze in PTU zijn om de werkzaamheid te valideren en aanhoudende depigmentatie te bevestigen. De oplossings- en/of bewaarcondities moeten worden geoptimaliseerd als een afname van de oplosbaarheid/werkzaamheid van PTU wordt vermoed.
  3. Bereid een stamoplossing van 0,05% w/v methyleenblauw, een schimmelgroeiremmer, door 0,05 g methyleenblauwpoeder toe te voegen aan 100 ml dH2O. Meng grondig met een roerstaaf en roerplaat. Bewaren bij 4°C.
  4. Bereid pipetten voor op manipulatie van embryo's/larven (bijv. het verplaatsen van embryo's/larven tussen petrischalen, het scheiden van larven tijdens fluorescentiescreening, het verzamelen van geëuthanaseerde larven in microcentrifugebuizen voor fixatie, enz.) door het taps toelopende uiteinde van een glazen Pasteur-pipet terug te snijden met behulp van een diamantpuntkrabbelpen. Ets rond de omtrek van de pipet met de diamantpen en trek of klik het uiteinde er voorzichtig af om een schone breuk te maken.
    OPMERKING: De mond van de pipet moet glad en breed genoeg zijn om gemakkelijk een embryo op te nemen dat zich nog in het chorion bevindt zonder te scheren. Gebruik als alternatief een bulb draw transfer pipet. Bereide pipetten kunnen ook worden gebruikt om vloeistof te verwijderen tijdens waterverversingen (in plaats van gieten) om het verlies van embryo's / larven te minimaliseren.
  5. Bereid een 4% paraformaldehyde (PFA) oplossing in 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) (voeg bijvoorbeeld 10 ml 16% PFA toe aan 4 ml 10x PBS en 26 ml dH2O). Bewaren bij 4°C gedurende maximaal 4 weken beschermd tegen licht.
    LET OP: Paraformaldehyde is een gevaarlijke chemische stof en moet in een chemische zuurkast worden behandeld en op de juiste manier worden weggegooid. Voorzichtigheid is geboden en persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) moeten worden gedragen om inname, inademing en/of contact met de huid of ogen te voorkomen.

2. Het verzamelen en onderhouden van embryo's van zebravissen voorafgaand aan genetische ablatie (0-5 dagen na de bevruchting)

  1. Houd volwassen zebravissen zoals eerder beschreven 3,4,5. De middag/avond voorafgaand aan het verzamelen van embryo's, scheid volwassen zebravissen in kweekbakken om te paaien.
  2. Verzamel de volgende ochtend (0 dagen na de bevruchting (dpf)) embryo's in petrischalen met een diameter van 10 cm in systeemwater en verwijder alle niet-levensvatbare of onbevruchte eieren, die ondoorzichtig lijken en / of onregelmatig cytoplasma en mislukte splitsing vertonen24.
    OPMERKING: Normale splitsings- en ontwikkelingsstadiëringsgebeurtenissen zullen zichtbaar zijn in gezonde embryo's zoals beschreven25. Petrischalen moeten gedurende het hele protocol voor driekwart vol worden gehouden (~ 30 ml voor een schaal met een diameter van 10 cm).
    1. Voeg twee druppels van 0,05% w/v methyleenblauw toe aan elke petrischaal, meng voorzichtig en bewaar embryo's bij 28,5 °C voor de rest van het protocol.
  3. Vervang ongeveer 6 uur na de bevruchting (hpf)4,5,26 het systeemwater in embryonale petrischalen door 1,5x PTU (werkoplossing gemaakt in stap 1.2.2) en vul methyleenblauw aan.
    OPMERKING: PTU moet aan embryo's worden toegevoegd vóór het begin van pigmentatie (d.w.z. vóór 24 hpf)25, omdat reeds gepigmenteerde weefsels niet zullen depigmenteren bij toevoeging van PTU21. Er moet echter worden opgemerkt dat verminderde ooggrootte, oculaire en craniofaciale tekorten en verstoring van sommige signaalroutes (bijv. Schildkliersignalering) zijn gemeld bij met PTU behandelde zebravissen 27,28,29. De ontwikkelingstoxiciteit van PTU lijkt afhankelijk te zijn van de concentratie en timing van PTU-toevoeging27,29. Zoals hierboven vermeld voor het valideren van de werkzaamheid van PTU (stap 1.2), moeten tekenen van PTU-toxiciteit ook zorgvuldig worden gecontroleerd en, indien vermoed, de werkconcentratie en/of het tijdstip van PTU-toevoeging worden geoptimaliseerd.
  4. Op 2-3 dpf, dechorionate embryo's met behulp van vers gemaakte pronase-oplossing.
    1. Los pronase op in 1,5x PTU in een concentratie van 2 mg/ml door vortexing.
      LET OP: Pronase is verpakt als een zeer fijn poeder en is irriterend. Neem maatregelen om inademing en/of contact met huid, ogen, etc. te voorkomen.
    2. Scheid uitgekomen embryo's van niet-gehate embryo's en pronase-behandel alleen niet-gehate embryo's.
    3. Vervang 1,5x PTU door 2 mg/ml pronase-oplossing gemaakt in stap 2.4.1 en laat niet-gehate embryo's gedurende 4-5 minuten zitten met zachte agitatie (bijv. op een tafelrotator / shaker of door handmatig te zwenken).
    4. Giet de pronase-oplossing af en spoel onmiddellijk af met verse 1,5x PTU. Triturateer voorzichtig 1,5x PTU spoel over embryo's met een bulb-draw transfer pipet.
    5. Herhaal een tweede 1,5x PTU-spoeling om alle chorionresten weg te gooien en vul vervolgens 1,5x PTU aan voor onderhoud.
      OPMERKING: Embryo's kunnen ook handmatig worden gedechorioneerd met behulp van een tang met fijne punt. In dit geval moet chorionresten worden verwijderd en 1,5x PTU worden aangevuld na handmatige dechorionatie.
  5. Controleer de gezondheid van embryo's / larven en vul elke 1-2 dagen 1,5x PTU aan. Embryo's/larven worden in 1,5x PTU gehouden tot ablatie bij 5 dpf.
    OPMERKING: Het belang van stap 2.3 en 2.4 wordt verder behandeld in de sectie Discussie.

3. Screening zebravislarven op rpe65a:nfsB-eGFP en genetische ablatie van het retinale pigmentepitheel (5-6 dagen na de bevruchting)

  1. Maak een verse 10 mM metronidazol (MTZ) oplossing op 5 dpf (dag van ablatie). Dit proces duurt 2 uur om te voltooien.
    1. Voeg MTZ-poeder toe aan systeemwater zonder PTU en meng grondig door krachtig schudden (bijv. 250 rotaties per minuut) gedurende 1 uur bij 37 °C.
    2. Koel de 10 mM MTZ-oplossing voor nog eens 1 uur bij kamertemperatuur op een tafelrotator / shaker en zorg voor volledige oplossing voordat u deze toevoegt aan petrischalen met larven.
      OPMERKING: Fluorescentiescreening en scheiding van eGFP+- larven (stap 3.2) kan worden uitgevoerd tijdens incubaties bij 37 °C en kamertemperatuur.
      LET OP: MTZ is gevaarlijk en er moet voor worden gezorgd dat inname, inademing en/of contact met de huid of ogen worden voorkomen. MTZ-poeder en alle hierin beschreven vloeibare derivaten moeten mogelijk worden verwijderd als chemisch afval, afhankelijk van de staats- en institutionele voorschriften. Bevestiging van de juiste MTZ-afvalverwijderingsmethoden, indien aanwezig, wordt aanbevolen vóór gebruik.
  2. Screen zebravislarven voor het rpe65a:nfsB-eGFP transgen.
    1. Verdoving larven met 0,168 g/l tricaïne (MS-222) en afzonderlijke transgene (eGFP+) larven (figuur 1) van niet-transgene (eGFP-) larven met behulp van een fluorescentie stereomicroscoop met een 488 nm excitatielaser/filter.
      OPMERKING: Tricaïne moet worden toegevoegd aan 1,5x PTU en/of farmacologische samengestelde oplossingen, omdat larven ondergedompeld moeten blijven in de behandeling terwijl ze worden gescreend op eGFP. Incubeer larven in tricaïne alleen voor de duur van de screening (bijvoorbeeld ≤10 min voor een enkele petrischaal van 10 cm met 50 larven).
    2. Wek gescreende larven onmiddellijk op door direct in een petrischaaltje te pipetteren met verse 1,5x PTU zonder tricaïne.
    3. Na voltooiing van de screening, verdeelt u de eGFP+ larven verder in twee groepen petrischalen: één groep om MTZ-behandeling te krijgen (ablated / MTZ +) en één groep om de niet-aangegeven (MTZ-) controle te zijn.
  3. Ablate het retinale pigmentepitheel.
    1. Verwijder 1,5x PTU uit de onopgeloste (MTZ-) controleschalen en voeg vers systeemwater toe zonder PTU.
    2. Verwijder 1,5x PTU uit de ablated (MTZ+) behandelingsschotels en voeg de vers gemaakte 10 mM MTZ-oplossing toe (stap 3.1.).
    3. Verwijder de 10 mM MTZ-oplossing na precies 24 uur (aangewezen 1 dag na het letsel (dpi)) en voeg vers systeemwater toe zonder PTU. Ververs het verse systeemwater zonder PTU op de MTZ-schotel (en). Larven zullen niet opnieuw worden blootgesteld aan PTU voor de rest van het protocol.
      OPMERKING: Het kan moeilijk zijn om alle 1,5x PTU (stappen 3.3.1 en 3.3.2) of 10 mM MTZ (stap 3.3.3) tussen oplossingsuitwisselingen te pipetten of af te gieten zonder larvenverlies, omdat dieren actief rondzwemmen. In dit geval kunnen was(en) van systeemwater zonder PTU worden toegevoegd om een succesvolle uitwisseling van oplossingen te garanderen.

4. Larvaal onderhoud post-genetische ablatie (6+ dagen na de bevruchting)

  1. Controleer larven en vul dagelijks het systeemwater zonder PTU aan tot euthanasie (stap 5.6) of keer terug naar de zebravishuisvesting.
  2. Monitor het succes en de mate van ablatie in vivo op 2 dpi (7 dpf) met behulp van doorgelaten lichtverlichting op een stereomicroscoop (figuur 2).

5. Integratie van farmacologische behandeling in het epiblatieprotocol voor retinale pigmentepitheel van zebravissen

OPMERKING: Zoals eerder uitgevoerd3, wordt de behandeling met 15 μM IWR-1 of volume-gematchte dimethylsulfoxide (DMSO) voertuigcontrole vanaf 4 dpf hier beschreven als een voorbeeldexperiment om RpEGEN te testen. Concentraties en tijdlijnen kunnen variëren met verschillende farmacologische verbindingen en aanbevelingen voor dosis-responsvalidatie, behandelingsduur, screening en andere aspecten van experimenteel ontwerp voor farmacologische manipulatiestudies worden behandeld in de sectie Discussie. Volg stap 6 en 7 als beeldanalyse vereist is.

  1. Verzamel en onderhoud embryo's zoals beschreven in stap 2. Dechorionaat embryo's op 2 dpf.
  2. Screen eGFP+ larven op 4 dpf zoals beschreven in stap 3.2. Plaats in plaats van petrischalen eGFP + -larven in 6-well-platen met een dichtheid van n ≤ 10 larven per 6-well voor farmacologische behandeling. Wijs aparte 6-putplaten aan voor larven die niet worden aangegeven (MTZ-) en larven die worden geableerd (MTZ +).
    OPMERKING: Het eGFP-signaal is zichtbaar op 4 dpf, maar lijkt zwakker dan de signaalintensiteit op 5 dpf.
  3. Voorbehandeling van 4 dpf eGFP+ larven met 15 μM IWR-1 of volume-gematchte DMSO voertuigcontrole gedurende precies 24 uur voorafgaand aan genetische ablatie met 10 mM MTZ-oplossing.
    OPMERKING: Vaak is er zeer weinig verbinding nodig voor farmacologische behandelingsexperimenten. Om te voorkomen dat kleine hoeveelheden IWR-1-poeder worden afgewogen, wordt deze farmacologische verbinding al gekocht in DMSO-oplossing, in een concentratie van 25 mM, en bij aankomst in kleinere volumes gealiquoteerd om herhaalde vries-dooicycli te voorkomen.
    1. Bepaal het volume van farmacologische en voertuigcontrolebehandelingen die nodig zijn en aliquot 1,5x PTU in conische buizen dienovereenkomstig. Een volume van 5 ml /put van een 6-well plaat wordt aanbevolen.
    2. Voeg IWR-1-voorraad toe aan 1,5x PTU voor een eindconcentratie van 15 μM IWR-1 (bijv. 3 μL van 25 mM IWR-1 per 5 ml van 1,5x PTU). Voeg een overeenkomend volume DMSO-voorraad toe aan 1,5x PTU (bijv. 3 μL ≥ 99,7% DMSO per 5 ml van 1,5x PTU). Hier levert dit uiteindelijk een eindconcentratie op van 0,06% volume/volume (% v/v) DMSO. Meng goed door vortexing en bevestig visueel het oplossen van verbindingen.
      LET OP: DMSO, IWR-1 en andere farmacologische verbindingen en oplosmiddelen moeten mogelijk worden verwijderd als chemisch afval, afhankelijk van de staats- en institutionele voorschriften. Bevestiging van het gevarenniveau en de juiste afvalverwijderingsmethoden voor deze verbindingen, indien aanwezig, wordt aanbevolen vóór gebruik.
    3. Verwijder 1,5x PTU uit de eGFP+ larven in 6-well platen en voeg 5 ml/put vers gemaakte 0,06% v/v DMSO of 15 μM IWR-1 behandelingen toe uit stap 5.3.2.
  4. Op 5 dpf, ablate de RPE. Naast de 24-uurs voorbehandeling (stap 5.3) blijven larven ondergedompeld in farmacologische en voertuigcontrolebehandelingen gedurende 24 uur genetische ablatie met 10 mM MTZ en tijdens herstel na ablatie, tot fixatie (bijv. van 4-9 dpf).
    1. Maak 10 mM MTZ-oplossing 2 uur voordat u genetische ablatie uitvoert (stap 3.1).
    2. Bepaal het volume van farmacologische en voertuigcontrolebehandelingen die nodig zijn voor zowel niet-geblazen (MTZ-) als ablated (MTZ+) 6-well platen en aliquot geschikte volumes van ofwel zoet systeemwater zonder PTU (MTZ-) of 10 mM MTZ-oplossing (MTZ +) in conische buizen. Dit levert vier behandelingsvoorwaarden op: 1) 0,06% v/v DMSO, MTZ-; 2) 15 μM IWR-1, MTZ-; 3) 0,06% v / v DMSO, MTZ +; en 4) 15 μM IWR-1, MTZ+.
    3. Voeg IWR-1- en DMSO-voorraadoplossingen toe aan de respectieve conische buizen zoals uitgevoerd in stap 5.3.2. Meng goed door vortexing en bevestig visueel het oplossen van verbindingen.
    4. Verwijder 0,06% v/v DMSO en 15 μM IWR-1 behandelingen in 1,5x PTU (stap 5.3.2) van aangewezen niet-aangegeven (MTZ-) en ablated (MTZ+) 6-well platen en vul aan met de juiste behandelingen in stap 5.4.3.
    5. Verwijder 0,06% v/v DMSO en 15 μM IWR-1 behandelingen in 10 mM MTZ oplossing na precies 24 uur en vul aan met behandelingen in vers systeemwater zonder PTU. Vul 0,06% v/v DMSO en 15 μM IWR-1 behandelingen aan in zoet systeemwater zonder PTU op de niet-aangegeven (MTZ-) 6-well plaat(en).
  5. Volg larvale onderhoudspost-ablatie zoals beschreven in stap 4 en vul dagelijks 0,06% v/v DMSO of 15 μM IWR-1 behandelingen aan in systeemwater zonder PTU.
  6. Euthanaseer larven op 9 dpf (4 dpi voor leeftijdsgematchte MTZ-behandelde broers en zussen) door dieren onder te dompelen in 0,3 g / L tricaïne-oplossing (dodelijke overdosis) in combinatie met snel koelen (bijv. Petrischalen op ijs plaatsen) gedurende ten minste 20 min30. Controleer of de larven niet reageren op aanraking en fixeer in 4% PFA (stap 1.5) gedurende 3 uur bij kamertemperatuur of bij 4 °C 's nachts.
  7. Verwerk post-fixatie larvaal weefsel voor z-stack beeldacquisitie op een confocale microscoop zoals eerder beschreven 5,31 en hier in de sectie Representatieve resultaten. Analyse in stap 6 en 7 vereist minimaal de verwerving van nucleaire marker (bijv. DAPI) en brightfield z-stack-afbeeldingen.

6. Confocale microscoop z-stack beeldvoorbewerking in FIJI (ImageJ)

  1. Importeer en formatteer confocale microscoop z-stack afbeeldingen met FIJI32.
    1. Open microscoopafbeeldingen met behulp van de importopties voor bio-indelingen die zijn ingesteld op Stapel weergeven met: Hyperstack en Kleurmodus: Grijswaarden.
    2. Genereer een maximale intensiteitsprojectie van het geïmporteerde microscoopbeeld door Afbeelding | Stapels | Z-project. Stel in het ZProjection-venster Slice starten en Slice stoppen in om alle segmenten voor die afbeelding op te nemen. Stel bijvoorbeeld Slice starten: 1 en Stop Slice: 18 in voor een z-stack met in totaal 18 slices. Kies Projectietype: Maximale intensiteit en klik op OK.
    3. Converteer het projectiebestand met maximale intensiteit naar een 8-bits afbeelding (indien nog niet) door Afbeelding | Soort | 8-bits.
    4. Heroriënteer de afbeelding zodat de dorsale zijde omhoog is en distale (d.w.z. de lens) wordt achtergelaten door Afbeelding | Transformeer | Horizontaal spiegelen (kies voor de laatste opdracht de optie die het beste past bij de richting die nodig is voor die afbeelding). Voor een meerkanaals afbeelding klikt u op Ja in de Process Stack? venster om alle kanalen te heroriënteren.
      OPMERKING: Deze stap is van cruciaal belang, maar niet nodig als de afbeelding zich al in de dorsale omhoog, distale linkeroriëntatie bevindt. Zie figuur 3A-D en figuur 4 voor afbeeldingen met ogen in de juiste richting voor verwerking.
    5. Sla de 8-bits projectie met maximale intensiteit op als een TIF-bestand (Tagged Image File Format) door Bestand | Opslaan als | Tiff....
  2. Genereer RPE-regio van belang (ROI) met FIJI.
    1. Open een 8-bits TIF-installatiekopie die is gegenereerd zoals beschreven in stap 6.1. Start de ROI Manager door | Gereedschap | ROI-manager.
    2. Afbeelding | gebruiken Zoom in en schakel tussen de DAPI- en brightfield-kanalen om het punt of de punten te identificeren waarop de apicale kant van de RPE grenst aan de punt van het buitenste limiterende membraan (OLM) (figuur 3B', B", D', D"; blauwe pijlpunten). Gebruik dit anatomische oriëntatiepunt als uitgangspunt voor de ROI.
    3. Maak de RPE ROI met het gereedschap Polygon Selections (in de FIJI-werkbalk) met behulp van zowel de DAPI- als brightfield-afbeeldingskanalen en de zoomfunctie (Image | Zoom) om apicale en basale RPE-grenzen te identificeren. Breng de dorsale en ventrale uiteinden van de ROI (d.w.z. waar de ROI overgaat van de apicale naar basale kant van de RPE) naar een scherp punt in plaats van af te stompen of af te ronden (Figuur 3B', B", D', D"; magenta-lijnen).
      OPMERKING: Het maken van een puntig ROI-einde is een cruciale stap voor het optimaliseren van eindpuntdetectie met behulp van RpEGEN en wordt behandeld in de sectie Discussie.
    4. Voeg de ROI toe door in de ROI Manager op Toevoegen te klikken. Pas de ROI indien nodig aan en klik op Update in de ROI Manager.
    5. Sla het ROI-bestand op door Meer>> | Redden... binnen de ROI Manager. Gebruik identieke namen voor overeenkomende ROI- en TIF-afbeeldingsbestanden (bijvoorbeeld [bestandsnaam].tif en [bestandsnaam].roi).
  3. Combineer 8-bits TIF- en ROI-bestanden voor elke voorwaarde in één map. De map, DMSO_9dpf, bevat bijvoorbeeld alle overeenkomende TIF- en ROI-bestanden voor de 9 dpf unablated (MTZ-) 0,06% v/v DMSO-behandelde larvale groep.

7. Kwantificering en visualisatie van RPE-regeneratie met behulp van RpEGEN-scripts

  1. Installeer en bereid RpEGEN-scripts voor.
    1. Download de nieuwste RpEGEN-scripts van de GitHub-repository (https://github.com/burchfisher/RpEGEN) door op Code | Zip downloaden.
    2. Pak de map uit en plaats deze op de gewenste werkruimtelocatie (bijvoorbeeld Desktop).
    3. Open MATLAB.
    4. Navigeer naar de map RpEGEN in het deelvenster Huidige map (meestal aan de linkerkant).
    5. Klik met de rechtermuisknop op de map RpEGEN en kies Toevoegen aan pad | Geselecteerde mappen en submappen. Hiermee wordt de map toegevoegd aan het MATLAB-pad, zodat deze automatisch alle scripts in de map kan vinden en uitvoeren.
    6. Dubbelklik op de map RpEGEN in het deelvenster Huidige map om alle submappen en M-bestanden weer te geven.
    7. Dubbelklik op het bestand RpEGEN.m om te openen in het deelvenster Editor .
    8. Voer in de sectie USER-DEFINED VARIABLES van het bestand RpEGEN.m de maplocaties in voor de mappen met de ROI-bestanden (.roi), afbeeldingsbestanden (.tif) en waar uitvoerbestanden moeten worden opgeslagen. Voer de groepsnaam in voor het MAT-bestand dat moet worden geëxporteerd (bijvoorbeeld DMSO_9dpf, DMSO_4dpi, enz.) en de locatie van het brightfield-kanaal in de TIF-afbeeldingsstapel (bijvoorbeeld 3, als brightfield het derde kanaal in een afbeeldingsstapel is). Als het afbeeldingsbestand alleen de brightfield-afbeelding bevat, moet dit gelijk zijn aan 1.
  2. Voer het RpEGEN.m-script uit en valideer de resultaten.
    OPMERKING: RpEGEN vereist dat de Image Processing Toolbox, de Curve Fitting Toolbox en de Statistics and Machine Learning Toolbox worden geactiveerd op de MATLAB-licentie van de gebruiker om te kunnen worden uitgevoerd. Daarnaast is de vrij beschikbare ReadImageJROI toolbox33 vereist om FIJI ROIs in MATLAB te importeren; het wordt echter geleverd in de map RpEGEN samen met andere functie M-bestanden die geen activering vereisen.
    1. Voer het script uit door op de knop Uitvoeren in het editormenu boven aan MATLAB te klikken.
      OPMERKING: Eenmaal gestart, biedt het opdrachtvenster uitgebreide uitvoer die de voortgang van het script aangeeft. Na het opslaan van het MAT-bestand met de geëxtraheerde gegevens, verschijnt er een figuur met drie panelen en wordt deze als PDF opgeslagen in de uitvoermap voor elke afbeeldingsrun. Dit zijn cijfers voor kwaliteitscontrole (QC) om ervoor te zorgen dat alles goed is verlopen en omvatten: 1) het brightfield-beeld bedekt met de ROI (figuur 4A); 2) de ROI met middellijn en bijbehorende hoekafstand (graden) (figuur 4G); en 3) de ROI met de mediaanintensiteitswaarden van de middellijn (0-255, 8-bits kleurenschaal) (figuur 4H). Wacht tot de QC-PDF's zijn opgeslagen in de uitvoermap en het laatste cijfer is verdwenen voordat u doorgaat naar de volgende stap.
    2. Open de afzonderlijke PDF's die zijn geëxporteerd naar de uitvoermap in een PDF-viewer en controleer of alle ROIs overeenkomen met de brightfield-afbeeldingen, dat de middellijnwaarden redelijke benaderingen zijn van het midden van de ROI's en of de mediane intensiteitswaarden op de juiste manier zijn gevuld met gegevens (d.w.z. niet allemaal dezelfde waarde over de hele middellijn).
      OPMERKING: Een gedetailleerde beschrijving en structuur van elke variabele die door RpEGEN.m in het MAT-bestand is opgeslagen, is te vinden in tabel 1.
  3. Voer het script RpEGEN_PermPlot.m. uit.
    OPMERKING: Het RpEGEN_PermPlot.m-script gebruikt de uitvoer van RpEGEN.m om statistische vergelijkingen uit te voeren met behulp van een permutatiesimulatie van de medianen van twee groepen en biedt ook de code voor het reproduceren van de plots in dit artikel met behulp van de vrij beschikbare GRAMM toolbox34, die ook is opgenomen in de RpEGEN-map.
    1. Dubbelklik op het RpEGEN_PermPlot.m-bestand om te openen in een nieuw editortabblad .
    2. Voer onder SECTIE 1 - DOOR DE GEBRUIKER GEDEFINIEERDE VARIABELEN in het bestand RpEGEN_PermPlot.m de maplocatie in voor de uitvoermap met de MAT-bestanden van het uitvoeren van RpEGEN.m en voer elke MAT-bestandsnaam in die moet worden geladen (bijvoorbeeld DMSO_4dpi.mat, IWR1_4dpi.mat).
    3. Voer dit gedeelte van het script uit door te klikken op de knop Sectie uitvoeren in het editormenu boven aan MATLAB.
    4. Voer in hoofdstuk 2 de namen van de twee groepen in voor statistische vergelijking in de data_A en data_B variabelen (dit zijn de groepen waaruit medianen worden afgeleid met behulp van de permutatiesimulatie). Voer in de variabele bin_sz het aantal graden in waarover de mediane intensiteitswaarden voor de gegevenssets moeten worden geïntegreerd (standaard is bakken van 1 graad).
      OPMERKING: De variabele reps geeft het aantal permutaties aan dat moet worden gebruikt om een kansverdeling op te bouwen en kan op elk getal worden ingesteld (standaardwaarde is 20.000). Over het algemeen zal een hoger aantal herhalingen statistisch robuuster zijn, maar zal de verwerkingstijd toenemen.
    5. Voer dit gedeelte van het script uit door te klikken op de knop Sectie uitvoeren in het editormenu boven aan MATLAB. Het kan enige tijd duren voordat deze sectie is voltooid, afhankelijk van het aantal opgegeven herhalingen, maar biedt wel een continue statusupdate in het opdrachtvenster.
    6. Voer de secties HEATMAP FIGURE EN GROUP RESULTS EN P-VALUES onafhankelijk van elkaar uit met de knop Sectie uitvoeren . Bewerk gegevensvariabelen in secties met de opmerking "VOER HIER GEGEVENS IN". PDF's van deze figuren worden automatisch voor elk opgeslagen en kunnen eenvoudig worden gewijzigd in elke vectorsoftware nabewerking.
      OPMERKING: De plots die in het RpEGEN_PermPlot.m-bestand worden gegenereerd, zijn ad hoc en vereisen waarschijnlijk wijzigingen op basis van de specifieke gegevens- en visualisatiebehoeften van elke gebruiker. De cijfers bieden echter een solide basis die gemakkelijk kan worden geïndividualiseerd met behulp van zowel MATLAB- als GRAMM-websites.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Het is bekend dat het remmen van de canonieke Wnt-signaleringsroute de RPE-regeneratie van zebravissen aanzienlijk schaadt met behulp van het genetische ablatieparadigma (rpe65a: nfsB-eGFP) en farmacologische manipulatiemethodologie (IWR-1) beschreven in het protocol3. Dit experiment werd hier herhaald om een geautomatiseerde methode te valideren voor het kwantificeren van zebravis RPE-regeneratie op basis van pigmentatie. De hieronder samengevatte resultaten omvatten alle stappen van het...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Dit protocol beschrijft methodologie om de RPE genetisch te aborteren en bestudeert mechanismen van degeneratie en regeneratie bij larvale-oude zebravissen. Dit protocol is ook met succes uitgevoerd bij volwassen zebravissen3, maar met minder uitgebreide karakterisering, daarom zijn larven hier de focus. Kritische aspecten van dit deel van het protocol (stappen 1-4) omvatten: 1) het toevoegen van 1,5x PTU aan embryo's voorafgaand aan het begin van melanogenese, 2) het dechorioneren van met PTU beh...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

L.L.L. is de mede-uitvinder van US Patent #9,458,428, dat een versnelde methode beschrijft om retinaal pigmentepitheel af te leiden uit menselijke pluripotente stamcellen; dit staat los van de inhoud hiervan. J.M.G. en G.B.F. hebben niets te melden.

Dankbetuigingen

Het hierin beschreven werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (RO1-EY29410 tot J.M.G, en NIH CORE Grant P30-EY08098 tot de afdeling Oogheelkunde); het UPMC Immune Transplant & Therapy Center (aan L.L.L. en J.M.G.); en de E. Ronald Salvitti-leerstoel in oogheelkundig onderzoek (aan J.M.G.). Aanvullende steun werd ontvangen van de Wiegand Fellowship in Ophthalmology (aan L.L.L), de Eye & Ear Foundation of Pittsburgh, en een onbeperkte subsidie van Research to Prevent Blindness, New York, NY. Auteurs willen ook Amanda Platt bedanken voor technische assistentie en Dr. Hugh Hammer en het aquatische personeel voor uitstekende ondersteuning van de dierenverzorging.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Lab Materiaal/Uitrusting
2-(4-Amidinofenyl)-6-indolcarbamidine dihydrochloride (DAPI)Millipore SigmaD9542
6-well platenFisher Scientific07-200-83
Conische Polypropyleen CentrifugeerbuisjesFisher Scientific05-539-13Catalogusnummer is voor 50 mL buisjes
Diamantstift voor graverenFisher Scientific50-254-51Gemaakt door Electron Microscopy Sciences, items vergelijkbaar met dit artikelnummer zijn voldoende
Dimethylsulfoxide (DMSO) ≥99,7 %Fisher ScientificBP231Controleer de instellingen voor de verwijdering van institutioneel chemisch afval
Embryo-incubator (groot)Fisher Scientific3720A
Embryo-incubator (mini/tafelmodel)LabnetI5110A
Fluorescentie stereomicroscoopZeissAxio Zoom.V16Of vergelijkbaar, met 488 nm opwindingslaser/filter
Glazen Pasteur-pipetFisher Scientific13-678-4Gemaakt door Corning, niet-sterieel
InSolution Wnt Antagonist I, IWR-1-endoMillipore Sigma5.04462Gemaakt door Calbiochem; 25 mM in DMSO; controleer de instellingen voor de verwijdering van institutioneel chemisch afval
Methyleenblauw (poeder)Fisher ScientificBP117-100Ook verkrijgbaar als voorbereide waterige oplossing
Metronidazol (MTZ)Millipore SigmaM3761Controleer de instellingen voor de verwijdering van institutioneel chemisch afval
N-fenylthioureum (PTU)Millipore SigmaP7629Controleer de instellingen voor de verwijdering van institutioneel chemisch afval
Paraformaldehyde (16 % w/v) methanolvrijFisher ScientificAA433689MChemisch afval, correcte verwijdering vereist
PetrischalenFisher ScientificFB087571210 cm diameter
Fosfaat gebufferde saline (poederpakketten)Millipore SigmaP3813Gebruikt om 10 X PBS stockoplossing te maken
PronaseMillipore SigmaPRON-RO
Schuddende incubatorBenchmarkH2010Gebruikt voor het incuberen van MTZ gedurende 1 uur bij 37 graden Celsius
StereomicroscoopLeicaS9iOf vergelijkbaar, met getransmitteerde lichtverlichting
Student Dumont #5 pincetFine Science Tools91150-20Pincet met fijne punt voor handmatige dechorionatie
Rotator/schuddende tafelmodelScilogexSK-D1807-E
TransferpipetMillipore SigmaZ1350033,2 mL buisje trekken, niet-sterieel
Tricaine methaansulfonaat (MS-222)PentairTRS1, TRS2, TRS5Ook verkrijgbaar bij Fisher Scientific (NC0342409)
VECTASHIELD Antifade Montage Medium met DAPIVector LaboratoriesH-1200
Software Materiaal
FIJI (Fiji is Just ImageJ)FIJI (Fiji is Just ImageJ)https://imagej.net/software/fiji/Versie: 2.0.0-rc-69/1.52p; Build: 269a0ad53f; Plugin nodig: Bio-Formats
GRAMM voorbeelden en hoe-te-doen'sMathWorkshttps://www.mathworks.com/matlabcentral/fileexchange/54465-gramm-complete-data-visualization-toolbox-ggplot2-r-like.
MATLABMathWorkshttps://www.mathworks.com/products/get-matlab.htmlWerkpakketten nodig om RpEGEN uit te voeren: Image Processing Toolbox, Curve Fitting Toolbox, Statistics and Machine Learning Toolbox
MATLAB ondersteuningMathWorkshttps://www.mathworks.com/support.html
```

Referenties

  1. Strauss, O. The retinal pigment epithelium in visual function. Physiological Reviews. 85 (3), 845-881 (2005).
  2. Grierson, I., et al. repair and regeneration of the retinal pigment epithelium. Eye. 8 (2), 255-262 (1994).
  3. Hanovice, N. J., et al. Regeneration of the zebrafish retinal pigment epithelium after widespread genetic ablation. PLoS Genetics. 15 (1), 1007939(2019).
  4. Lu, F., Leach, L. L., Gross, J. M. mTOR activity is essential for retinal pigment epithelium regeneration in zebrafish. bioRxiv. , (2021).
  5. Leach, L. L., Hanovice, N. J., George, S. M., Gabriel, A. E., Gross, J. M. The immune response is a critical regulator of zebrafish retinal pigment epithelium regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (21), (2021).
  6. Zenno, S., Koike, H., Tanokura, M., Saigo, K. Gene cloning, purification, and characterization of nfsb, a minor oxygen-insensitive nitroreductase from escherichia coli, similar in biochemical properties to frase I, the major flavin reductase in vibrio fischeri. The Journal of Biochemistry. 120 (4), 736-744 (1996).
  7. Hamel, C. P., et al. Molecular cloning and expression of rpe65, a novel retinal pigment epithelium-specific microsomal protein that is post-transcriptionally regulated in vitro. Journal of Biological Chemistry. 268 (21), 15751-15757 (1993).
  8. Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236 (4), 1025-1035 (2007).
  9. White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62 (3), 232-240 (2013).
  10. White, D. T., et al. Immunomodulation-accelerated neuronal regeneration following selective rod photoreceptor cell ablation in the zebrafish retina. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (18), 3719-3728 (2017).
  11. Yoshimatsu, T., et al. Presynaptic partner selection during retinal circuit reassembly varies with timing of neuronal regeneration in vivo. Nature Communications. 7, 10590(2016).
  12. Montgomery, J. E., Parsons, M. J., Hyde, D. R. A novel model of retinal ablation demonstrates that the extent of rod cell death regulates the origin of the regenerated zebrafish rod photoreceptors. The Journal of Comparative Neurology. 518 (6), 800-814 (2010).
  13. Hagerman, G. F., et al. Rapid recovery of visual function associated with blue cone ablation in zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0166932(2016).
  14. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969(2021).
  15. Chiba, C., et al. Visual cycle protein rpe65 persists in new retinal cells during retinal regeneration of adult newt. The Journal of Comparative Neurology. 495 (4), 391-407 (2006).
  16. Yoshii, C., Ueda, Y., Okamoto, M., Araki, M. Neural retinal regeneration in the anuran amphibian xenopus laevis post-metamorphosis: Transdifferentiation of retinal pigmented epithelium regenerates the neural retina. Developmental Biology. 303 (1), 45-56 (2007).
  17. Xia, H., Krebs, M. P., Kaushal, S., Scott, E. W. Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in mrl/mpj mice. Experimental Eye Research. 93 (6), 862-872 (2011).
  18. McGill, T. J., et al. Subretinal transplantation of human central nervous system stem cells stimulates controlled proliferation of endogenous retinal pigment epithelium. Translational Vision Science and Technology. 8 (3), 43(2019).
  19. Salero, E., et al. Adult human rpe can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
  20. Chen, B., et al. Small molecule-mediated disruption of wnt-dependent signaling in tissue regeneration and cancer. Nature Chemical Biology. 5 (2), 100-107 (2009).
  21. Whittaker, J. R. An analysis of melanogenesis in differentiating pigment cells of ascidian embryos. Developmental Biology. 14 (1), 1-39 (1966).
  22. Westerfield, M. Zebrafish Book, 5th Edition; A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , University of Oregon Press. Eugene, Oregon, USA. (2007).
  23. Hammer, H. S. Water quality for zebrafish culture in The Zebrafish in Biomedical Research. , Elsevier. Amsterdam, Netherlands. 321-335 (2020).
  24. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196(2012).
  25. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  26. Camp, E., Lardelli, M. Tyrosinase gene expression in zebrafish embryos. Development Genes and Evolution. 211 (3), 150-153 (2001).
  27. Baumann, L., Ros, A., Rehberger, K., Neuhauss, S. C., Segner, H. Thyroid disruption in zebrafish (danio rerio) larvae: Different molecular response patterns lead to impaired eye development and visual functions. Aquatic Toxicology. 172, 44-55 (2016).
  28. Li, Z., et al. Phenylthiourea specifically reduces zebrafish eye size. PloS One. 7 (6), 40132(2012).
  29. Bohnsack, B. L., Gallina, D., Kahana, A. Phenothiourea sensitizes zebrafish cranial neural crest and extraocular muscle development to changes in retinoic acid and igf signaling. PLoS One. 6 (8), 22991(2011).
  30. Leary, S., et al. Avma Guidelines for the Euthanasia of Animals: 2020 Edition. , American veterinary medical association. Schaumburg, Illinois, USA. (2020).
  31. Uribe, R. A., Gross, J. M. Immunohistochemistry on cryosections from embryonic and adult zebrafish eyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2007, 4779(2007).
  32. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  33. Muir, D. GitHub - ReadImageJROI. , Available from: https://github.com/DylanMuir/ReadImageJROI (2021).
  34. Morel, P. Gramm: Grammar of graphics plotting in matlab. Journal of Open Source Software. 3 (23), 568(2018).
  35. Reinhardt, R., et al. Sox2, tlx, gli3, and her9 converge on rx2 to define retinal stem cells in vivo. The EMBO Journal. 34 (11), 1572-1588 (2015).
  36. Schonthaler, H. B., et al. Evidence for rpe65-independent vision in the cone-dominated zebrafish retina. European Journal of Neuroscience. 26 (7), 1940-1949 (2007).
  37. Yazulla, S., Studholme, K. M. Neurochemical anatomy of the zebrafish retina as determined by immunocytochemistry. Journal of Neurocytology. 30 (7), 551-592 (2001).
  38. Larison, K. D., Bremiller, R. Early onset of phenotype and cell patterning in the embryonic zebrafish retina. Development. 109 (3), 567-576 (1990).
  39. Dwass, M. Modified randomization tests for nonparametric hypotheses. The Annals of Mathematical Statistics. 28 (1), 181-187 (1957).
  40. Karlsson, J., von Hofsten, J., Olsson, P. E. Generating transparent zebrafish: A refined method to improve detection of gene expression during embryonic development. Marine Biotechnology (NY). 3 (6), 522-527 (2001).
  41. Hernandez, R. E., Galitan, L., Cameron, J., Goodwin, N., Ramakrishnan, L. Delay of initial feeding of zebrafish larvae until 8 days postfertilization has no impact on survival or growth through the juvenile stage. Zebrafish. 15 (5), 515-518 (2018).
  42. Meyers, J. R., et al. Β-catenin/wnt signaling controls progenitor fate in the developing and regenerating zebrafish retina. Neural Development. 7, 30(2012).
  43. Tappeiner, C., et al. Inhibition of the tgfβ pathway enhances retinal regeneration in adult zebrafish. PLoS One. 11 (11), 0167073(2016).
  44. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, o-phospho-l-serine, suppresses müller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Experimental Eye Research. 91 (5), 601-612 (2010).
  45. Ramachandran, R., Zhao, X. F., Goldman, D. Ascl1a/dkk/beta-catenin signaling pathway is necessary and glycogen synthase kinase-3beta inhibition is sufficient for zebrafish retina regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (38), 15858-15863 (2011).
  46. Lemmens, K., et al. Matrix metalloproteinases as promising regulators of axonal regrowth in the injured adult zebrafish retinotectal system. The Journal of Comparative Neurology. 524 (7), 1472-1493 (2016).
  47. Elsaeidi, F., Bemben, M. A., Zhao, X. F., Goldman, D. Jak/stat signaling stimulates zebrafish optic nerve regeneration and overcomes the inhibitory actions of socs3 and sfpq. The Journal of Neuroscience. 34 (7), 2632-2644 (2014).
  48. Van Dyck, A., et al. Müller glia-myeloid cell crosstalk accelerates optic nerve regeneration in the adult zebrafish. Glia. 69 (6), 1444-1463 (2021).
  49. Conedera, F. M., Pousa, A. M. Q., Mercader, N., Tschopp, M., Enzmann, V. Retinal microglia signaling affects müller cell behavior in the zebrafish following laser injury induction. Glia. 67 (6), 1150-1166 (2019).
  50. Chen, S., Lathrop, K. L., Kuwajima, T., Gross, J. M. Retinal ganglion cell survival after severe optic nerve injury is modulated by crosstalk between jak/stat signaling and innate immune responses in the zebrafish retina. Development. 149 (8), (2022).
  51. de Preux Charles, A. S., Bise, T., Baier, F., Marro, J., Jaźwińska, A. Distinct effects of inflammation on preconditioning and regeneration of the adult zebrafish heart. Open Biology. 6 (7), 160102(2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

RPE regeneratie bij zebravisnitroreductase metronidazol ablatieRpEGEN MATLAB platformRPE beschadigingsmodeltransgene zebravisfarmacologische screeningkwantificering van RPE pigmentatiefluorescentie stereomicroscopieWnt signaleringsroute
Nitroreductase/metronidazol-gemedieerde ablatie en een MATLAB-platform (RpEGEN) voor het bestuderen van regeneratie van het retinale pigmentepitheel van de zebravis
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.